Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (igy) kháng urease của vi khuẩn helicobacter pylori

Đến năm 1983, Barry Marshall, người Úc, đã thành công trong việc nuôi cấy,phân lập vi khuẩn này từ mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân bị viêm dạdày mạn, loét dạ dày, loét tá tràng và g

ĐẶT VẤN ĐỀ

Helicobacter pylori là vi khuẩn Gram âm đã gây nhiễm hơn nửa dân số

trên thế giới và đã được chứng minh có liên quan đến cơ chế gây bệnh viêm

dạ dày mạn tính, loét dạ dày tá tràng, ung thư dạ dày và u lympho ở dạ dày

(gastric MALT lymphoma) [1], [2], [3], [4], [5] Tần suất nhiễm H pylori có

liên quan rất lớn đến điều kiện kinh tế xã hội, trên 80% ở các nước đang pháttriển trong khi chỉ có khoảng 20 – 50% ở các nước phát triển [6], [7], [8], [9],[10] và có sự khác biệt theo từng vùng địa lý giữa các nước dao động từ 13%

ở Nga đến Myanmar (48%), Nhật (71%), Trung Quốc (58%), Trung Mỹ(62%), Việt Nam (>70%), Đông Âu (82%) và các nước châu Phi (>80%) [10],

[11], [12], [13], [14] Mặc dù mỗi chủng H pylori đều có sự khác biệt về khả năng gây bệnh nhưng nhìn chung H pylori đã nhiễm ở 90% bệnh nhân viêm

dạ dày, trên 90% loét tá tràng, 70% loét dạ dày và 90% ung thư dạ dày [11],

[15], [16], [17] Riêng ở Việt Nam, nhiễm H pylori khá phổ biến và có mối liên quan mật thiết với bệnh lý dạ dày tá tràng H pylori được tìm thấy trong

viêm dạ dày mạn (100%), viêm dạ dày thể hoạt động (83,1%), viêm teo niêmmạc dạ dày (85,3%), chuyển sản ruột (14,7%) tạo nguy cơ dẫn đến ung thưbiểu mô tuyến dạ dày và loét dạ dày tá tràng (21%) [18], [19], [20]

Việc điều trị viêm loét dạ dày - tá tràng do nhiễm H pylori rất phức tạp

vì phải sử dụng phác đồ phối hợp các thuốc kháng sinh với các thuốc giảmtoan, giảm tiết đúng, đủ liều, đủ thời gian và đúng quy cách Tuy nhiên, khảnăng thất bại cũng rất lớn do tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh Hội nghị

Đồng thuận Maastricht III (2005) khuyến cáo nên sử dụng phác đồ điều trị chuẩn ban đầu với bộ ba điều trị PPI (thuốc ức chế sự bài tiết acid của dạ dày

- proton pump inhibitor) – clarithromycin – amoxicillin hoặc metronidazole.Tuy nhiên, tỉ lệ đề kháng thuốc với phác đồ bộ ba ngày càng tăng Để hỗ trợ

cho phác đồ điều trị chuẩn ban đầu, Hội nghị cũng nhắc đến phác đồ thứ hai

và phác đồ thứ ba, đồng thời tiếp tục bàn luận về sự đề kháng thuốc và nhận

thấy khả năng đề kháng thuốc đạt tới 20% [21] Năm 2010, tại Hội nghịMaastricht IV ở Florence (Ý) đã ghi nhận tỉ lệ kháng thuốc trong điều trị tiệt

trừ H pylori tăng trên toàn cầu và cũng thống nhất những phác đồ thích hợp

dựa trên tình trạng kháng thuốc [22], trong đó phương pháp miễn dịch trị liệu

thụ động sử dụng các kháng thể kháng trực tiếp H pylori hoặc kháng urease của H pylori là một hướng nghiên cứu được quan tâm đặc biệt.

Globulin miễn dịch từ trứng gà (egg york immunoglobulin - IgY) làkháng thể được chuyển từ máu gà mái sang lòng đỏ trứng để thực hiện chứcnăng sinh lý là bảo vệ phôi và gà con Các kháng thể IgY đặc hiệu trong trứng

gà có các đặc tính bảo vệ giống như các kháng thể có trong máu gà mẹ Các

tác giả Nhật Bản và Hàn Quốc đã sử dụng IgY kháng urease của H pylori bổ sung vào sữa chua làm thực phẩm chức năng dự phòng nhiễm H pylori bước

đầu cho thấy có hiệu quả dự phòng trên người tình nguyện [23] Nhằm tạo ra

nguyên liệu chế tạo các chế phẩm dự phòng nhiễm H pylori tại Việt Nam

theo phương pháp miễn dịch thụ động, đề tài “Nghiên cứu chế tạo globulin

miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng urease của vi khuẩn Helicobacter pylori” được thực hiện với những mục tiêu sau:

1. Tách chiết urease của vi khuẩn Helicobacter pylori phân lập từ bệnh nhân viêm loét dạ dày - tá tràng.

2. Chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng urease của vi khuẩn Helicobacter pylori.

3. Đánh giá khả năng dự phòng nhiễm Helicobacter pylori trên động vật thực nghiệm của IgY kháng urease.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 VI KHUẨN Helicobacter pylori

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Vào năm 1981, Robin Warren, nhà Giải phẫu bệnh người Úc, đã pháthiện được một loại vi khuẩn ở niêm mạc dạ dày của bệnh nhân bị viêm hoặcloét dạ dày và hình dạng của chúng giống vi khuẩn thuộc giống

Campylobacter cho nên tên gọi đầu tiên của chúng là Campylobacter pylori.

Đến năm 1983, Barry Marshall, người Úc, đã thành công trong việc nuôi cấy,phân lập vi khuẩn này từ mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân bị viêm dạdày mạn, loét dạ dày, loét tá tràng và ghi nhận đặc tính tăng trưởng khác nhau

giữa chúng với Campylobacter pylori Cho đến năm 1989, dưới kính hiển vi điện tử, vi khuẩn này không giống Campylobacter vì có cấu trúc lông khác

hẳn, bên cạnh đó, còn có những khác biệt lớn trong tính chất sinh hoá và cấutrúc chuỗi 16S rRNA cho nên cuối cùng loài vi khuẩn này được xếp vào một

giống mới, giống Helicobacter, thuộc họ Helicobacteraceae và được đổi tên

là Helicobacter pylori [24], [25].

1.1.2 Dịch tễ học

Một trong những nhiễm khuẩn mạn tính thường gặp nhất ở người mà

các tác giả trong và ngoài nước thường hay nhắc đến đó chính là nhiễm H pylori Qua nhiều nghiên cứu nhận thấy tuổi, tình trạng kinh tế, xã hội và chủng tộc đã ảnh hưởng rất lớn đến tần suất nhiễm H pylori Đã có khoảng hơn nửa dân số thế giới bị nhiễm H pylori và tần suất nhiễm có sự khác biệt

rất lớn giữa các nước phát triển và các nước đang phát triển Ở các nước đang

phát triển như Ấn Độ, Saudi Arabia, Việt Nam và châu Phi có tỉ lệ nhiễm H.

nước phát triển như Anh, Úc và Pháp, tỉ lệ nhiễm thấp hơn 10 – 20% và tăngkhoảng 1% mỗi năm [11], [26], [27] Nguyên nhân của sự khác biệt này chủyếu là do vệ sinh môi trường, cụ thể như sự phát triển của hệ thống hiện đạitrong việc xử lý nước và chất thảy ở các nước phát triển [28], [29], [30].

Riêng về tuổi, trẻ em phần lớn bị nhiễm ở độ tuổi từ 2 – 8, trong đó cácnước phát triển tỉ lệ nhiễm cũng thấp hơn như tần suất nhiễm ở trẻ em NhậtBản dưới 10 tuổi rất thấp chỉ có 5% và cũng tăng dần theo tuổi [27] Thêmvào đó, ở các nước phát triển, người lớn có độ tuổi bị nhiễm thường trên 50tuổi và tần suất này tăng thêm 10% mỗi năm, trong khi các nước đang pháttriển có độ tuổi nhiễm sớm hơn thường trên 20 tuổi Ở Việt Nam, Nguyễn Sào

Trung (2005) đã ghi nhận tần suất nhiễm H pylori cao ở độ tuổi từ 31 - 50

tuổi [31]

Đường lây nhiễm chủ yếu là đường ăn uống (phân - miệng) hoặc lâytrực tiếp (miệng - miệng) qua nước bọt Ở những nơi có điều kiện vệ sinhkém, nước và thức ăn bị nhiễm là nguồn lây quan trọng ban đầu Đó cũng

chính là lý do giải thích tại sao ở các nước đang phát triển tần suất nhiễm H pylori cao hơn rất nhiều [11], [28], [32], [33].

1.1.3 Đặc điểm sinh học của H pylori

1.1.3.1 Hình thể và dinh dưỡng

Hình 1.1 Vi khuẩn Helicobacter pylori

* Nguồn: McColl K.E.L (2010) [34]

Helicobacter pylori là vi khuẩn Gram âm, hình cong, xoắn nhẹ, dài 1,5

- 5µm, đường kính 0,3 - 1µm Bề mặt vi khuẩn nhẵn, vỏ mỏng, có 4 - 6 lông,

đầu mút hình củ hành, nhờ đó H pylori di chuyển được trong lớp nhầy của

niêm mạc dạ dày bởi chuyển động xoắn (Hình 1.1) [24], [34], [35], [36]

Helicobacter pylori thuộc loại vi khuẩn vi hiếu khí, mọc chậm nên phải

nuôi cấy từ 4 - 7 ngày Vi khuẩn mọc trên các môi trường chuyên biệt nhưPylori agar, Skirrow cải tiến hoặc trên các môi trường Columbia, Brucella,BHI agar có thêm 7 – 10% máu ngựa hoặc máu cừu tươi, để ở 37oC trongđiều kiện có 5% O2, 10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao Môi trường chọn lọcthường có thêm các thuốc kháng sinh như vancomycin, trimethoprim và

amphotericin B để ức chế tạp nhiễm Helicobacter pylori có thể tăng trưởng

được ở nhiệt độ từ 30 – 40oC, chịu được môi trường pH từ 5,5 - 8,5 và sốngnhiều tháng ở âm 70oC trong môi trường thích hợp [24] Kết quả có thể đọcsau 3 - 5 ngày nuôi cấy (hoặc có thể để đến 14 ngày) với các khuẩn lạc tròn,bóng, màu xám trong, đường kính từ 0,5 – 1mm, không tan máu hoặc tan máu

alpha Đặc biệt, tiêu chuẩn xác định H pylori sau nuôi cấy là khuẩn lạc phải

cho kết quả dương tính với các thử nghiệm oxidase, catalase và urease, trong

đó thử nghiệm urease cho dương tính nhanh và mạnh

* Thử nghiệm oxydase

Lấy 1mm khuẩn lạc trong suốt đặt lên giấy thấm Nhỏ thuốc thử TMPD0,1% (TMPD: N,N,N’,N’-Tetramethyl-p-phenylenediamine)

Cytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom oxy hóa + H2O

Cytochrom oxy hóa + TMPD khử TMPD oxy hóa (màu xanh)Đọc kết quả ngay sau 30 giây: phản ứng (+) tính thì sinh khối chuyểnmàu xanh và phản ứng (-) tính sinh khối vẫn còn màu trắng (Hình 1.2)

Hình 1.2 Thử nghiệm oxydase của Helicobacter pylori

* Nguồn: Lê Văn Phủng (2009) [35]

Hình 1.3 Thử nghiệm catalase của Helicobacter pylori

* Nguồn: Lê Văn Phủng (2009) [35]

Hình 1.4 Thử nghiệm urease của Helicobacter pylori

* Nguồn: Lê Văn Phủng (2009) [35]

Đồng thời trên tiêu bản nhuộm Gram, hình thể vi khuẩn H pylori đa số

là hình cong, mức độ xoắn không điển hình như trên tiêu bản trực tiếp từmảnh sinh thiết, có thể có cả hình trực khuẩn (Hình 1.5) và nếu để sau 10ngày nuôi cấy, có thể xuất hiện các thể hình cầu [24], [36], [37]

Hình 1.5 Hình ảnh nhuộm Gram của Helicobacter pylori

* Nguồn: O'Rourke J.L., et al (2001) [36]

1.1.3.2 Tính chất hóa sinh và kháng nguyên urease của H pylori

Urease là một trong những enzyme chủ yếu trong sinh bệnh học của H pylori Trọng lượng phân tử của urease khoảng 550 kDa Enzyme này mang tính quan trọng sống còn đối với H pylori trong môi trường dạ dày.

Urease có tên hệ thống là carbamine amidohydrolase, là enzyme xúctác cho quá trình thủy phân urea thành ammonia và acid carbonic:

urease

(NH2)2CO + H2O NH3 + NH2COOH

NH3 vừa được tạo ra nhanh chóng hợp nước để tạo thành NH4+ và OH-.

acid mạnh (pH < 4) ở dạ dày (Hình 1.6 và 1.7) [38] Bên cạnh đó, urease còn

là tác nhân kích thích mạnh mẽ hoạt động thực bào đơn nhân và sản sinh racác cytokine gây viêm Đồng thời, NH3 còn gây độc trực tiếp lên tế bào vàphá vỡ liên kết giữa các tế bào làm tổn thương niêm mạc dạ dày Như vậy,urease biểu hiện cả hai chức năng: vừa là tác nhân xâm lấn và cũng vừa là tácnhân gây độc Urease là một trong những mục tiêu quan trọng nhất trong việc

phát triển thuốc để kiểm soát nhiễm H pylori ở dạ dày [39], [40], [41], [42],

[43]

Hình 1.6 Vai trò của H pylori urease trong nhiễm H pylori

* Nguồn: Follmer C (2010) [44]

Hình 1.7 Cơ chế xâm lấn của H pylori vào dịch nhày dạ dày

* Nguồn: Bansil R., et al (2013) [39]

Trong bảng phân loại enzyme theo quy ước quốc tế, urease mang mã số

EC 3.5.1.5 trong đó 3 (nhóm chính là nhóm hydrolase), 5 (nhóm phụ enzyme

tác dụng lên liên kết C-N), 1 (phân nhóm phụ cắt các amid thẳng) và 5 (số thứ

tự của urease trong phân nhóm phụ)

Vào năm 1926, urease lần đầu tiên được Summer tách chiết từ đậu rựa(jack bean) Urease là các tinh thể có 8 cạnh, không màu, trong suốt, quan sátđược dưới kính hiển vi và có đường kính d = 4 – 30µm tùy theo phương pháptách chiết Khối lượng phân tử của urease được Polacco và Havir xác địnhbằng phương pháp lọc gel trên cột agarose A-15m đối với urease đậu rựa vàđậu nành Brazil Urease đậu nành có 2 phân tử lượng khác nhau 540 kDa và

420 kDa, còn urease đậu rựa chỉ có một phân tử lượng là 480 kDa Như vậy,urease từ những nguồn khác nhau có phân tử lượng khác nhau và ngay cảtrong cùng một nguồn đậu nành đã có tới 2 loại urease Hai loại urease nàykhác nhau ở thành phần apoenzyme nhưng bản chất của coenzyme vẫn khôngthay đổi Các apoenzyme là những chuỗi polypeptide được hình thành từnhiều acid amine, mà thành phần của các acid amine này thì không giốngnhau ở những nguồn khác nhau, điều này lý giải sự khác nhau về khối lượngphân tử giữa chúng [45], [46]

Urease dễ dàng hòa tan trong dung dịch ammonia loãng và dung dịchkiềm loãng, có thể hòa tan hoặc đông tụ trong dung dịch muối loãng và acidhữu cơ tùy thuộc nồng độ acid Điểm đẳng điện của urease nằm trong khoảng

pH = 5,0 – 5,1 và tại điểm đẳng điện độ hòa tan của urease cực nhỏ

Urease cũng mang những đặc tính của protein như tan trong nước vàdung dịch muối loãng; không đi qua được màng thẩm tích vì có kích thướcphân tử lớn; tan khi có lớp áo nước và tích điện; tủa khi mất lớp áo nước vàtrung tính; bị biến tính dưới tác dụng của acid, kiềm đặc, các ion kim loạinặng và nhiệt độ cao; dễ bị tủa thuận nghịch trong các dung môi hữu cơ

(ethanol, acetone ) hoặc muối ammonium sulfate, sodium chloride; tính chấthóa lý có thể thay đổi khi kết hợp với cơ chất, coenzyme, ion kim loại hoặcmột số chất hữu cơ đặc hiệu khác; và phân tử enzyme có thể tồn tại ở cáctrạng thái ion như anion, cation hoặc trung hòa tùy theo pH của môi trường.

Trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm các acid amine có nhóm hóahọc hoạt động mạnh và các ion kim loại Các nhóm hóa học hoạt động mạnhnày có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất Cácion kim loại có vai trò xúc tác rất lớn, có tác dụng liên kết giữa enzyme và cơchất hoặc apoenzyme và coenzyme hoặc tham gia vào quá trình vận chuyểnđiện tử Đồng thời, urease là enzyme không có bất cứ cofactor hữu cơ nào vàcũng không có sắt, manganese hay phosphorus Bên cạnh đó, trung tâm hoạtđộng của urease còn có chứa hai nguyên tử nitrogen Hai nguyên tử nitrogennày đóng vai trò rất quan trọng trong việc xúc tác phản ứng của urease haycòn gọi là Nikel dependent enzyme Cơ chất của urease khá quan trọng trongviệc mô tả vai trò của trung tâm hoạt động nitrogen trong quá trình xúc tác.Một số cơ chất của urease là urea, semicarbazide, formamide, acetamide, N –Methylurea, N – Hydroxyurea, dihydroxyurea… Urea là cơ chất đặc hiệu củaurease với năng lượng hoạt hóa là 8.700 hoặc 11.700 calories/gmol ở 25oC,còn đối với các cơ chất như hydroxyurea hoặc dihydroxyurea thì vận tốc nhỏhơn 120 lần Phân tử urea rất bền và sự phân hủy urea không enzyme trongdung dịch không phụ thuộc vào độ pH Tuy nhiên, khi gặp enzyme, chínhenzyme đã chống lại sự phân hủy và tạo điều kiện cho urea bị nước hay OH-

tấn công để tạo ra carbamate [7], [42], [47]

Urease được phát hiện ở nhiều loài vi sinh vật, thực vật và một số ítđộng vật Các vi khuẩn có chứa urease tham gia vào quá trình đồng hóa urea

thành muối amon, tên gọi chung là Ureabacterium và phần lớn thuộc hai họ

tiểu đơn vị (UreA [30 kDa] và UreB [62 kDa]) theo tỉ lệ phân tử 1:1 Nhìnchung, hoạt tính của urease được đòi hỏi là phải tạo ra vi môi trường trung

tính trong dạ dày cho H pylori Urease được biểu lộ như một protein lớp bề mặt ngoài của H pylori và hình thành một lượng lớn protein bao quanh H pylori Cùng với việc urease sau tiết liên kết với màng ngoài của H pylori thì hoạt tính của urease cũng còn biểu hiện trong bào tương của H pylori với vai

trò tiêu hóa nitrogen hữu cơ Sự tương quan giữa urease và bề mặt vi khuẩn

có vẻ ổn định nhờ vào các ion dương hóa trị 2 như Ca2+ và Mg2+ mặc dùnhững ion dương khác có thể ức chế hoạt tính urease [7], [40], [42], [48]

Bên cạnh urease, những sản phẩm chuyển hóa đặc biệt khác của H pylori là catalase, superoxid dismutase và alkylhydroperoxid reductase.

Superoxid dismutase phân hủy superoxid của các tế bào bạch cầu đa nhân và

đại thực bào, do đó H pylori sẽ không bị bạch cầu đa nhân và đại thực bào tiêu diệt Catalase bảo vệ H pylori tránh khỏi sự tiêu diệt từ các hydro

peroxid (H2O2) của các tế bào thực bào Các protein màng ngoài,

phospholipid, glucolipid và các điểm bám dính của H pylori đã giúp cho vi

khuẩn này bám vào lớp mucin và tế bào niêm mạc của dạ dày Các điểm bámdính này bám vào các thụ thể đặc hiệu có ở trên tế bào chủ [7], [24], [49]

Ngoài ra, H pylori còn sản xuất các độc tố khác như yếu tố độc tế bào

tạo không bào A (Vacuolating cytotoxin A – VacA), yếu tố độc tế bào liênquan gen A (Cytotoxin associated gen A – CagA), lipopolysaccharid (LPS)

của H pylori [24] Vai trò của CagA và VacA sau tiết từ H pylori được minh

Thay đổi hình tháiTăng sinh tế bào Đáp ứng

tiền viêm

họa trong Hình 1.8 và 1.9 Trong đó, VacA ảnh hưởng đến quy trình hoạt động

tế bào bằng những đường khác nhau nhằm tạo thuận cho bệnh viêm dạ dày

mạn tính bởi H pylori:

(1) VacA bề mặt vi khuẩn bám trực tiếp vào màng,

(2) VacA tiết bám lên thụ thể màng tế bào và khởi đầu đáp ứng tiềnviêm,

(3) xuyên trực tiếp qua màng tế bào và vào mitochondria gây ra sự chết

tế bào,

(4) vào pinocytosis tạo ra sự ẩm bào,

(5) tạo kênh qua màng tế bào dẫn đến sự dò rỉ chất dinh dưỡng ra ngoàiqua màng,

(6) xuyên qua kẽ hở màng tế bào và ức chế sự hoạt hóa và tăng sinh của

tế bào T [8], [50]

Hình 1.8 Những vai trò khác nhau của hệ thống tiết loại IV của Cag trong

điều chỉnh về miễn dịch, tăng sinh tế bào và thay đổi hình thái

* Nguồn: Kusters J.G., et al (2006) [8]

Con đường tín hiệu tiền viêm

Sự chết tế bào Sự tạo không bào

Kênh màng tế bào

Ức chế hoạt hóa và tăng sinh

tế bào T

13

Hình 1.9 VacA ảnh hưởng đến quy trình hoạt động tế bào bằng những

đường khác nhau nhằm tạo thuận cho viêm dạ dày mạn tính bởi H pylori

* Nguồn: Kusters J.G., et al (2006) [8]

1.1.4 Nhiễm H pylori và bệnh viêm loét dạ dày tá tràng

Cơ chế bệnh sinh của viêm loét dạ dày tá tràng liên quan đến H pylori được thể hiện rõ nét qua phản ứng của cơ thể đối với H pylori Urease của vi

khuẩn trung hòa pH của dạ dày đưa pH dạ dày trở về trung tính, từ đó đã tạothuận lợi cho sự tồn tại của vi khuẩn, sự tấn công của chúng vào tế bào biểu

mô dạ dày và sự di chuyển của chúng trên bề mặt nhày của niêm mạc dạ dày[51] Sự dính bám của vi khuẩn vào lớp biểu mô của dạ dày nhờ vào hai yếu

tố dính bám là BabA (blood group antigen - binding adhesion) và SabA (sialicacid - binding adhesion), ngay sau khi dính bám, vi khuẩn giải phóng hai yếu

tố CagA và VacA vào lớp tế bào này Chính CagA và VacA là những nguyênnhân tạo ra một đáp ứng của hệ thống miễn dịch rất mạnh và gây viêm niêmmạc dạ dày [52]

Hình 1.10 Cơ chế bệnh sinh của nhiễm H pylori và đáp ứng miễn dịch

của cơ thể người bệnh

* Nguồn: Cadamuro A.C.T., et al (2014) [52]

Lipopolysaccharide (LPS) của H pylori được nhận biết chủ yếu bởi hai

thụ thể TLR4 và TLR2 (Toll-like receptor - TLR) trong đó TLR4 là thụ thể

nhận biết chính LPS của H pylori, tuy nhiên do sự thay đổi của cấu trúc LPS

đã làm thay đổi sự nhận biết này và làm giảm kích thích đáp ứng miễn dịchcủa cơ thể, điều này tạo thuận cho sự tấn công của vi khuẩn và gây ra bệnh.Hai thụ thể này phụ thuộc vào sự hiện diện của MyD88 (myeloiddifferentiation primary-response gene 88) để truyền tín hiệu Phức hợpMyD88 được kết hợp với IRAK1 (interleukin-1-receptor-associated kinase-1)

và IRAK4 IRAK1 được phosphoryl hóa và kế đó phân ly từ MyD88 Cũngbằng sự phosphoryl hóa, phức hợp MyD88 phân tách cho ra NF-κB (nuclearfacter κB) NF-κB được di chuyển vào nhân để kích hoạt biểu lộ các gen liênquan đến tiến trình hình thành viêm niêm mạc dạ dày [52]

CagA tạo ra đáp ứng viêm là do chúng gây ra sự tăng sản xuất một vàicytokines như IL-1β (interleukin - 1β) và IL-8 và đồng thời hoạt hóa NF-κB,thủ phạm tạo ra sự phát sinh nhanh các kiểu hình của vi khuẩn, quan trọngtrong quá trình hình thành cơ chế bệnh sinh của ung thư như kích hoạt các yếu

tố tăng trưởng và ức chế sự chết tế bào Như vậy, CagA đã hủy bỏ con đườngtruyền tín hiệu trong tế bào và thay vào sự phát triển những tế bào ung thư,

một điểm quan trọng trong bệnh sinh của H pylori [52], [53].

VacA kích hoạt đáp ứng tiền viêm và hoạt hóa những tế bào viêm thamgia trong đáp ứng viêm mạn tính ở niêm mạc dạ dày bởi sự tấn công của vi

khuẩn H pylori VacA còn kích hoạt sản sinh ra TNF-α, IL-1β, nitric oxide,

phản ứng đặc hiệu oxy và hoạt hóa NF-κB có thể liên quan đến nhữngcytokine tiền viêm và sự chết tế bào VacA cũng tác động đến hệ thống miễn

dịch nhằm giúp cho H pylori né tránh được đáp ứng miễn dịch thu được của

cơ thể để tạo ra nhiễm trùng dai dẳng, từ đó cản trở sự thực bào, sự trình diệnkháng nguyên và cũng ức chế sự biệt hóa tế bào lympho T [52]

Song song đó, đáp ứng miễn dịch cũng được hoạt hóa với sự tăng sinhnhững tế bào viêm tại ổ nhiễm ở dạ dày dẫn đến sự phóng thích nhiều hóachất trung gian tiền viêm và kháng viêm khác nhau Bên cạnh đó, sau khi hoạthóa NF-κB (nuclear factor - NF), đã tạo ra một lượng lớn các cytokine vàchemokine tiền viêm như yếu tố hoại tử u alpha (TNF-α) và nhiều interleukin,

và đồng thời đã hoạt hóa những con đường phát bệnh ung thư có thể gây raung thư dạ dày Thêm vào đó, sự giải phóng các hóa chất trung gian trong đápứng miễn dịch học được điều tiết bởi miRNAs và những hóa chất trung gian

trong viêm do nhiễm H pylori có thể làm thay đổi sự phóng thích miRNAs Mặt khác, sau hoạt hóa NF-κB và sản sinh các cytokine, nhiễm H pylori tạo

ra hóa hướng động các đại thực bào và tẩm nhuận các bạch cầu đa nhân (bạch

1.1.5 Các phương pháp phát hiện H pylori

Có hai nhóm phương pháp phát hiện H pylori: các phương pháp xâm

phạm (invasive methods) và không xâm phạm (non-invasive methods) [24],

[54], [55], [56] Các phương pháp xâm phạm bao gồm phương pháp tế bào

học, phương pháp mô bệnh học, thử nghiệm urease, nuôi cấy và phản ứngchuỗi polymerase (PCR - Polymerase chain reaction) Để thực hiện một trongnhững phương pháp này, bệnh nhân phải được nội soi dạ dày – tá tràng để lấy

mảnh sinh thiết ở vị trí tổn thương dạ dày hoặc tá tràng Bên cạnh đó, các phương pháp không xâm phạm bao gồm test thở với urea gắn 14C hoặc 13C,các xét nghiệm huyết thanh học tìm kháng thể và xét nghiệm phân tìm kháng

nguyên H pylori

1.1.6 Khả năng kháng kháng sinh của H pylori

Helicobacter pylori có khả năng đề kháng rất mạnh với những thuốc

kháng sinh đưa vào điều trị cả trên in vitro và in vivo Đối với bệnh lý viêm

loét dạ dày và tá tràng do nhiễm H pylori, Hội nghị Đồng thuận Maastricht III (2005) bàn luận về phác đồ điều trị chuẩn ban đầu trong điều trị tiệt trừ H pylori với thời gian điều trị từ 7 – 14 ngày Với phác đồ bộ ba này, tỉ lệ đề

kháng thuốc ngày càng tăng [57] Ví dụ như tỉ lệ đề kháng clarithromycin ởNhật là 16%, châu Âu lớn hơn 20% và Bắc Mỹ 25% [58]; và hiệu quả tiệt trừ

H pylori của phác đồ điều trị chuẩn ban đầu trong năm 2007 chỉ đạt được 72% [59] Riêng ở Việt Nam, sự thất bại của phác đồ chuẩn điều trị tiệt trừ H pylori được ghi nhận trong Hình 1.11 [60], [61], [62], [63] Đồng thời, Hội nghị cũng bàn luận đến phác đồ thứ hai hoặc là bổ sung bismuth 10 – 14 ngày

điều trị trong phác đồ bộ bốn (bismuth - PPI – clarithromycin – amoxicillinhoặc metronidazole) hoặc lựa chọn sự kết hợp khác thay clarithromycin vàamoxicillin bằng tetracycline (PPI – tetracycline – metronidazole), tuy nhiên

khả năng điều trị tiệt trừ H pylori trên toàn cầu chỉ đạt được 64% đối với

phác đồ bộ bốn và 91% đối với phác đồ có tetracycline và phác đồ thứ ba có

thêm hai kháng sinh levofloxacin (fluoroquinolone) và rifabutin (rifamycin)cũng với ghi nhận sự đề kháng thuốc tăng nhanh (Bảng 1.1) [21], [22], [64],[65]

Hình 1.11 Hiệu quả tiệt trừ H pylori của phác đồ chuẩn tại Việt Nam

* Nguồn: Nguyễn Thúy Vinh (2003) [62], Trần Ngọc Bảo (2004) [63],

Đào Hữu Ngôi (2010) [61] và Bùi Hữu Hoàng (2011) [60]

Bảng 1.1 Tình hình đề kháng kháng sinh của H pylori trên thế giới

theo Hội nghị Đồng thuận Maastricht III và IV

Riêng ở Việt Nam, vào những năm gần đây, tình hình đề kháng với các

loại thuốc kháng sinh trong điều trị tiệt trừ H pylori như Clarithromycin,

Amoxicillin, Metronidazole và Tetracycline trong bệnh viêm dạ dày mạn tính,loét dạ dày - tá tràng và ung thư dạ dày ngày càng tăng: metronidazole (94,6 –95,5%), amoxicillin (33,9 – 35,5%), tetracycline (17,78 - 21,4%) vàclarithromycin (21,4 – 26,6%) (Hình 1.12) [66], [67], [68], [69], [70]

Tóm lại, về vấn đề đề kháng thuốc kháng sinh trong điều trị tiệt trừ H pylori trên toàn cầu, Hội nghị khuyến cáo nên dựa chủ yếu vào kháng sinh đồ

trước khi tiến hành điều trị cho bệnh nhân [21] Tiếp đến Hội nghị Maastricht

IV ở Florence (2010) đã ghi nhận tỉ lệ kháng thuốc trong điều trị tiệt trừ H pylori tăng trên toàn cầu và thống nhất những phác đồ thích hợp dựa theo tình

trạng kháng thuốc [22]

Hình 1.12 Tình hình đề kháng kháng sinh của H pylori tại Việt Nam

* Nguồn: Phan Quốc Hoàn (2000) [69], Lê Đình Minh Nhân (2006) [66],

Nguyễn Văn Thịnh (2009) [68] và Nguyễn Thị Nguyệt (2010) [67]

1.2.2 Các kháng thể của gà

Năm 1893, Klemperer lần đầu tiên đã mô tả khả năng miễn dịch thụđộng thu được ở chim Ông đã chứng minh về sự di truyền các yếu tố miễndịch chống lại độc tố uốn ván từ gà mái sang gà con Sự miễn dịch này cóđược là nhờ có sự vận chuyển của kháng thể từ gà mẹ sang gà con [74], [75]

Gà có 3 lớp kháng thể là IgA, IgM và IgY Trọng lượng phân tử, đặcđiểm hình thái học và tính linh động của IgA và IgM ở gà thì tương tự nhưcác lớp này ở động vật có vú, trong khi đó, IgY có trọng lượng phân tử thấp,

có trong máu gà và được chuyển qua chứa trong lòng đỏ trứng (egg york –nên có tên gọi là IgY) nhằm cung cấp khả năng đề kháng cho phôi gà và gàcon [72], [73], [74], [76], [77]

1.2.3 Kháng thể IgY

1.2.3.1 Cấu trúc và chức năng

Cấu trúc IgY của gà (chim) nói chung cũng giống như cấu trúc IgG ởđộng vật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L(light chain) liên kết với nhau bằng các cầu nối disulfua (-S-S-) Trọng lượngphân tử của IgY là 167.250Da, lớn hơn so với IgG của động vật có vú(160.000 Da) Chuỗi nhẹ của IgY gồm một vùng thay đổi V (variable region)

và một vùng hằng định CL (constant region), có trọng lượng phân tử là18.660Da Chuỗi nặng gồm một vùng thay đổi VH và bốn vùng hằng định kýhiệu từ Cν1 đến Cν4, với trọng lượng phân tử là 65.105 Da (Hình 1.13) [72],[74], [75].

Khác với chuỗi nặng của IgG, chuỗi nặng của IgY không có vùng bản

lề Một số nghiên cứu chỉ ra rằng vùng Cν3, Cν4 của IgY tương tự như cácvùng Cγ2 và Cγ3 của IgG còn vùng bản lề của IgG được thay bằng vùng Cν2

ở IgY, điều này làm cho chuỗi nặng của IgY kém linh hoạt hơn Đây có thể là

lý do làm cho IgY có nhiều đặc tính sinh học khác với IgG ở động vật có vú.Vùng Fc của IgY gián tiếp quy định chức năng của nó như sự ngưng kết bổthể và opsonin hóa các kháng nguyên Cụ thể IgY không gắn vào các thụ thể

Fc người và động vật có vú cũng như không hoạt hóa hệ thống bổ thể ở người

và động vật có vú khác, đồng thời cũng không tương tác với yếu tố dạng thấp[72], [73], [75], [76], [78]

Hình 1.13 Cấu trúc IgY của gà (chim) và IgG của động vật có vú

* Nguồn: Schade R., et al (1996) [75]

1.2.3.2 Sự vận chuyển IgY từ gà mẹ sang gà con

IgY được vận chuyển từ máu gà mẹ sang gà con trải qua 2 bước:

- Bước 1: IgY chuyển từ máu vào lòng đỏ trứng, tương tự như quá trìnhvận chuyển IgG qua nhau thai ở động vật có vú

- Bước 2: Sự vận chuyển IgY từ lòng đỏ trứng sang phôi trong quá trìnhphát triển

Sự tập trung IgY ở lòng đỏ trứng về cơ bản là thông qua sự chín củanoãn bào Ở trong trứng, IgY không tồn tại ở lòng trắng trong khi IgA và IgMlại không có ở lòng đỏ trứng Lượng IgY được kết lại trong lòng đỏ trứng từngày thứ 7 trở đi cho đến ít nhất là ngày thứ 18 Trên noãn bào có các thụ thể(receptor) ái lực cao và thấp dành cho IgY IgY sẽ gắn kết với thụ thể của nótrên bề mặt noãn bào để chuyển từ máu gà mái sang trứng Sau 3 đến 4 ngày

kể từ khi IgY xuất hiện trong huyết thanh thì IgY cũng được tìm thấy tronglòng đỏ trứng Tổng hàm lượng IgY trong gà mái mới nở là 2 – 3mg trong khi

đó ở lòng đỏ trứng dao động từ 100 - 400mg Nồng độ IgY trong huyết thanhcủa gà con mới nở là 1 - 1,5mg/ml, thời gian bán hủy trong vòng tuần hoàn là

36 giờ [72], [74], [75], [76]

1.2.3.3 Tính ổn định của IgY

Tính ổn định của IgY phụ thuộc vào các yếu tố như: nhiệt độ, pH vàenzyme protein

- Yếu tố pH: khi pH acid, hoạt tính của IgY bị giảm ở pH = 3,5 hoặc

thấp hơn và bị thay đổi hoàn toàn ở pH = 3; và khi pH kiềm, trong điều kiệnnày thì hoạt tính của IgY không thay đổi cho tới pH = 11

- Yếu tố nhiệt độ và thời gian: nhiệt độ và thời gian ủ làm ảnh hưởng

đến hoạt tính của IgY, hoạt tính của nó sẽ giảm ở 75oC Lạnh và khô không

làm ảnh hưởng đến hoạt tính của IgY trừ khi lặp đi lặp lại nhiều lần sẽ làmthay đổi cấu trúc cũng như khả năng bám dính của protein.

- Các enzyme thủy phân protein: IgY có khả năng đề kháng rất cao với

các enzyme đường tiêu hóa như trypsin, chymotrypsin… nhưng lại rất nhạycảm với pepsin Trong môi trường chymotrysin thì IgY không những vẫn giữđược hoạt tính cao mà sự phân cắt chuỗi polypeptide còn chưa rõ ràng Còntrong môi trường trypsin thì hoạt tính ngưng kết kháng nguyên và kết dính tếbào vẫn còn những cấu trúc của chuỗi polypeptide đã bị phá vỡ Theo một sốnghiên cứu thì hoạt tính IgY còn lại tới 39%, 41% theo thứ tự trong môitrường trypsin, chymotrypsin sau 8 giờ

IgY có thể bảo quản trong NaCl 0,9%, NaNO3 ở 4°C hơn 10 năm màkhông bị mất hoạt tính Ái lực và kháng thể gắn biotin vẫn còn hoạt tính caokhi bảo quản ở 4°C sau 5 năm Kháng thể được tinh chế vẫn còn ngưng kếtvới kháng nguyên sau 6 tháng ở 20°C và sau 1 tháng ở 37°C Một quả trứng

có thể bảo quản trong vòng 6 tháng ở 4oC mà hoạt tính của IgY giảm đi khôngđáng kể [72], [74]

1.2.3.4 Tính ưu việt của việc sản xuất IgY

Gà mái được dùng để sản xuất kháng thể trong toàn bộ giai đoạn đẻtrứng Gà có thể sản xuất kháng thể có hoạt tính cao chỉ cần sau một lần gâymiễn dịch, trong khi đó để có kết quả tương tự như vậy ở cừu thì phải gâymiễn dịch 4 lần Khi gây miễn dịch nhắc lại hàng tháng thì nhận thấy ở cừusản xuất kháng thể đặc hiệu gấp 10 lần so với ở gà, nhưng sự khác nhau này

có thể do khác nhau về kích cỡ và cả thời gian bán hủy kháng thể: ở cừu 1ngày còn ở gà là 36 giờ

Sau khi gây miễn dịch cho gà (một mũi tiêm tĩnh mạch hay ổ bụng),nồng độ IgY trong huyết thanh cao nhất vào ngày thứ 7 - 9, có thể gây miễn

so với kháng thể thỏ [79] Tóm lại, tính ưu việt của IgY đã được ghi lại trongBảng 1.2 [75], [80].

Bảng 1.2 Tính ưu việt của IgY

(ngựa, cừu, thỏ)

Gà (gà mới

đẻ trứng)

Loại mẫu để thu hoạch kháng

Lượng kháng thể thu được 200mg/lần lấy máu

(2 – 3 tháng/1 lần)

50-100mg/trứng(5 - 7 trứng/tuần)

Số lượng kháng thể trong năm 1.400mg 40.000mg

Hoạt hóa bổ thể ở động vật có

* Nguồn: Schade R., et al (1991, 1996) [75], [80]

1.2.4 IgY và những ứng dụng trong dự phòng và điều trị

Ngày nay, tỷ lệ vi khuẩn đề kháng với thuốc kháng sinh ngày càng tăngdần dẫn đến các loại thuốc kháng sinh cổ điển càng kém hiệu quả Do đó, điềuquan trọng là phải tìm ra một giải pháp trị liệu khác để sử dụng mà có tácdụng giống như thuốc kháng sinh nhằm để tiêu diệt các vi sinh vật hoặc bấthoạt chúng Kháng thể đặc hiệu đường uống là hướng đến hấp dẫn việc hìnhthành miễn dịch bảo vệ chống lại những tác nhân gây bệnh ở dạ dày và ruộtcủa cả người lẫn động vật, và trị liệu miễn dịch này cũng có thể chống lạinhững tác nhân gây bệnh khó điều trị với thuốc kháng sinh cổ điển [81]

Từ năm 1930, trị liệu miễn dịch thụ động đã bắt đầu được triển khaibằng cách truyền tác nhân miễn dịch của cơ thể cho đã được mẫn cảm (kháng

thể) sang cơ thể nhận chưa có miễn dịch nhằm phòng ngừa hoặc giảm nhẹbệnh viêm gan siêu vi A và bệnh sởi[4] Tiếp theo sau đó, việc sử dụng khángthể đặc hiệu đã được thực hiện ngày càng nhiều vào cuối thế kỷ XIX và đầuthế kỷ XX

Phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng (mAbs) bằng những tế bào

B bất tử và phát triển thành công nghệ lai đã tạo ra một cuộc cách mạng trongtrị liệu bằng kháng thể vào năm 1975 Đến năm 1980, kháng thể đơn dòngchống CD3 đã được đưa vào ứng dụng lâm sàng để ngăn ngừa thải loại ghép

cơ quan Năm 1990, trị liệu các bệnh nhiễm trùng bằng kháng thể đơn dòng

đã đưa vào nghiên cứu Mãi đến năm 1998, chỉ có một loại kháng thể đơndòng, palivizumab, đã được cho phép điều trị bệnh nhiễm RSV (Respiratorysyncytial virus) Hơn thế nữa, vào năm 2004 đã có trên 12 loại kháng thể đơndòng đã được phép ứng dụng để điều trị các bệnh không nhiễm trùng [82].Bên cạnh đó, trong thời gian này việc nghiên cứu sản xuất kháng thể đơndòng đặc hiệu với các vi sinh vật gây bệnh cho người cũng đã và đang đượctiếp tục tiến hành và xin cấp phép Ví dụ như:

- Bệnh than (Bacillus anthracis)

- Bệnh ho gà (Bordetella pertussis)

- Bệnh uốn ván (Clostridium tetani)

- Bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)

- Viêm màng não (Neisseria meningitidis)

- Viêm phổi (Streptococcus pneumoniae)

- Viêm gan siêu vi B (Hepatitis B virus)

- Bệnh sởi (Measles virus)

- Bệnh dại (Rabies virus)

- Nhiễm trùng đường tiêu hóa (Enterovirus)…

Cho đến nay, có nhiều loại kháng thể đơn dòng đã được tạo ra để điềutrị các bệnh nhiễm trùng và không nhiễm trùng và đã được cấp phép Trị liệubằng kháng thể đặc hiệu chủ yếu được thực hiện theo đường tiêm truyền, ví

dụ như huyết thanh kháng dại, huyết thanh kháng uốn ván, huyết thanh khángnọc rắn… Thuận lợi của trị liệu bằng kháng thể là có độc tính thấp và tínhđặc hiệu cao, nhưng ngược lại nguyên nhân chính cản trở việc sử dụng khángthể đơn dòng để điều trị là giá thành cho sản xuất, bảo quản và đăng ký cấpphép rất cao [82], [83]

Miễn dịch thụ động (passive immunity) bằng đường uống bởi nhữngkháng thể đặc hiệu là phương pháp hấp dẫn nhằm chống lại các tác nhân gâybệnh ở dạ dày và ruột của cả người lẫn động vật Trứng gia cầm chứa tất cảcác chất dinh dưỡng thiết yếu và các yếu tố tăng trưởng cần cho sự phát triểncủa phôi, gồm có các kháng thể được vận chuyển từ máu gà mái vào lòng đỏtrứng để cung cấp miễn dịch cho gà con Từ khi khám phá kháng thể lòng đỏtrứng (IgY) vào những năm cuối thế kỷ XVIII, quy trình sản xuất IgY đặchiệu kháng nguyên đã được tiến hành nhằm ứng dụng một vài lĩnh vực trong

y khoa và trong nghiên cứu bao gồm những khía cạnh trong chẩn đoán vàtrong nghiên cứu về protein Trong đó, một trong những khía cạnh có giá trịlớn và đầy hứa hẹn của nghiên cứu IgY là sử dụng chúng để gây miễn dịchthụ động phục vụ cho điều trị và phòng ngừa các bệnh ở người và động vật[84]

Nhờ công nghệ sản xuất đơn giản cho sản lượng cao và giá thành thấp,IgY là ứng viên tiềm năng để sử dụng điều trị bằng các đường khác nhau nhưđường tiêu hóa hoặc rửa đắp kháng thể tại chỗ Thông thường để điều trị cáctác nhân gây bệnh đường dạ dày - ruột thì các thuốc được đưa vào đườnguống là hiệu quả nhất do tác động trực tiếp của thuốc đối với vi sinh vật có

mặt trong đường tiêu hoá Đưa trực tiếp kháng thể đặc hiệu với các tác nhângây bệnh dạ dày vào dạ dày và bệnh đường ruột vào ruột được xác định làmột biện pháp rất hữu hiệu nhằm cung cấp khả năng bảo vệ tức thì trước cáctác nhân gây bệnh đường dạ dày - ruột cả trên động vật lẫn trên người, đặcbiệt là khi các vi sinh vật đó đã đề kháng với thuốc kháng sinh [85]

1.2.4.1 IgY trong dự phòng và điều trị bệnh cho động vật

IgY cũng là nguồn trị liệu khác có thể thay thế cho kháng sinh trongđiều trị khi mà các tác nhân gây bệnh đã đề kháng với thuốc kháng sinhđường ruột Bằng đường uống, IgY đã cung cấp thành công cho việc điều trịnhiều trường hợp nhiễm trùng ở dạ dày và ruột như rotavirus, coronavirus,

Yersinia ruckeri, Escherichia coli, Salmonella species, Edwardsiella tarda, Staphylococcus và Pseudomonas [72], [81], [86], [87], [88].

Kháng thể IgY đặc hiệu đã được chế tạo và sử dụng để ngăn ngừa

nhiễm Salmonella species ở gà [89] IgY cũng được dùng để dự phòng nhiễm

rotavirus gây tiêu chảy và đã làm giảm tỷ lệ bệnh tiêu chảy cho động vật [90],

[91] Riêng bệnh tiêu chảy do Escherichia coli xuất hiện ở heo con, hiệu quả trị liệu của bệnh này bằng IgY kháng E coli đã được tác giả Marquardt và

cộng sự ghi nhận [92] Bên cạnh đó, Neri và cộng sự cho chuột uống độc chất

Shiga của E coli có vai trò gây viêm ruột xuất huyết, sau đó trị liệu bằng IgY

kháng độc chất này và nhận thấy tỉ lệ tử vong của chuột đã giảm rõ rệt [93].Mặt khác, một số tác giả cũng ghi nhận sự giảm có ý nghĩa thống kê về sựphát triển của bệnh trên chuột khi nhiễm enterovirus và về tỉ lệ tử vong saukhi cho chuột uống IgY kháng enterovirus [94]

Trên động vật, có một vài vật nuôi có thể nhiễm H pylori và bị bệnh

viêm loét dạ dày như lạc đà, cừu, bò, khỉ, mèo, chó và loài gậm nhấm (chuột

nhảy, chuột lang, chuột nhắt, thỏ…) Vì vậy, IgY kháng H pylori cũng đã

kháng VacA, CagA của H pylori hoặc IgY kháng urease của H pylori và từ

đó đã xác định được khả năng có thể ứng dụng IgY kháng urease của H pylori trong việc phòng ngừa và trị liệu cho bệnh nhân bị bệnh viêm dạ dày, viêm loét dạ dày – tá tràng và ung thư dạ dày khi nhiễm H pylori [95].

1.2.4.2 IgY trong dự phòng và điều trị bệnh cho người

Hệ thống miễn dịch nhày đã cung cấp một lượng lớn IgA tiết trongnước bọt, từ đó đã tạo ra một đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống lại

Streptococcus mutans gây bệnh sâu răng ở trẻ em Cơ chế hoạt động của IgA tiết trong nước bọt bao gồm sự ngăn cản không cho S mutans bám vào bề mặt

của răng theo hướng phụ thuộc hay không phụ thuộc đường sucrose, cũngnhư ức chế sự chuyển hóa của chúng Cuối cùng không cho chúng định cư ởrăng của trẻ em và sau đó loại chúng ra khỏi đường tiêu hóa [96] Bổ sungcho đáp ứng miễn dịch thụ động này, các tác giả Trung Quốc và Nhật Bản đã

chứng minh được vai trò của IgY kháng S mutans trong việc ức chế sự bám

dính vào mảng bám răng và sự định cư của vi khuẩn này vào mảng bám răng

trong bệnh nha chu [97] Thêm vào đó, IgY kháng vi khuẩn S mutans cũng đã

được đưa vào nước súc miệng để phòng ngừa và tiêu diệt nhiễm vi khuẩn nàytrong dự phòng bệnh sâu răng ở Brazil [72]

Về nhiễm trùng đường tiêu hóa bao gồm các bệnh lý dạ dày – tá tràng

do tác nhân gây bệnh dạ dày tá tràng như H pylori; hoặc bệnh tiêu chảy do vi rút và vi khuẩn đường ruột như E coli, rotavirus [98]; hoặc bệnh thương hàn

do nhiễm Salmonella typhi; hoặc nhiễm nấm Candida albicans ở miệng IgY

đã được chế tạo chống lại hàng loạt tác nhân gây bệnh nêu trên [74] Sarker

và cộng sự ở Bangladesh đã chứng minh được hiệu quả điều trị rất tốt của IgYkháng rotavirus ở bệnh nhi bị bệnh tiêu chảy do nhiễm rotavirus [99] Với

bệnh tiêu chảy do E coli ở trẻ em Brazil, Amaral và cộng sự đã chứng minh được hiệu quả trị liệu của IgY kháng E coli [100] Đối với nấm Candida

albicans, một loại nấm nhiễm cơ hội ở niêm mạc miệng của bệnh nhân sau khi chúng đã bám chặt vào, IgY kháng C albicans đã có hiệu quả đáng kể

trong việc làm giảm sự bám dính của nấm này trên tế bào niêm mạc miệng

của bệnh nhân Nhìn chung, IgY kháng C albicans là ứng viên tốt trong trị liệu miễn dịch dự phòng và thậm chí có thể sử dụng trong điều trị nấm C albicans dưới những điều kiện thích hợp cho phép [101].

Đối với trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa), sự đề kháng

với kháng sinh giữa các chủng vi khuẩn này trên bệnh nhân xơ hóa phổi ngàycàng gia tăng đáng kể Đó là một trong những lý do mà Bộ Y tế Thụy Điển đã

cho phép sử dụng IgY kháng P aeruginosa cho các bệnh nhân mắc chứng xơ

hóa phổi xúc họng để dự phòng nhiễm vi khuẩn này, đặc biệt là dự phòngnhiễm khuẩn bệnh viện do trực khuẩn mủ xanh cho các bệnh nhân này và

hiệu quả của IgY kháng P aeruginosa cũng đã được chứng minh [72].

Đối với Propionibacterium acnes thường gây mụn trứng cá ở da mặt,

lưng và ngực chủ yếu ở nam giới, Selvan và cộng sự (2012) đã sản xuất được

IgY đặc hiệu P acnes được tìm thấy từ những bệnh nhân viêm da [102].

Riêng về bệnh viêm loét dạ dày – tá tràng do nhiễm H pylori, do phác

đồ điều trị theo khuyến cáo của Hội nghị Đồng thuận Maastricht III và IV đã

bị đề kháng với thuốc kháng sinh rất nhiều, từ đó đã thúc đẩy các nhà khoahọc tiến hành nhiều nghiên cứu với mong muốn tìm ra giải pháp thay thế chothuốc kháng sinh đang bị kháng thuốc hiện nay trong điều trị bệnh viêm loét

dạ dày – tá tràng có nhiễm H pylori

Nghiên cứu chế tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu với vi khuẩn H pylori hoặc các protein tiết ra từ vi khuẩn này đã được tiến hành [103], [104].

Ví dụ như sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu với protein hoạt hóa bạch

cầu đa nhân trung tính được tiết ra từ H pylori bởi Iankov và cộng sự (2012)

[103] Nhưng có lẽ do giá thành sản xuất và xin cấp phép quá đắt cho nên đến

nay vẫn chưa có kháng thể đơn dòng đặc hiệu với vi khuẩn H pylori được

đưa vào sử dụng trên thế giới Trong khi đó, nghiên cứu chế tạo IgY kháng vi

khuẩn H pylori gây bệnh trên in vitro lẫn in vivo đã chứng minh phần nào hiệu quả của IgY kháng H pylori, đặc biệt là IgY kháng urease của H pylori [79], [105], [106], [107], [108] IgY kháng urease của H pylori đã được các

tác giả người Nhật cho vào sữa chua (yogurt) để dự phòng cho người chưa

nhiễm và điều trị cho các bệnh nhân đã nhiễm vi khuẩn H pylori Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự giảm đáng kể có ý nghĩa thống kê của H pylori

trong nhóm nghiên cứu so với nhóm chứng [23]

Tóm lại, miễn dịch thụ động bằng đường uống bởi kháng thể đặc hiệuIgY chống lại các tác nhân gây bệnh ở dạ dày và ruột của cả người lẫn độngvật hiện đang là đích đến khá hấp dẫn đối với những nhà nghiên cứu trên toànthế giới trong đó có Việt Nam

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mẫu sinh thiết

Các mẫu sinh thiết niêm mạc dạ dày thu được qua nội soi dạ dày đượclấy ở niêm mạc hang vị trong phạm vi cách môn vị nhỏ hơn hoặc bằng 4cmcủa 18 bệnh nhân có những biểu hiện lâm sàng về bệnh lý viêm dạ dày mạnhoặc loét dạ dày tá tràng chưa được điều trị với thuốc kháng sinh hoặc cácthuốc điều trị dạ dày và có chỉ định nội soi dạ dày tá tràng tại Phòng khámNội soi tiêu hóa, Khoa Khám bệnh, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y

được sử dụng để phân lập vi khuẩn Helicobacter pylori.

2.1.2 Động vật thí nghiệm

2.1.2.1 Gà mái

Gà mái được sử dụng làm động vật gây miễn dịch tạo kháng thể IgY:

12 gà mái giống Lương Phượng, cân nặng từ 1,9 đến 2,1kg ở độ tuổi sắp đẻtrứng và cùng lứa Gà do Ban Chăn nuôi động vật thí nghiệm, Phòng trang bị

và Vật tư kỹ thuật, Học viện Quân y cung cấp

Gà được nuôi trong điều kiện chiếu sáng tự nhiên, cung cấp dư thừathức ăn và nước uống Hàng ngày, gà được theo dõi tình trạng sức khoẻ cũngnhư tình hình đẻ trứng Trứng gà được thu hoạch hàng ngày và trên mỗi quảtrứng đều được ghi số lô và ngày đẻ trứng Trứng gà ngay sau khi thu nhậnđược bảo quản ở 4°C liên tục cho đến khi sử dụng

2.1.2.2 Chuột nhắt trắng

Chuột nhắt trắng được dùng để nghiên cứu khả năng dự phòng nhiễm

H pylori của chế phẩm IgY kháng urease: 28 con chuột nhắt trắng đực, dòng

Swiss, cân nặng từ 16 - 18g, khoẻ mạnh do Ban Chăn nuôi động vật thí nghiệm,Phòng trang bị và Vật tư kỹ thuật, Học viện Quân y cung cấp

+ Sodium Bisulfite 0,1g+ Yeast Extract 2g+ Demineralized water 1.000ml)

- Bộ nhuộm Gram

- Thuốc thử TMPD (TMPD 0,1%: Phenylenediamine)

N,N,N’,N’-Tetramethyl-p H2O2 30% (hydrogen peroxide)

- Các hóa chất để tạo môi trường Urea Broth:

+ Urea 20g+ Dipotassium phosphate 9,5g+ Monopotassium phosphate 9,1g+ Yeast Extract 0,1g

+ Phenol Red 0,01g (Sigma, Mỹ)

2.1.3.2 Các hóa chất dùng để tạo kháng nguyên urease của H pylori, tách chiết tinh sạch, đánh giá và xác đinh hoạt tính IgY từ lòng đỏ trứng gà

- Tá chất Freund hoàn chỉnh và Freund không hoàn chỉnh (Sigma, Mỹ)

- Ammonium, Ammonium sulfate, Ammonium persulfate 10%

- Dung dịch đệm PBS (Phosphate buffer saline)

- Acrylamide, Bisacrylamide, Temed, Tris, SDS, SDS electrophoresisbuffer

- Thang protein chuẩn (Thermo Scientific, Mỹ)

- OPD, TMB, dung dịch Bradford, kháng thể kháng IgY gắn enzymepeoxidase (Sigma, Mỹ)

- Formaldehyde, Giemsa, Hematoxylin, Ethanol 98%, Potassium,Oxyde thủy ngân đỏ, Eosin Y, Glycerol, Methanol 50ml

- Và các hóa chất khác được cung cấp từ các hãng có uy tín như Sigma,Merck

2.1.3.3 Vật tư tiêu hao

2.1.4 Trang thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu

- Máy nội soi dạ dày tá tràng

- Dụng cụ lấy mẫu làm xét nghiệm định danh và định lượng vi khuẩn

- Máy đo độ đục chuẩn Mc-Farland (hãng BioMerieux, Pháp)

- Tủ nuôi cấy vi sinh (Shel Lab, Mỹ)

- Kính hiển vi có gắn máy ảnh

- Cân điện tử

- Máy khuấy từ

- Máy đo pH

- Máy ly tâm các cỡ (Henttich, Đức)

- Máy lắc Vortex (Satorius, Đức)

- Máy DTX 880 (Beckman Coulter, Đức)

- Hệ thống điện di protein Mini Protein II (Biorad, Mỹ)

- Hệ thống Western blot (Biorad, Mỹ)

- Hệ thống sắc ký trao đổi ion (Biorad, Mỹ)

- Dao sinh thiết mô, cố định mẫu làm tiêu bản giải phẫu bệnh lý

- Máy cắt, nhuộm tiêu bản giải phẫu bệnh lý

- Pipetman các loại

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp thực nghiệm trong phòngthí nghiệm và trên động vật với các bước nghiên cứu chính được trình bàytrong Hình 2.1

Mẫu sinh thiết

Đánh giá tác dụng dự phòng nhiễm H pylori

- Đánh giá tác dụng điều trị nhiễm H pylori

Đánh giá tác dụng dự phòng nhiễm H.

pylori

IgY kháng urease

Kết luận

37

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.2.1 Phân lập vi khuẩn và tách chiết urease của H pylori

2.2.1.1 Phân lập vi khuẩn H pylori từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân

viêm loét dạ dày – tá tràng

- Các mẫu sinh thiết niêm mạc hang vị qua nội soi dạ dày của bệnh

nhân bị bệnh viêm dạ dày mạn và loét dạ dày tá tràng được cung cấp từ Phòng

khám nội soi tiêu hóa, Bệnh viện 103, Học viện Quân y, được bảo quản trong

ống nghiệm chứa BHI broth vô trùng và được vận chuyển về phòng thí

nghiệm nuôi cấy vi sinh của Bộ môn Khoa Vi sinh Y học, Bệnh viện Quân y

103, Học viện Quân y trong vòng 2 giờ để phân lập H pylori (các mẫu bệnh

+ Đặt túi trong tủ nuôi cấy vi sinh, nhiệt độ nuôi cấy 37oC

- Vi khuẩn H pylori phân lập được sẽ được nhuộm Gram và làm các

phản ứng sinh hóa như oxidase, catalase và urease [24]

Các tiêu chuẩn để xác định H pylori:

- Mọc trên môi trường phân lập trong điều kiện vi hiếu khí

- Khuẩn lạc nhỏ, đường kính 0,5 – 1mm, tròn xám trong

- Hình cong xoắn đặc trưng trên tiêu bản nhuộm Gram

- Dương tính với các thử nghiệm: oxidase, catalase và urease [24].

2.2.1.2 Nuôi cấy tăng sinh H pylori và tách chiết urease từ dịch nuôi cấy

Sau nuôi cấy, xác định vi khuẩn H pylori và chọn ra 3 chủng H pylori

có hoạt tính urease mạnh nhất Ba chủng H pylori được chọn sẽ được tăng

sinh trong môi trường Brucella broth (Neogen Corporation, Mỹ) trong tủ ấm,nhiệt độ 37oC, lắc liên tục 75 vòng/phút trong 72 giờ (Suzuki và cộng sự(2004)

Sau khi nuôi cấy H pylori, urease được tách chiết từ dịch nuôi cấy

bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate 50% độ bão hòa Sảnphẩm kết tủa được:

- Thẩm tích loại muối;

- Xác định hoạt tính urease;

- Xác định độ tinh sạch và kích thước

Sau mỗi bước tách chiết, sản phẩm urease thu được đều được:

- Xác định hoạt tính urease (theo phương pháp của Icatlo và cộng sự(1998) và Suzuki và cộng sự (2004)), xác định hoạt tính urease theo nguyên

lý urease thủy phân urea thành ammonia, tạo môi trường kiềm và chuyển chỉthị màu đỏ phenol trong môi trường phản ứng thành màu hồng cánh sen có độ

điều kiện biến tính, phân tử lượng urease của vi khuẩn H pylori sẽ được xác

định bằng cách lập đồ thị đường chuẩn biểu hiện sự tương quan giữa phân tửlượng protein chuẩn và khoảng di chuyển của chúng Phương trình đường

chuẩn được xác lập với protein chuẩn được sử dụng có phân tử lượng từ 10 –120kDa (Thermo Scientific, Mỹ) và khoảng di chuyển của protein chuẩn trênđiện di đồ Trong đó, trục tung là Ln(phân tử lượng của protein chuẩn) và trụchoành là khoảng di chuyển của protein chuẩn Từ khoảng di chuyển của

urease của vi khuẩn H pylori trên điện di đồ, bằng phương trình đường chuẩn phân tử lượng của urease của vi khuẩn H pylori sẽ được xác định (Lê Thị Phú

và cộng sự (2007))

2.2.2 Chế tạo IgY kháng urease

2.2.2.1 Tạo kháng nguyên và gây miễn dịch cho gà mái

Tạo kháng nguyên và gây miễn dịch cho gà được thực hiện dựa theoquy trình của các tác giả Schade R và cộng sự (1996), Đỗ Minh Trung vàcộng sự (2010), Hoàng Trung Kiên và cộng sự (2013)

b) Gây miễn dịch cho gà mái

Huyền dịch kháng nguyên urease tạo được, được gây miễn dịch cho gàmái bằng cách tiêm vào dưới da trước cơ ngực lớn theo quy trình tiêm nhiềumũi nhắc lại

Gà mái gây miễn dịch được chia thành 3 lô tương ứng với 3 nồng độkháng nguyên urease được khảo sát:

- Lô 1 (3 gà mái): nồng độ 250µg/ml/gà/lần tiêm/5 lần tiêm

- Lô 2 (3 gà mái): nồng độ 500µg/ml/gà/lần tiêm/5 lần tiêm

- Lô 3 (3 gà mái): nồng độ 750µg/ml/gà/lần tiêm/5 lần tiêm