140428 bao cao tong ket thang nhuan TT

Cách sử dụng máy móc, thiết bịphòng thí nghiệm Theo phụ lục 1 Cách pha môi trường nuôi cấy Theo ly tâm lạnh, máy Vortex, cân chân không,máy hút chân không.. Tự pha được môi trường PBS-,

BÁO CÁO TRƯỞNG BỘ MÔN HÓA

3 Người thực hiện

Người thực hiện: BSTY Trần ThịNhuận

Người hướng dẫn: BSTY Phạm ThiNga

4 Nội dung học tập

Kiến tập Quy trình cất giống tế bào 1lần (tế bào MDCK), quy trình mở giống tếbào 2 lần ( Tế bào Vero,tế bào BHK-21),trypsin tế bào (tế bào MDCK, Tế bào Vero)

Kiến tập quy trình nuôi cấy tế bào xơphôi gà 1 lớp 1 lần

Thực hành nuôi cấy tế bào xơ phôi gà

1 lớp 2 lần

Thực hành xử lý mẫu Swab, mẫuhuyết thanh lấy từ các địa phương: ThạchThất, Chương Mỹ, Thường Tín, Đông Anh

Kiến tập làm phản ứng ELISA cúmlợn theo KIT

5 Kết quả học tập

Nắm được các quy trình:

Cách sử dụng máy móc, thiết bị

phòng thí nghiệm (Theo phụ lục 1) Cách pha môi trường nuôi cấy (Theo

ly tâm lạnh, máy Vortex, cân chân không,máy hút chân không

Biết cách sử dụng pipet 1 kênh

Tự pha được môi trường PBS-, lọcnước cất 2x

Nắm được các bước của quy trình mởgiống tế bào, cất giống tế bào, trypsin tế bào

và nuôi cấy xơ phôi gà môt lớp

Biết cách chọn trứng có phôi khỏe,mạch máu rõ ràng

Chuẩn bị dụng cụ cho 1 quy trìnhnuôi cấy

Những việc chưa làm được:

Thao tác sử dụng pipet chưa đượcthành thạo, đầu pipet vẫn chạm vào thànhống fancol, chai môi trường

Sử dụng pipet đa kênh còn chưa thànhthạo

Thao tác mở nắp chai nuôi tế bào, ốngfancol vẫn phải dùng hai tay

Thao tác trong Cabinet: thao tác còn ởgần ngoài cửa Cabinet

Thao tác trong quá trình thực hiệnchưa dứt khoát, chưa bố trí được thời gian

cho các bước thực hành: quá trình trypsin tế

bào quá lâu, kiểm tra hình thái tế bào trên

kính hiển vi lâu làm ảnh hưởng tới môi

trường nuôi cấy tế bào

6.Kết luận

Sau một tháng theo học, tôi nhận thấy

bản thân học được rất nhiều điều: từ văn hóa

giao tiếp nơi công sở, đến các kỹ thuật cơ

bản phòng thí nghiệm, tiếp thêm niềm đam

mê tâm huyết với nghề, học cách bố trí, sắp

xếp công việc, sử dụng thời gian vào công

việc một cách hiệu quả nhất

Mong muốn của tôi là được tiếp tục

theo học các kỹ thuật, được thực hành nhiều

hơn nữa để tôi nâng cao được chuyên môn,

đóng góp cho công ty sau này

Hà nội, ngày 27 tháng 04 năm 2014Người thực hiện

Trần Thị Nhuận

Phụ Lục 1: Hướng dẫn sử dụng máy móc,

thiết bị Nguyên tắc: Trước khi sử dụng quan sát

tình trạng hoạt động của máy, sau khi sửdụng máy móc ghi vào sổ theo dõi

Cấu tạo máy hấp:

Đồng hồ chỉ thị áp suất

Van áp suất

Các nút điều chỉnh nhiệt độ, thời gianBình xả nước, van xả nước

Cách vệ sinh máy hấp: Sau khi hấp dụng cụ

bẩn phải tiên hành rửa máy hấp

Kiểm tra van xả áp suất Đảm bảo ápsuất về 0

Tắt công tắc điện

Lấy dụng cụ bẩn vừa được hấp

Xả hết nước trong máy

Hòa nước xà phòng: dung chổi rửarửa sạch bên trong máy Xả nước sạch chođến khi hết xà phòng

Vệ sinh bên ngoài máy hấp

Thay nước trong bình xả nằm tronggiới hạn cho phép

Đóng cửa nồi hấp, khóa chặt van ápsuất.

Bật công tắc cài đặt máy bằng cácnút điều chỉnh nhiệt độ và thời gian ( 1210C/30-45 phút)

Ấn nút SET/ START Máy hấp hiểnthị ở chế độ Sterile

Muốn xem nhiệt độ hiện tại của máyhấp ấn nút CHECK HEAT

Khi lấy đồ hấp ra khỏi máy hấp phải

xả van xả áp đảm bảo áp suất về 0 mới được

Bước 2: Cho dụng cụ cần sấy vào trong tủ

sấy, tùy từng dụng cụ mà sấy ở nhiệt độ khácnhau, hầu hết các dụng cụ được hấp ở 90-

1000C/2-3 giờ

Bước 3: Đóng tủ sấy, bật công tắc máy và

cài đặt thời gian và nhiệt độ

Cách cài đẳt thời gian:

Giữ 2 nút RAM + TIME, đèn SEThiện màu đỏ, trên đồng hồ hiển thị thời gian

Giữ RAM sau đó TIME để chỉnhgiảm thời gian

Giữ RAM sau đó TEMP để tăng thờigian

Sau đó ấn RAM, thời gian đã đượccài đặt

Bước 4: tủ sấy đã hoạt động, đèn ở chế độ

heater

Chú ý:

Khi mở tủ sấy phải tắt công tắc đểđảm bảo an toàn cho người sử dụng cungnhư tránh hỏng tủ sấy

Trước khi cho đồ vào sấy phải kiểmtra nhiệt độ và thời gian, để quá trình hấpđược đảm bảo và an toàn cho dụng cụ khisấy khô

3 Cân chân không

Cách sử dụng:

Bước 1: Cắm nguồn điện.

Bước 2: Cân hóa chất:

Mở cửa cân, đưa máng vào để đựngvật cần cân Sau đó đóng cửa, ấn TARE, đểđồng hồ chỉ thị 0.000 g Cân đủ lượng cầnlấy, thao tác cẩn thận, cân chính xác sốlượng cần dùng

Bước 3: Tắt cân

Ấn nút OFF để tắt máy

Bước 4: Vệ sinh cân:

Sau khi cân nguyên liệu xong cần vệsinh cân sạch sẽ Lau bề mặt cân

Bước 5: Rút nguồn điện Để cân về trạng

thái nghỉ

4 Kính hiển vi soi ngược

Cấu tạo:

Thị kính có độ phóng đại khác nhauVật kính

Ốc vĩ cấp

Ốc vi cấp

Ốc điều chỉnh ánh sáng

Cách sử dụng:

Bước 1: Cắm nguồn điện

Sử dụng nguồn điện 110V, cắm vàonguồn điện 110V, không cắm trực tiếp vàonguồn điện 220V sẽ gây hỏng máy, qua bộđổi điện

Bước 2: Khởi động máy

Bật công tắc đưa máy về chế độ hoạtđộng.

Xoay ốc điều chỉnh độ sáng của đènlên tối đa Điều chỉnh độ sang của đèn thôngqua núm điều chỉnh nguồn sáng

Bước 3: Soi kính

Đặt chai nuôi tế bào hoặc buồng đếm

tế bào lên khu vực soi

Điều chỉnh ốc vĩ cấp lấy hình ảnh.Sau đó điều chỉnh ốc vi cấp để chỉnh ảnh rõnét

Bước 4:Cho kính nghỉ

Vặn núm điều chỉnh ánh sáng về 0 Tắt đèn

Tắt công tắc nguồn

Cho vật kính về chế độ nghỉrútđiện vệ sinh Kính hiển vi

5 Máy Ly tâm

Cấu tạo:

Có 2 Roto

Roto 15ml với tốc độ ly tâm 3500vòng/ phút.

Roto 50ml với tốc độ ly tâmvòng/phút

Các nút điều chỉnh:

Nút công tắc máy: ON, OFF

Nút chế độ: HIGHT, LOW

Đồng hồ chỉ thị tốc độ và thời gian.Nút điều chỉnh tốc độ

Nút điều chỉnh thời gian

Cách sử dụng: Máy ly tâm hoạt động dựatrên nguyên lý cân bằng

Bước 1: Cắm điện nguồn điện 220V.

Bước 2: Xếp mẫu vào các ROTO

Khi xếp mẫu phải đảm bảo các mẫucần ly tâm ở dạng đối xứng và cân bằng.Dùng cân tiểu ly khi cần thiết

Bước 3: Khởi động máy

Đóng nắp máy ly tâm

Ấn MAIN cho máy hoạt động

Cài đặt vòng quay và thời gian: Nếu

ly tâm <2.500 vòng ấn nút LOW nếu ly tâm

> 2.500 vòng ấn HIGHT

Điều chỉnh số vòng quay vặn nútspeed, quan sát trên đồng hồ chỉ thị số vòngtrong khoảng cần ly tâm

Điều chỉnh thời gian: vặn nút TIMEchỉ thị trên máy, chỉnh thời gian cần ly tâm

Bước 4: Đưa máy về trạng thái nghỉ,

Ấn tắt MAIN, rút ổ điện

6 Cabinet

Trước khi sử dụng cabinet: ở trạngthái không hoạt động, chìa khóa cabinet ở vịtrí số 0, cánh cửa tủ ở vị trí đóng

Vô trùng cabinet 15 phút trước khi sử dụng:

Vặn chìa khóa tủ ở số 2, ấn nút UVlamp

Đèn tử ngoại sáng, đồng thời xuấthiện tiếng kêu

Để tắt tiếng kêu, ta ấn nút Stop Vôtrùng tủ trong 15 phút.

Sau 15 phút tắt đèn tử ngoại bằngcách ấn nút UV lamp và chìa khóa cabinet ở

vị trí số 0

Cách sử dụng cabinet:

Mở cánh cửa tủ cabinet

Vặn chìa khóa tủ về vị trí số 1, númquạt gió sẽ tự động hoạt động (không cần ấnnút FAN) Khi quạt gió hoạt động ấn nútbiểu tượng đèn (bên cạnh núm FAN) Tủ cấy

Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng:

Thu dọn sạch sẽ, không được để lạibất cứ dụng cụ thí nghiệm trong cabinet Tắtquạt gió và AS, vặn chìa khóa cabinet về vịtrí 0

Đậy cánh cửa cabinet lại, vô trùngcabinet 15 phút (giống như các bước ở trên).

Tắt cabinet hoàn toàn ( chìa khóa ở vịtrí 0)

Chú ý khi sử dụng cabinet:

Trong quá trình sử dụng cabinet, cóthể xuất hiện tiếng kêu, để tắt tiếng kêu ấnnút Stop

Không để quá nhiều dụng cụ trong tủlúc làm việc và sau làm việc

Phụ Lục 2: Cách pha các loại môi trường nuôi cấy tế bào

1 Quy trình chuẩn bị nước cất 2x

1.1 Mục đích: là dung môi để pha các môitrường PBS-, MEM 1x

Bước 2: Nối hệ thống lọc với máy hút chân không

Dùng dây gắn hệ thống lọc với đầuvào INLET của máy hút chân không Dùngmáy hút chân không hút hết không khí trongbình, khi đó tạo ra sự chênh lệch áp suất nước sẽ đi từ nơi có áp suất cao đến nơi có

áp suất thấp

Bước 3: Lọc nước

Cắm điện máy hút chân không, đổnước cất 2x vào hệ thống lọc chân không.

Nước cất sau khi được lọc vào cácchai Scott 1 lít, không hấp nước cất quánhiều, khi hấp không vặn nút chai quá chặt

sẽ gây nổ

Bước 4: Bảo quản

Sau khi hấp, nước cất 2x được bảo

Bước 1: Chuẩn bị nước cất

Lấy 1 lượng nước cất 2x vô trùng200- 300ml

Bước 2: Cân PBS

Dùng máng cân 9,55 gam bột PBS

Bước 3: Pha PBS

Cho PBS vừa cân vào chai nước cất2x, tráng máng vừa cân PBS, lắc đều cho bộttan hết ( lắc trên máy khuấy từ nếu pha với 1lượng lớn)

Chuyển lượng môi trường vừa phasang cốc định mức 1 lít, cho thêm lượngnước cất đủ thể tích cần pha

Chuyển toàn bộ 1 lít môi trường từcốc định mức sang chai Schott 1 lít, lắc đềucho tan hết

Bước 4: Kiểm tra pH

Có thể sử dụng máy đo pH hoặc giấy

đo pH

Dùng pipet hút 1 ít dung dịch nhỏ lêngiấy rồi đo pH Dùng NaOH 1N hoặc HCl1N để điều chỉnh pH của môi trường (pH =7,2 – 7,4)

Bước 5: Bảo quản

Chia môi trường ra các chai Schottnhỏ vô trùng Đem hấp 1210C/15 phút

Để nguội Bảo quản 40C đến khi sửdụng

3 Quy trình chuẩn bị môi trường MEM1x

3.1 Mục đích: Là môi trường để tế bào sinhtrưởng và phát triển

3.2 Nguyên vật liệu pha MEM 1x 1 lít

a Nước cất 2x đã lọc và hấp vô trùng 1 lít

b Hóa chất:

NaHCO3……… 2,2gMEM bột…… 9,53gGentamycin…….50µg

Bước 2: Cân hoá chất

Dùng máng để cân hóa chất, trước khicân nên lau sạch máng

Cân MEM bột 9,53g cho vào bình

đã có sẵn ít nước Không được lắc ngay sẽđông vón

Tráng máng  lắc đều với cục khuấytừ

Dùng máng khác cân NaHCO3: 2,2gam cho tiếp vào bình, tráng máng lắcđều

Bước 3: Bổ sung lượng nước sao cho đủ thể

tích 1 lít

Tiếp tục cho lên máy khuấy từ, lắcđều, cho đến khi tan hoàn toàn

Bước 4: Lọc

Lọc qua màng lọc 0,22µm bằng hệthống lọc chân không đã được hấp vô trùng

Bước 5: Điều chỉnh pH

Dùng 6ml HCl 1N để điều chỉnh pH

về 7,2- 7,4

Bước 6: Bổ sung Gentamycin

Dùng pipet hút 50µg/ 1ml cho vàodung dịch

Bước 7: Bảo quản

Dung dịch sau khi pha được bảo quản

ở 40C

4 Huyết thanh bào thai bò (FBS)

Huyết thanh được bảo quản ở -200C Đông tan huyết thanh

Xử lý nhiệt huyết thanh 560C trong 30phút

Chia 20ml/ ống ly tâm 50ml

Bảo quản ở -200C cho đến khi sửdụng.

5 Trypsin- EDTA

Trypsin bảo quản ở -200C

Đông tan trypsin

Chia 10ml/ ống ly tâm 15ml

Bảo quản ở -200C cho đến khi sửdụng

Phụ lục 3: Quy trình mở giống tế bào

1.Nguyên vật liệu

a Tế bào đã được cất giống trước đó

b Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:

MEM 10%

Thành phần:

MEM1x……….100mlFBS……….10ml

FBS:

Thành phần:

PBS bột ……… 9,55 gamNước cất vô trùng vừa đủ …….1 lít

tế bào.

MEM1x, MEM10%, PBS- bảo quảntrong tủ lạnh 40C

Chuyển môi trường đang bảo quảntrong tủ lạnh đưa ra ngoài để tan đông.

Bước 2: Giải đông tế bào cất giống

Mục đích: đưa tế bào về trạng thái hoạt độngCách tiến hành:

Chuẩn bị ống môi trường 5mlMEM10% để cân bằng môi trường tế bào

Cho ống giống vào bọt xốp, thả vàocốc nước ấm 370C

Thấy môi trường chuyển màu đậmhơn

Khi môi trường đồng nhất, chuyểnống môi trường vào Cabinet

Bước 3: Cân bằng môi trường

Mục đích: Cân bằng môi trường nuôi cấy tếbào

Cách tiến hành:

Dùng pipet chuyển nhẹ nhàng giốngvào ống môi trường 5ml MEM10%FBS đãchuẩn bị

Tráng lại ống giống để lấy hết tế bào.Chú ý:

Khi sử dụng pipet để lấy môi trườnghoặc lấy huyễn dịch tế bào, tránh làm pipetchạm vào thành chai, thành ống sẽ gây tạpnhiễm tế bào

Bước 4: Ly tâm và đánh tan cặn tế bào

Chú ý:

Trước khi ly tâm, các ống ly tâm phảiđược đóng chặt nút và bao dán bằngparaffin

Khi hút bỏ môi trường, tránh để đầutype chạm vào cặn tế bào.

Bước 5: Hòa tan trong môi trường nuôi cấy tế bào

Mục đích: Hòa tan huyễn dịch tế bào trongmôi trường nuôi cấy

Cách tiến hành:

Cho 6ml môi trường MEM10% vàoống ly tâm có chứa cặn tế bào

Dùng pipet đảo đều

Bước 6: Cấy tế bào vào chai nuôi

Mục đích: cung cấp chất dinh dưỡng cho tếbào phát triển

Cách tiến hành:

Ghi thông tin lên chai nuôi về ngày

mở giống, dòng tế bào, đời tế bào, ngườithực hiện

Dùng pipet chuyển hết lượng huyễndịch tế bào vừa được đánh tan cặn có bổsung 6ml MEM 10% vào chai nuôi T25

Lắc nhẹ nhàng chai nuôi

Bước 7: Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng

Chuyển các dụng cụ vừa thao tác rakhỏi cabinet

Dùng giấy lau xịt cồn lau sạchCabinet

Đóng cửa Cabinet, bật UV trong 30phút

Bước 8: Theo dõi sự phát triển của tế bào

Nuôi tế bào 370C, 5%CO2 Hàngngày theo dõi tế bào trên kính hiển vi soingược

Phụ lục 4: Quy trình cất giống tế bào

Pha dung dịch cất giống

Lượng dung dịch cất giống chiếm50% cần pha 5ml dung dịch cất giống saukhi đã qua màng lọc

Cách pha 6ml dung dịch cất giống 20% PBS,20% DMSO:

Lấy 1 ống fancol 50ml vô trùng

Dùng pipet hút 3,6 ml MEM10%

Thay đầu type, hút tiếp 1,2ml PBScho vào ống

Cho tiếp vào ống 1,2ml DMSODùng xilanh, kim tiêm vô trùng húthết dung dịch cất giống ở ống fancol, lắpxilanh vào đầu lọc 0.45, bơm qua lọc chovào ống fancol mới

Chú ý : không được cho PBS sau khi choDMSO, sẽ gây kết tủa

Mục đích: không làm ảnh hưởng tếbào vì nếu để nhiệt độ quá thấp sẽ gây chết

Bước 2: Quan sát tế bào

Mục đích: quan sát mức độ phát triển của têbào, tỷ lệ tế bào bám đáy

Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai

Mở nắp chai, nghiêng chai về mặtkhông có tế bào

Dùng pipet lắp đầu type 5ml hút bỏmôi trường vào cốc thủy tinh đựng rác.

Bước 5: Trypsin tế bào

Mục đích: tách tế bào ra khỏi đáy bình

Cách tiến hành:

Dùng pipet hút 3ml trypsin 1x chovào mặt chai không có tế bào, nghiêng chainhẹ nhàng để các tế bào đồng pha cùng táchnhau

Quan sát tế bào sau khi trypsin dướikính hiển vi nếu tế bào bắt đầu co tròn lại,tách rời nhau thì tiến hành dừng trypsin.

Nếu tế bào chưa tách rời nhau thì đểtiếp tủ ấm 3-5 phút để cho các tế bào đồngpha

Chú ý:

Không được lắc chai nuôi TB

Bước 6: Trung hòa trypsin

Mục đích: Dừng quá trình trypsin

Cách tiến hành:

Vỗ mạnh chai để các tế bào tách nhauhoàn toàn (tránh làm môi trường bắn lênthành bình)

Dùng pipet hút 7ml môi trườngMEM10%FBS cho vào chai nuôi để trunghòa trypsin

Dùng pipet đảo đều môi trường, tướiđều lên mặt tế bào bám đáy, lắc đều nhiềulần để bong hết các tế bào bám dính đáychai

Chuyển hết huyễn dịch vào ốngfancol 50ml (chú ý khi mở nắp ống khôngchạm tay vào miệng ống fancol) Đậy nắp,Bao dán paraffin, lắc nhẹ, đem ly tâm.

Bước 7: Ly tâm và đánh tan cặn

Cách tiến hành:

Pha loãng tế bào 10 lần vớiMEM10%FBS : Hút 900µl môi trườngMEM10% cho vào ống eppendorf Cho vào100µl huyễn dịch tế bào vào trộn đều

Pha loãng huyễn dịch tế bào với thuốcnhuộm trypan blue theo hệ số pha loãng 2:cho vào ống eppendorf 100µl huyễn dịch tếbào vừa pha loãng 10 lần với 100µl trypanblue

Dùng pipet hút 1 lượng huyễn dịch tếbào sau khi nhuộm nhỏ từ từ vào buồng đếm

tế bào

Đếm sô tế bào trên buồng đếm:

Đếm tế bào ở 4 góc, trong mỗi góc có

16 ô vuông nhỏ, đếm số tế bào nằmtrong khung 16 ô vuông nhỏ

Đếm từng tế bào riêng lẻ trong đám tếbào

Đếm theo hình zic zắc

Đếm các tế bào có kích thước tươngđồng nhau

Không đếm các tế bào chết bắt màuxanh, chỉ đếm các tế bào còn sống.

Ước lượng số tế bào trong 1ml:

số tế bào/1ml = (số tế bào đếm được trong4góc/4 )x 2 x độ pha loãng tế bào x 104

Bước 9: Ra chai và cất giống tế bào:

Mục đích: Lưu giữ giống tế bào (106 cell/tube)

Cách tiến hành:

Dùng pipet hút 1,5 ml huyễn dịch tếbào + 3,5 ml môi trường MEM10% FBS chovào ống fancol chứa dung dịch cất giống vừalọc

Dùng pipet trộn đều môi trường, chiavào ống cất giống,mỗi ống cất 1ml

Xoáy chặt nắp ống, bao dán paraffin

Bước 10: Bảo quản tế bào

Giữ ống giống trong hộp đá

Sau đó chuyển sang tủ lạnh -200 C/

2-3 giờ