Bước 3: Loại bỏ môi trường đang nuôi:Mục đích: loại bỏ tế bào chết Cách tiến hành: Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai Dùng pipet 5ml hút bỏ môi trường.. Chú ý: Khi cho PBS- nên để đầu typ
Trang 1BÁO CÁO TRƯỞNG BỘ MÔN HÓA SINH – MIỄN DỊCH V/v Thực hành trypsin tế bào BHK-21 ra chai T25 1.Mục đích:
Thành thạo các bước của quy trình trypsin tế bào BHK21
2.Thời gian, địa điểm:
Thời gian: Ngày 26 tháng 5 năm 2014
Địa điểm: Phòng tế bào bộ môn Hóa sinh – Miễn dịch
3.Người thực hiện
Người thực hiện: Trần Thị Nhuận
4.Cách tiến hành
4.1.Nguyên vật liệu:
a.Tế bào: Tế bào BHK21 được nuôi cấy ngày 140521, P15 Tế bào đã phát triển, tỉ lệ bám đáy 100% Tế bào hình thuôn dài, mượt, bám đáy đều
b Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:
MEM1x:
Thành phần:
NaHCO3……… 2,2g
MEM bột…… 9,53g
Gentamycin……… 50µg
Nước cất vô trùng vừa đủ 1 lít
MEM 10%
Thành phần:
MEM1x……….100ml
FBS……….10ml
Trang 2Thành phần:
PBS bột ……… 9,55 gam
Nước cất vô trùng vừa đủ …….1 lít
Trypsin – EDTA
10ml trypsin EDTA / ống ly tâm 15ml
Trypan blue 0,4%
c Dụng cụ an toàn sinh học
Mũ, quần áo, khẩu trang, găng tay
Chai xịt cồn 700
d.Dụng cụ hấp, sấy:
e.Máy móc, thiết bị
Trang 3STT Vật liệu Số lượng
9 Kính hiển vi soi ngược 01
4.2.Các bước thực hiện
Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng
Chuẩn bị Cabinet:
Vô trùng Cabinet trong 15 phút
Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:
Chuyển môi trường đang bảo quản trong tủ lạnh đưa ra ngoài để tan đông
Bước 2: Quan sát tế bào
Mục đích: quan sát mức độ phát triển của tê bào, tỷ lệ tế bào bám đáy
Cách tiến hành:
Quan sát trên kính hiển vi soi ngược về hình dạng tế bào, mức độ phát triển, tỷ
lệ tế bào bám đáy
Tế bào BHK21 sau khi nuôi cấy 5 ngày thấy tế bào hình thuôn nhỏ, mượt, tỷ lệ bám đáy 100%
Trang 4Bước 3: Loại bỏ môi trường đang nuôi:
Mục đích: loại bỏ tế bào chết
Cách tiến hành:
Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai
Dùng pipet 5ml hút bỏ môi trường
Chú ý: Cho đầu type xuống dưới đáy chai, hút hết môi trường nuôi cấy
Bước 4: Rửa
PBS-Mục đích: loại bỏ tế bào chết, huyết thanh và môi trường còn sót lại
Cách tiến hành:
Thêm vào bình nuôi 5ml PBS- vào chai nuôi T25
Lắc ngang chai, hút bỏ PBS-
Rửa tế bào 2 lần với PBS-
Chú ý:
Khi cho PBS- nên để đầu type vào gần miệng chai, không cho sâu quá, cho vào mặt không có tế bào bám dính, đầu pipet không được chạm vào thành chai
Bước 5: Trypsin tế bào
Mục đích: tách tế bào ra khỏi đáy bình
Cách tiến hành:
Dùng pipet hút 1ml Trypsin cho vào mặt chai không có tế bào, nghiêng chai nhẹ nhàng để các tế bào đồng pha cùng tách nhau
Quan sát tế bào sau khi trypsin dưới kính hiển vi nếu tế bào bắt đầu co tròn lại, tách rời nhau thì tiến hành dừng trypsin
Thời gian trypsin tế bào BHK21(140521, P15) là 4 phút
Chú ý:
Không được lắc chai nuôi TB
Trang 5Bước 6: Trung hòa trypsin
Mục đích: Dừng quá trình trypsin
Cách tiến hành:
Vỗ mạnh chai hoặc đập chai nuôi để các tế bào tách nhau hoàn toàn (tránh làm môi trường bắn lên thành bình)
Dùng pipet hút 3ml môi trường MEM10% cho vào chai nuôi để trung hòa trypsin
Dùng pipet đảo đều môi trường, tưới đều lên mặt tế bào bám đáy, lắc đều nhiều lần để bong hết các tế bào bám dính đáy chai
Chuyển hết huyễn dịch vào ống fancol 15ml Đậy nắp, Bao dán paraffin, lắc nhẹ, đem ly tâm
Bước 7: Ly tâm và đánh tan cặn
Mục đích: thu cặn tế bào
Cách tiến hành:
Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700vòng/phút trong 10 phút
Dùng pipet hút hết dung dịch ở phía trên, giữ lại cặn tế bào
Hút 3ml môi trường MEM10% cho vào ống, dùng pipet đảo đều hoặc rà đáy ống vào mặt cabinet để đánh tan hoàn toàn cặn tế bào
Chú ý :
Khi hút dung dịch phía trên, không để đầu type chạm vào đáy ống có tế bào sẽ hút lẫn cặn tế bào
Bước 8: Đếm tế bào
Mục đích: xác định lượng tế bào có trong 1ml huyễn dịch
Cách tiến hành:
Pha loãng tế bào 10 lần với MEM10% : Hút 900µl môi trường MEM10% cho vào ống eppendorf Cho vào 100µl huyễn dịch tế bào vào trộn đều
Trang 6Pha loãng huyễn dịch tế bào với thuốc nhuộm trypan blue theo hệ số 2: cho vào ống eppendorf 100µl huyễn dịch tế bào vừa pha loãng 10 lần với 100µl trypan blue
Dùng pipet hút 1 lượng huyễn dịch tế bào sau khi nhuộm nhỏ từ từ vào buồng đếm tế bào
Đếm sô tế bào trên buồng đếm:
Đếm tế bào ở 4 góc, trong mỗi góc có 16 ô vuông nhỏ, đếm số tế bào nằm trong khung 16 ô vuông nhỏ
Đếm từng tế bào riêng lẻ trong đám tế bào
Đếm theo hình zic zắc
Đếm các tế bào có kích thước tương đồng nhau
Không đếm các tế bào chết bắt màu xanh, chỉ đếm các tế bào còn sống
Ước lượng số tế bào trong 1ml:
số tế bào/1ml = (số tế bào đếm được trong 4góc/4 )x 2 x độ pha loãng tế bào x 104
Số tế bào BHK21 /1ml = (45/4) x2 x 105 = 2,25 106 cell
Muốn ra chai T25 với số lượng 1,2 106 cell thì cần 0,53 ml huyễn dịch tế bào
và 5,47 ml MEM10%
Bước 10: Ra chai nuôi
Mục đích: Tiếp tục nuôi tế bào, để tế bào nhân lên
Cách tiến hành:
Dùng pipet hút 5,47 ml MEM10% cho vào T25
Dùng pipet lấy 0,53ml huyễn dịch cho vào chai nuôi
Lắc nhẹ nhàng để tế bào được trải đều khắp mặt đáy chai nuôi
Bước 11: Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng
Thu dọn rác, Chuyển các dụng cụ vừa thao tác ra khỏi cabinet
Dùng giấy lau xịt cồn lau sạch Cabinet
Trang 7Đóng cửa Cabinet, bật UV trong 30 phút
Bước 12: Theo dõi sự phát triển của tế bào
Nuôi tế bào ở tủ ấm 370C, 5% CO2
Hằng ngày quan sát tế bào phát triển ở đáy chai nuôi trên kính hiển vi soi ngược
5 Nhận xét:
Thao tác ra chai nuôi, tế bào đã bám đáy đều
Thao tác nhuộm tế bào, chuyển huyễn dịch tế bào với thuốc nhuộm lên buồng đếm còn chưa chuẩn làm tế bào trong 4 góc lớn không đều nhau
Bảng theo dõi trypsin ra chai T25 (140512, BHK-21, P16)
STT Ngày Thao tác Thời Mật độ % TB % Hình dạng TB Màu môi
Trang 8theo
/2014 Ra chai T25 1,2.10
6
trong
/2014 Quan sáttế bào 18h 30-40% 1 % Tế bào hình thuôn dài, tế
bào bám đáy đều Tế bào đang phát triển
Môi trường màu hồng đỏ, trong
/2014
Quan sát
tế bào
70%
1% Tế bào hình
thon dài, tế bào bám đáy đều, một số tế bào co tròn,tế bào đang phát triển
Môi trường màu đỏ hồng, trong
/2014
Quan sát
tế bào
90- 100%
2% Tế bào hình
thon, nhỏ, bám đáy dầy,
có những cụm
tế bào co tròn
tụ lại thành từng đám nhỏ
Môi trường màu đỏ vàng, có
ít vẩn nhỏ li ti màu trắng
Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2014 Người thực hiện
Trần Thị Nhuận