QUY TRÌNH PHÂN LẬP MẪU BỆNH PHẨM CÚM LỢN TỪ THỰC ĐỊA

Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng.Bước 2: Loại bỏ môi trường đang nuôi: Mục đích: loại bỏ tế bào chết Cách tiến hành: Lắc nhẹ chai nuôi.. Cách tiến hành: Dùng pipet hút 1ml Trypsin cho

QUY TRÌNH PHÂN LẬP MẪU BỆNH PHẨM CÚM LỢN TỪ THỰC ĐỊA

1 Trypsin tế bào MDCK ra đĩa 24 giếng

1.1.Nguyên vật liệu:

a.Tế bào: Tế bào MDCK được nuôi cấy sau 3 ngày Tế bào đã phát triển,

tỉ lệ bám đáy 95 - 100%

b Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:

MEM1x:

Thành phần:

NaHCO3……… 2,2g MEM bột…… 9,53g Gentamycin……… 50µg Nước cất vô trùng vừa đủ 1 lít

MEM 10% FBS

Thành phần:

MEM1x……….100ml FBS……….10ml Hepes 1M……… 2,5 ml

PBS

-Thành phần:

PBS bột ……… 9,55 gam

Nước cất vô trùng vừa đủ …….1 lít

Trypsin – EDTA

10ml trypsin EDTA / ống ly tâm 15ml

c Dụng cụ an toàn sinh học

Mũ, quần áo, khẩu trang, găng tay Chai xịt cồn 700 .

d Dụng cụ hấp, sấy:

e Máy móc, thiết bị

9 Kính hiển vi soi ngược 01

4.2.Các bước thực hiện

Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng

Vô trùng Cabinet trong 30-45 phút

Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng.

Bước 2: Loại bỏ môi trường đang nuôi:

Mục đích: loại bỏ tế bào chết

Cách tiến hành:

Lắc nhẹ chai nuôi Dùng pipet 5ml hút bỏ môi trường.

Bước 3: Rửa

PBS-Mục đích: loại bỏ tế bào chết, huyết thanh và môi trường còn sót lại

Cách tiến hành:

Thêm vào bình nuôi 5ml PBS- vào chai nuôi T25

Rửa tế bào 2 lần với PBS-

Bước 4: Trypsin tế bào

Mục đích: tách tế bào ra khỏi đáy bình

Cách tiến hành:

Dùng pipet hút 1ml Trypsin cho vào mặt chai không có tế bào, nghiêng chai nhẹ nhàng để các tế bào đồng pha cùng tách nhau

Quan sát tế bào sau khi trypsin dưới kính hiển vi nếu tế bào bắt đầu co tròn lại, tách rời nhau thì tiến hành dừng trypsin

Bước 5: Trung hòa trypsin

Mục đích: Dừng quá trình trypsin

Cách tiến hành:

Vỗ mạnh chai hoặc đập chai nuôi để các tế bào tách nhau hoàn toàn (tránh làm môi trường bắn lên thành bình)

Dùng pipet hút 3ml môi trường MEM10% cho vào chai nuôi để trung hòa trypsin

Dùng pipet đảo đều môi trường, tưới đều lên mặt tế bào bám đáy, lắc đều nhiều lần để bong hết các tế bào bám dính đáy chai

Chuyển hết huyễn dịch vào ống fancol 15ml Đậy nắp, Bao dán paraffin, lắc nhẹ, đem ly tâm

Bước 6: Ly tâm và đánh tan cặn

Mục đích: thu cặn tế bào

Cách tiến hành:

Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700vòng/phút trong 10 phút Dùng pipet hút hết dung dịch ở phía trên, giữ lại cặn tế bào

Hút 4ml môi trường MEM10% cho vào ống, dùng pipet đảo đều hoặc rà

đáy ống vào mặt cabinet để đánh tan hoàn toàn cặn tế bào.

Bước 7: Đếm tế bào

Mục đích: xác định lượng tế bào có trong 1ml huyễn dịch

Cách tiến hành:

Pha loãng tế bào 10 lần với MEM10% : Hút 900µl môi trường MEM10% cho vào ống eppendorf Cho vào 100µl huyễn dịch tế bào vào trộn đều

Pha loãng huyễn dịch tế bào với thuốc nhuộm trypan blue theo hệ số 2: cho vào ống eppendorf 100µl huyễn dịch tế bào vừa pha loãng 10 lần với 100µl trypan blue

Dùng pipet hút 1 lượng huyễn dịch tế bào sau khi nhuộm nhỏ từ từ vào buồng đếm tế bào

Đếm sô tế bào trên buồng đếm:

Đếm tế bào ở 4 góc, trong mỗi góc có 16 ô vuông nhỏ, đếm số tế bào nằm trong khung 16 ô vuông nhỏ

Đếm từng tế bào riêng lẻ trong đám tế bào

Đếm theo hình zic zắc

Đếm các tế bào có kích thước tương đồng nhau

Không đếm các tế bào chết bắt màu xanh, chỉ đếm các tế bào còn sống

Ước lượng số tế bào trong 1ml:

số tế bào/1ml = (số tế bào đếm được trong 4góc/4 )x 2 x độ pha loãng tế bào x

104

Ra đĩa 24 giếng với mật độ 2.105 cell/giếng

Bước 10: Ra đĩa nuôi

Mục đích: Tiếp tục nuôi tế bào, để tế bào nhân lên

Cách tiến hành:

Ra đĩa với mật độ 2.105 cell/giếng

Đổ huyễn dịch tế bào đã pha loãng ra máng Dùng pipet đa kênh đảo đều trước khi cho vào các giếng

Dùng pipet đa kênh hút huyễn dịch tế bào đã pha loãng MEM10% cho vào mỗi giếng 1ml

Quan sát trên kính hiển vi soi ngược sau khi ra đĩa

Bước 11: Theo dõi sự phát triển của tế bào

Nuôi tế bào trong tủ ấm 370C, 5% CO2

Bước 12: Vệ sinh Cabinet sau khi sử dụng.

2 Phân lập mẫu bệnh phẩm

2.1 Xử lý mẫu bệnh phẩm từ thực địa

Môi trường bảo quản mẫu VTM (bảo quản ở -300C, đông tan bằng máy waterbarth) được điều chỉnh pH bằng NaOH cho đến khi pH môi trường từ 7-7,5

là được

Chia môi trường bảo quản vào các ống, mỗi ống 1ml Bảo quản ở 40C

Mẫu dịch ngoáy mũi được vortex đều, xếp theo thứ tự trên khay.

2.2 Quy trình phân lập

a Nguyên vật liệu

Tế bào MDCK được nuôi cấy ở 12 giếng trên đĩa 24 giếng Sau 24 giờ, tế bào bám đáy 100%, tiến hành phân lập

Type 200µl có lọc

Pipet 200µl, pipet đa kênh

Khay để đựng môi trường

b Môi trường hóa chất

MEM1x có Hepes

MEM có Hepes có bổ sung TPCK-trypsin đảm bảo 2µg TPCK-trypsin/ 1ml môi trường

c Các bước tiến hành:

Bước 1: Chuẩn bị Cabinet

Bật đèn tím vô trùng 30-60 phút

Bước 2: Xử lý mẫu Swab

Vortex mẫu, xếp mẫu theo thứ tự

Ghi kí hiệu mẫu trên các giếng đã nuôi cấy tế bào

Bước 3: Rửa tế bào

Đổ bỏ môi trường nuôi cấy trong các giếng Đổ dứt khoát tránh làm

vương rớt môi trường ra đĩa

Dùng pipet đa kênh cho vào mỗi giếng 1ml môi trường MEM1x Nên cho 200µl môi trường vào tất cả các giếng, sau đó mới bổ sung thêm môi trường sao cho mỗi giếng 1ml

Tiến hành rửa tế bào 2 lần.

Bước 4 : Gây nhiễm virus

Sau khi rửa tế bào lần 2, bổ sung vào mỗi giếng 200µl mẫu Swab theo đúng thứ tự đã ghi trên đĩa Mỗi một mẫu Swab sử dụng một đầu tube có lọc riêng

Ủ trong tủ ấm 370C, 5% CO2 trong 1 giờ

Bước 5: Bổ sung môi trường nuôi cấy

Bổ sung thêm vào mỗi giếng 800µl MEM có bổ sung TPCK-trypsin

Để tủ ấm 370C, 5% CO2 Sau 24 giờ tiến hành thay môi trường

Bước 6: Vệ sinh Cabinet sau khi sử dụng

Vệ sinh Cabinet Bật đèn tím 30 phút

3 Thay môi trường cho tế bào sau khi gây nhiễm

a Nguyên vật liệu

Type 1000µl có lọc, type 200µl có lọc

Pipet 1000, pipet đa kênh

Máng có nắp vô trùng

Khay đựng môi trường

b Môi trường, hóa chất

MEM1x có bổ sung Hepes và TPCK-trypsin

c Các bước thực hiện

Bước 1: Chuẩn bị cabinet

Vô trùng Cabinet trong 30 phút

Bước 2: Thay môi trường nuôi cấy

Dùng pipet 1000 rửa cặn bẩn từ mẫu swab bằng cách rửa xung quanh thành giếng, tránh rửa xuống đáy giếng, tránh làm bong tế bào

Hút bỏ hết môi trường đang nuôi trong các giếng

Bổ sung vào mỗi giếng 1ml môi trường đã chuẩn bị

Bước 3: Để tủ ấm 370C, 5% CO2 Theo dõi trong 3 ngày Đọc CPE.

4 Đọc kết quả CPE

Giếng (+) : tế bào chết co tròn thành từng cụm nổi lên trên Giếng (-) :