Kỹ thuật lấy mẫu Bênh Phẩm chẩn đoán 1 số bệnh trên người

- Bệnh nhân ngồi hơi ngửa đầu - Đưa catheter vào mũi theo hướng song song với vòm miệng, độ sâu bằng ẵ đường nối mũi, tai - Bật máy hút chân không - Từ từ đưa catheter ra ngoài vừa đua r

Kỹ thuật lấy bệnh phẩm xét nghiệm chẩn đoán vi rút

Mục tiêu học tập: Sau khi học xong bài này, học viên có khả năng:

1 Nắm được các kỹ thuật lấy bệnh phẩm chẩn đoán vi rút

2 Thực hiện được kỹ thuật lấy bệnh phẩm đường hô hấp để chẩn đoán sinh học phân tử và phân lập vi rút

3 Thực hiện được kỹ thuật lấy máu toàn phần và lấy máu tách huyết thanh

4 Thực hiện được kỹ thuật đóng gói và vận chuyển đúng cho từng loại bệnh phẩm

1 Giới thiệu chung

Trong công tác xét nghiệm xác định tác nhân vi rút gây bệnh trong phòng thí nghiệm thì công việc lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm

đúng qui định là vô cùng quan trọng Công việc này thực hiện tốt thì thời gian xác

định được căn nguyên sẽ nhanh chóng và kết quả có độ tin cậy cao Chúng tôi xin giới thiệu các qui trình chi tiết trong công việc lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm để cùng nhau thực hiện

1.1 Trang bị bảo hộ cá nhân

Tuỳ từng loại bệnh phẩm và mức độ nguy hiểm, mức độ lây của bệnh mà có các quy định bảo hộ cá nhân như khẩu trang (khẩu trang phẫu thuật, N95, N/P/R - 100), găng tay, quần, áo choàng, kính, tạp dề, mũ, ủng hoặc bao giày

2.2 Các thông tin tối thiểu cần thiết của mẫu bệnh phẩm

Tất cả các tube đựng mẫu bệnh phẩm phải được ghi họ tên, tuổi, địa chỉ, loại mẫu bệnh phẩm hoặc phải được mã hoá, ghi thông tin đầy đủ trên phiếu điều tra Phiếu điều tra được thiết kế tuỳ theo từng loại bệnh và tuỳ theo những thông tin cần thu thập, nhưng tối thiểu bao gồm các thông tin:

- Thông tin về hành chính: Họ tên, tuổi, địa chỉ

- Thông tin về bệnh, dịch tễ: Ngày khởi bệnh, ngày vào viện, một số thông tin

về tiền sử phơi nhiễm, một số triệu chứng hội chứng nếu cần thiết

- Thông tin về mẫu bệnh phẩm: Ngày thu thập mẫu, loại bệnh phẩm

Nếu dịch xảy ra đột ngột chưa có phiếu điều tra chính thức thì cần phải nghi thông tin tối thiểu như họ và tên, tuổi, địa chỉ, ngày khởi bệnh, triệu chứng lâm sàng, ngày lấy mẫu

2 Lấy bệnh phẩm xét nghiệm

2.1 Dịch não tủy

* Lấy mẫu: Mẫu dịch não tuỷ do các bác sĩ lâm sàng có kinh nghiệm lấy mẫu,

hứng trực tiếp 1,5 - 2 ml dịch não tuỷ vào ống nghiệm Chia dịch não tuỷ vào 3 tube riêng biệt có nắp xoáy

* Bảo quản và vận chuyển mẫu: Dịch não tuỷ được bảo quản 40C vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt trong vòng 24 giờ Nếu không thể vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm, phải bảo quản dịch não tuỷ ở nhiệt độ âm sâu, tối thiểu - 20oC, dịch não tuỷ dùng cho phân lập vi rút bảo quản tốt nhất - 800C,

đá khô hoặc nitơ lỏng

2.2 Mẫu bệnh phẩm đường hô hấp

Tuỳ vào vị trí tổn thương, mẫu bệnh phẩm được lấy ở vị trí đường hô hấp trên hoặc đường hô hấp dưới

Bệnh phẩm đường hô hấp trên: dịch mũi, dịch hầu họng, dịch súc họng, dịch rửa mũi, dịch tỵ hầu, dịch mũi họng

Bệnh phẩm đường hô hấp dưới: dịch phế quản, dịch phế nang

2.2.1 Dụng cụ và môi trường:

Môi truờng vận chuyển: có thể sử dụng một trong các môi trường MEM, DMEM, M199, các môi truờng này cho thêm kháng sinh Penicilline, streptomicine

và fungizone, môi trường được chia 2 - 3 ml cho vào tube có nắp xoáy, bảo quản

40C trong vòng 4 tuần

Dụng cụ lấy mẫu và bảo quản mẫu:

- Lọ, tube đựng mẫu có sẵn môi trường

- Quần áo bảo hộ

- Phiếu điều tra

Lọ đựng mẫu Dụng cụ lấy dịch tỵ hầu

Hình 1: Các loại dụng cụ để lấy và đựng bệnh phẩm

2.2.2 Cách lấy bệnh phẩm

Dịch mũi

- Đặt bệnh nhân ngồi thoải mái, hơi ngửa cổ ra sau

- Đưa tăm bông vào mũi theo một đường song song

với vòm miệng

- Giữ tại đó vài giây

- Rút nhẹ nhàng xoáy tròn tăm bông trong quá

trình rút ra

- Sử dụng tăm bông khác để lấy mẫu mũi bên kia

- Cho cả 2 tăm bông vào lọ đựng mẫu đã có sẵn môi

trường vận chuyển

- Bẻ đầu tăm bông thừa đạy chặt nắp

- Bệnh nhân ngồi hơi ngửa đầu

- Đưa catheter vào mũi theo hướng song song với vòm miệng, độ sâu bằng ẵ

đường nối mũi, tai

- Bật máy hút chân không

- Từ từ đưa catheter ra ngoài vừa đua ra vừa xoáy

- Tương tự như vậy với mũi bên kia, sử dụng chung một catheter

- Hút 3 ml dung dịch vận chuyển để rửa catheter, chia mẫu vào tube đựng mẫu

Bệnh phẩm đường hô hấp dưới:

* Dịch khí phế nang, phế quản

Chỉ những người có kinh nghiệm mới được lấy bệnh phẩm này, có thể lấy dịch phế nang, phế quản qua ống nội khí quản hoặc ống mở khí quản trong trường hợp bệnh nhân thở máy

2.2.3 Bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm đường hô hấp

Mẫu bệnh phẩm đường hô hấp được bảo quản 40C chuyển về phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt Trong trường hợp mẫu bệnh phẩm nghi do các tác nhân gây bệnh nguy hiểm như SARS, cúm A H5N1 phải tuân thủ nghiêm ngặt quy trình đóng gói, bảo quản và vận chuyển mẫu nghi ngờ chứa các tác nhân gây bệnh nguy hiểm (mô tả ở phần đóng gói, bảo quản vận chuyển mẫu bệnh phẩm do tác nhân nguy hiểm)

This image cannot currently be display ed.

Trong trường hợp không thể vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm thì phải bảo quản mẫu bệnh phẩm ở nhiệt độ - 80oC, đá khô hoặc nitơ lỏng

- Kim chích hoặc kim tiêm

2.3.2 Phương pháp lấy và bảo quản, vận chuyển bệnh phẩm

Bệnh phẩm là nốt phỏng hoặc vết loét: thường dùng cho chẩn đoán các tác nhân như thuỷ đậu, Herpes, bệnh chân tay miệng

- Dùng kim vô trùng chích thủng nốt phỏng

- Dùng tăm bông vô trùng thấm dịch chảy ra từ nốt phỏng Cố gắng lấy được càng nhiều dịch càng tốt

- Cho tăm bông trực tiếp vào môi trường vận chuyển vi rút, bảo quản lạnh

4oC trong quá trình vận chuyển

- Những tổn thương đã bị vỡ hoặc các vết loét cần phải miết đủ mạnh ở vùng gần bờ tổn thương để đảm bảo lấy được cả các tế bào bị bong ra, Các tế bào này chứa vi rút

Sinh thiết da: dùng cho chẩn đoán bệnh dại

Kỹ thuật này thường không áp dụng trong các vụ dịch Khi cần thiết, kỹ thuật này phải được tiến hành bởi những người có kinh nghiệm

2.4 Mẫu máu/huyết thanh

Bệnh phẩm máu có thể sử dụng cho phân lập tác nhân gây bệnh, huyết thanh

có thể sử dụng làm các phản ứng phát hiện vật liệu di truyền (ví dụ phản ứng PCR), phát hiện kháng thể, kháng nguyên

Đối với các phản ứng huyết thanh học thì tốt nhất lên lấy mẫu máu kép, mẫu máu trong giai đoạn cấp tính (máu 1) được thu thập trong những ngày đầu của bệnh, mẫu máu 2 thu thập trong giai đoạn hồi phục, thường sau bốn tuần

2.4.2 Lấy máu toàn phần: bắt buộc phải lấy máu tĩnh mạch

- Sử dụng bơm tiêm thông thường: garo tĩnh mạch cần lấy, sát trùng cồn, dùng bơm kim 5 - 10ml để lấy máu, người lớn lấy từ 2 đến 10ml máu, trẻ em lấy từ 2 đến 5ml máu, còn trẻ sơ sinh lấy từ 0,5 đến 2 ml máu Cho máu vào ống nghiệm đã có sẵn chất chống đông

- Dùng hệ thống hút chân không: Cắm kim lấy máu vào hệ thống nối với tube chân không Đưa kim vào tĩnh mạch, khi kim đã hoàn toàn nằm trong lòng tĩnh mạch nhanh chóng cắm hệ thống nối với tube chân không đã có sẵn EDTA, lấy từ 5

- 10 ml máu

- Trong trường hợp máu dùng cho phân lập vi rút, bảo quản 40C chuyển mẫu bệnh phẩm càng nhanh càng tốt về phòng thí nghiệm (trong vòng 24 giờ, nếu không thì phải bảo quản nhiệt độ âm tốt nhất là - 800C

2.4.3 Lấy mấu và tách huyết thanh

* Lấy máu tĩnh mạch

Lấy 5 - 10 ml máu tĩnh mạch

Cho máu vào tube không có chất chống đông, để máu đông tự nhiên ở nhiệt

độ thường khoảng 30 phút Sau đó, chuyển mẫu vào tủ lạnh 4 - 8oC trong ít nhất 1 -

2 giờ để cục máu đông co lại (có thể giữ mẫu ở nhiệt độ này từ 48 - 72 giờ) Nếu không có máy ly tâm, nên để mẫu ở nhiệt độ này từ 4- 6 tiếng cho cục máu đông co lại hoàn toàn Nếu có máy ly tâm, ly tâm mẫu máu ở tốc độ thấp 2.500 vòng/ phút/

10 phút chắt huyết thanh

* Lấy máu bằng ống mao dẫn

- Sát trùng cồn 700 vào đầu ngón tay, bóp nhẹ đầu ngón tay để cho máu dồn xuống;

- Dùng kim chích đầu ngón tay;

- Dùng ống mao dẫn đã đánh dấu sẵn mã hoá bệnh nhân đặt ngang để cho máu chảy dần vào ống mao dẫn;

- Để ống mao dẫn nằm ngang ở nhiệt độ phòng cho tạo cục máu đông, khi máu đã đônng dùng đèn cồn hàn kín hai đầu của ống mao dẫ;

- Cho ống mao dẫn vào ống nghiệm, bảo quản 40C chuyển về phòng thí nghiệm

* Lấy máu bằng giấy thấm

- Sát trùng cồn 700 vào đầu ngón tay, bóp nhẹ đầu ngón tay để cho máu dồn xuống;

- Dùng kim chích đầu ngón tay;

- Dùng giấy thấm đã đánh dấu sẵn mã hoá bệnh nhân thấm máu sao cho máu thấm đều 2 mặt của giấy thấm;

- Xếp giấy thấm theo phương thẳng đứng, để khô ở nhiệt độ thường, tránh để sát các giấy thấm với nhau Sau khi giấy thấm khô, cho giấy vào tube hoặc 1 túi nilon riêng biệt, bảo quản 40C chuyển về phòng thí nghiệm

2.5 Mẫu phân

Thu thập mẫu phân càng sớm càng tốt ngay sau khi xuất hiện bệnh Nếu có thể, thu thập mẫu phân hai đến ba lần trong các ngày khác nhau Mẫu phân rất có giá trị cho phân lập tác nhân gây bệnh như vi rút đường ruột, bệnh chân tay miệng,

vi rút Rota

Đối với trẻ sơ sinh, có thể dùng tăm bông vô khuẩn hoặc ống thông trực tràng đưa vào trực tràng để lấy phân

2.5.1 Dụng cụ

- Tube đựng mẫu sạch có nắp xoáy, khô và không thấm nước;

- Để vận chuyển mẫu bệnh phẩm lấy bằng tăm bông trực tràng cần dùng môi trường vận chuyển;

- Kéo nhẹ tăm bông ra, chú ý kiểm tra chắc chắn có mẫu phân thấm vào đầu tăm bông;

- Cho tăm bông vào trong tube đựng bệnh phẩm có chứa môi trường vận chuyển thích hợp;

- Bẻ phần que thừa, đậy chặt nắp, chú ý không làm que thừa chạm vào miệng tube đựng bệnh phẩm

2.5.3 Bảo quản và vận chuyển

Mẫu phân bảo quản ở 4- 8oC trong quá trình vận chuyển tới phòng thí nghiệm Nên chuyển càng sớm càng tốt tới phòng thí nghiệm, nếu không thì bảo quản -

200C Khi mẫu phân tới phòng thí nghiệm thì phải được xử lý ngay theo thường quy xét nghiệm của mỗi loại tác nhân gây bệnh

2.6 Mẫu nước tiểu

2.6.1 Dụng cụ

- Cốc nhựa 50 ml tiệt trùng có nắp đậy;

- Tube đựng mẫu có nắp xoáy;

- Gạc hoặc giấy thấm;

- Xà phòng và nước sạch (hoặc nước muối)

2.6.2 Phương pháp lấy mẫu

Để tránh nhiễm trùng, nên rửa bộ phận sinh dục ngoài trước bằng xà phòng và nước sạch Nếu không có xà phòng và nước sạch, có thể dùng nước muối thường Lau khô bộ phận sinh dục bằng giấy thấm trước khi lấy nước tiểu

Hướng dẫn bệnh nhân rõ ràng cách lấy nước tiểu giữa dòng bằng cách bỏ một

ít nước tiểu ban đầu, hứng bãi nước tiểu ở giữa Chú ý dặn bệnh nhân không được chạm tay, chân và bộ phận sinh dục ngoài vào mặt trong cốc

Sau khi lấy được nước tiểu đậy chặt nắp, bệnh phẩm thu thập được phải dùng pipét để chuyển mẫu nước tiểu sang tube đựng mẫu càng sớm càng tốt, tránh nhiễm trùng

Đối với trẻ sơ sinh và trẻ nam có thể dùng túi đựng nước tiểu để thu thập mẫu,

sử dụng pipét chuyển mẫu nước tiểu thu thập được vào tube đựng mẫu

2.6.3 Bảo quản và vận chuyển

Vận chuyển mẫu nước tiểu đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt Không

được làm đông băng mẫu nước tiểu, chỉ cần bảo quản ở 4 - 8oC

Chú ý: Phải đảm bảo chắc chắn tube đựng mẫu bệnh phẩm không thấm nước

và đậy chặt

3 Đóng gói và vận chuyển mẫu bệnh phẩm

3.1 Nguyên tắc

- Mẫu bệnh phẩm phải đựng trong tube có nắp xoáy, không dễ vỡ và không thấm nước;

- Mẫu bệnh phẩm phải được đóng gói ba lớp;

- Lớp thứ nhất phải là lớp không thấm nước;

- Sử dụng các chất liệu thấm nước để bao bọc bên ngoài ở tất cả các lớp: Bông thấm nước

- Mỗi hộp đựng mẫu để vận chuyển không quá 50 ml

3.2 Phương pháp đóng gói bệnh phẩm

* Lớp trong cùng:

- Tube chứa bệnh phẩm phải được xoáy chặt nắp, dùng giấy parafin hoặc băng dính được làm bằng oxít kẽm quấn quanh nắp;

- Bọc ra ngoài tube bệnh phẩm bằng một lớp giấy thấm;

- Một vài tube bệnh phẩm có thể để chung vào lớp hộp thứ hai

* Lớp thứ hai: Lớp thứ hai là một hộp chứa không thấm nước, lót bên trong là lớp giấy thấm có khả năng thấm hút dung dịch từ mẫu bệnh phẩm trong trường hợp tube đựng bệnh phẩm bị rò

- Hộp này cũng phải được đậy nắp chặt và quấn kín nắp như lớp trong cùng;

- Hộp thứ hai này cũng được bao ngoài bằng lớp giấy thấm;

- Có thể để một vài hộp lớp thứ hai chung vào hộp thứ ba;

* Lớp ngoài cùng: Lớp ngoài cùng có tác dụng bảo vệ lớp thứ hai khỏi các tác nhân từ bên ngoài như va chạm cơ học, nước trong quá trình vận chuyển;

- Lót bên trong hộp bằng giấy thấm ngăn cách lớp thứ hai và lớp ngoài cùng;

- Vặn chặt nắp hộp, dán kín

3.3 Bảo quản mẫu ở phòng thí nghiệm

Các mẫu cần được lưu giữ trong điều kiện tốt và khoa học để thuận lợi cho việc lấy mẫu kiểm tra - mẫu được để thứ tự trong các hộp đựng mẫu có số thứ tự

được ghi trên nắp hộp (có thể sử dụng hộp giấy hoặc hộp nhựa loại thiết kế cho 100 tube nhựa loại 1,5 ml hay 2 ml)

Cần có sổ theo dõi vị trí để mẫu (để ở tủ nào, ngăn nào ) để thuận tiện cho khi tìm kiếm

Câu hỏi lượng giá

1 Hãy nêu nguyên tắc cơ bản về an toàn sinh học khi tiếp xúc với các tác nhân gây bệnh (bảo hộ cá nhân, nguyên tắc đóng gói, dán nhẫn và vận chuyển các mẫu bệnh phẩm có nguy cơ gây nhiễm cao)

2 Trình bày các thông tin tối thiểu trong công tác thu thập bệnh phẩm xét nghiệm, vai trò của các thông tin này?

3 Trình bày cách lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm đường hô hấp (dịch mũi, dịch hầu họng, dịch tỵ hầu)

4 Trình bày cách lấy mẫu phân, bảo quản và vận chuyển đến phòng thí nghiệm

5 Trình bày cách lấy mẫu máu, huyết thanh, bảo quản và vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm dùng cho phân lập và chẩn đoán huyết thanh học

Tài liệu tham khảo

1 David M Knife, Peter M Howley (2001), Field Virology, Diagnostic Virology,

pp 493 - 452

2 H Lenneter, David A Lenneter, Evelyne T Lennetter (1995), Diagnostic

procedure for Viral, Rickettsial and Clamidial Infections, diagnosis by serologic

assay, pp 121 - 138

3 Lee Cheow Pheng, Zainudin Abdul Wahab, Rodani Jahis, Husnina Ibrahim (2004) Syndromic notification and laboratory investigation manual 2nd edition,

collection and handling specific speciments, pp 20 - 30

4 Piere Payment, Michel Trudel (1989) Manuel de techniques Virologiques,

Isolement et Idenfication des vi rỳt, pp 21 - 22

5 WHO, (2006), Rapid Respose for Avial and Pandemic Influenza training of trainers, Module 8- Specimens collection

Các Phương pháp cơ bản

để phân lập và định danh vi rút

Mục tiêu học tập: Sau khi học xong bài này, học viên có khả năng:

1 Trình bày được các đường lây truyền của một số vi rút gây bệnh ở người

2 Trình bày được vì sao mỗi loại căn nguyên vi rút lại lấy mỗi loại bệnh phẩm khác nhau

3 Biết được các phương pháp cơ bản để phân lập và định danh vi rút

1 Đại cương

Tuỳ từng loại vi rút mà đường lây truyền của vi rút vào cơ thể có khác nhau

Có loại vi rút lây nhiễm theo đường phân- miệng (vi rút đường ruột); Có loại vi rút lây nhiễm theo đường hô hấp như vi rút Cúm, vi rút hợp bào đường hô hấp, vi rút Sởi, Rubella ; Có loại vi rút lây nhiễm theo đường máu (vi rút viêm gan trừ vi rút viêm gan A, vi rút HIV ), Có loại vi rút lây nhiễm theo đường máu qua côn trùng tiết túc (vi rút viêm não Nhật Bản, vi rút Dengue ) Tuỳ vào từng loại vi rút, tuỳ vào đường lây truyền, tuỳ vào mục tiêu chẩn đoán và dựa vào cơ chế sinh bệnh mà

đưa ra phương pháp lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm cũng như lựa chọn phương pháp xét nghiệm phù hợp nhất để xác định căn nguyên nhanh nhất mà có độ tin cậy cao

2 Lấy mẫu và bệnh phẩm xét nghiệm

2.1 Thông tin thu thập mẫu

Thông tin tối thiểu bao gồm họ tên bệnh nhân, tuổi, địa chỉ (thôn, xã, huyện, tỉnh), ngày tiêm vacxin cuối cùng, ngày phát ban, ngày thu thập mẫu, loại mẫu, ngày nhận mẫu tại phòng thí nghiệm

2.2 Các loại mẫu dùng cho phân lập vi rút

- Dịch ngoáy họng: phân lập vi rút Cúm, vi rút Sởi, vi rút Rubella, vi rút hợp bào

đường hô hấp, vi rút Rhino

Đè lưỡi và dùng tăm bông miết mạnh xung quanh thành họng Cho tăm bông vào tube đã có sẵn môi trường vận chuyển vi rút

- Phân : phân lập vi rút đường ruột, vi rút Rota

+ Phân cục: lấy khoảng 4 gam phân (cục phân bằng đầu ngón tay cái) Dùng thìa gắn trên nắp nhựa, xúc cục phân và cho vào tube, vặn chặt nắp

+ Phân lỏng: Dùng bơm tiêm hút khoảng 5-10 ml, cho vào tube sạch, đậy chặt nắp

+ Sông trực tràng: Dùng Sonde nelaton lấy khoảng 5ml phân từ hậu môn cho vào tube sạch, đậy chặt nắp

- Máu toàn phần: phân lập vi rút Dengue

Dùng bơm tiêm lấy máu ven 5-10 ml, cho vào tube vô khuẩn, đậy chặt nắp

Để máu đông tự nhiên để tránh vỡ hồng cầu

- Dịch não tủy: phân lập vi rút VNNB và viêm não arbor

Bác sĩ điều trị lấy: lấy khoảng 5-10 ml DNT, cho vào tube vô khuẩn

- Dịch âm đạo, dịch mụn nước: Phân lập vi rút Herpes, vi rút thủy đậu, vi rút

đường ruột typ71, vi rút Coxsackie A16,

+ Dịch âm đạo: Bác sĩ chuyên khoa lấy

+ Dịch mụn nước: Dùng bơm tiêm hút dịch Nếu không hút được thì sau khi chọc nhẹ mụn nước, dùng tăm bông thấm dịch và cho vào tube đã có sẵn môi trường vận chuyển

- Tổ chức bệnh lý như não, nhu mô ruột: phân lập vi rút dại, vi rút VNNB,

2.3 Thời gian thu thập mẫu bệnh phẩm

Dựa vào cơ chế bệnh sinh của vi rút để xác định thời gian lấy mẫu bệnh phẩm cho phân lập vi rút hay xác định kháng thể

Thời gian thu thập mẫu để phân lập vi rút hoặc xác định ARN (ADN) của vi rút: Tùy thuộc vào từng loại vi rút, tuy nhiên, hầu hết các vi rút đều dễ dàng phân lập được nếu lấy mẫu ở giai đoạn sớm của bệnh sau ngày khởi phát Vi rút Dengue

và viêm não <= 3 ngày sau ngày khởi bệnh, vi rút Sởi và Rubella <=7 ngày, vi rút

đường ruột <=14 ngày, vi rút Cúm trong thời gian bệnh nhân viêm đường hô hấp

2.4 Bảo quản và vận chuyển mẫu xét nghiệm

Mỗi loại vi rút có nhiệt độ bảo quản khác nhau, tuỳ thuộc vào tính nhạy cảm với nhiệt độ mà có điều kiện bảo quản thích hợp để phân lập vi rút (như vi rút Cúm,

vi rút viêm não Nhật Bản ) Tuy nhiên, phần lớn các vi rút được bảo quản theo điều kiện nhiệt độ sau

- Bảo quản tại 40C: nếu mẫu được vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm hoặc lâu nhất trong vòng 3 ngày

- Bảo quản tại - 200C (tốt nhất là -800C) nếu chưa có điều kiện chuyển mẫu ngay và phải vận chuyển đến PTN trong điều kiện còn đông đá

3 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

3.1 Dụng cụ và thiét bị phòng thí nghiệm

- Dụng cụ, phương tiện máy móc tối thiểu cần thiết để phân lập vi rút: Máy

ly tâm, tủ ấm, tủ sấy, tủ ATSH

- Dụng cụ, phương tiện máy móc cho sinh học phân tử: Tủ an toàn sinh học, máy PCR, máy ly tâm cao tốc, máy chạy điện di, máy đọc gel

+ Tế bào thường trực: là dòng tế bào đã được thuần hóa (cấy truyền nhiều lần) và có khả năng giữ được trong phòng thí nghiệm trong thời gian dài Có nhiều các dòng tế bào thường trực khác nhau, mỗi dòng có khả năng nhạy cảm với từng nhóm vi rút Tế bào thường trực hiện nay được sử dụng phổ biến để phân lập vi rút

* Phương pháp thực hiện:

- Chuẩn bị tế bào một lớp: tế bào được trypssin hóa, pha loãng tế bào ở nồng

độ 105TB/1ml trong môi trường thích hợp có 10% huyết thanh bào thai Bê ủ chai tế bào ở nhiệt độ thích hợp cho đến khi tạo được tế bào 1 lớp khoảng 75% (thông thường khoảng 3 ngày)

- Gây nhiễm bệnh phẩm: Bệnh phẩm được xử lý với kháng sinh P/S nồng độ 100U/ml

Thay môi trường phát triển bằng môi trường duy trì có 2% Serum

Cho bệnh phẩm vào chai tế bào

ủ chai tế bào đã gây nhiễm ở nhiệt độ thích hợp

Theo dõi hủy hoại tế bào hàng ngày (CPE)

Chai tế bào có CPE>50% được cất tại -200C để xác định typ huyết thanh hoặc loại vi rút (Có loại vi rút không tạo CPE, cần xác định mù như vi rút Rubella,

vi rút arbor, vi rút dại trên một số loại tế bào)

Giải thích kết quả: xác định loại vi rút hay serotyp vi rút khi tế bào hoàn toàn bình thường do vi rút đã bị bất hoạt bởi kháng huyết thanh đặc hiệu vi rút, tế bào tự

do và phát triển bình thường tạo nên một lớp tế bào khỏe mạnh

3.3.2 Phương pháp ức chế ngưng kết hồng cầu (HI): xác định vi rút Cúm, vi rút Dengue, vi rút VNNB

3.3.3 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang: Xác định nhiều loại vi rút

3.3.4 Phương pháp sinh học phân tử sử dụng cặp mồi đặc hiệu

3.4 Phương pháp sinh học phân tử xác định vi rút

3.4.1 Phương pháp RT-PCR, xác định các vi rút có vật liệu di truyền là RNA từ các mẫu lâm sàng và mẫu phân lập

3.4.2 Phương pháp snPCR/Seq xác định các typ vi rút đường ruột từ mẫu lâm sàng

3.4.3 Phương pháp PCR xác định các vi rút có vật liệu di truyền là ADN từ các mẫu lâm sàng và mẫu phân lập: Vi rút viêm gan B, Herpes, Adeno 3.4.4 Phương pháp RT – PCR ứng dụng xác định tác nhân vi rút

4 Phân tích và nhận định kết quả

Kết quả dương tính khi:

Vi rút gây hủy hoại tế bào (một số ít vi rút không gây hủy hoại tế bào) Typ vi rút hoặc loại vi rút được xác định bằng một trong các phương pháp: phương pháp trung hòa trên nuôi cấy tế bào, phương pháp ức chế ngưng kết hồng cầu, IFA, sinh học phân tử (RT-PCR, PCR, Seq.),

Câu hỏi lượng giá

1 Vi rút nào lấy mẫu dịch ngoáy họng? Vi rút nào lấy mẫu phân, mẫu máu, mẫu dịch não tủy?

2 Các phương pháp phân lập vi rút

3 Phương pháp định danh vi rút

4 Phương pháp nào thực hiện thuận lợi nhất

Tài liệu tham khảo

1 Manuel de techniques virologiques, presses de L’universite’ du Que’bec,

xét nghiệm huyết thanh

chẩn đoán vi rút

Mục tiêu học tập: Sau khi học xong bài này, học viên có khả năng:

1 Trình bày được nguyên lý các kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh học

2 Thực hành được các kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh học

1 Giới thiệu chung

Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học là phương pháp dùng kháng nguyên mẫu (đã biết trước) để xác định hoặc định lượng kháng thể có mặt trong huyết thanh hoặc các dịch của cơ thể bệnh nhân Phương pháp huyết thanh học thường

được ứng dụng trong các lĩnh vực sau đây:

Chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng

Xác định sự có mặt của kháng thể IgM và hoặc động lực kháng thể IgG đối với một loại vi sinh vật nào đó trong huyết thanh hoặc chất dịch cơ thể

Nghiên cứu dịch tễ học của các bệnh nhiễm trùng

Điều tra tình hình nhiễm một loại vi sinh vật nào đó qua việc điều tra kháng thể trong huyết thanh của các mẫu nghiên cứu (người hoặc động vật truyền bệnh hay ổ chứa)

Nghiên cứu sự đáp ứng của cơ thể đối với kháng nguyên vi sinh vật

Thường dùng trong đánh giá hiệu lực đáp ứng miễn dịch của vắc xin

2 Lấy mẫu để chẩn đoán huyết thanh học

Cỏc kỹ thuật xỏc định IgM, lấy mỏu trong giai đoạn cấp tớnh và cú thể sử dụng một mẫu mỏu đơn nhưng đối với cỏc kỹ thuật xột nghiệm xỏc định IgG thỡ cần thiết phải lấy mấu mỏu kộp Mỏu 1 trong giai đoạn cấp thường trong vũng tuần thứ 1 – 2 của bệnh, mỏu 2 lấy trong thời kỳ lui bệnh, thường 10 ngày – 2 tuần sau khi lấy mỏu 1

2.1 Lấy mỏu tĩnh mạch

Dựng kim, xi lanh hoặc kim và týp chõn khụng lấy 5 ml mỏu tĩnh mạch, cú thể ly tõm ngay tỏch tế bào lấy huyết thanh hoặc trong trường hợp khụng cú mỏy ly tõm thỡ để týp nghiờng ở nhiệt độ phũng thớ nghiệm 30 phỳt – 1 giờ cho co cục mỏu đụng rồi chắt huyết thanh

2.2 Lấy mỏu đầu ngún tay

- Lấy mỏu bằng giấy thấm:

+ Dựng bỳt chỡ viết mó hoỏ (code) của bệnh nhõn lờn một đầu giấy thấm; + Lấy mỏu đầu ngún tay, dựng giấy thấm thấm đều 2 mặt;

+ Để giấy thấm khụ ở nơi thoỏng mỏt, trỏnh ỏnh sỏng mặt trời và cụn trựng, trỏnh xếp chồng lờn nhau;

+ Sau khi giấy khụ cho vào tỳi nilon, dỏn kớn miệng tỳi (1 mẫu cho vào 1 tỳi); + Bảo quản 40C, chuyển về PTN;

+ Giấy thấm thường chỉ phỏt hiện được IgG nờn phải lấy mỏu 2 lần

- Lấy mỏu bằng ống mao dẫn:

+ Ghi mó hoỏ của bệnh nhõn vào một đầu ống mao dẫn;

+ Lấy mỏu đầu ngún tay, để ngiờng ống mao dẫn cho mỏu chảy dần về đầu bờn kia;

+ Để ống mao dẫn nằm ngang ở nhiệt độ phũng 30 phỳt – 1 giờ cho co cục mỏu đụng;

+ Dựng đốn cồn để hàn kớn 2 đầu ống mao dẫn;

+ Bảo quản 40C, chuyển về phũng thớ nghiệm;

+ Ly tõm 2.500 vũng/10 phỳt chắt huyết thanh

2.3 Dịch nóo tuỷ

+ Ghi code hoỏ bệnh nhõn vào týp;

+ Sử dụng týp vụ trựng lấy khoảng 3 – 5 ml dịch nóo tuỷ;

+ Bảo quản lạnh 40C, chuyển về phũng thớ nghiệm

Chỳ ý: Tất cả cỏc mẫu bệnh phẩm phải được mó hoỏ và ghi code trờn týp, cỏc thụng tin mó hoỏ bao gồm

- Cỏc thụng tin hành chớnh: tờn, tuổi, giới, địa chỉ;

- Cỏc thụng tin về bệnh: ngày mắc bệnh, ngày khởi phỏt, ngày vào viện;

- Cỏc thụng tin về mẫu: ngày lấy mẫu, loại bệnh phẩm;

- Cỏc thụng tin dịch tễ liờn quan, tuỳ từng bệnh cú thụng tin chi tiết;

3 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

3.1 Phản ứng ức chế ng−ng kết hồng cầu (HI-heamagglutination inhibition

test)

* Chuẩn bị dụng cụ

- Tấm nhựa đáy tròn 96 giếng;

- Tube thuỷ tinh 12, sấy khô để tách huyết thanh và xử lý huyết thanh;

Lấy máu tĩnh mạch có chống đông, rửa hồng cầu bằng nước muối sinh lý, bảo quản hồng cầu trong dung dịch đệm phù hợp mà kháng nguyên vi rút có khả năng gây ngưng kết hồng cầu

+ Chuẩn độ kháng nguyên

Kháng nguyên được pha loãng bậc 2 trong tấm nhựa đáy tròn 96 giếng bằng dung dịch đệm thích hợp cho phản ứng ngưng kết hồng cầu Cho tiếp xúc với hồng cầu đã xử lý, ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ Hiệu giá kháng nguyên là nồng độ kháng nguyên pha loãng nhất còn có khả năng ngưng kết hồng cầu hoàn toàn

Cho tiếp xúc với kháng nguyên (thường pha 4 hoặc 8 đơn vị, tuỳ theo từng vi rỳt) ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ

Chuẩn độ lại hiệu giá kháng nguyên bằng cách từ nồng độ kháng nguyên cho vào phản ứng pha loãng tiếp bậc 2 để được 4 đơn vị, 2 đơn vị và 1 đơn vị kháng nguyên Cho hồng cầu ủ 30 phút

* ứng dụng

- Dùng trong chẩn đoán bệnh dựa vào việc xác định động lực kháng thể trong mẫu máu kép

- Trong điều tra dịch tễ huyết thanh học các bệnh nhiễm vi rỳt

- Dùng trong xác định và hoặc định týp huyết thanh vi rỳt: ở trường hợp này

đã biết trước kháng thể đặc hiệu, xác định vi rỳt hoặc định týp huyết thanh của vi rỳt phân lập được nhờ vào phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (vi rỳt viêm não Nhật Bản, Dengue, vi rỳt cúm, vi rỳt sởi)

3 2 Kỹ thuật trung hoà

3.2.1 Chuẩn bị dụng cụ

Kỹ thuật trung hoà trên tế bào

- Tube vô trùng để trung hoà huyết thanh - vi rút;

- Chai nuôi cấy tế bào, tấm nhựa nuôi cấy tế bào;

- Bể nhiệt;

- Thiết bị cần thiết nuôi cấy tế bào như tủ ấm CO2, hốt vô trùng, kính hiển vi lộn ngược;

- Môi trường, hoá chất cần thiết cho nuôi cấy tế bà;

Kỹ thuật trung hoà trên động vật

- Tube vô trùng để trung hoà huyết thanh - vi rút;

- Bơm kim tiêm vô trùng để tiêm truyền động vật;

- Cho tiếp xúc với kháng nguyên với một lượng tương đương ủ ở nhiệt độ 20 -

370C trong 30 - 60 phút Hỗn dịch vi rút, kháng thể này có thể đem tiêm truyền trên

động vật thí nghiệm (thường là chuột) hoặc gây nhiễm trên tế bào nhạy cảm với từng loại vi rút

- Sau vài ngày (tuỳ thuộc vào tính chất gây huỷ hoại tế bào của từng loại vi rút hoặc thời gian gây bệnh) quan sát thấy các triệu chứng lâm sàng của động vật hoặc hiện tượng huỷ hoại tế bào

3.2.3 Nhận định kết quả

Dựa vào các dấu hiệu bệnh của động vật hoặc hiện tượng huỷ hoại tế bào mà xác định, định týp vi rút hoặc biết hiệu giá kháng thể trung hoà

3.3 Kỹ thuật trung hoà trên động vật

Dùng để xác định và định týp vi rút ví dụ như vi rút viêm não Nhật Bản, vi rút Dengue, dại Các vi rút này khi tiêm vào não chuột sẽ gây hiện tượng liệt chuột, khi có kháng thể đặc hiệu (đã biết trước) trung hoà vi rút thì chuột được tiêm hỗn dịch kháng nguyên - kháng thể sẽ hoàn toàn khoẻ mạnh Do vậy ta có thể xác định,

định týp được vi rút

Một ứng dụng khá phổ biến của kỹ thuật này dùng để xác định hiệu giá kháng thể, đặc biệt trong việc đánh giá hiệu lực bảo vệ của vắc xin Người ta gây miễn dịch cho chuột kháng nguyên pha loãng ở các nồng độ khác nhau (vaccine), đồng thời tiêm kháng nguyên mẫu chuẩn đủ liều gây miễn dịch cơ bản (thường là 2 liều), sau khi tiêm miễn dịch cơ bản khoảng 2 tuần người ta tiêm cho chuột một lượng vi rút cố định Quan sát sự biểu hiện bệnh của động vật theo nồng độ pha loãng của vaccine, so sánh với lô động vật tiêm kháng nguyên chuẩn mà có thể xác định được công hiệu của vaccine

3.4 Kỹ thuật trung hoà trên tế bào

* Định lượng hiệu giá kháng thể trung hoà trong huyết thanh;

- Pha loãng huyết thanh bậc 2 trong môi trường duy trì trên tấm nhựa nuôi cấy

tế bào;

- Trung hoà với vi rút với một lượng vi rút cố định, thường là 100 TCID/ 25 ul;

- Cho tế bào vào hỗn dịch vi rút - kháng thể ủ tế bào ở điều kiện nuôi cấy bình thường, thời gian tuỳ thuộc vào từng loại vi rút;

- Cần chuẩn độ lại hiệu giá vi rút cho vào phản ứng

* Đọc kết quả

- Đọc chứng dương: không thấy có hiện tượng huỷ hoại tế bào;

- Chứng âm: Tế bào bị huỷ hoại hoàn toàn;

- Chuẩn độ vi rút: đủ 100 TCID/ 25ul;

- Hiệu giá kháng thể trung hoà là hiệu giá kháng thể pha loãng nhất không gây hiện tuợng huỷ hoại tế bào;

- Xác định dương tính khi động lực kháng thể gấp 4 lần trong mẫu máu kép

TB bình thường tế bào huỷ hoại Hình 2: Sơ đồ phản ứng trung hoà trên tế bào

* Xác định và định týp vi rút: Kỹ thuật này thường dùng sau khi đã phân lập

được vi rút, trung hoà vi rút với kháng thể đã biết trước, từ đó xác định và định týp

vi rút;

Kỹ thuật tương tự như kỹ thuật trung hoà xác định hiệu giá kháng thể, nhưng ở

kỹ thuật này kháng thể mẫu đã biết trước không cần pha loãng;

3.5 Kỹ thuật trung hoà giảm đám hoại tử;

Kỹ thuật tương tự như trung hoà trên tế bào để xác định hiệu giá kháng thể, nhưng khác ở chỗ sau khi trung hoà vi rút - kháng thể, người ta gây nhiễm lên tế bào nuôi cấy 1 lớp rồi phủ lên tế bào lớp thạch hoặc methyl cellulose, sau một vài ngày tuỳ theo thời gian từng vi rút gây hoại tử tế bào, nhuộm tế bào với đỏ trung tính hoặc tím tinh thể, đếm đám hoại tử tế bào, so sánh sự giảm đám hoại tử tính

được ở các nồng độ pha loãng huyết thanh khác nhau với chứng vi rút mà tính được hiệu giá kháng thể trung hoà;

- Trong kiểm tra chất lượng vắc xin: kiểm định công hiệu của vắc xin

3.6 Kỹ thuật ức chế tạo đám huỳnh quang:

Kỹ thuật tương tự trung hoà giảm đám hoại tử, có một vài điểm khác nó được ứng dụng cho các vi rút không gây hiện tượng huỷ hoại tế bào, do vậy hệ thống phát hiện đám tế bào nhiễm vi rút (tương tự như đám hoại tử tế bào của các vi rút gây huỷ hoại tế bào) thường dùng là nhuộm với huỳnh quang hoặc nhuộm enzym -

peroxidase

3.7 Kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA)

Có rất nhiều kỹ thuật phát triển dựa trên nguyên lý của kỹ thuật gắn men (ELISA) dùng kháng nguyên, kháng thể hoặc kháng kháng thể phủ bản để tóm bắt kháng thể hoặc kháng nguyên, tiếp theo dùng hệ thống đánh dấu (cộng hợp là kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym), hệ thống phát hiện cơ chất tạo mầu Trong chẩn đoán bệnh người ta thường sử dụng các kỹ thuật sau:

* ELISA gián tiếp

Chuẩn bị dụng cụ:

- Pipét nhiều kênh, pipét man các loại

(2) Cho tiếp xúc với huyết thanh, kháng thể đặc hiệu có trong huyết thanh sẽ gắn với kháng nguyên đã gắn bản, các kháng thể không đặc hiệu sẽ bị loại bỏ qua bước rửa

(3) Cho tiếp xúc với cộng hợp (kháng kháng thể gắn enzym), cộng hợp thừa hoặc không gắn sẽ bị loại qua bước rửa

(4) Cho cơ chất lên màu

(5) Dừng phản ứng: bằng H2SO4 hoặc HCL tuỳ theo cơ chất sử dụng

Đọc kết quả: đọc bằng máy đọc ELISA, tuỳ thuộc cơ chất sử dụng

mà đọc ở bước sóng khác nhau Đối với cơ chất OPD đọc ở bước sóng 492nm; TMB

ở bước sóng 405 nm

Các nhà sản xuất sinh phẩm sẽ đưa ra tiêu chí đọc kết quả, dựa trên nguyên tắc

đọc OD chứng dương, chứng âm, ngưỡng (cut off) để nhận định mẫu dương tính, mẫu âm tính (trong trường hợp định tính) hoặc xác định hiệu giá kháng thể dựa vào thang chuẩn (trong trường hợp định lượng)

Định lượng kháng thể

Xác định mẫu huyết thanh dương tính trong chẩn đoán bệnh

3.8 Kỹ thuật MAC - ELISA phát hiện kháng thể kháng IgM

* Chuẩn bị dụng cụ:

- Pipét nhiều kênh, pipét man các loại

Hình 4: Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật miễn dịch gằn enzyme

* Các bước tiến hành:

Phủ bản kháng IgM người đặc hiệu chuỗi à

(1) Cho tiếp xúc với huyết thanh bệnh nhân, tóm bắt toàn bộ kháng thể IgM, các thành phần khác trong huyết thanh bị loại qua bước rửa

(2) Tiếp xúc với kháng nguyên đặc hiệu đã biết trước, kháng nguyên thừa hoặc không gắn (không có kháng thể đặc hiệu IgM ) bị loại bỏ qua bước rửa

(3) Tiếp xúc cộng hợp (kháng thể gắn Enzym) Rửa bản nhựa các cộng hợp thừa hoặc không gắn do không có kháng nguyên gắn ở bước trên sẽ bị loại

(4) Cơ chất tạo mầu

(5) Dừng phản ứng: bằng H2SO4 hoặc HCL tuỳ theo cơ chất sử dụng

* Đọc kết quả: Đọc bằng máy đọc ELISA, bước sóng tuỳ thuộc vào từng loại

cơ chất OPD ở bước sóng 492nm; TMB ở bước sóng 405nm

Các nhà sản xuất sinh phẩm sẽ đưa ra tiêu chí đọc kết quả, dựa trên nguyên tắc

đọc OD chứng dương, OD chứng âm, giá trị ngưỡng (cut off) để nhận định mẫu dương tính, mẫu âm tính

* ứng dụng

Kỹ thuật MAC-ELISA là kỹ thuật khá phổ biến trong chẩn đoán nhanh các bệnh nhiễm trùng ví dụ trong chẩn đoán vi rút Sởi, Rubella, Dengue, viêm não Nhật Bản…

* ưu điểm: Nhanh, nhạy, dễ thực hiện, có thể sử dụng một mẫu máu đơn để

chẩn đoán

* Nhược điểm: Giá thành còn khá cao đối với một số bộ sinh phẩm

3.9 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

3.9.1 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

* Chuẩn bị dụng cụ

- Kháng nguyên cần xác định có thể là vi khuẩn, vi khuẩn ký sinh nội bào,

vi rút nằm trong mô, nằm trong tế bào nuôi cấy một lớp hoặc là kháng nguyên tế bào được cố định vào lam kính

- Cho tiếp xúc với cộng hợp pha theo hiệu giá trong evan blue, ủ trong môi trường ẩm ở nhiệt độ thích hợp từ 30 phút - 1 giờ Trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, cộng hợp sử dụng chính là kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên của vi sinh vật được gắn với huỳnh quang

- Các cộng hợp thừa hoặc không gắn sẽ bị loại bỏ qua bước rửa

- Để khô lam kính ở nhiệt độ phòng, phủ glycerol, đặt lamen lên lam kính

* Đọc kết quả: đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang, tuỳ theo chất gắn huỳnh

quang mà đọc ở các bước sóng khác nhau

- Đọc chứng âm: không có hiện tượng phát quang

- Đọc chứng dương: có hiện tượng phát quang, tuỳ theo đặc tính của vi rút nằm trong nhân hay bào tương của tế bào, tuỳ theo kháng thể kháng lại protein nào của vi rút mà có phát quang đặc hiệu trong nhân hay bào tương của tế bào

- Phản ứng dương tính: có hiện tượng phát quang đặc hiệu giống như chứng dương

* ứng dụng:

- Xác định kháng nguyên của vi sinh vật trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng như mô, bệnh phẩm ngoáy họng

- Xác định, định týp vi sinh vật sau khi phân lập được

3.9.2 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

* Chuẩn bị dụng cụ

- Kháng nguyên cần xác định hoặc đã biết trước được cố định trên lam kính;

- Cho tiếp xúc với kháng thể thứ nhất đặc hiệu với kháng nguyên ủ 1 giờ trong môi trường ẩm, ở nhiệt độ thích hợp với từng loại kháng nguyên Rửa loại bỏ kháng thể thừa hoặc không tóm bắt.;

- Cho tiếp xúc với cộng hợp: Trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, cộng hợp (kháng thể đánh dấu huỳnh quang) chính là kháng thể thứ hai đặc hiệu với một loài động vật sản xuất ra kháng thể thứ nhất ví dụ như kháng thỏ, kháng cừu, kháng dê, kháng chuột Kháng thể này có thể đặc hiệu với chuỗi nặng, chuỗi nhẹ hay mảnh Fc của kháng thể loài;

- Để khô lam kính ở nhiệt độ phòng, phủ glycerol, đặt lamen lên lam kính

* Đọc kết quả: đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang Phản ứng dương tính khi

có hiện tượng phát quang Luôn luôn phải đọc chứng dương và chứng âm để so sánh loại trừ các trường hợp dương tính giả, âm tính giả

* ứng dụng:

- Xác định vi sinh vật trực tiếp từ mô bệnh phẩm

- Xác định, định týp vi sinh vật sau khi phân lập

- Xác định, chuẩn độ hiệu giá kháng thể đặc hiệu vi sinh vật trong huyết

thanh hoặc dịch cơ thể

Chú ý: Luôn luôn phải làm chứng dương và chứng âm để so sánh khi đọc kết quả

3.10 Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ

* Nguyên lý: Tương tự như kỹ thuật ELISA, thay vào hệ thống đánh dấu là

enzym thì hệ thống đánh dấu ở đây là chất phóng xạ

* ưu điểm: Nhanh, nhạy và rất đặc hiệu

* Các bước tiến hành;

Các protein kháng nguyên được điện di trên gel để phân tách riêng rẽ sau đó người ta dùng đòng điện chuyển protein kháng nguyên lên màng nitrocellulose Bước tiếp theo nhỏ huyết thanh lên màng nitrocellulose, kháng thể đặc hiệu có trong huyết thanh bệnh nhân sẽ kết hợp với kháng nguyên trên màng, các kháng thể không đặc hiệu sẽ bị loại bỏ qua bước rửa

Cho cộng hợp (kháng kháng thể gắn enzym) và hệ thống cơ chất lên màu, phản ứng dương tính khi vạch màu trùng với vị trí protein kháng nguyên trên màng nitrocellulose

* ứng dụng:

- Chẩn đoán HIV

- Trong chẩn đoán nhanh (quick test): HIV, viêm gan B, phát hiện HCG

C©u hái L−îng gi¸

1 Nguyªn lý cña chÈn ®o¸n huyÕt thanh häc, øng dông trong chÈn ®o¸n bÖnh vµ nghiªn cøu

2 Kü thuËt trung hoµ: nguyªn lý, c¸c b−íc thùc hiÖn chÝnh cña kü thuËt vµ øng dông

3 Kü thuËt øc chÕ ng−ng kÕt hång cÇu: nguyªn lý, øng dông

4 Kü thuËt ELISA: nguyªn lý, c¸c kü thuËt vµ øng dông

Tµi liÖu tham kh¶o

1 ELISA therory and practice, Humana press, 1995

2 Field virology 4 th edition , 2001

3 Kü thuËt xÐt nghiÖm vi sinh y häc, nhµ xuÊt b¶n v¨n ho¸, 1994

4 Manuel de techniques virologiques, presses de L’universite’ du Que’bec, 1989

5 Vi sinh y häc, nhµ xuÊt b¶n Y häc, 2001

KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

Mục tiêu học tập: Sau khi học xong bài này, học viên có khả năng:

1 Hiểu đ−ợc nguyên lý kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và gián tiếp

2 Thực hiện thành thạo kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

3 Xỏc định được kết quả dương tớnh

1 Giới thiệu chung

Phản ứng kết hợp khỏng nguyờn khỏng thể cú thể quan sỏt được bằng cỏch đỏnh dấu miễn dịch, cú rất nhiều cỏch đỏnh dấu miễn dịch như đỏnh dấu bằng enzyme, huỳnh quang, gắn vàng, gắn phúng xạ, gắn bioluminescent, chimioluminescent Phương phỏp miễn dịch huỳnh quang là phỏt hiện khỏng nguyờn vius, vi khuẩn, vi sinh vật núi chung trong tế bào hoặc mụ (vi rỳt) bằng cỏch cho phản ứng với khỏng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang (cộng hợp), nếu cú sự kết hợp đặc hiệu khỏng nguyờn - khỏng thể sẽ cú hiện tượng phỏt quang

Khỏng thể dựng để gắn huỳnh quang phải được tinh chế hoặc là IgG, hoặc IgM, khỏng thể cú thể được gắn với Fluorescence Iso Thiocianate (FITC) hoặc Rhodamine Iso Thiocianate (TRITC) Cộng hợp gắn với FITC sẽ cú hỡnh ảnh màu xanh lỏ mạ, gắn với TRITC sẽ cú hỡnh ảnh màu đỏ

2 Chuẩn bị mẫu

2.1 Nguyờn lý kỹ thuật

* Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp: Trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp khỏng thể sử dụng đặc hiệu với khỏng nguyờn, khỏng nguyờn cú thể là vi sinh vật nằm trong mụ bị nhiễm, trong mảnh cắt của mụ hoặc trong tế bào một lớp gõy nhiễm vi rỳt

Hỡnh 1: Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

* Miễn dịch huỳnh quang giỏn tiếp: Trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang giỏn tiếp, cộng hợp (khỏng thể đỏnh dấu huỳnh quang) chớnh là khỏng thể thứ 2 đặc hiệu với một loài động vật nào đú như khỏng thỏ, khỏng cừu, dờ, chuột, khỏng nguời…, khỏng thể này cú thể đặc hiệu với chuỗi nặng, chuỗi nhẹ hoặc mảnh Fc

Hỡnh 2: Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

2.2 Chuẩn bị mẫu

Khỏng nguyờn vi khuẩn, vi sinh vật cú kớch thước lớn, tế bào

Khỏng nguyờn vi rỳt cú mặt trong mụ, trong mụ sinh thiết, trong tế bào nuụi cấy 1 lớp gõy nhiễm vi rỳt hoặc trong mẫu bệnh phẩm ngoỏy họng, đường sinh dục, sinh thiết da… cú cỏc tế bào chứa khỏng nguyờn vi rỳt

2.2.1 Chuẩn bị mẫu trờn tế bào nuụi cấy 1 lớp

Gõy nhiễm vi rỳt hoặc bệnh phẩm sau khi đó được xử lý (tuỳ loại bệnh phẩm

và tỏc nhõn gõy bệnh cú cỏc dũng tế bào đặc hiệu và cỏch xử lý bệnh phẩm khỏc nhau) lờn trờn tế bào 1 lớp hay cấy treo (hỗn dịch tế bào) vào tấm nhựa nuụi cấy tế bào cú sẵn lam kớnh, buồng nuụi cấy tế bào hoặc chai nhựa… Thời điểm tốt nhất để nhuộm huỳnh quang khi tế bào bị huỷ hoại 70 – 80%

Đối với tế bào gõy nhiễm trờn lam kớnh hoặc trong buồng nuụi cấy tế bào thỡ

cố định lam hoặc slide nơi đó cú tế bào bỏm sẵn rồi nhuộm huỳnh quang

Đối với tế bào gõy nhiễm trờn chai nuụi cấy cú thể dựng nạo tế bào để nạo mảng tế bào phết lờn lam kớnh hoặc dựng trypsin tỏch tế bào, nhỏ lờn lam kớnh Nếu

cú kớnh hiển vi huỳnh quang lộn ngược (Invested fluorescence microscopy) thỡ cú thể cố định trực tiếp tế bào từ cỏc chai nuụi cấy này rồi nhuộm huỳnh quang

2.2.2 Chuẩn bị mẫu từ mụ

- Phương phỏp Smear: phết kớnh

- Phương phỏp lỏt mỏng: ộp mụ mỏng

2.2.3 Chuẩn bị mẫu trực tiếp từ bệnh phẩm

Bệnh phẩm có chứa tế bào bong ra từ các mô như ngoáy hầu họng, biểu mô đường sinh dục, tổn thương da, nước tiểu sau khi được xử lý, hầu hết bằng ly tâm, lấy tế bào lắng ở đáy týp phết lên lam kính

- Chỉ áp dụng đối với phương pháp cố định bằng formaldehyde

- Sau khi cố định rửa lam kính hoặc tấm nhựa, chai tế bào… bằng PBS 3 lần

- Sử dụng một trong các hoá chất sau, với nồng độ 0,02%

3.1 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

- Rửa lam kính sau bước thấm 3 lần bằng PBS

- Nhỏ cộng hợp pha theo hiệu giá trong Evan Blue 0,003% (kháng thể đặc hiệu vi sinh vật gắn huỳnh quang) lên lam kính, ủ 30 phút – 1 giờ

- Rửa lam kính 3 lần bằng PBS

- Phủ Glycerine (1: 9) pha trong PBS

3.2 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp

- Rửa lam kính sau bước thấm 3 lần bằng PBS

- Cho tiếp xúc với kháng thể 1, pha theo hiệu giá (kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên vi sinh vật) Ủ 30 phút – 1 giờ

- Rửa PBS 3 lần, để ráo lam kính

- Cho tiếp xúc với kháng thể 2 (kháng loài, kháng kháng thể 1 gắn huỳnh quang), pha kháng thể trong Evan blue 0,003%

- Trong chẩn đoán bệnh trực tiếp từ các mẫu bệnh phẩm lâm sàng

- Xác định vi sinh vật sau khi đã phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm lâm sàng

- Chuẩn độ nồng độ kháng thể (miễn dịch huỳnh quang gián tiếp), xác định được khả năng đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm phòng vaccine

- Chuẩn độ hiệu giá vi sinh vật

- Trong nghiên cứu, đặc biệt là trong nghiên cứu di truyền và cấu trúc của vi sinh vật

3.4.2 Ưu nhược điểm

Cộng hợp dùng riêng cho từng loại kháng nguyên Không định lượng được

3.5 Các phương pháp loại trừ các yếu tố không đặc hiệu

- Sử dụng Evan Blue, pha trong nước cất hoặc trong nước lọc qua pore size

- Giảm huỳnh quang không đặc hiệu bằng cách pha kháng thể trong 1% albumine bò hoặc ovalbumine

- Dùng cộng hợp thương mại hoá đã hấp phụ trước hoặc sử dụng kháng thể đơn dòng có độ đặc hiệu cao để chế tạo cộng hợp

- Kỹ thuật:

+ Các bước rửa phải để khoảng 5 phút và nhúng lam lên xuống 2 - 3 lần + Luôn luôn phải làm chứng dương, chứng âm

4 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

4.1 Lấy mẫu bệnh phẩm xét nghiệm

4.1.1 Mẫu bệnh phẩm từ người

- Bệnh phẩm từ não tử thi: Lấy mẫu bệnh phẩm ở nhân xám, đồi thị, tiểu não

và hai bán cầu đại não cho vào tube đựng mẫu có sẵn dung dịch glycerol 50%

- Bệnh phẩm là phết giác mạc: mẫu bệnh phẩm này do bác sỹ có kinh nghiệm và được đào tạo lấy mẫu, lam kính được để khô tự nhiên ở điều kiện nhiệt

độ phòng thí nghiệm

- Bệnh phẩm sinh thiết da vùng gáy: Do bác sỹ có kinh nghiệm và được đào tạo lấy mẫu Gây tê tại chỗ da vùng gáy, dùng dao sinh thiết 4 – 5 chân tóc sát gáy, lấy đến hết phần hạ bì Bệnh phẩm được cho vào tube bảo quản mẫu có sẵn dung dịch glycerol 50%

4.1.2 Mẫu bệnh phẩm từ động vật nghi dại

Mổ não động vật nghi dại lấy sừng Amon hai bên, tiểu não, nhân xám và đại não Các mẫu bệnh phẩm ở các vùng não khác nhau cho vào các tube riêng biệt có sẵn glycerol 50%

4.2 Bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm

Các mẫu bệnh phẩm đều phải được mã hoá và ghi vào phiếu xét nghiệm các thông tin như họ tên, tuổi, ngày mắc bệnh, ngày lấy mẫu, loại mẫu bệnh phẩm tiền

sử phơi nhiễm hoặc mẫu bệnh phẩm nghi dại thuộc loài động vật nào, chủ của con vật (nếu có), địa chỉ liên hệ, loại mẫu bệnh phẩm, một số thông tin về triệu chứng Các mẫu bệnh phẩm nghi dại phải được bảo quản trong tube nhựa, có nắp xoáy và phải được đóng gói 3 lớp theo nguyên tắc đóng gói bệnh phẩm nguy hiểm

có nguy cơ lây nhiễm cao

Tất cả các mẫu bệnh phẩm phải được bảo quản lạnh và chuyển ngay đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt Nếu vận chuyển trong 24 giờ thì bảo quản mẫu ở 4oC, nếu không có điều kiện vận chuyển ngay thì bảo quản mẫu ở nhiệt độ

- Kính hiển vi huỳnh quang

- Các dụng cụ cần thiết khác để chuẩn bị mẫu như chai nuôi cấy tế bào, slide nuôi cấy tế bào, tấm nhựa nuôi cấy tế bào hốt vô trùng, nạo tế bào khi chuẩn bị các mẫu trên tế bào nuôi cấy

+ Phương pháp smear:

Cách 1: Lấy khoảng 1 mm3 mô não đặt lên slide, dùng pince kẹp mẫu bệnh phẩm phết lên slide vừa phết vừa xoay tròn tạo đường kính mẫu khoảng 2 – 3 cm Cách 2: Lấy khoảng 1 mm3 mô não đặt lên slide thứ nhất, dùng slide thứ 2 đặt ép lên bề mặt của mẫu bệnh phẩm và slide thứ nhất, mẫu bệnh phẩm ở slide thứ

2 sẽ được dùng để nhuộm huỳnh quang

+ Phương phép impression: Lấy khoảng 1mm3 mô não đặt lên slide thứ nhất, dùng slide thứ hai đặt lên mô não phết dài theo chiều từ trên xuống dưới sao cho mô não dàn đều một lớp mỏng trên slide 1 Sử dụng slide thứ nhất nhuộm huỳnh quang

- Cố định slide

+ Để khô slide ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, cố định slide trong bể aceton 100% lạnh – 200C

+ Cố định slide ở điều kiện – 200C, trong 1 giờ

+ Sau khi cố định rửa slide 3 lần bằng PBS (-),để ráo

- Nhuộm huỳnh quang

+ Dùng kháng thể kháng dại (anti N – FITC) của hãng Bio-ra

+ Pha kháng thể 1/20 trong dung dịch PBS (-) có 0,04% Evan Blue

+ Dùng bút xoá khoanh tròn vùng có mẫu để khi nhỏ cộng hợp không bị lan

ra ngoài

+ Nhỏ 0,3 ml cộng hợp vào mẫu

+ Ủ slide trong buồng tối, nhiệt độ 370C và ở điều kiện ẩm trong 1 giờ

+ Rửa slide 5 lần bằng PBS (-), mỗi lần 5 phút

+ Để khô slide ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, phủ glycerol 10%

+ Đặt lamen lên slide

- Nhận định kết quả

+ Đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang, bước sóng 450nm

+ Đọc mẫu chứng

Chứng âm: toàn bộ vi trường có mầu hồng

Chứng dương: có hình ảnh phát quang màu xanh lá mạ nằm trong bào tương của tế bào

C©u hái l−îng gi¸

1 Trình bày nguyên lý và các bước cơ bản của kỹ thuật MDHQ trực tiếp và gián tiếp

2 Trình bày các phương pháp chuẩn bị mẫu cho kỹ thuật MDHQ

3 Trình bày ưu nhược điểm của kỹ thuật MDHQ, các ứng dụng của kỹ thuật MDHQ

4 Trình bày phương pháp nhận định kết quả, các phương pháp loại trừ yếu tố không đặc hiệu

Tµi liÖu tham kh¶o

1 Nguyễn Thị Kiều Anh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Thị Thu Trang (2006)

“Xây dựng tiêu chuẩn hiệu giá vi rút trong sản xuất vaccine dại tế bào” tạp chí

nghiên cứu dự phòng, tập XVI, số 2 (80), tr 16 – 20

2 Nguyễn Thị Kiều Anh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh và CS (2006) “Ứng dụng kỹ

thuật miễn dịch huỳnh quang chuẩn độ hiệu giá vi rút dại trên tế bào”, Tạp chí

nghiên cứu y dược học quân sự tập 31, số 2 (206) tr117 – 121

3 Ed Hallow and David Lane(2001) “Using antibodies” a laboratory manual,

CSHL Press, pp353-356

4 Pierre Payment/ Michel Trudel (1989) “Immunofluorecescence”, Manual de

techniques virologiques, Press de l’universite’ du Que’bec pp 137-142

5 Schmitz H (1978) “New immunofluorescence methods with high sensitivity

and specificity” abstracts of IV th International Congress of Virology, The Hague,

p 692

Tách chiết acid nucleic

và kỹ thuật pcr, rt-pcr

Mục tiêu học tập: Sau khi học xong bài này, học viên có khả năng:

1 Hiểu được khái niệm ADN, ARN và nguyên lý của phương pháp tách chiết acid nucleic

2 Biết được các điều kiện bảo quản ADN, ARN sau tách chiết

3 Nắm được các phương pháp tách chiết acid nucleic và thực hiện được kỹ thuật tách chiết acid nucleic bằng các bộ sinh phẩm thương mại hóa

4 Trình bày được bản chất của PCR, RT-PCR, 3 giai đoạn của một chu kỳ nhiệt trong PCR;

5 Thực hành được một số kỹ thuật PCR phổ biến trong chẩn đoán và biết cách phòng nhiễm trong PCR và RT-PCR

I Tách chiết acid nucleic

1 Giới thiệu chung

1.1 Khái niệm acid nucleic

Acid deoxyribonucleic (ADN) được định nghĩa là chất mang thông tin di truyền của mọi cơ thể sống và của rất nhiều loại vi rỳt ADN có thể là sợi đơn hoặc sợi kép, được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Acid ribonucleic (ARN) cũng mang thông tin di truyền, là trung tâm của quá trình tổng hợp protein, điều hòa các gien đang được biểu hiện và là vật liệu di truyền của nhiều loại vi rỳt ARN chuỗi kép có hai chuỗi bổ trợ tương tự như ADN trong tế bào, ARN là khuôn mẫu cho phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR)

1.2 Tính bền vững và bảo quản acid nucleic

Tính bền vững của acid nucleic nhìn chung phụ thuộc vào nhiệt độ, thành phần của base nitơ, muối và độ pH ADN có thể bị phá hủy khi phơi nhiễm với các tia điện từ giầu năng lượng như tia cực tím hay tia X-quang, chất oxi hóa như các gốc tự do và hydrogen peroxide Với cùng điều kiện vật lý và hóa học thì ADN chuỗi đơn kém bền hơn chuỗi kép nhiều lần ở cả mức độ nucleotide và acid amin Trong điều kiện sinh lý (nhiệt độ 37oC, pH = 7,4, sức bền ion là 150mM với sự có mặt của 10mM ion Mg2+) thì phân tử ADN có thể bị mất purin ở tốc độ 3x10-

11/giây, cytosine (C) có thể khử amin để tạo thành uracil (U) ở tốc độ 7x10-13/giây,

C bắt cặp nhầm (C:C và C:T) ở tốc độ 4-13x10-10/giây, và thời gian bán hủy của cầu nối phosphodiester ở vị trí nhân purin là 190 giờ

ADN sau khi tách chiết nên được bảo quản trong đệm phù hợp, nếu được dùng làm khuôn mẫu cho PCR trong vòng 12 giờ thì có thể giữ ở 4oC, trong vòng 6 - 12 tháng thì ở -20oC hoặc -30oC, nếu cần lưu giữ lâu hơn thì cần bảo quản ở nhiệt độ

âm sâu (-80oC) hoặc thậm chí trong nitơ lỏng (-196oC) Cần hạn chế đến mức tối đa quá trình đông tan băng ADN nhiều lần

ARN kém bền hơn so với ADN nhiều lần, có nhiều loại ARN như ARN “giữ nhà” (house keeping), điều hòa, ký sinh, thông tin, định hướng hiệu chỉnh v.v Sau tách chiết, ARN được pha loãng và bảo quản theo một số phương cách khác nhau nhưng điều quan trọng là phải đảm bảo điều kiện không có RNAse, tốt nhất là dung dịch bảo quản có đặc điểm bất hoạt không hồi phục hoạt tính RNAse Để giữ ARN trong thời gian ngắn, có thể dùng đệm EDTA 0,1mM hay đệm TE và điều kiện nhiệt độ -20oC, để giữ ARN trong thời gian dài thì bảo quản ở -80oC Ion Mg2+ và các ion kim loại khác thủy phân không đặc hiệu các vị trí cắt trong ARN do vậy cần thêm EDTA trong môi trường bảo quản nếu cần giữ ARN trong điều kiện nguyên vẹn Các dung dịch bảo quản ARN thường dùng là đệm citrate natri 1 mM pH = 6,4

± 0,2; EDTA 0,1 mM trong nước khử ion xử lý DEPC, đệm TE (10 mM Tris - HCL,

1 mM EDTA, pH = 7,0) và dung dịch bảo quản ARN thương mại hóa

1.3 Sự cần thiết của thử nghiệm tách chiết acid nucleic

PCR/RT-PCR là một trong số các thử nghiệm sinh học phân tử đã và đang

được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán Y học nhờ những tiến bộ về độ nhạy, độ đặc hiệu, và nhanh Acid nucleic chất lượng và nguyên vẹn là bước đầu tiên và quan trọng nhất trong tiến hành các thử nghiệm sinh học phân tử Tuy nhiên, một trong

số những hạn chế của chẩn đoán phòng thí nghiệm dựa vào PCR/RT-PCR là phản ứng dễ bị ức chế do rất nhiều các thành phần có trong bệnh phẩm như haem và các chất khác trong máu, chất nhày, nước tiểu, dịch não tủy, tinh dịch, bilirubin hay muối mật trong phân Người ta chưa hiểu nhiều về đặc điểm tự nhiên của các chất

ức chế nhưng một điều hiển nhiên là chúng bao gồm cả yếu tố do cơ thể tổng hợp (nội tố) và những yếu tố được thêm từ ngoài vào (ngoại tố) Nội tố là các chất trong

tế bào như vòng porphyrin của haem, còn ví dụ điển hình của ngoại tố là chất chống

đông heparin và các yếu tố mang như Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) Phenol

và Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) dạng vết cũng có thể ức chế Taq polymerase

Chính vì vậy, chẩn đoán bệnh dựa vào PCR/RT-PCR trực tiếp từ bệnh phẩm là rất khó, đặt ra một yêu cầu thiết yếu là phải có các thử nghiệm tách chiết acid nucleic Mặc dù chúng ta đều đang nỗ lực để đơn giản hóa và tăng cường chất lượng tinh sạch acid nucleic song vì có nhiều loại bệnh phẩm rất khác nhau về đặc điểm thành phần như máu, nước tiểu, phân, dịch não tủy v.v nên các thường quy nhìn chung vẫn còn nhiều hạn chế và vẫn cần phải có thường quy tách chiết đặc hiệu cho mỗi loại bệnh phẩm trước khi đưa vào PCR/RT-PCR

Acid nucleic có thể được tách chiết từ vi rỳt, vi khuẩn, nấm, thực vật, môi trường, plasmid, và bệnh phẩm từ người hay động vật tùy theo mục đích áp dụng trong chẩn đoán phòng thí nghiệm hay trong nghiên cứu và sản xuất Trong phạm vi bài viết này, chúng tôi chỉ xin phép đề cập đến một số nguyên tắc cơ bản của các thường quy tách chiết từ mức độ đơn giản nhất cho đến những thường quy đang

được cập nhật tại thời điểm hiện tại để có thể áp dụng cho mọi tuyến Y tế, mọi điều kiện phòng thí nghiệm

2 Phương pháp tách chiết acid nucleic

Tách chiết Acid nucleic là bước vô cùng quan trọng trước khi tiến hành PCR/RT-PCR Mặc dù có rất nhiều phương pháp song một thường quy cụ thể cần phù hợp với từng loại tác nhân, tổ chức mà ta cần tách chiết vì cấu trúc và thành phần của các tổ chức rất khác nhau Một đặc điểm chung của các phương pháp tách chiết là trước tiên tế bào hoặc vi rỳt được phá hủy để giải phóng acid nucleic, sau đó acid nucleic được tách rời ra khỏi các thành phần khác như các loại protein, lipid và carbohydrate Quá trình tách chiết ARN phức tạp và khó hơn nhiều do enzyme phá hủy ARN là ribonuclease có mặt ở khắp mọi nơi trong tế bào và tổ chức, điều quan trọng là trong quá trình phá hủy tế bào hay tổ chức thì các chất làm biến tính phải tiếp xúc được với các thành phần trong tế bào ở thời điểm tế bào bị phá hủy Để thành công, các thường quy tách chiết ARN cần bao gồm một vài bước trước và sau bước tinh sạch ARN thực sự và thường phải sử dụng các chất gây biến tính mạnh như GITC, LiCL, SDS, phenol trước và sau tách chiết, là những thời điểm tính toàn vẹn của ARN bị đe dọa Có một số phương pháp tách chiết ARN song phương pháp hay được dùng nhiều nhất là Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform Như vậy cho dù bằng bất kỳ phương pháp nào thì một điều thiết yếu là bất cứ một chất nào

có thể ức chế PCR/RT-PCR đều phải được loại bỏ bằng các kỹ thuật tinh sạch đáng tin cậy, nhạy, và có tính lặp lại cao