QUY TRÌNH NUÔI cấy tế bào sơ PHÔI một lớp

QUY TRÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO SƠ PHÔI MỘT LỚP1.. Phương pháp MỔ TRỨNG LẤY PHÔI ↓ XỬ LÝ PHÔI ↓ TRYPSIN TÁCH TẾ BÀO PHÔI ↓ LY TÂM VÀ THU CẶN ↓ ĐẾM TẾ BÀO VÀ RA CHAI ↓ THEO DÕI SỰ PHÁT TRIỂN CỦ

QUY TRÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO SƠ PHÔI MỘT LỚP

1. VẬT LIỆU:

- TRỨNG có phôi 11 ngày tuổi ( phôi gà: 9-11 ngày tuổi, phôi vịt 11-14 ngày tuổi)

- PBS (-)

- MEM 1X

- MEM 10% FBS

- Trypsin 1x trong PBS

- Gentamycin ( 40mg/1ml)

- Trypan Blue

- Cốc đong 500ml, chai 250, phễu, pank và kéo, Gạc, buồng đếm tế bào, ống ly tâm 15, chai nuôi tế bào T25, T75

2. Phương pháp

MỔ TRỨNG LẤY PHÔI

↓

XỬ LÝ PHÔI

↓ TRYPSIN TÁCH TẾ BÀO PHÔI

↓

LY TÂM VÀ THU CẶN

↓ ĐẾM TẾ BÀO VÀ RA CHAI

↓ THEO DÕI SỰ PHÁT TRIỂN CỦA TẾ BÀO MÔI TRƯỜNG

CẦN CHUẨN BỊ

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

B1: MỔ TRỨNG LẤY PHÔI

- Sát trùng trứng bằng cồn 70

- Dung pank làm vỡ vỏ trứng

- Dung kéo cắt vỏ

- Dung pank mở màng, gắp phôi vào trong cốc

đong 500 có sãn PBS (-) để rửa

B2: XỬ LÝ PHÔI

-Sau khi rửa B1  đặt vào đĩa lồng pettri

-Cắt bỏ đầu, chân, các cơ quan nội tạng

-Chuyển thân phôi sang đĩa pettri có Trypsin1X rửa

phôi

-Dung pank nhẹ nhàng ép phôi để loại bỏ hết máu

- Chuyển phôi ra khỏi dung dịch rửa, để ráo nước, chuyển sang đĩa petttri vô trùng. > dung kéo vô

trùng cắt nhỏ phôi

B3: TRYPSIN TÁCH TẾ BÀO PHÔI

- PHÔI đã cắt cho vào chai 250ml

- Them 15ml trypsin 1x lắc đều +150 ᶬL Gentamycin

- Khuấy từ 20 phút ở nhiệt độ phòng

Lọc dịch nổi bằng phễu có 8 lớp vải gạc cho

vào ống ly tâm 50

- Them 10ml MEM 1x để trung hòa trypsin

B4: LY TÂM

VÀ THU CẶN

- Huyễn dịch thu được ở lần đầu  ly tâm 500v/p/ 10 phút( t0 phòng)

- Thu cặn pha loãng TB: 3ml MEM 10%FBS Đánh tan cặn

B5: ĐẾM TẾ

BÀO VÀ RA

CHAI - Pha 100ᶬl TB+ 100ᶬl trypanblue đếm TB

trên buồng đếm

- Ra chai 2*106 cell/chai, 6ml/ chai T25 B6: THEO DÕI

SỰ PHÁT

TRIỂN CỦA

TB

- Nuôi 370C, 5% CO2  TB mọc thành lớp