Tế bào động vật đầu tiên được trồng nhuan

Khi đình chỉ này của các tế bào đơn được trộn với huyết tương và chiết xuất phôi thai và được đặt trong một thùng chứa thủy tinh vô trùng, các tế bào tôn trọng kính và chia để hình thành

Tế bào động vật đầu tiên được trồng trong ống nghiệm vào đầu thế kỷ XX Năm 1912, Alexis Carrel bắt đầu phát triển bit của gà tim trong giọt huyết tương ngựa Các tế bào ở rìa của cấy chia

và phát triển từ các cục máu đông trong huyết tương Các mẫu cấy chết trong vòng một vài ngày,

và Carrel lý luận rằng cái chết của họ là do cạn kiệt chất dinh dưỡng Ông phát hiện ra rằng các

tế bào từ một mẫu cấy cho có thể được duy trì vô thời hạn nếu họ được định kỳ phân chia và cho

ăn chiết xuất dung dịch nước vô trùng của phôi toàn bộ gà

Trong đầu những năm 1950, Earle (2) phát triển một kỹ thuật để phân tách các tế bào của một toàn bộ gà phôi thai từ nhau với trypsin Khi đình chỉ này của các tế bào đơn được trộn với huyết tương và chiết xuất phôi thai và được đặt trong một thùng chứa thủy tinh vô trùng, các tế bào tôn trọng kính và chia để hình thành một nền văn hóa chính Văn hóa tiểu học có nhiều loại tế bào bao gồm các đại thực bào, các sợi cơ, vv Một số loại tế bào tăng lên một lớp đơn, một lớp mỏng

tế bào một lớp dày, bao phủ toàn bộ bề mặt đáy của tàu văn hóa của họ và sau đó dừng lại phân chia Các tế bào sau đó có thể được redispersed với trypsin và trồng trong mạch văn hóa mới có chứa môi trường mới Những nền văn hóa thứ cấp có loại tế bào ít hơn so với các nền văn hóa tế bào, như rất nhiều các tế bào sơ cấp khác biệt đã không chia và được pha loãng ra khi chuyển giao Thông thường, các nền văn hóa thứ cấp được cấu tạo hoàn toàn của các tế bào trục chính hình được gọi là nguyên bào sợi vì tương đồng với mô liên kết văn hóa Các tế bào có nguồn gốc

từ thận và ung thư từ nhất định đã có một sự xuất hiện đa giác trong văn hóa Vì mô xuất xứ của mình, họ và các tế bào khác với hình thái tương tự được gọi là biểu mô

Mục đích

Nuôi cấy tế bào là điều cần thiết cho sự phát triển của virus bởi vì họ là ký sinh trùng nội bào bắt buộc; họ không thể tái tạo trong bất kỳ phương tiện di động miễn phí, và họ yêu cầu các tế bào sống từ một máy chủ phù hợp trong đó để nhân lên Động vật như chuột và trứng gia cầm có phôi có thể được sử dụng cho công tác tuyên truyền của virus, nhưng vì nhiều lý do (thời gian, chi phí, tính đồng nhất, dễ xử lý, quyền lợi động vật, vv), công tác tuyên truyền của hầu hết các virus trong tế bào sống văn hóa là phương pháp lựa chọn ngày hôm nay Nuôi cấy tế bào cũng được sử dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp và nhiều xét nghiệm trong ống nghiệm Trong thực tế hầu hết những gì chúng ta biết về chức năng và quy định của các gen động vật có vú xuất phát từ gen nghiên cứu chuyển nạp vào tế bào (3)

Lý thuyết

Các tế bào có thể được trồng trong ống nghiệm bằng nhiều cách Nền văn hóa cơ quan, nếu xử lý cẩn thận, duy trì kiến trúc và chức năng ban đầu của họ trong nhiều ngày hoặc đôi khi tuần.Lát của các cơ quan (mà trên thực tế nuôi cấy mô) bao gồm biểu mô đường hô hấp đã được sử dụng

để nghiên cứu histopathogenesis nhiễm virus đường hô hấp nào đó mà chỉ có thể được phát triển bên ngoài vật chủ tự nhiên của họ trong mô tổ chức phức tạp Văn hóa mô hạn ban đầu được áp dụng cho cấy mô nhúng trong huyết tương Thuật ngữ này sau đó trở thành kết hợp với văn hóa của các tế bào nói chung và bây giờ là lỗi thời trong ý nghĩa ban đầu của nó Nuôi cấy tế bào là một thuật ngữ được sử dụng đúng nhất hiện nay Nó đề cập đến mô liên hợp thành một hệ thống treo của các tế bào duy nhất của cả hai phương tiện cơ khí và enzym Sau khi được rửa sạch và tính, các tế bào được pha loãng trong môi trường phát triển và cho phép giải quyết lên bề mặt đáy phẳng của một thủy tinh hoặc điều trị đặc biệt thùng nhựa Hầu hết các loại tế bào tuân thủ

một cách nhanh chóng, và trong điều kiện tối ưu họ sẽ trải qua quá trình nguyên phân và phân chia tế bào về mỗi ngày một lần cho đến khi bề mặt được bao phủ bởi một lớp đơn bào hợp lưu Các tế bào này tạo thành một nền văn hóa chính Những tế bào này thường được lấy ra từ bề mặt mà họ đang phát triển với sự kết hợp của trypsin và một đại lý chelating như EDTA, tính, pha loãng, và replated trong container mới với môi trường mới Này được gọi là một nền văn hóa thứ cấp

Có ba loại chính của tế bào nuôi cấy Sự khác biệt trong các loại nằm trong số lần các tế bào có thể phân chia

1 Nuôi cấy tế bào tiểu học

Khi các tế bào được lấy từ mô động vật tươi và được đặt trong nền văn hóa, các nền văn hóa bao gồm một loạt các loại tế bào, hầu hết trong số đó là có khả năng tăng trưởng rất hạn chế trong ống nghiệm, thường là ít hơn mười đơn vị Các tế bào nhiễm sắc thể lưỡng bội của họ giữ lại, nghĩa là, họ có số lượng nhiễm sắc thể và hình thái của mô xuất xứ của mình Họ cũng giữ lại

một số đặc điểm khác biệt mà họ sở hữu trong cơ thể Bởi vì điều này, các tế bào này hỗ trợ việc

nhân rộng một loạt các vi rút Nền văn hóa chính bắt nguồn từ thận khỉ, bào thai chuột, và phôi

gà thường được sử dụng cho mục đích chẩn đoán và phòng thí nghiệm

2 Chủng tế bào lưỡng bội

Một số tế bào sơ cấp có thể được thông qua thông qua cấy truyền sau trung học và một số trong khi giữ lại đặc điểm hình thái ban đầu của họ và nhiễm sắc Tiểu văn hóa sẽ có các loại tế bào ít hơn các nền văn hóa chính Sau 20 đến 50 đoạn trong ống nghiệm, các chủng tế bào lưỡng bội thường trải qua một cuộc khủng hoảng, trong đó tốc độ tăng trưởng của họ chậm lại và cuối cùng

họ chết ra ngoài Chủng lưỡng bội các nguyên bào sợi có nguồn gốc từ các mô bào thai của con người được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán virus học và sản xuất vắc xin

3 Dòng tế bào liên tục

Một số tế bào nuôi cấy, đặc biệt là các nguyên bào sợi chuột bào thai, tế bào thận từ các loài động vật có vú khác nhau, và các tế bào ung thư của con người, có thể tồn tại cuộc khủng hoảng tăng trưởng và trải qua công tác tuyên truyền không xác định trong ống nghiệm Sau nhiều đoạn, tốc độ tăng trưởng của nền văn hóa chậm; sau đó bị cô lập thuộc địa của các tế bào bắt đầu phát triển nhanh hơn so với các tế bào lưỡng bội, nhiễm sắc của họ trở nên bất thường (aneuploid), thay đổi hình thái của họ, và những thay đổi chưa được hiểu rõ khác diễn ra mà làm cho các tế bào bất tử Các tế bào đang "dedifferentiated," đã mất hình thái học chuyên ngành và khả năng sinh hóa mà họ sở hữu như tế bào đã biệt trong cơ thể Dòng tế bào liên tục như KB và HeLa, cả hai bắt nguồn từ ung thư của con người, hỗ trợ sự tăng trưởng của một số vi rút Những dòng này

và những người khác bắt nguồn từ thận khỉ (ví dụ, Vero), bào thai chuột (L929), và thận chuột (BHK) được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán virus học và thực nghiệm Dòng tế bào liên tục đã được thiết lập từ nhiều loại vật có xương sống và không xương sống và mô động vật có sẵn từ các Bộ sưu tập Văn hóa Loại Mỹ

Sự phát triển của kháng sinh trong Thế chiến II đơn giản nuôi cấy tế bào động vật lâu dài bằng

cách giảm thiểu các vấn đề về ô nhiễm vi khuẩn và nấm Eagle thực hiện một khám phá quan trọng trong những năm 1950 khi ông xác định các yêu cầu dinh dưỡng tối thiểu của các tế bào nuôi cấy (1) Ông bắt đầu bằng cách hiển thị các tế bào HeLa L và chuột sẽ tăng trưởng trong một hỗn hợp của muối, axit amin, vitamin và yếu tố then, carbohydrate, và huyết thanh

ngựa.Bằng cách loại bỏ một thành phần tại một thời gian, sau đó ông xác định được các chất dinh dưỡng rất cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào Trung bình cần thiết tối thiểu của mình (MEM) có chứa 13 axit amin (các mô trong cơ thể con người chỉ có tám yêu cầu), 8 loại vitamin

và yếu tố then, glucose như một nguồn năng lượng, và một dung dịch muối sinh lý đẳng trương

là đến các tế bào Độ pH được duy trì ở mức 7,2-7,4 bởi NaHCO3 cân bằng với CO 2. Độ pH chỉ số phenol đỏ thường được kết hợp vào môi trường; nó chuyển sang màu đỏ-tím nếu các phương tiện

cơ bản, vàng nếu các phương tiện có tính axit, và vẫn còn màu đỏ cam nếu độ pH trong phạm vi quyền.Huyết thanh ở nồng độ từ 1 đến 10% phải được thêm vào môi trường để cung cấp các tế bào với các yếu tố kém được xác định bổ sung, mà không có hầu hết các tế bào sẽ không phát triển.Hầu hết các tế bào động vật có vú được ủ ở 37 o C; các tế bào gia cầm, bò sát, động vật chân đốt và có thể phát triển tốt nhất ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn Nếu tế bào được trồng trong các mạch với khí quyển, vườn ươm của họ phải được làm ẩm và chứa một tăng nồng độ

CO 2.Một số phosphate không bay hơi hoặc thay thế các bộ đệm axit sulfonic (HEPES, TES) loại

bỏ các yêu cầu cho các vườn ươm được cung cấp nhiên liệu với CO 2. Container chặt kín cũng loại bỏ nhu cầu CO 2. Các điều kiện khác cần thiết cho sự tăng trưởng của các tế bào trong nền văn hóa là một bề mặt rắn cực âm tính (một số tế bào ung thư có thể được điều chỉnh để phát triển trong hệ thống treo) và nồng độ tối thiểu là 2 x 05-ngày 05 Tháng 10 x 10 5 tế bào mỗi ml trung bình hoặc cm 2 của khu vực tăng trưởng

Với sự ra đời của nền văn hóa tế bào, nhiều virus động vật đã được tuyên truyền trong ống nghiệm, và hàng trăm loại virus trước đó chưa biết đã được phân lập và xác định Việc phát hiện

ra các adenovirus, echovirus, và rhinoviruses, ví dụ, liên quan trực tiếp đến việc sử dụng tế bào nuôi cấy, như là cuộc cách mạng trong việc chẩn đoán bệnh của virus và sự phát triển của bệnh bại liệt, sởi, rubella, và vắc-xin khác

Nghị định thư

A Văn hóa của chính Chick nguyên bào sợi phôi (CEF)

Vật liệu

Trứng có phôi đến 12 ngày tuổi - 10

Kẹp và kéo

Đĩa petri vô trùng

Tiệt trùng bình nón 125 ml với thanh khuấy từ

Vô trùng 25 cm 2 bình chứa MEM cộng với 10% huyết thanh thai bê

Vô trùng 0,5% trypsin trong Saline Một

Vô trùng ống ly tâm 15 ml có chứa 0,5 ml huyết thanh

Hemacytometers

Ống hút 1 ml và 10 ml

Vô trùng Saline Một

Thủ tục

1 Khử trùng bề mặt của trứng trên túi khí Bằng kéo hoặc cùn cấp của một kẹp, phá vỡ vỏ trên túi khí Khử trùng kẹp bằng cách nhúng trong rượu và lửa Kẹp mát, sau đó bóc bỏ vỏ trên túi khí, khử trùng kẹp một lần nữa, và kéo trở lại màng vỏ và màng chorioallantoic để lộ phôi

2 Resterilize các kẹp, nắm bắt các phôi lỏng lẻo quanh cổ, và loại bỏ toàn bộ phôi từ trứng đến

một đĩa petri vô trùng

3 Sử dụng hai kẹp hoặc kéo cộng với một kẹp, decapitate và mổ bụng phôi Mince xác chết phôi thành các mảnh rất nhỏ với một kéo

4 Thêm khoảng 10 ml vô trùng Saline A đến mảnh khăn giấy vào đĩa petri, xoáy nhẹ

nhàngtrong vòng 1 đến 2 phút để resuspend và rửa mảnh vỡ, và cẩn thận đổ toàn bộ nội dung

vào 125 ml Erlenmeyer bình Bình nghiêng, cho phép các mảnh vỡ để giải quyết, và nhẹ nhàng gạn nước muối Loại bỏ muối

5 Thêm 10 ml dung dịch trypsin ấm áp vô trùng để các mảnh vỡ trong bình, đậy nắp, và khuấy từ từ với thanh từ 5 đến 10 phút Bình nghiêng, cho phép các mảnh vỡ để giải quyết, và

đổ treo trypsin-cell vào ống ly tâm 15 ml có chứa 0,5 ml huyết thanh Huyết thanh có chứa một chất ức chế trypsin mà sẽ ngăn chặn thiệt hại thêm cho màng tế bào bởi các enzyme

6 Thêm 10 ml trypsin ấm áp vô trùng để các mảnh vỡ và lặp lại bước 5 Vào cuối điều trị thứ hai này, kích thước của các mảnh mô này sẽ được giảm đáng kể và một số lượng lớn các tế bào đơn

lẻ nên bị đình chỉ trong trypsin (Lưu ý: nó là thích hợp hơn để điều trị các mô với nhiều ứng dụng ngắn của trypsin, tuy nhiên, nếu thời gian là một hạn chế, ví dụ như trong một lớp học trong phòng thí nghiệm, phương pháp này sẽ làm việc)

7 Trực quan khối lượng cân bằng trong ống ly tâm (chuyển chất lỏng nếu cần thiết) và ly tâm ở

1500 rpm trong 10 phút Cẩn thận gạn và loại bỏ nổi, resuspend viên di động gộp lại trong tổng

số 5 ml MEM (Resuspend các viên trong một ống, sau đó chuyển việc đình chỉ vào ống thứ hai

và resuspend viên đó.) Trộn đều cho tính trong một hemacytometer Hãy chắc chắn để giữ cho

hệ thống treo di động của bạn vô trùng

8 Trong hầu hết các hemacytometers, mỗi vuông nặng nề khắc (bao quanh bởi các đường đôi hoặc gấp ba và chứa hoặc 16 hoặc 25 hình vuông nhỏ hơn) là 1 mm mỗi bên và 0,1 mm sâu Vì vậy, khu vực này là 1 mm 2 và khối lượng là 0,1 mm 3 (Hình 1) Sau khi ly tâm, các tế bào phải được đóng gói trong một viên chặt chẽ ở dưới cùng của mỗi ống

9 Đặt trượt che trên đầu trang của hemacytometer, cầu nối trên hai cánh tay thủy tinh bên cạnh

mô hình khắc Thêm một giọt treo tế bào đều bị đình chỉ để các rãnh trong giai đoạn

hemacytometer và cho phép nó để điền vào các buồng dưới trượt nắp Kiểm tra với mục tiêu 10X Nếu có quá nhiều tế bào để đếm (> 200), thực hiện một pha loãng 1:10 của dịch treo tế bào trong MEM (0,1 ml dịch treo tế bào cộng với 0,9 ml MEM) để đếm

Ví dụ sau đây cho thấy làm thế nào để chuyển đổi số di động của bạn với nồng độ của các tế bào trong hệ thống treo ban đầu của bạn Giả sử bạn đã thực hiện một pha loãng 1:10, sau đó tính tổng số 168 tế bào trong một 16-vuông lưới điện:

168 x 10 4 x 10 = 1.68 x 10 7 tế bào / cm 3

Không từng kỳ hạn có nghĩa là gì?

168 là số lượng tế bào trong lưới điện

x 10 4 chuyển đổi các tế bào mỗi ml (10 4 là số 0,1 mm 3 trong 1 cm 3 (1 ml))

x 10 tài khoản cho pha loãng

1,68 x 10 7 tế bào / ml (cm 3) là số lượng tế bào trong hệ thống treo ban đầu của bạn

Lưu ý: nếu một số thực sự chính xác là cần thiết nó là phong tục để đếm nhiều hơn một

1-mm 2lưới, sau đó lấy trung bình của số lượng các lưới tính

10 Tính toán những gì khối lượng của dịch treo tế bào ban đầu bạn sẽ cần phải thêm vào các môi trường phát triển trong bình để cung cấp cho giữa 2 x 10 5 và 8 x 10 5 tế bào / ml (~ 5 x 105 tế bào / ml) (Gợi ý: nếu bạn có 5 ml môi trường phát triển trong bình, bạn cần tổng cộng 5 ml x 5 x

10 5 tế bào / ml = 2,5 x 10 6 tế bào.) Thêm khối lượng thích hợp của dịch treo tế bào gốc (không

phải là 1 : 10 pha loãng, nếu bạn làm một) vào môi trường trong bình của bạn

11 Hãy chắc chắn để kiểm tra nuôi cấy tế bào cả vĩ mô và kính hiển vi mỗi ngày Tế bào phát triển tích cực sản xuất axit chuyển hóa các sản phẩm và phương tiện của họ sẽ trở thành màu vàng, và do đó độ pH của môi trường có thể cần phải được điều chỉnh bằng cách cho thêm một giọt hoặc hai trong số 7,5% NaHCO3. Nếu nổi tế bào (đã chết) và các mảnh vỡ có mặt hay màu sắc của môi trường chỉ ra độ pH cơ bản, môi trường nên được thay đổi

FIG 1 Hemacytometer (cải thiện Neubauer đếm buồng).

B Chuyển các nền văn hoá di động

Sau khi các tế bào nuôi cấy đã hình thành một lớp đơn hợp lưu trên bề mặt của tàu văn hóa của

họ, họ có thể được loại bỏ khỏi bề mặt, pha loãng, và hạt giống vào tàu mới Nếu văn hóa ban đầu là chính, các nền văn hóa mới được gọi là trung học và có khả năng bao gồm các loại tế bào

ít hơn Loại bỏ các tế bào từ các bề mặt thủy tinh hoặc nhựa có thể là do một trong hai phương pháp vật lý cào với một cảnh sát vô trùng cao su hoặc các phương pháp hóa học enzyme phân giải protein hoặc các đại lý chelating hoặc một sự kết hợp của cả hai Sau khi loại bỏ, các tế bào được pipetted lên xuống so với đáy bình để phá vỡ khối, pha loãng, và tính Nền văn hóa chính thường có thể được pha loãng 1:02 hoặc 1:03 cho nuôi trung học, và sau khi một người trở thành quen thuộc với các đặc điểm phát triển của một loại tế bào nhất định, tính thường

có thể được phân phối với

Các thủ tục tương tự có thể được sử dụng để chuyển các tế bào tiểu học và một dòng tế bào liên tục, loại bỏ các tế bào từ bình với một hỗn hợp của trypsin và EDTA trong nước muối sinh lý (STE là viết tắt của mặn, trypsin, EDTA)

Thủ tục

1 Kiểm tra các tế bào phát triển trong 25 cm 2 bình bằng kính hiển vi đảo ngược để xem họ đã thành lập một đơn lớp tế bào hợp lưu Nếu có đủ các tế bào, đổ ra môi trường

2 Rửa lớp tế với 2 ml Saline A Rửa sạch tốt mà không có rung (rung sản xuất bong bóng) và đổ

ra Lặp lại

3 Thêm 1,0 ml STE vào bình và ủ ở 37 o C trong 2-10 phút với STE bao gồm các tế bào Quan sát định kỳ để xác định khi các tế bào được nới lỏng từ nhựa (Lưu ý: STE sẽ chứa một chỉ số pH

và cần phải có độ pH 7,0-8,0 Dưới đây pH 7,0 trypsin không hoạt động pH trên 8.0 là gây tổn hại đến các tế bào )

4 Khi các tế bào được xem tách từ bề mặt khi lắc hoặc chói tai đối với gót chân của bàn tay của bạn (bạn có thể kiểm tra trong kính hiển vi), thêm 4 ml môi trường phát triển mới với huyết thanh 10% và đình chỉ các tế bào bằng pipetting lên và xuống vài lần Đếm tế bào trong một hemacytometer, tính toán khối lượng bổ sung trung bình cần thiết để mang lại nồng độ tế bào để

~ 5x10 5 tế bào / ml, và thêm khối lượng này để treo tế bào

5 Giống một khối lượng phù hợp với kích thước của bình, hoặc 1 ml dung dịch treo tế bào vào từng giếng của một món ăn 24 cũng cụm, hoặc 5 ml dịch treo tế bào vào 25 cm 2 bình nhựa mới

C Bảo quản tế bào nuôi cấy bằng cách đông lạnh

Tính khả thi của virus và vi khuẩn được bảo quản trong thời gian đóng băng, nhưng những nỗ lực ban đầu để bảo vệ các tế bào động vật đông lạnh dẫn đến chết tế bào Này lần đầu tiên được cho là do rách màng huyết tương tế bào bởi các tinh thể nước đá, nhưng bằng chứng gần đây cho thấy nguyên nhân có thể thay đổi thẩm thấu trong quá trình đóng băng làm phát sinh những thay đổi không thể đảo ngược trong khu phức hợp lipoprotein trong màng tế bào Trong mọi trường hợp, câu trả lời cho bảo quản tế bào động vật đã chứng tỏ là việc bổ sung glycerol, ethylene glycol, hoặc dimethyl sulfoxide (DMSO) để trung và đông lạnh chậm, lý tưởng với một tốc độ làm mát của một độ C trong một phút Các tế bào phải được bảo quản ở -70 o C hoặc thấp hơn (tốt nhất là trong nitơ lỏng ở -196 o C), và khi chúng được phục hồi, rã đông phải được nhanh chóng Với kỹ thuật cẩn thận, từ 50 đến 80% của các tế bào của một nền văn hóa lành mạnh sẽ tồn tại đông

Thủ tục

1 Hủy bỏ lớp tế bào hợp lưu từ bình văn hóa theo phương pháp mô tả trong các thủ tục chuyển nhượng di động Đình chỉ các tế bào trong thêm MEM, chuyển sang ống có chứa huyết thanh bò của thai nhi, và ly tâm ở 1500 rpm từ 5 đến 10 phút Sau khi ly tâm, các tế bào resuspend trong 0,5 ml trung bình lạnh có chứa 10% huyết thanh và 10% DMSO và diễn ra trong một cryotube nhỏ

2 Ngay lập tức đặt ống trong một bồn tắm nước đá Sau đó, họ sẽ được chuyển giao cho một container cách nhiệt và làm lạnh đến -20 o C với tốc độ - 1 o C mỗi phút (nếu bạn không sở hữu một container như vậy, các tế bào có thể được lưu trữ trên băng 1/2 giờ sau đó chuyển đến một

-70 o C tủ lạnh trong một hộp với rất nhiều Kimwipes xung quanh các ống), sau vài ngày các tế bào này có thể được chuyển từ -70 o C đến nitơ lỏng cho lưu trữ vĩnh viễn Các tế bào được lưu trữ ở -70 o C sẽ không còn khả thi miễn là các tế bào được lưu trữ trong nitơ lỏng Nếu các tế bào

sẽ được cất giữ trong nitơ lỏng, chúng phải được đặt trong ống tiêm kín hoặc cryotubes

3 Để phục hồi các tế bào, loại bỏ ống từ -70 o C hoặc nitơ lỏng và đặt trực tiếp tại 37 o C tắm nước Lưu ý: Nitơ lỏng có thể gây bỏng, do đó, cần thận trọng khi xử lý nitơ lỏng và ống nên được tổ chức tại ngón tay của bạn càng ngắn gọn một khoảng thời gian càng tốt Khi rã đông là hầu như không đầy đủ, thêm nội dung của ống để 25 cm 2 bình chứa 5 ml trung bình với huyết thanh 10% Môi trường nuôi cấy nên được thay đổi khoảng 4 giờ sau đó (sau khi các tế bào có kèm theo) để giảm thiểu thời gian tiếp xúc với DMSO ở 37 o C

Công thức của truyền thông và giải pháp

Một nước muối

Thành phần g / l

NaCl 8.0

KCl 0,4

NaHCO 3 0.35

Glucose 1.0

Phenol đỏ 0.05

Thêm cất H 2 O vào 1 lít Bộ lọc khử trùng Một nước muối thường được chuẩn bị như một giải

pháp 10X và bảo quản ở -20 o C

Mặn Trypsin-EDTA (STE)

Thành phần g / l

Trypsin (1:250) 0.5

EDTA (muối dinatri) 0.2

NaCl 8.0

KCl 0,4

NaHCO 3 0.35

Glucose 1.0

Phenol đỏ 0.05

Thêm cất H 2 O vào 1 lít Hòa tan trypsin đầu tiên bằng cách từ từ khuấy động trong ~ 200 ml

H2 O (tránh biến tính) Thêm các thành phần còn lại và bộ lọc khử trùng STE thường được chuẩn bị như một giải pháp 10X và bảo quản ở -20 o C

Phosphate Buffered Saline Dulbecco (PBS)

Thành phần g / l

CaCl 2 2 H 2 O 0,133

MgCl 2 6 H 2 O 0.1

KCl 0,2

KH 2 PO 4 0,2

NaCl 8.0

2 HPO 4 1.15

Thêm cất H 2 O vào 1 lít Độ thẩm thấu (mOsm / kg H 2 O) = 289 + 5% pH = 7,3 + 0,3 Nước muối này có thể được thực hiện mà không cần Ca +2 và Mg 2 muối cho các tế bào giặt Tối thiểu cần thiết vừa Eagle (MEM)

Thành phần g / l

CaCl 2. H 2 O 0,265

MgSO 4 0,09767

KCl 0,4

NaCl 6.8

NaH 2 PO 4 0.122

L-arginine.HCl 0,126

L-cystine.HCl 0,0313

L-glutamine 0.292

L-histidine.HCl.H 2 O 0.042

L-isoleucine 0,052

L-leucine 0,052

L-lysine.HCl 0,0725

L-methionine 0.015

L-phenylalanine 0.032

L-threonine 0,048