Luận Văn - Quy trình sản xuất chế phẩm kháng thể lỏng chống GUMBORO

Các chủng virus này có sự tương ñồng kháng nguyên với chủng virus “cổ ñiển” gây bệnh dịch Gumboro trong nhiều thập kỷ và có thể gây ra các tổn thương bệnh tích ñặc trưng Eterradossi và c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2013

Tác giả luận văn

Trần Văn Thể

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành Luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận ñược sự quan tâm giúp ñỡ của các thầy cô giáo và bạn bè ñồng nghiệp Nhân dịp này, trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ của các thầy cô giáo khoa Thú y, Ban quản lý ñào tạo trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giảng dạy, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại Trường

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn: TS Nguyễn Bá Hiên ñã tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh ñạo và cán bộ công nhân viên chức của Xí nghiệp thuốc Thú y Trung ương ñã giúp ñỡ tôi thực hiện các thí nghiệm trong suốt thời gian qua

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân trong gia ñình và bạn bè ñồng nghiệp ñã luôn giúp ñỡ, ñộng viên giúp tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2013

Tác giả luận văn

Trần Văn Thể

MỤC LỤC

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1.1 Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm kháng thể chống

2.1.3 Bước ñầu ứng dụng thử nghiệm chế phẩm trong phòng và ñiều trị

2.3.1 Phương pháp gây tối miễn dịch cho ñàn gà mái ñẻ ñể lấy trứng

2.3.3 Phương pháp làm phản ứng trung hoà trên tế bào xơ phôi gà một lớp 25

2.3.5 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn của chế phẩm 26

2.3.7 Phương pháp xác ñịnh thời gian thu hoạch trứng sản xuất chế

3.1 Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm kháng thể chống

3.1.1 Nghiên cứu quy trình gây tối miễn dịch cho gà mẹ 30 3.1.2 Kết quả xác ñịnh thời gian thu hoạch trứng sản xuất chế phẩm

3.1.3 Quy trình sản xuất chế phẩm kháng thể ñặc hiệu chống Gumboro 34 3.2 Kết quả kiểm nghiệm chế phẩm kháng thể chống Gumboro 38 3.2.1 Kết quả kiểm tra vô trùng chế phẩm kháng thể chống Gumboro 38

3.2.5 Kết quả xác ñịnh thời gian bảo quản của chế phẩm 50

3.3.1 Kết quả ứng dụng thử nghiệm chế phẩm ñiều trị bệnh Gumboro 53 3.3.2 Kết quả ứng dụng thử nghiệm chế phẩm phòng bệnh Gumboro 55

DANH MỤC BẢNG

3.2 Kết quả xác ñịnh khoảng thời gian bắt ñầu thu trứng ñể sản xuất

3.3 Xác ñịnh thời gian thu hoạch trứng sản xuất chế phẩm sau khi gây

tối miễn dịch trên ñàn gà bằng phương pháp trung hoà trên gà 36 3.4 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của chế phẩm kháng thể chống

3.5 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của chế phẩm trong phòng thí

3.6 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của chế phẩm trên ñàn gà tại

3.8 Kết quả xác ñịnh hiệu lực của chế phẩm bằng phương pháp công

3.12 Kết quả phòng bệnh Gumboro trong vùng dịch bằng chế phẩm

DANH MỤC HÌNH

1.1 Vùng Gumboro, ñịa hạt Sussex bang Delaware của Mỹ, nơi ñầu

1.3 Virus Gumboro thường tập hợp thành từng cụm nằm trong tế bào

1.5 Ảnh vi thể của các tế bào ñại thực bào trong túi Fabricius bị virus

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CPE: Cytopathogenic effect

ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay

ELD50: Embyo Lethal Dose 50%

IBD: Infectious Bursal Disease

IBDV: Infectious Bursal Disease Virus

ICT: Immunochromatographic test,

LD50: Lethal Dose 50%

OIE: Office International des Epizooties

PBS Phosphate Buffered Saline

PCR: Polymerase chain reaction

RNA: Ribonucleic acid

RT-PCR : Reverse transcriptase Polymerase chain reaction

TCID50: Tissue Culture Infective Dose 50%

vvIBDV: very virulent IBDV

MỞ ðẦU

1 ðặt vấn ñề

Trong lĩnh vực chăn nuôi, ngành chăn nuôi gia cầm của nước ta ñã có những bước phát trển vượt bậc và ñang dần trở thành ngành sản xuất hàng hóa góp phần cung cấp nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, ñáp ứng nhu cầu trong nước và bước ñầu xuất khẩu.Theo quyết ñịnh số 10/2005-QðTTg về chiến lược phát triển ngành chăn nuôi ñến 2020, tổng ñàn gà phải ñạt trên 300 triệu con, sản lượng thịt gà ñạt 1760 tấn, trứng ñạt 14 tỷ quả Tính ñến ngày 15 tháng 6 năm 2013, tổng số gia cầm của cả nước là 304,5 triệu con Hàng năm chăn nuôi gia cầm cung cấp khối lượng thực phẩm ñứng thứ hai sau chăn nuôi lợn Nó ñã trở thành nguồn thu nhập quan trọng với các

hộ nông dân và là một trong những nghề có tác dụng xóa ñói giảm nghèo nhanh, góp phần chuyển dịch cơ cấu kinh tế trong nông nghiệp

Tuy nhiên, việc phát triển ñàn gia cầm cũng làm xuất hiện các loại bệnh, ảnh hưởng không nhỏ tới năng suất và hiệu quả chăn nuôi.Trở ngại lớn nhất hiện nay, ñặc biệt trong các cơ sở chăn nuôi gia cầm là bệnh Gumboro

Bệnh Gumboro hay còn gọi là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan nhanh ở gia cầm non, chủ yếu ở gà và

gà tây, do một loại virus gây ra gọi là virus Gumboro Bệnh gây thiệt hại lớn

về mặt kinh tế cho người chăn nuôi Ngày nay bệnh thường xảy ra ở hầu hết các vùng chăn nuôi gà tập trung trên thế giới Virus Gumboro gây bệnh có nhiều biến chủng khác nhau nhưng ñều thuộc về serotype I và II, trong ñó serotype I có mức ñộ ñộc lực và tính gây bệnh cao, còn serotype II hầu như không có tính gây bệnh

Từ ñầu thế kỷ trước, việc ñấu tranh với thiên nhiên ñể bảo vệ sản xuất, sưc khỏe con người và ñộng vật (chống lại sâu bọ, côn trùng, phòng bệnh và chữa bệnh cho con người và gia súc…) người ta ñã nghiên cứu, sử dụng hóa

chất và các chất kháng sinh Kết quả của hướng nghiên cứu ñó ñã ñem lại những thành tựu và hiệu quả to lớn cho loài người Song ñến cuối thế kỷ 20, khi sinh học phát triển mạnh mẽ, người ta cũng ñã phát hiện ra một số mặt trái của việc sử dụng hóa chất và kháng sinh này Càng ngày người ta càng thấm thía rằng, việc sử dụng thuốc và các chế phẩm dùng trong bảo vệ cây trồng, vật nuôi và sức khỏe con người ngoài mục tiêu có hiệu quả còn cần phải ñi ñôi với an toàn và bảo vệ môi trường sinh thái trong sạch, vững bền, ñể có thể bảo vệ con người và thiên nhiên Muốn ñạt ñược yêu cầu ñó, việc nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học ñể phòng và chữa bệnh cho vật nuôi ñang ñòi hỏi cấp bách Dựa trên cơ sở miễn dịch học và phản ứng kháng nguyên – kháng thể người ta ñã sản xuất nhiều loại kháng thể ñặc hiệu từ huyết thanh ñộng vật ñể chữa bệnh, nhưng giá thành cao, khi dùng dễ có phản ứng huyết thanh nên ít ñược sử dụng rộng rãi

Gần ñây người ta phát hiện ra rằng, khi gà ñược tiêm kháng nguyên ñể gây ra trạng thái miễn dịch, kháng thể ở máu của gà ñược miễn dịch ñã truyền vào trong lòng ñỏ trứng khoảng 80% Kháng thể ñặc hiệu chế từ lòng ñỏ trứng gà ñược miễn dịch có nhiều ưu thế hơn hẳn so với kháng thể ñặc hiệu chế từ huyết thanh ñộng vật, vì khi ứng dụng vào sản xuất nó có thể sản xuất với số lượng lớn, giá thành hạ, không phải giết ñộng vật và khi dùng ít xảy ra phản ứng phụ Cho ñến nay ñã có nhiều công trình ở các nước ðức, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc công bố về việc chế tạo sử dụng kháng thể lòng ñỏ ñể ñiều trị

và phòng nhiều bệnh cho vật nuôi có hiệu quả cao

Khi gà ñược tiêm chế phẩm kháng thể Gumboro, nếu gà tiếp xúc hoặc cảm nhiễm với virus Gumboro, cơ thể con vật ñã có sẵn kháng thể ñặc hiệu ñể trung hòa virus Khi gà ñang mắc bệnh, tiêm chế phẩm cho gà thì kháng thể sẽ tác ñộng trực tiếp lên virus này và trung hòa virus Vì vậy việc nghiên cứu ñể sản xuất ñược một loại kháng thể kháng virus Gumboro có hàm lượng kháng thể cao, ổn ñịnh trong thời gian bảo quản dài và sử dụng ñơn giản là một việc cấp thiết

Trên cơ sở khoa học này và ñáp ứng yêu cầu cấp bách của thực tế sản xuất, ñược sự ñồng ý của Ban giám ñốc Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương, sự hướng dẫn khoa học của TS Nguyễn Bá Hiên, khoa Thú y, ðại học Nông

nghiệp Hà Nội, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: ”Nghiên cứu quy trình

sản xuất chế phẩm kháng thể lòng ñỏ chống Gumboro”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu ñược quy trình sản xuất chế phẩm kháng thể chống bệnh Gumboro

- Ứng dụng thử nghiệm chế phẩm cho việc phòng và ñiều trị bệnh Gumboro ở gia cầm

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Là cơ sở khoa học ñể có thêm các biện pháp phòng trị bệnh Gumboro

- Cung cấp một chế phẩm sinh học có tác dụng phòng và ñiều trị bệnh Gumboro cho hiệu quả cao, giá thành rẻ, dễ sử dụng phù hợp với ñiều kiện ở nước ta

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh gumboro

Bệnh Gumboro hay còn gọi là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm (Infectious Bursal Disease - IBD) là bệnh truyền nhiễm lây lan cấp tính ở gà con (2-6 tuần tuổi) Nguyên nhân gây ra bệnh Gumboro là một loại virus RNA có tên là virus gây viêm túi truyền nhiễm (Infectious Bursal Disease Virus - IBDV) hay còn gọi là virus Gumboro Sự nhiễm IBDV có thể làm gia tăng trầm trọng mức ñộ nhiễm bệnh với những tác nhân gây bệnh khác và làm giảm khả năng ñáp ứng miễn dịch của gia cầm

Các tế bào lympho trong túi Fabricius là những tế bào ñích của virus Gumboro Gà ở ñộ tuổi 3 - 6 tuần có tính nhạy cảm cao với virus, khi túi Fabricius phát triển lớn nhất Hậu quả của IBDV gây nhiễm ở gia cầm là làm teo nhỏ các mô lympho và cuối cùng là phá hủy cấu trúc túi Fabricius làm cho cơ quan có thẩm quyền miễn dịch này mất hoàn toàn hoặc một phần chức năng ñáp ứng miễn dịch dẫn ñến suy giảm miễn dịch (immunosuppression) (Sharma và cs, 2000);

Virus ở các dạng ñộc lực cổ ñiển, nguyên nhân gây ra nhiều vụ dịch xảy

ra trước ñây, thường gây ra tỷ lệ chết khoảng từ 1 - 50% số gà nhiễm trong ñàn (Müller và cs, 2003).Ở những ñàn gà thịt thương phẩm bị nhiễm, tỉ lệ này có thể lên ñến 50%, tuy nhiên ở các ñàn gà trong ñộ tuổi 3-6 tuần tỉ lệ chết ít khi vượt quá 3% Người ta thấy rằng, khi thay thế các ñàn gà mái tơ Leghorn (thay ñàn) ở trong ñộ tuổi nhạy cảm với bệnh có thể làm gia tăng tỉ

lệ chết của số gà nhiễm bệnh trong ñàn lên ñến 20% (Müller và cs, 2003) Trong các ñàn ñang ở thời kì ñẻ trứng, có sự giảm sút sản lượng trứng và cả chất lượng trứng

Bên cạnh khả năng gây chết, IBDV còn gây suy giảm miễn dịch ở gà bị nhiễm bệnh Ở các ñàn gà thịt thương phẩm, sự suy giảm khả năng miễn dịch

ñược biểu hiện rõ rệt bởi tỉ lệ xâm nhiễm cao của các virus ñường hô hấp và

làm gia tăng tỉ lệ chết do sự nhiễm trùng máu của vi khuẩn E coli (trực khuẩn

ruột già) trong suốt một phần ba cuối của chu kỳ phát triển 6-8 tuần Vaccine sống nhược ñộc có thể không phát huy tác dụng ở cả các ñàn gà thịt và ñàn gà mái tơ sau tiêm chủng nhằm chống lại với các bệnh ñường hô hấp như là bệnh viêm phế quản và bệnh Newcastle

Từ năm 1986 ñến nay, các chủng IBDV ñộc lực cao ñã gây ra nhiều vụ dịch lớn ở Châu Âu, bao gồm nhiều chủng có thể gây chết tới 70% số gà nhiễm bệnh trong các ñàn gà mái ñẻ (Van Den Berg, 1991; 2000); (Zorman-Rojs và cs, 2003) Các chủng virus này có sự tương ñồng kháng nguyên với chủng virus “cổ ñiển” gây bệnh dịch Gumboro trong nhiều thập kỷ và có thể gây ra các tổn thương bệnh tích ñặc trưng (Eterradossi và cs, 1992) ðặc biệt, các chủng IBDV

có ñộc lực cao (very virulent IBDV = vvIBDV) có khả năng “lẩn tránh” ñược ñáp ứng miễn dịch dịch thể sinh ra sau kích thích bằng chủng virus cổ ñiển (không bị trung hòa bởi các kháng thể này), khi xâm nhiễm và gây bệnh ở gà mẫn cảm

ðược phát hiện lần ñầu tiên cách ñây hơn 50 năm, cho ñến nay bệnh Gumboro vẫn ñang là mối ñe dọa nguy hiểm với ngành chăn nuôi gà công nghiệp ở khía cạnh suy giảm miễn dịch do virus gây ra Sự thay ñổi tính kháng nguyên cũng như sự xuất hiện các chủng virus có tính gây bệnh cao trong nhiều ñàn gia cầm ñược tiêm vaccine (Dolz và cs, 2005); (Yuwen và

cs, 2008), ñã kích thích nỗ lực quan tâm nghiên cứu các chủng Gumboro mới xuất hiện cả về bệnh và nguyên nhân gây bệnh

1.1.1 Lịch sử và ñịa dư bệnh

IBDV là loại virus thuộc họ Birnaviridae, nhóm Birnavirus, ñược phát

hiện ñầu tiên vào năm 1957 tại vùng Gumboro, ñịa hạt Sussex thuộc bang Delaware của Mỹ (Hình 1.1), nhưng mãi ñến năm 1962 mới ñược Cosgrove miêu tả cặn kẽ (Cosgrove, 1962) Năm 1970, Hitchner ñề nghị chính thức coi

bệnh do Cosgrove phát hiện là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm (IBD) hay còn gọi là bệnh Gumboro ñể ghi nhớ ñịa danh phát hiện bệnh ñầu tiên (Hitchner, 1970)

Hình 1.1: Vùng Gumboro, ñịa hạt Sussex bang Delaware của Mỹ,

nơi ñầu tiên phát hiện bệnh Gumboro

Từ khi ñược phát hiện ñến nay, bệnh ñã lan truyền nhanh chóng và rộng rãi trên nhiều nước có nền chăn nuôi gà công nghiệp phát triển Ở Việt Nam bệnh ñược phát hiện năm 1984 (Bitay và cs, 1984)

1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh

1.1.2.1 Hình thái, cấu trúc và phân loại virus gây bệnh Gumboro

IBDV là một virus hoàn toàn mới, thành viên của nhóm Avibirnavirus thuộc họ Birnaviridae, là một virus có kích thước không lớn, khoảng 58 - 60

nm, dạng hình khối ña diện cấu trúc ñối xứng 20 mặt (Dobos và cs, 1979), (Hình 1.2)

Hình 1.2: Cấu trúc của hạt IBDV dưới kính hiển vi ñiện tử

(Nguồn: vir.sgmjournals.org/ /vol86/issue8/cover.shtml)

Trong nguyên sinh chất của tế bào bị nhiễm, dưới kính hiển vi ñiện tử,

có thể quan sát thấy tập hợp virus Gumboro, xếp ñều ñặn cạnh nhau (Hình 1.3) Mỗi một nguyên sinh chất có thể chứa một vài tập hợp virus nói trên

Hình 1.3: Virus Gumboro thường tập hợp thành từng cụm nằm trong tế

bào lympho B bị nhiễm

(Nguồn: 210.36.18.48/gxujingpin/dwwswx/ev/16.htm)

IBDV không có vỏ bọc ngoài cùng (envelop), mà chỉ là virus dạng trần, hay còn gọi là nucleocapsid, bao gồm nhân chứa ribonucleic acid (RNA) và bao quanh hệ gen là lớp vỏ protein hay còn gọi là capsid Vỏ capsid của virus bao gồm 32 ñơn vị hình thái, mà mỗi một ñơn vị hình thái còn ñược gọi là capsomer ñan chéo nhau tạo thành (Hirai và cs, 1979) Mỗi capsomer ñược tạo thành bởi 4 loại protein khác nhau (Dobos, 1979) Các nucleotide trong ribonucleic acid (RNA) của virus Gumboro ñược xếp thành ñôi cuộn tròn và

phân làm hai ñoạn riêng biệt (Becht và cs, 1988), ñây là một ñặc ñiểm hết sức ñặc trưng của loại virus này do vậy, theo sự phân loại mới nhất hiện nay, IBDV ñược xếp vào nhóm virus có chứa RNA và là thành viên ñại diện ñầu tiên của

nhóm Avibirnavirus (Leong và cs, 2000)

1.1.2.2 Phân type huyết thanh học

Cho ñến nay người ta coi tất cả các loại IBDV thuộc 2 serotype: I và

II Hai serotype của IBDV có thể ñược phân biệt bằng phản ứng trung hòa virus (McFerran và cs, 1980)

Serotype I bao gồm các chủng virus cường ñộc Gumboro gây bệnh cho

gà, mà tùy thuộc vào mức ñộ ñộc lực, người ta phân ra làm 4 nhóm chính: nhóm cường ñộc cao (very virulent group), nhóm cổ ñiển (classical group), nhóm biến ñổi (variant group) và nhóm nhược ñộc (attenuated group) (Wu và

cs, 2007) Giữa các chủng trong cùng serotype I có thể có mức ñộ cộng ñồng kháng nguyên không ñều nhau, nhiều trường hợp chủng này chỉ cho 30% miễn dịch chéo với chủng khác

Serotype II bao gồm tất cả các chủng IBDV gây nhiễm và ñược phân lập ở gà tây Chúng không gây bệnh ở gà nhưng có thể gây nhiễm, cũng tương tự các chủng ở type I không gây bệnh cho gà tây nhưng có thể tồn tại ở

gà tây ñể lan truyền trở lại bệnh cho gà

1.1.2.3 Tính gây bệnh của IBDV

Trong tự nhiên: gà nhà và gà tây là hai loại mẫn cảm với virus Gumboro,

trong ñó type I gây bệnh cho gà nhà và type II gây bệnh cho gà tây Người ta cũng ñã phát hiện thấy IBDV ở gà Nhật và chim bồ câu sống hoang dã ở Châu Phi (Kasanga và cs, 2007; 2008) Một số loài chim hoang dã như gà trời, ngỗng trời, chim ác là, cũng có thể bị nhiễm virus Gumboro, bị bệnh và chết Virus Gumboro phân lập từ những loài chim hoang dã này có thể gây bệnh trở lại cho

gà mẫn cảm, gây chết tới 60% và làm teo túi Fabricius (Jeon và cs, 2008)

Trong phòng thí nghiệm:khác với một số virus gây bệnh ở ñộng vật khác là

có thể gây bệnh dễ dàng trên chính ñộng vật mẫn cảm hoặc trên một số ñộng vật

cảm thụ phòng thí nghiệm như chuột lang, chuột bạch, thỏ và một số ñộng vật khác Với virus Gumboro, ngoài gia cầm mẫn cảm (gà 2 - 6 tuần tuổi), virus chỉ

có khả năng gây bệnh trên phôi gà hoặc môi trường tế bào xơ phôi gà mà không

có khả năng gây bệnh trên các ñộng vật cảm thụ phòng thí nghiệm

1.1.3 Cơ chế sinh bệnh

Khác với nhiều loại virus gây bệnh ở gia cầm mà cơ quan thích ứng cho

sự nhân lên và gây bệnh thuộc về các cơ quan nội tạng hay da, niêm mạc, virus gây bệnh Gumboro lại chọn túi Fabricius - cơ quan có thẩm quyền miễn dịch chủ yếu ở gia cầm làm cơ quan thích ứng cho sự nhân lên và gây bệnh của mình, cụ thể là các tế bào lympho B mang thụ thể kháng thể IgG bề mặt và ñại thực bào (Nakai và Hirai, 1981); (Terasaki và cs, 2008)

Qua con ñường tiêu hóa, do thức ăn, nước uống virus xâm nhập vào hệ tiêu hóa Tại ñây, chúng ñược các tế bào ñại thực bào tiếp nhận, ñồng thời tiếp xúc với tế bào lympho B còn non là loại mẫn cảm với virus, bắt ñầu thực hiện quá

trình nhân lên, quá trình này là sự nhân lên cục bộ, hay sự nhân lên sơ cấp Chỉ

sau 6-8 giờ, một số lượng virus Gumboro ñáng kể ñược giải phóng và xâm nhập vào hệ tuần hoàn ðây là lần thứ nhất virus xuất hiện trong máu, nhưng người ta không gọi là sự nhiễm trùng máu vì số lượng virus không nhiều Hệ tuần hoàn chỉ làm nhiệm vụ vận chuyển virus ñi khắp cơ thể mà trước hết là ñến lách, túi Fabricius và một số cơ quan khác Thông thường 9-11 giờ sau khi vào hệ tiêu hóa, một số lượng lớn virus Gumboro ñã có mặt trong túi Fabricius và bắt ñầu tấn công các loại hình tế bào lympho B, ñây là quá trình nhân lên toàn phần hay

sự nhân lên thứ cấp Số lượng lớn virus Gumboro ñược giải phóng ñã xâm nhập

vào hệ tuần hoàn lần thứ hai, lúc này người ta coi sự có mặt của virus Gumboro trong máu là sự nhiễm trùng máu (viremia)

Theo Skeeles và cs (1980), virus Gumboro tác ñộng gây nên hiện tượng bệnh lý ñông máu, do vậy trong hệ tuần hoàn xuất hiện các cục huyết khối, làm nghẽn mạch mao quản, chủ yếu là vùng niêm mạc túi Fabricius và ở một số nơi khác, dẫn ñến hiện tượng xung huyết Khi không chịu nổi áp suất gia tăng của

máu, mao mạch bị ñứt gây nên hiện tượng xuất huyết Sự xuất huyết thường gặp ở các vùng cơ ñùi, cơ lườn thành tia, thành mảng, thành vệt dài và có màu tím, màu hồng, ñồng thời ở túi Fabricius, lách, gan cũng có thể xảy ra trường hợp tương tự

Cứ như vậy, sự xung huyết, xuất huyết từ quy mô nhỏ (từng ñiểm li ti) ñến quy mô lớn (vệt, mảng) và có màu sắc ña dạng từ hồng ñến tím hoặc nâu ñen Một số biến ñổi bệnh lý trong một số cơ quan có thể dần dần mất ñi và dần phục hồi chức năng vốn có, nhưng ñối với túi Fabriciussự phục hồi không xảy ra

Do virus Gumboro phá hủy túi một cách trầm trọng, virus nhân lên trong tế bào lymphoB, phá hủy chúng làm giảm ñáng kể số lượng tế bào này Số lượng tế bào lympho mất ñi không ñược bù ñắp nên chức năng miễn dịch của túi bị mất một phần hoặc hoàn toàn dẫn ñến sự suy giảm miễn dịch (immunosuppression) Mức

ñộ suy giảm miễn dịch phụ thuộc vào ñộc lực của virus, thời gian và ñiểm xâm nhập vào cơ thể gà (Hirai và cs, 1979); (Sharma và cs, 2000)

1.1.4 Triệu chứng lâm sàng

ðối với ñàn gà mẫn cảm, thời gian nung bệnh xảy ra ngắn, khoảng 2-3 ngày:

gà ngoẹo ñầu, rúc mỏ vào cánh, có khi gục sang một bên, thích nằm, mắt lim dim mỏi mệt và thường dồn về một góc chuồng, gà kém ăn hoặc bỏ ăn, uống nhiều nước, mất ñịnh hướng, ỉa phân trắng, loãng hoặc toàn nước có khi lẫn máu, lúc ñầu

nhiệt ñộ tăng, sau giảm và nếu không qua khỏi thì gà chết trong vòng vài ngày

Do ñặc tính truyền ngang rất mạnh, virus Gumboro gây nên tỷ lệ nhiễm trong ñàn có khi ñạt 100% Thông thường từ ngày thứ 3 sau triệu chứng lâm sàng ñầu tiên, trong ñàn bắt ñầu có cá thể chết và chết ồ ạt trong vòng 5-7 ngày, sau ñó giảm chết rất nhanh, thường 10-12 ngày có thể dứt bệnh, gà dần hồi phục, tuy nhiên các

cá thể bị bệnh qua khỏi thông thường bị tổn thương khá nặng, ñặc biệt là hệ miễn dịch dẫn ñến suy giảm miễn dịch

1.1.5 Bệnh tích

1.1.5.1 Bệnh tích ñại thể

Túi Fabricius: sau 72 giờ bị nhiễm, virus Gumboro có ñộc lực mạnh ñã

có thể gây bệnh với bệnh tích ñại thể ñiển hình: túi Fabricius thường sưng rất

to, có kích thước và trọng lượng gấp 2-3 lần bình thường Xung quanh túi có thủy thũng keo nhầy vàng, có khi có bọc dịch thẩm xuất bọc quanh túi Fabricius Nếu chích hết nước, túi lộ rõ ra, căng tròn, sưng phù Túi chuyển màu sắc từ vàng sáng sang màu trắng ñục Túi dễ cấu, dễ bục, các nếp gấp múi khế sưng không rõ nét Niêm mạc sưng dầy lên làm cho dung tích khoang

túi trở nên hẹp lại ðây là giai ñoạn viêm sưng (Hình 1.4A)

Có nhiều cá thể bị bệnh Gumboro, hiện tượng viêm sưng ñi kèm với hiện tượng xuất huyết và thẩm xuất dịch vào trong lòng túi Fabricius, niêm mạc túi có ñiểm xuất huyết, ñôi khi thành vệt, niêm mạc túi chuyển từ màu trắng sang màu thâm tím, nâu ñen (Hình 1.4B)

Theo Cheville (1967), túi Fabricius bắt ñầu tăng về kích thước và trọng lượng trong khoảng 48-72 giờ sau khi nhiễm do thủy thũng và xuất huyết Kích thước túi có thể tăng gấp 2-3 lần so với bình thường Vào ngày thứ 4 sau nhiễm, kích thước túi vẫn còn to gấp ñôi, sau ñó mới nhỏ dần lại Ngày thứ 5 sau nhiễm trọng lượng túi bằng trọng lượng ban ñầu và sau ñó bắt ñầu teo ñi ðến ngày thứ 8 trọng lượng túi chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban ñầu

Hình 1.4: Bệnh tích túi Fabricius và hệ cơ

A: Hình ảnh túi Fabricius sưng to, xung quanh có thủy thũng keo nhầy (Nguồn: www.vemedim.vn/benhvadieutri), B: Hình ảnh xuất huyết bên trong túi (Nguồn: www.medvet.umontreal.ca/ /OrigiInfect/), C: Hình ảnh cơ ñùi,

cơ lườn bị xuất huyết ñiểm hoặc thành từng vệt, từng mảng có màu ñỏ hay màu nâu thẫm (Nguồn: http://www.anova.com.vn/contents/article)

Hệ cơ:gà bệnh bị mất nước nên cơ khô rất nhanh, chỉ vài phút sau khi lột

da, cơ ngực của gà ñã khô nhăn lại, có mầu thẫm, ñặc biệt có xuất huyết những ñám lấm chấm hoặc thành từng vệt, có khi các vệt xuất huyết hợp lại tạo thành mảng lớn (Hình 1.4C)

Ngoài ra, lách có thể bị sưng nhẹ Gan sưng, bề mặt có những vệt loang

lổ mầu vàng, có thể có hoại tử rìa gan, ñôi khi ñiểm hoại tử hợp thành từng vệt nhỏ, mầu vàng sáng ăn sâu vào nội mô của gan Thận có thể bị sưng, trên

bề mặt có những ñiểm xuất huyết, hoại tử Tuyến ức bị xuất huyết ñiểm, vệt hoặc từng mảng, có khi xuất huyết ăn sâu vào các thùy của tuyến

1.1.5.2 Bệnh tích vi thể

Bệnh tích vi thể xuất hiện sớm ở các cơ quan có cấu trúc từ tổ chức lympho và các cơ quan tạo miễn dịch như túi Fabricius, tuyến ức (thymus), lách, hạch, các mô lympho ở ruột, chỉ trong vòng vài giờ ñến vài chục giờ sau khi virus cường ñộc Gumboro xâm nhập vào cơ thể

Theo Müller và Lange (1985), có sự tập trung của ñại thực bào và các

tế bào lympho trong vòng 4-5 giờ sau khi gây nhiễm qua ñường tiêu hóa và sau 11 giờ xuất hiện những tế bào lympho bị nhiễm virus, nếu gây nhiễm trực tiếp vào túi Fabricius chỉ sau 6 giờ ñã xuất hiện những tế bào lympho bị nhiễm virus

Theo Helmboldt và Garner (1964), 24 giờ sau khi nhiễm các tế bào lympho trong túi Fabricius ñã bị thoái hóa, các tế bào lympho ở vùng tủy của nang ñã bắt ñầu quá trình hoại tử Virus tấn công và phá hủy các tế bào lympho

B non và lympho B trưởng thành, nên chỉ trong thời gian rất ngắn lượng tế bào lympho B ñã giảm ñáng kể (Kim và cs, 2000) Trung tâm bị hoại tử ngày càng tăng, các vách nang giảm dần, nang bị thu hẹp lại, có các hình tròn, chữ nhật, ô van khác nhau Các trung tâm hoại tử xuất hiện không bào (vacuole), không còn tế bào lympho hoặc chỉ còn rất ít tập trung ở vùng ngoại vi nang Thay vào các vị trí của các tế bào lympho là các tế bào heterophil, các mảnh tế bào bị phân hủy một phần, các tế bào hệ lưới nội mô Toàn bộ các nang lympho bị

hủy hoại và có thể quan sát thấy các mức ñộ khác nhau (Kulkarui và cs, 1982) (Hình 1.5)

Hình 1.5: Ảnh vi thể của các tế bào ñại thực bào trong túi Fabricius bị virus Gumboro tấn công

Ghi chú: A: sự hủy hoại của tế bào ñại thực bào

B: tập hợp virus ñang nhân lên trong tế bào ñại thực bào (Nguồn: ss.niah.affrc.go.jp/disease/EM/em_en/virus0.html)

Vào ngày thứ 3 hoặc 4, sự thủy thũng, xung huyết và tập trung của các

tế bào của túi làm cho túi Fabricius sưng to Sự khám phá vai trò của các tế bào T trong miễn dịch bệnh lý ñược gây ra bởi IBDV và sự phục hồi của những mô bị nhiễm ñã cho thấy có sự xâm nhiễm của cả tế bào lympho T (CD4+) và tế bào lympho T (CD8+) làm cho số lượng lympho T tăng tối ña vào ngày thứ 7 sau khi nhiễm (Kim và cs, 2000) Các tế bào T ở trong túi Fabricius ngăn cản sự nhân lên của virus trong túi trong giai ñoạn ñầu của bệnh, nhưng cũng thúc ñẩy quá trình phá hủy mô túi và làm chậm quá trình hồi phục của mô thông qua việc giải phóng ra các cytokine gây ñộc tế bào (Rautenschlein và cs, 2002) Khi phản ứng viêm mất dần, túi Fabricius teo ñi, các nang rỗng phát triển ở vùng tủy nang túi.Có sự hoại tử và thực bào của các tế bào heterophil và tương bào (plasmocyte), có sự xơ hóa của các tế bào

phân cách các nang Sự tăng sinh tế bào nền biểu mơ cĩ những đám dịch nhầy mucin trên bề mặt

1.1.6 Chẩn đốn bệnh

Cĩ nhiều phương pháp để chẩn đốn bệnh Gumboro đĩ là chẩn đốn bằng phương pháp phân lập virus,chẩn đốn bằng phương pháp huyết thanh học và hiện nay, chẩn đốn bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng phản ứng RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) và Real time PCR (Moody và cs, 2000) RT-PCR là phương pháp hiện đại và chính xác, xác định sự cĩ mặt của một đoạn gen trong hệ gen virus Gumboro cĩ trong bệnh phẩm; real-time PCR xác định hàm lượng RNA thơng tin của virus Gumboro vừa định tính vừa định lượng (Moody và cs, 2000) Phương pháp chẩn đốn nhanh bằng miễn dịch học sắc ký (immunochromatographic test, ICT) cũng

đã được phát triển và ứng dụng hiện nay (Zhang và cs, 2009)

1.1.7 Phịng bệnh Gumboro

Do đặc điểm cấu tạo đặc biệt, IBDV cĩ sức đề kháng rất cao trong tự nhiên, khả năng tồn tại và lan truyền bệnh rất lớn, tính chất dịch tễ bệnh rất phức tạp Các biện pháp vệ sinh thú y, chăm sĩc nuơi dưỡng, kiểm dịch là các biện pháp đĩng gĩp tích cực trong phịng dịch, song chưa hồn tồn ngăn được bệnh xảy ra Biện pháp cơ bản để khống chế bệnh là tạo miễn dịch cho

gà Do bệnh thường xảy ra ở gà con nên việc tạo miễn dịch cho gà con là vơ cùng quan trọng

Cĩ nhiều loại vaccine như vaccine nhược độc cho gà con, vaccine vơ hoạt nhũ dầu cho gà mẹ Một loại vaccine “phức hợp miễn dịch - immune complex” đã được phát triển, trong đĩ các virus vaccine được pha trộn với một số lượng các kháng thể tối ưu (Whitfill và cs, 1995) và được sử dụng để tiêm chủng trong phơi trứng gà (nỗn) Tuy nhiên, cơ chế hoạt động chính xác của vaccine “phức hợp miễn dịch” vẫn chưa được làm sáng tỏ, người ta cho

rằng “phức hợp miễn dịch” làm gia tăng các tế bào tua và ñại thực bào trong nang túi Fabricius, nơi virus tồn tại cho ñến khi giảm lượng kháng thể nhận ñược từ mẹ (Jeurissen và cs, 1998)

Một số loại vaccine vector tái tổ hợp thế hệ mới sử dụng các virus dẫn truyền gen kháng nguyên VP2 hoặc toàn bộ phân ñoạn A của virus Gumboro

ñã ñược thử nghiệm ñó là các loại vaccine có vector dẫn truyền chứa gen kháng nguyên virus Gumboro, cụ thể là vector virus ñậu gà, vector virus herpes của

gà tây, vector adenovirus ở gà, vector virus gây bệnh Marek và vector virus Forest Semliki, hay sử dụng bacteriophageT4 Protein VP2 ñược biểu hiện trong hệ thống baculovirus riêng biệt hoặc cùng với cytokine IL-6; các tiểu phần cấu tạo (giống hạt virus) tương tự virus ñược biểu hiện trong tế bào côn trùng (VLP = virus-like particle) của IBDV, tất cả các loại hình này cũng ñược coi là các vaccine mới cung cấp kháng nguyên miễn dịch trong ñịnh hướng phát triển vaccine phòng chống Gumboro

Một loại hình vaccine thế hệ mới khác là vaccine DNA cũng ñược sử dụng cho việc phòng chống ñối với IBDV, ñó là plasmid ñược thiết kế chứa gen kháng nguyên của virus Gumboro, công nghệ ứng dụng vaccine dạng này

ở Việt Nam cũng ñã ñược tiến hành nghiên cứu (Lê Thanh Hòa, 2006), cũng như vaccine tái tổ hợp gen kháng nguyên VP2 ñã ñược sản xuất và sử dụng trên quy mô lớn Một phương thức mới dựa trên công nghệ cao ñã ñược thử nghiệm ñó là liệu pháp phá bỏ gen RNA thông tin VP2 của virus Gumboro thông qua cơ chế can thiệp RNA (RNA interference, RNAi) nhờ vector dẫn truyền adeno-associated virus

1.2 Miễn dịch học bệnh gumboro

1.2.1 Khái niệm chung

Miễn dịch (Immunity) là khả năng của cơ thể nhận ra và loại trừ các vật

lạ (Vũ Triệu An và Jean, 1998) Vì vậy, khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, cơ thể tự bảo vệ mình trước hết bằng các cơ chế miễn dịch không ñặc

hiệu, tham gia vào cơ chế này gồm có các ựại thực bào, các tế bào giết tự nhiên, hệ thống Propecdin, hệ thống bổ thể, các enzym Sau ựó cơ thể vật chủ sẽ tạo ra ựáp ứng miễn dịch ựặc hiệu

đáp ứng miễn dịch ựặc hiệu là kết quả của sự tương tác phức tạp giữa các kháng nguyên với các tế bào dạng lympho của cơ thể vật chủ, trong ựó trước hết là các lympho bào nhận dạng kháng nguyên lạ và sau ựó là những cố gắng ựể loại trừ những kháng nguyên ựó

Trong quá trình này, hai cơ chế miễn dịch ựặc hiệu và miễn dịch không ựặc hiệu phối hợp chặt chẽ làm tăng sức ựề kháng bảo vệ cơ thể Hệ thống miễn dịch của cơ thể bao gồm các tế bào và cơ quan có thẩm quyền miễn dịch, các cơ quan này tham gia vào cơ chế miễn dịch ựặc hiệu ựồng thời tại các cơ quan ựó cũng là nơi sản sinh, huấn luyện, biệt hoá và tàng trữ các tế bào dạng lympho

Theo Vũ Triệu An (1998) thì những tế bào dạng lympho có thể hợp thành cơ quan có vỏ bọc hay dưới hình thức những tụ nhóm phân tán

Cơ quan thẩm quyền miễn dịch của cơ thể chỉ chiếm một phần rất nhỏ

so với trọng lượng cơ thể (ở người chỉ chiếm 1/60 trọng lượng cơ thể) nhưng

nó có vai trò quan trọng trong cuộc ựấu tranh sinh tồn

Nói về miễn dịch bệnh Gumboro, người ta phải ựề cập tới túi Fabricius

ở gia cầm nói chung và ở gà nói riêng

Túi Fabricius là cơ quan lympho biểu mô nằm ở mặt trong của lỗ huyệt, phắa trên trực tràng Túi Fabricius còn gọi là túi bạch huyết, túi huyệt Túi nhỏ bằng hạt ựậu xanh (lúc gia cầm vài ngày tuổi), bằng hạt lạc (lúc vài tuần tuổi) Túi có cuống thông với trực tràng Túi có nhiều ngăn nhỏ như múi khế tạo nên các xoang chứa tế bào lympho Túi Fabricius là nơi tiếp nhận các nguyên bào lympho, rồi huấn luyện, biệt hoá ựể trở thành lympho B có vai trò quan trọng trong ựáp ứng miễn dịch dịch thể Túi Fabricius và tuyến ức ựóng vai trò chủ yếu trong sự phát triển ựầy ựủ thẩm quyền miễn dịch ở gia cầm, trong

ñó túi Fabricius ñáp ứng về sự hình thành kháng thể trong miễn dịch dịch thể, còn tuyến ức có tác dụng trong miễn dịch trung gian tế bào hoặc hiện tượng quá mẫn chậm

Các tế bào sơ khai của Fabricius và thymus ñã bắt ñầu xuất hiện trong khoảng ngày thứ tư hoặc thứ 5 của giai ñoạn phát triển phôi Tế bào tiền lympho của Bursa có nguồn gốc từ túi lòng ñỏ Lúc phôi gà 19-20 ngày tuổi, Bursa ñã có màng sinh lympho Các nang túi hình thành lúc gà 1 ngày tuổi, nhưng hoàn chỉnh lúc 2 tuần tuổi

Khi gà ñược 2-3 tuần tuổi, Fabricius và thymus phát triển và hoạt ñộng nhịp nhàng Túi teo hoàn toàn khi trọng lượng cơ thể ñạt lớn nhất Theo Glick (1956-1960) túi Fabricius và thymus ñạt kích thước lớn nhất trong khoảng 1-2 tháng tuổi, sau ñó túi Fabricius teo dần

Hiểu ñược quá trình phát triển của túi Fabricius sẽ giải thích ñược khả năng cảm nhiễm bệnh theo tuổi và tầm quan trọng của miễn dịch thụ ñộng trong bệnh Gumboro cũng như việc chọn thời ñiểm thích hợp dùng vacxin ñối với các quần thể gà trong những ñiều kiện dịch tễ khác nhau

1.2.2 Cơ chế miễn dịch chống bệnh Gumboro

Miễn dịch chống bệnh Gumboro ở gà chủ yếu là miễn dịch dịch thể do các tế bào lympho B và túi fabricius ñảm nhiệm Tuy nhiên có sự tham gia của tuyến ức và lách Tế bào có khả năng miễn dịch có nguồn gốc từ tế bào nguồn Sau khi sinh ra, chúng di tản tới các cơ quan lympho trung tâm (túi Fabricius) Tại ñây chúng ñược biệt hoá thành các tế bào lympho B Sau ñó chúng cùng với những tế bào lympho B sinh ra từ túi Fabricius di tản ñến các

cơ quan ngoại biên như lách, thận, gan

Các tế bào lympho B khi bị kháng nguyên kích thích lần ñầu, chúng phân chia biệt hoá thành các nguyên bào lympho B và tiếp tục chuyển hoá thành các nguyên tương bào lympho B (plasmoblaste) và cuối cùng thành các tương bào (plasmocyt) Các tương bào này là những tế bào trực tiếp sản xuất

ra các kháng thể Quá trình này phụ thuộc vào sự kích thích của kháng nguyên

và có sự giúp ñỡ của tế bào lympho T Kháng thể tồn tại trong các dịch sinh học trong cơ thể một thời gian nhất ñịnh

ðương nhiên, lúc ñầu khi kháng nguyên kích thích thì kháng thể không ñược sinh ra ngay mà phải qua một thời gian nhất ñịnh, thường là 5-7 ngày mới xuất hiện và ñạt hàm lượng cao nhất sau 15-21 ngày Kháng thể ñược duy trì một thời gian rồi giảm dần sau vài tháng hoặc vài năm, ñiều này còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như trạng thái sức khoẻ của cơ thể, ñiều kiện ngoại cảnh, ñiều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng Nhưng quan trọng hơn cả vẫn là bản chất của kháng nguyên

Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể lần sau, các tế bào sinh kháng thể lần ñầu chỉ việc “nhớ lại” ñể sinh kháng thể, các kháng thể ñặc hiệu này sẽ kết hợp với kháng nguyên tạo thành một phức hợp kháng nguyên - kháng thể

và kết quả là kháng nguyên bị loại trừ Hiện tượng các tế bào sinh kháng thể

“nhớ lại” gọi là hiện tượng “trí nhớ miễn dịch” Dựa trên cơ chế của hiện tượng này người ta áp dụng cho việc “tiêm phòng nhắc lại”

Theo Becht và cộng sự (1985) thì: Cả hai Serotype của virus Gumboro ñều có kháng nguyên ñặc hiệu type, các kháng nguyên này có khả năng kích thích sản sinh ra kháng thể trung hoà virus Tác giả cũng cho rằng những gà

có kháng thể ñối với virus Gumboro thuộc Serotype 2 không có khả năng bảo

vệ ñể chống lại virus của Serotype 1 Khi nghiên cứu tính gây bệnh của các chủng virus thuộc Serotype 2, Jackwood và cộng sự (1985) cho biết virus thuộc Serotype 2 không gây bệnh cho gà

Trong những nghiên cứu gần ñây, người ta ñã phát hiện ra 5 biến chủng khác nhau của virus Gumboro thuộc Serotype 1 Sự phát hiện ra các biến chủng này ñã nâng cao thêm hiểu biết về sự ñáp ứng miễn dịch của virus Gumboro Theo Saif (1984) thì: các biến chủng có nguồn gốc phân lập từ gà ñều có kháng thể trung hoà với virus Gumboro thuộc Serotype 1 Các tác giả

trên cũng cho rằng: Vacxin vô hoạt và vacxin nhược ñộc sản xuất từ virus biến chủng phân lập trong ổ dịch tự nhiên ñều có khả năng bảo hộ gà chống lại bệnh do các chủng chuẩn và các biến chủng gây ra Trong khi ñó các vacxin vô hoạt chế từ các chủng chuẩn lại không bảo hộ cho gà khi công cường ñộc bằng các biến chủng

Khi nghiên cứu về miễn dịch chống bệnh Gumboro, người ta thường ñề cập tới miễn dịch chủ ñộng và bị ñộng Hai loại miễn dịch này phải ñược phối hợp chặt chẽ trên cơ sở tạo sự miễn dịch cho ñàn gà nhằm bảo vệ chúng chống lại bệnh một cách tốt nhất ñặc biệt ñối với gà dưới 8 tuần tuổi (tuổi mẫn cảm với virus Gumboro)

Túi Fabricius, nơi xảy ra quá trình sinh bệnh, cũng là nơi sản sinh miễn dịch dịch thể chống bệnh Gumboro cho nên miễn dịch thụ ñộng ñược ñặt lên hàng ñầu Miễn dịch thụ ñộng là sự trang bị kháng thể dịch thể cần thiết, ngăn cản sự nhiễm virus Gumboro ở lứa tuổi còn non nhưng ñồng thời có thể gây trở ngại cho sự kích thích ñáp ứng miễn dịch chủ ñộng

Kháng thể thụ ñộng có tác dụng ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus cường ñộc Gumboro gây bệnh ở gà con trong những ngày tuổi ñầu, và ñồng thời chống lại sự suy giảm miễn dịch do virus Gumboro gây ra Ở những gà con ñã có kháng thể thụ ñộng từ mẹ truyền sang, ngay cả những gà có hàm lượng kháng thể thụ ñộng rất cao nhưng khi bị nhiễm virus cường ñộc

Gumboro thì chúng cũng không bảo vệ ựược túi Fabricius , virus cường ựộc vẫn nhân lên ựược ở trong túi song ở những gà này không biểu hiện lâm sàng của bệnh

Lukert và Rifuliadi (1982) ựã làm thắ nghiệm công cường ựộc Gumboro cho gà con một ngày tuổi có hiệu giá trung hoà bình quân là 1:654

và cho biết ựã phân lập ựược virus cường ựộc Gumboro ở vùng trung tâm nang túi ngay sau khi gây nhiễm 3 ngày và virus tồn tại tới 14 ngày tuổi đó

là lý do tại sao ở những vùng không an toàn dịch người ta khuyến cáo các nhà chăn nuôi nên sử dụng một loại vacxin nhược ựộc cho gà con từ lúc một ngày tuổi ngay tại nhà ấp trước khi gà con tiếp xúc với môi trường (Rhone Merieux, 1992) Liều vacxin này không có ý nghĩa kắch thắch cơ thể sản sinh miễn dịch chủ ựộng phòng bệnh Gumboro, mà chỉ ựể ựảm bảo cho túi fabricius của toàn bộ số gà con nở ra ựều ựược virus vacxin chiếm lĩnh thay cho việc túi fabricius bị virus cường ựộc tấn công

Hàm lượng kháng thể thụ ựộng trong cơ thể gà con phụ thuộc vào khoảng thời gian từ khi dùng vacxin cho gà mẹ ựến khi gà ựẻ trứng Khi dùng vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh Gumboro cho gà mẹ sẽ kắch thắch tạo ra lượng kháng thể thụ ựộng ở gà con ựủ bảo hộ chúng trong 4 ựến 5 tuần ựầu Theo Skeeles và cộng sự (1979) kháng thể thụ ựộng có trong gà con giảm ựi 1/2 sau 3 - 5 ngày tuổi và sau 7 - 10 ngày thì ựào thải hoàn toàn ra khỏi cơ thể

Khi hiệu giá kháng thể Gumboro nhỏ hơn 1:100 thì 100% ựàn gà mẫn cảm với virus Gumboro, nghĩa là ựàn gà có khả năng nhiễm bệnh Hiệu giá

từ 1:100 ựến 1:600 ựàn gà ựược bảo hộ 40%, còn nếu hiệu giá kháng thể trên 1:600 thì ựàn gà ựược bảo hộ tốt

Việc nghiên cứu kháng thể thụ ựộng của gà con cho phép xác ựịnh thời ựiểm và số lần dùng vacxin thắch hợp ựể bảo hộ ựược ựàn gà không mắc bệnh Gumboro Cũng như nhiều bệnh khác, miễn dịch thụ ựộng trong bệnh

Gumboro ở gà có thể gây trở ngại cho sự kích thích ñáp ứng miễn dịch chủ ñộng Vì vậy việc chọn thời ñiểm thích hợp ñể dùng vacxin cho gà con tới nay vẫn là vấn ñề phức tạp

ðể vacxin nhược ñộc ñưa vào cho cơ thể gà con không hoặc ít bị trung hoà bởi kháng thể thụ ñộng, thì hàm lượng kháng thể thụ ñộng phải nhỏ hơn 1:64 (Skeeles và cộng sự, 1979) Thời gian bán huỷ của kháng thể thụ ñộng truyền từ gà mẹ sang là ±4 ngày Kết quả nghiên cứu của Narin và cộng sự cũng cho biết thời gian bán huỷ của kháng thể thụ ñộng là 3,8 ngày

1.2.2.2 Miễn dịch chủ ñộng

Miễn dịch chủ ñộng là trạng thái miễn dịch của cơ thể do bộ máy miễn dịch của bản thân cơ thể ñó sinh ra khi ñược kháng nguyên kích thích (Vũ Triệu An và Jean, 1998)

Miễn dịch chủ ñộng chống bệnh Gumboro là loại miễn dịch thu ñược sau khi gà mắc bệnh khỏi hoặc sau khi gà ñược tiêm chủng bằng vacxin nhược ñộc hoặc vacxin vô hoạt

Biện pháp tạo miễn dịch bằng cách ñưa vacxin vào cơ thể gia cầm là biện pháp phòng bệnh tích cực Vacxin sau khi vào cơ thể, ñến các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch, kích thích cơ thể sản sinh ra các kháng thể ñặc hiệu Những kháng thể này tồn tại trong các dịch sinh học trong cơ thể (máu, hệ thống bạch huyết)

Thông thường gà mái ñẻ ñược tiêm vacxin vô hoạt nhũ dầu, ñàn gà con ñược chủng vacxin nhược ñộc

Kháng thể Gumboro do vacxin kích thích tạo ra có thể ñược phát hiện sau khi dùng vacxin 14 ngày và ñến 24 ngày 100% số gà trong ñàn có kháng thể , kiểm tra sau nhiễm 2-5 tuần cho kết quả là kháng thể trung hoà trong lòng ñỏ cao hơn trong huyết thanh gà bố mẹ cũng như gà con mới nở

Sự xuất hiện kháng thể dịch thể Gumboro trong máu có thể phát hiện

và ñịnh lượng bằng các phản ứng huyết thanh học, khi gà khỏi bệnh hàm

lượng kháng thể trung hoà virus thường cao hơn 1:1000 (Lukert và cộng sự,1991) Gà ở ñộ tuổi còn non sau khi tiếp xúc với virus vacxin bằng ñường miệng là có thể tạo ra kháng thể, nhưng ở gà có ñộ tuổi lớn hơn thì phải ñưa vacxin vào ñường tiêm bắp hoặc dưới da mới tạo ra ñược kháng thể

Khi hiệu giá kháng thể trung hoà trong cơ thể gà lớn hơn 600 (> 600) thì gà có khả năng chống lại công cường ñộc (Hitchner, 1970) Trong ñiều kiện sức khoẻ cơ thể bình thường, việc áp dụng chủng loại vacxin ñúng bệnh, ñúng liều, ñúng thời ñiểm và vacxin có chất lượng tốt thì hầu như bao giờ cũng tạo ñược miễn dich cao và ñặc hiệu cho ñàn gà

Ở các trại gà sinh sản, việc áp dụng quy trình khép kín bằng vacxin ñã tạo cho ñàn gà có sức miễn dịch tốt chống lại bệnh

Theo Kozlina( 1989) nếu gà con ñược uống vacxin Gumboro nhược ñộc lúc 2 – 4 tuần tuổi thì hiệu giá kháng thể bảo hộ kéo dài tới 45 tuần tuổi và thế

hệ gà con nhận ñược kháng thể thụ ñộng một cách ñầy ñủ

Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

2.1.1 Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm kháng thể chống Gumboro

- Nghiên cứu quy trình gây tối miễn dịch cho gà mẹ

- Xây dựng quy trình thu hoạch và kiểm nghiệm chế phẩm

- Xác ñịnh thời gian thu hoạch trứng sản xuất chế phẩm sau khi gây tối miễn dịch trên ñàn gà

2.1.2 Kiểm tra một số chỉ tiêu của chế phẩm

- Xác ñịnh chỉ tiêu vô trùng của chế phẩm

- Xác ñịnh chỉ tiêu an toàn của chế phẩm

- Xác ñịnh hiệu lực của chế phẩm

- Xác ñịnh ñộ dài miễn dịch của chế phẩm

2.1.3 Bước ñầu ứng dụng thử nghiệm chế phẩm trong phòng và ñiều trị bệnh Gumboro ở gia cầm

2.2 Nguyên liệu

 Giống virus

- Chủng virus vacxin Gumboro vô hoạt nhũ dầu

- Chủng virus Gumboro cường ñộc CVL 52/70 do Ban giống, Xí nghiệp thuốc Thú y Trung ương cung cấp

 Phôi gà 9-11 ngày tuổi

Dùng ñể làm tế bào sơ phôi gà một lớp Chọn phôi khoẻ mạnh từ ñàn gà sạch bệnh, không mắc các bệnh truyền nhiễm

 Dụng cụ và hóa chất thường quy trong phòng thí nghiệm vi sinh vật

 Dụng cụ và hóa chất nuôi cấy tế bào fibroblast phôi gà

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp gây tối miễn dịch cho ñàn gà mái ñẻ ñể lấy trứng sản xuất chế phẩm kháng thể chống bệnh Gumboro

Tiến hành gây tối miễn dịch trên 3 lô gà theo 3 quy trình khác nhau Mỗi lô sử dụng 10 gà mái ñẻ khoẻ mạnh, chưa ñược tiêm vacxin Gumboro

∗ Quy trình 1: Trên lô gà 1

Tiến hành tiêm vacxin Gumboro vô hoạt nhũ dầu cho 10 gà mái ñẻ 2 lần, mỗi lần cách nhau 1 tuần với liều 1ml/con Sau14 ngày, tiêm chủng virus Gumboro cường ñộc 3 lần với liều 100TCID50/50µl, mỗi lần cách nhau 1 tuần, kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phương pháp trung hòa

∗ Quy trình 2: Trên lô gà 2

Tiến hành tiêm vacxin Gumboro vô hoạt nhũ dầu cho 10 gà mái ñẻ 3 lần, mỗi lần cách nhau 1 tuần với liều 1ml/con Sau 14 ngày, tiêm chủng virus Gumboro cường ñộc 3 lần với liều 100TCID50/50µl, mỗi lần cách nhau 1 tuần, kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phương pháp trung hòa

∗ Quy trình 3: Trên lô gà 3

Tiến hành tiêm vacxin Gumboro vô hoạt nhũ dầu cho 10 gà mái ñẻ 4

lần, mỗi lần cách nhau 1 tuần với liều 1ml/con Sau 14 ngày, tiêm chủng virus Gumboro cường ñộc 3 lần với liều 100TCID50/50µl, mỗi lần cách nhau 1 tuần, kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phương pháp trung hòa

2.3.2 Phương pháp lấy máu và chế huyết thanh

- Cách lấy máu: dùng kim tiêm ñã vô trùng lấy máu ở tĩnh mạch cánh của gà, mỗi con lấy 1ml máu, sau ñó bơm từ từ vào ống nghiệm vô trùng

- ðể máu tự ñông ở nhiệt ñộ phòng sau ñó ñưa vào tủ lạnh 40C ñể huyết thanh tách ra

- Dùng kim tiêm vô trùng hút lấy phần huyết thanh bên trên, ñóng vào ampoul, ghi nhãn ñánh dấu từng mẫu, sau ñó ñể tủ lạnh (-200C)

2.3.3 Phương pháp làm phản ứng trung hoà trên tế bào xơ phôi gà một lớp

* Chuẩn bị tế bào xơ phôi gà 1 lớp CEF trên các ñĩa nhựa 96 giếng

Nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 1 lớp: Trứng gà có phôi ñược ấp 10 ± 1 ngày tuổi ñược thu hoạch thai Sử dụng panh, kéo vô trùng cắt bỏ ñầu thai, chân, cánh, loại bỏ hết nội tạng, rửa sạch bằng dung dịch PBS Cắt nhỏ thai và tách tế bào bằng dung dịch Trypsin 0,25% trên máy khuấy từ trong vòng 30 phút, gạn phần tế bào ñã tách, giữ ở 40C ñể dừng hoạt ñộng của Trypsin Phần còn lại tiếp tục tách cho ñến hết tế bào Sau khi tách, ly tâm loại bỏ Trypsin, rửa tê bào 3 lần bằng PBS, pha loãng, ñếm số, chia tế bào thu ñược vào môi trường nuôi cấy tế bào, chia ra các chai nuôi và nuôi cấy ở nhiệt ñộ 350C Hàng ngày kiểm tra sự phát triển của tế bào bằng kính hiển vi Khi tế bào mọc trên 80% diện tích bề mặt nuôi cấy thì ñược sử dụng làm phản ứng trung hoà

* Chuẩn bị kháng thể pha loãng: Sử dụng một ñĩa nhựa 96 giếng ñể

pha loãng kháng thể Cho 50µl môi trường vào tất cả các giếng của ñĩa nhựa

96 giếng, trừ hàng ñầu tiên Cho 90µl môi trường MEM và 10µl mẫu Kháng thể Gum vào giếng ñầu tiên (hàng ñầu) Mẫu ñược pha loãng 1/10 Sử dụng 1 hàng của ñĩa nhựa chuẩn ñộ ñể kiểm tra ñối chứng huyết thanh, ñối chứng tế bào và kiểm tra lại nồng ñộ virus Trộn ñều mẫu ở hàng ñầu tiên, sau ñó

chuyển 50µl sang hàng kế tiếp, cứ thế tiếp tục cho ñến hàng cuối cùng thì bỏ (pha loãng theo cơ số 2)

* Chuẩn bị kháng nguyên cố ñịnh: Chuẩn bị virus Gumboro dùng trong

phản ứng là 100TCID50/50µl Cho 50µl virus Gumboro cường ñộc chủng CVL 52/70vào tất cả các giếng (trừ hàng ñối chứng) ðể ñĩa nhựa 96 giếng ở nhiệt ñộ phòng trong 30 phút ñể kháng thể trung hoà kháng nguyên

* Gây nhiễm cho giếng tế bào và ñọc kết quả:

Sử dụng hỗn dịch kháng nguyên – kháng thể ñể gây nhiễm cho tế bào

xơ phôi gà Xác ñịnh bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi Hiệu giá kháng thể của mẫu ñược xác ñịnh ở nồng ñộ pha loãng cao nhất của mẫu kiểm tra mà ở

ñó có thể trung hòa virus Gumboro (Hay nói cách khác hiệu giá kháng thể của mẫu ñược xác ñịnh ở nồng ñộ pha loãng cao nhất của mẫu kiểm tra mà ở

ñó không có CPE)

2.3.4 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng chế phẩm

Chế phẩm trước khi ñưa vào thí nghiệm cần kiểm tra tính vô trùng và phải ñảm bảo ñược sự thuần khiết của chế phẩm

Tiến hành với 3 lô chế phẩm sản xuất thử nghiệm Mỗi lô chế phẩm ñều ñược tiến hành nuôi cấy trên các môi trường: nước thịt, thạch thường, thạch máu, nước thịt gan yếm khí, thạch nấm

Số lượng mỗi loại môi trường là 3 ống/1 lô chế phẩm

Hút 0,2ml chế phẩm cấy vào các ống môi trường

ðể tủ ấm 370C/24 – 48h, kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn

Riêng môi trường thạch nấm sau khi cấy chế phẩm ta ñể ở nhiệt ñộ phòng (25 - 270C) trong 5 - 7 ngày.Sau ñó ñem kiểm tra xem nấm có phát triển không

2.3.5 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu an toàn của chế phẩm

ðể kiểm tra chỉ tiêu an toàn của 3 lô chế phẩm chúng tôi tiến hành nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và trên thực tế ñàn gà của các hộ chăn nuôi

* Trong phòng thí nghiệm: chúng tôi tiến hành trên 3 lô gà con 21–30 ngày