Tạo dòng và biểu hiện peptide CPE30 có nguồn gốc từ protein độc tố Clostridium perfringnes dung hợp với GFP

Ruôt la nơi tiêp xúc vơi rât nhiêu vi sinh vât thông qua con đương ăn uống; trong đo co ca nhưng vi sinh vât gây bệnh như: Salmonella, Campylobacter, Shigella,...Cac bệnh nhiêm khuân đương tiêu hoa rât dê bùng phát thành dich, gây nguy hiêm cho ngươi bệnh nêu không được xư ly kip thơi. Theo số liệu thống kê, vi sinh vât đa gây ra hang triệu ca măc bệnh nhiêm khuân đương tiêu hoa môi năm trên toan thê giơi, đăc biệt ơ cac nươc đang phat triên. Trong khi đo, vi sinh vât ngay cang biên đôi đê chống lai hang rao miên dich cua con ngươi. Phương phap điêu tri chưa thưc sư hiệu qua, việc lam dung thuốc khang sinh gây nên tinh trang khang khang sinh cao cua nhiêu loai vi sinh vât gây bệnh. Do đo, cac nha nghiên cưu đang phat triên phương phap phòng ngưa các bệnh nhiêm khuân đương tiêu hoa băng cách sư dung vaccine uống.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thị Mộng Quỳnh

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PEPTIDE CPE30 CÓ

NGUỒN GỐC TỪ PROTEIN ĐỘC TỐ

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS DUNG HỢP VỚI GFP

KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS TRẦN VĂN HIẾU

CN TRẦN MẠNH CƯỜNG

Tp Hồ Chí Minh – 2017

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2017

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thị Mộng Quỳnh

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PEPTIDE CPE30 CÓ

NGUỒN GỐC TỪ PROTEIN ĐỘC TỐ

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS DUNG HỢP VỚI GFP

Ngành: Công nghệ sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Y Dược

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS TS Trần Văn Hiếu

2 CN Trần Mạnh Cường

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2017

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy, thầy Trần Văn Hiếu Em cảm

ơn thầy đã dạy bảo, hướng dẫn và tạo điều kiện để em có cơ hội học tập, làm việc

tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh học Phân tử và Môi trường trong khoảng

thời gian vừa qua Thầy đã luôn tận tình với em, giúp đỡ em hoàn thiện bản thân,

và hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến anh Cường Em cảm ơn anh đã

hết lòng dạy dỗ em trong suốt khoảng thời gian một năm vừa qua Anh là người

dạy em từ những ngày em chập chững bước chân vào phòng thí nghiệm, lắng nghe

ý kiến của em và vực em dậy những lúc em khó khăn và bế tắc nhất Cảm ơn anh

đã luôn hỗ trợ, cùng em đi hết con đường mang tên khóa luận Tuy có những lúc

vui, lúc buồn nhưng giờ đây, sau tất cả, mọi thứ trở thành những kỷ niệm đẹp và

đáng nhớ Cảm ơn anh nhé, người thầy em luôn dành một sự trân trọng đặc biệt

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị, anh An, chị Mai, anh Thượng, chị

Châu, anh Trí, anh Quang đã giúp đỡ em trong suốt thời gian em thực hiện khóa

luận Quỳnh cảm ơn các bạn Hoàng Anh, Hồng Anh, Lê Duy, Hồng Điệp, Thanh

Long đã giúp đỡ Quỳnh, cùng Quỳnh trải qua những ngày tháng đáng nhớ khi làm

việc tại phòng thí nghiệm

Cảm ơn các cô gái G5+ đã luôn bên cạnh tui, cùng vui cùng buồn cùng khóc

với tui Cảm ơn mấy bà đã cùng tui đi qua quãng thời gian tươi đẹp này

Con cảm ơn gia đình đã luôn ở bên cạnh con, tin tưởng, và ủng hộ con Gia

đình đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để con được làm theo những điều con đã

chọn, là điểm tựa vững chắc nhất, giúp con đứng lên mỗi khi con gặp khó khăn

Lời cuối, tôi muốn cảm ơn chính bản thân mình đã đủ mạnh mẽ để vượt qua

tất cả mọi khó khăn và đi đến được ngày hôm nay

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 11/07/2017

Phạm Thị Mộng Quỳnh

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

TÓM TẮT 1

LỜI MỞ ĐẦU 2

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa 5

1.1.1 Tình hình trong nước và trên thế giới 5

1.1.2 Phương pháp phòng ngừa và điều trị 6

1.2 Đáp ứng miễn dịch thông qua tế bào M 8

1.2.1 Giới thiệu chung 8

1.2.2 Tế bào M 9

1.3 Peptide CPE30 (Clostridium perfringens enterotoxin) 14

1.4 Protein phát huỳnh quang lục GFP 15

1.5 Biểu hiện protein tái tổ hợp ở Escherichia Coli (E coli) 16

1.5.1 Giới thiệu chung 16

1.5.2 Hệ thống cảm ứng biểu hiện ở E coli bằng IPTG 18

2 VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 21

2.1 Vật liệu 22

2.1.1 Dụng cụ và thiết bị 22

2.1.2 Hóa chất và môi trường 23

2.1.3 Môi trường 26

2.1.4 Vật liệu sinh học 26

2.2 Phương pháp 27

2.2.1 Cấu trúc vector tái tổ hợp pET-cpe30-gfp mang gene mã hóa protein dung hợp CPE30-GFP 27

2.2.2 Cấu trúc chủng biểu hiện E coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET-cpe30-gfp (E coli BL21(DE3)/pET-cpe30-gfp) 36

2.2.3 Xác nhận sự biểu hiện protein dung hợp CPE30-GFP của chủng E coli BL21(DE3)/pET-cpe30-gfp 36

3 KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN 41

3.1.1 Thu nhận gene cpe30 42

3.1.2 Thu nhận và cắt mở vòng plasmid pET-co1-gfp bằng 2 enzyme BamHI và NdeI 43

3.1.3 Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E coli DH5α 44

3.1.4 Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-cpe30-gfp 45

3.2 Cấu trúc chủng E coli BL21(DE3) biểu hiện protein dung hợp CPE30-GFP 49 3.2.1 Biến nạp plasmid pET-cpe30-gfp vào tế bào E coli BL21(DE3) 49

3.2.2 Sàng lọc thể biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc 50

3.3 Xác nhận sự biểu hiện của protein dung hợp CPE30-GFP của chủng E coli BL21(DE3)/pET-cpe30-gfp 51

4 KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ 53

4.1 Kết luận 54

4.2 Đề nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamide gel electrophoresis

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các vaccine uống đã được cấp phép [11] 8Bảng 1.2 Các phối tử tương ứng với các thụ thể trên bề mặt tế bào M [11] [21] 12Bảng 1.3 Các chủng E coli thường được dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp [32] 17Bảng 2.1 Công thức đổ gel phân tách và gel gom trong điện di SDS – PAGE 38Bảng 3.1 Nồng độ và độ tinh sạch của plasmid pET-co1-gfp 43

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Đặc điểm cấu trúc tế bào M [17] 10

Hình 1.2 Đáp ứng miễn dịch niêm mạc thông qua tế bào M [18] 11

Hình 1.3 Cơ chế vận chuyển kháng nguyên xuyên tế bào của tế bào M [19] 11

Hình 1.4 Cơ chế vận chuyển kháng nguyên thông qua tương tác phối tử và thụ thể [11] 12

Hình 1.5 Cấu trúc của CPE [23] 15

Hình 1.6 Cấu trúc protein GFP [29] 16

Hình 1.7 Cơ chế điều hòa của T7 promoter [35] 20

Hình 2.1 Plasmid pET-co1-gfp 27

Hình 2.2 Các thang chuẩn 27

Hình 2.3 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pET-cpe30-gfp 28

Hình 2.4 Sơ đồ minh họa thứ tự các thành phần trong bước chuyển màng 40

Hình 3.1 Thu nhận gene cpe30 bằng phương pháp PCR 42

Hình 3.2 Thu nhận và cắt mở vòng plasmid pET-co1-gfp bằng BamHI và NdeI 43

Hình 3.3 Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E coli DH5α 44

Hình 3.4 Sàng lọc thể biến nạp E coli DH5α bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi T7promoter và T7terminator 45

Hình 3.5 Sàng lọc thể biến nạp E coli DH5α bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi cpe30-F và cpe30-R 47

Hình 3.6 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-cpe30-gfp bằng phương pháp PCR với cặp mồi T7promoter/T7terminator và cặp mồi cpe30-F/cpe30-R 48

Hình 3.7 Biến nạp plasmid pET-cpe30-gfp vào tế bào E coli BL21(DE3) 49

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH

Hình 3.8 Sàng lọc thể biến nạp E coli BL21(DE3) bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi cpe30-F và cpe30-R 50Hình 3.9 Kiểm tra sự biểu hiện protein dung hợp CPE30-GFP bằng điện di SDS-PAGE (A) và Western blot với kháng thể kháng 6xHis-taq (B) 51

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÓM TẮT

TÓM TẮT

Vaccine uống là phương pháp hiệu quả nhất nhằm phòng ngừa các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa Nhằm phát triển hệ thống phân phối vaccine hiệu quả, kháng nguyên được định hướng nhắm trúng đích tới tế bào M để giảm đi sự phân tán của kháng nguyên trên bề mặt ruột, tăng khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch Trong đó, peptide CPE30 được đánh giá là phối tử có khả năng bám với thụ thể Claudin 4 trên tế bào M Để quan sát và đánh giá khả năng bám của

peptide CPE30, chúng tôi tiến hành dòng hóa gen cpe30 vào vector pET-co1-gfp thay thế cho vị trí gen co1 trước đó bởi hai enzyme cắt giới hạn BamHI và NdeI trên chủng E coli DH5α Kết quả biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của protein

dung hợp CPE30-GFP được cảm ứng bằng IPTG trong tế bào chủ

E coli BL21(DE3) bằng phương pháp SDS-PAGE và Western blot với kháng thể

kháng 6xHis-taq, cho thấy khả năng biểu hiện vượt mức protein CPE30-GFP trong tế bào chất, chủ yếu ở dạng tan Với kết quả này, protein dung hợp CPE30-GFP có thể trở thành nguyên liệu để tinh chế và đánh giá khả năng bám với Claudin 4 trên tế bào M

SUMMARY

Oral vaccine is the most effective way to prevent gastrointestinal infections

In order to develop vaccine delivery systems effectively, antigens will be targeted

to M cells to reducing the dispersion of antigens on the intestinal surface, and increasing immune responses Especially, the CPE30 peptide was evaluated as a potential ligand which binds to the Claudin 4 receptor on M cells To observe and

evaluate the binding affinity specific of the CPE30 peptide, we cloned cpe30 gene into the pET-co1-gfp plasmid to replacing the co1 gene by two restriction enzyme

BamHI and NdeI on the E coli DH5α strain The expression and confirmation of

fusion protein CPE30-GFP which is inducibled by IPTG in E coli BL21(DE3)

strain by SDS-PAGE and Western blot with 6xHis-taq antibody demonstrated that the expression of CPE30-GFP fusion protein in the cytoplasm, mainly the soluble form With this result, the CPE30-GFP fusion protein will be purified and measured the binding affinity to Claudin 4 on M cells

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI MỞ ĐẦU

LỜI MỞ ĐẦU

Ruột là nơi tiếp xúc với rất nhiều vi sinh vật thông qua con đường ăn uống;

trong đó có cả những vi sinh vật gây bệnh như: Salmonella, Campylobacter,

Shigella, Các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa rất dễ bùng phát thành dịch, gây

nguy hiểm cho người bệnh nếu không được xử lý kịp thời Theo số liệu thống kê,

vi sinh vật đã gây ra hàng triệu ca mắc bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa mỗi năm trên toàn thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển Trong khi đó, vi sinh vật ngày càng biến đổi để chống lại hàng rào miễn dịch của con người Phương pháp điều trị chưa thực sự hiệu quả, việc lạm dụng thuốc kháng sinh gây nên tình trạng kháng kháng sinh cao của nhiều loài vi sinh vật gây bệnh Do đó, các nhà nghiên cứu đang phát triển phương pháp phòng ngừa các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa bằng cách sử dụng vaccine uống

Vaccine uống có khả năng ngăn chặn các tác nhân gây bệnh Vaccine uống vừa gây đáp ứng miễn dịch hệ thống, vừa gây đáp ứng miễn dịch tại vị trí niêm mạc ruột một cách hiệu quả Đồng thời, vaccine uống có thể sản xuất trên quy mô lớn, dễ sử dụng và bảo quản, hạ thấp chi phí đầu tư và giá thành sản phẩm Tuy nhiên, vaccine uống vẫn còn tồn tại một số nhược điểm như dễ bị biến tính bởi điều kiện khắc nghiệt ở dạ dày, diện tích cũng như bề mặt tiếp xúc của dạ dày và ruột lớn gây phân tán lượng kháng nguyên đưa vào cơ thể Thêm vào đó, ruột cũng là nơi có nhiệm vụ chính là hấp thụ thức ăn và chất dinh dưỡng nên hiện tượng dung nạp miễn dịch rất dễ xảy ra Hiện nay, có nhiều nghiên cứu tập trung phát triển các hệ thống dẫn truyền vaccine uống nhằm phân phối trúng đích tế bào M - một loại tế bào biểu mô chuyên biệt có khả năng vận chuyển kháng nguyên đến các tế bào miễn dịch, để tăng cường khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch hiệu quả

Theo nhiều nghiên cứu, peptide CPE30 nằm ở vùng đầu C của protein độc

tố Clostridum perfringens có khả năng gắn đặc hiệu với thụ thể Claudin 4 trên bề

mặt tế bào M thông qua tương tác phối tử – thụ thể, và không gây độc cho tế bào

Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo dòng và biểu hiện peptide CPE30 có nguồn

gốc từ protein độc tố Clostridium perfringnes dung hợp với GFP” trên tế bào chủ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI MỞ ĐẦU

E coli Chúng tôi tiến hành dung hợp phối tử peptide CPE30 với kháng nguyên

mô hình GFP để theo dõi khả năng vận chuyển kháng nguyên nhắm trúng đích tế bào M, nhằm thực hiện các nghiên cứu tiếp theo để phát triển và sản xuất vaccine uống

Với mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài với những nội dung sau:

 Cấu trúc chủng E coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET-cpe30-gfp;

 Cấu trúc chủng biểu hiện E coli BL21(DE3) mang vector pET-cpe30-gfp;

 Biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của protein dung hợp CPE30-GFP trong

chủng E coli BL21(DE3)/pET-cpe30-gfp

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa

1.1.1 Tình hình trong nước và trên thế giới

Bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa gây ra bởi nhiều vi sinh vật gây bệnh,

chủ yếu là một số vi khuẩn như Salmonella, Campylobacter, Shigella, Escherichia

coli O157: H7, Clostridium difficile; virus như Caliciviruses, Rotaviruses, và ký

sinh trùng Giardia, Cryptosporidium Nhiễm khuẩn đường tiêu hóa có thể xảy ra

ở mọi lứa tuổi, đặc biệt ở trẻ nhỏ và người già, những người bị suy giảm miễn dịch Mầm bệnh có thể có trong thực phẩm, nước, hoặc lây lan từ người sang người Vì thế, bệnh thường xuyên xuất hiện và bùng phát thành dịch ở những nơi đông dân

cư, công tác giữ gìn vệ sinh kém, ăn uống không hợp vệ sinh Người mắc bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa thường có triệu chứng sốt, đau bụng, tiêu chảy hay kiết lỵ, buồn nôn, nôn mửa và đau bụng,… Mặc dù không trực tiếp đe dọa đến tính mạng, nhưng bệnh không được điều trị kịp thời có thể gây ra những biến chứng nguy hiểm như xuất huyết tiêu hóa, suy thận, viêm màng não mủ, thậm chí tử vong [1]

Theo Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh dịch Hoa Kỳ (Centers for Disease Control and Prevention), vi sinh vật gây bệnh là nguyên nhân chính gây

ra 9,4 triệu ca bệnh về đường tiêu hóa liên quan đến thực phẩm mỗi năm, trong số đó có 55961 ca nhập viện và 1,351 trường hợp tử vong [1] Tại Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, từ năm 2004-2009 đã có 1058 vụ ngộ độc thực phẩm, trung bình 176,3 vụ/ năm, số người bị ngộ độc thực phẩm là 5302 người/năm, số người chết là 298 người (49,7 người/năm) trong đó nguyên nhân gây bệnh do vi sinh vật chiếm đến 29,6% [2]

Trong đó, bệnh tiêu chảy là một trong những bệnh thường gặp của bệnh nhiễm khuẩn đường ruột Tiêu chảy là nguyên nhân chính gây tử vong ở trẻ em dưới 5 tuổi, đặc biệt là ở các nước đang phát triển [3] Tiêu chảy cấp là bệnh nguy hiểm gây tình trạng mất nước, sụt cân và nếu để tình trạng này kéo dài sẽ dẫn đến suy dinh dưỡng, và có nguy cơ tử vong Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (World Heath Organization), trên toàn thế giới, số ca mắc bệnh lên đến 1,7 tỷ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

trường hợp mỗi năm, trong đó có khoảng 525000 trường hợp ở trẻ em dưới 5 tuổi [4] Theo cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ, ở các nước phát triển như Hoa Kỳ, vi khuẩn đường ruột gây ra khoảng 5 triệu ca tiêu chảy mỗi năm Tại Việt Nam, quỹ nhi đồng Liên Hợp Quốc thống kê được tiêu chảy vẫn là một trong hai nguyên chính gây tử vong ở trẻ em, chiếm 10% tổng số trường hợp tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi [5]

Chính vì thế, bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa cần được phòng chống và điều trị kịp thời để tránh lây lan, bùng phát thành dịch trên diện rộng, hạn chết số người mắc bệnh và tử vong

1.1.2 Phương pháp phòng ngừa và điều trị

Hàng ngày, cơ thể tiếp xúc với một lượng lớn vi sinh vật gây bệnh theo thức

ăn, nước uống xâm nhiễm vào đường ruột, tuy nhiên phần lớn đều không gây bệnh nhờ vào hàng rào bảo vệ nghiêm ngặt của cơ thể Môi trường khắc nghiệt ở ruột sẽ làm ức chế sự sinh trưởng của một số tác nhân gây bệnh Nhu động ruột cũng sẽ giúp làm sạch vi sinh vật gây bệnh ở đầu ruột non Đồng thời, hàng rào tế bào biểu mô ngăn vi sinh vật gây bệnh bám lên và xâm nhập vào bên trong ruột Bên cạnh đó, hệ thống miễn dịch của cơ thể là cơ chế phòng vệ giúp chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh, bằng cách gây ra một loạt các phản ứng viêm và kháng khuẩn Đáp ứng phòng vệ sớm giúp cơ thể kiểm soát, hạn chế nhiễm khuẩn Tuy nhiên, nhiều vi sinh vật gây bệnh có khả năng chống lại sự đề kháng tự nhiên của người, gây nên hàng triệu ca mắc bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa mỗi năm [6] Do đó, khi có những triệu chứng của bệnh, người bệnh cần đến các cơ sở y tế để được bác sĩ điều trị kịp thời

Phương pháp điều trị cho người bệnh mắc bệnh nhiễm khuẩn đường ruột chủ yếu dựa vào kháng sinh đồ Kháng sinh sẽ trực tiếp tiêu diệt vi khuẩn hoặc làm chậm lại sự phát triển của vi khuẩn, tạo điều kiện cho hệ miễn dịch của cơ thể giải quyết tình trạng nhiễm khuẩn Tuy nhiên, kháng sinh không chỉ tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh mà còn tiêu diệt cả vi khuẩn có lợi có trong đường ruột, từ đó làm mất cân bằng mang tính tự nhiên của cơ thể [7] Thêm vào đó, sử dụng kháng sinh

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

quá nhiều, bừa bãi sẽ làm phát sinh nhiều bệnh như rối loạn dạ dày, tiêu chảy và tăng nguy cơ mắc bệnh rối loạn tự miễn đường ruột Một trong những lo ngại hiện nay là tình trạng lạm dụng kháng sinh, dẫn đến vi khuẩn có thể thích ứng và kháng kháng sinh Theo báo cáo của trung tâm phòng chống bệnh tật Châu Âu (ECDC), hằng năm tại Châu Âu có trên 25000 ca bệnh chết vì nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh Các vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh được tìm thấy ở người như

Campylobacter có tỷ lệ kháng ciprofloxacin đến 60,2%; Salmonella có tỷ lệ kháng

tetracycline 30%, sulphonamide 28,2%, ampicillin 28,2%, hầu hết các chủng

Shigella có tỷ lệ kháng streptomycin 98,7%, trimethoprim 98,0%, ampicillin

92,1% và acid nalidixic 91,7% [8]

Với thực trạng kháng kháng sinh như đã đề cập, FDA khuyến khích phát triển các loại thuốc mới, vaccine phòng bệnh, và thử nghiệm cải tiến đối với các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa Một trong những phương pháp phòng ngừa hiệu quả nhất hiện nay chính là sử dụng vaccine uống [9] Vaccine uống đã được nghiên cứu từ khoảng 900 năm trước, khi Bedouins lấy gan chó dại nướng và cho người bị chó cắn ăn Đến thế kỷ 16, những thầy thuốc người Trung Quốc đã kê đơn thuốc làm từ bọ chét thu từ những con bò bị bệnh để ngăn ngừa bệnh đậu mùa Nghiên cứu khác của Charles Richet vào năm 1990 cho người ăn thịt chó mắc bệnh lao để chữa bệnh – zomotherapy [10] Những dẫn chứng đó cho thấy tiềm năng ứng dụng của vaccine dạng uống trong việc phòng bệnh một cách an toàn nếu được phát triển đúng đắn Trên lý thuyết, vaccine uống có thể kích thích đáp ứng miễn dịch hệ thống tạo ra kháng thể IgG để ngăn chặn vi sinh vật và độc tố của chúng trong máu Đồng thời, vaccine uống cũng có thể kích thích đáp ứng miễn dịch cục bộ tại vị trí niêm mạc ruột bằng cách tiết kháng thể IgA giúp ngăn ngừa sự bám dính của vi sinh vật lên biểu mô ruột, hạn chế ngay từ lớp đầu tiên của hệ thống phòng vệ, và giúp tăng khả năng đáp ứng miễn dịch Hơn nữa vaccine có thể được sản xuất trên quy mô lớn, chi phí thấp, an toàn và dễ sử dụng [11] [12] Vì thế vaccine uống sẽ có nhiều cơ hội tiếp cận đến người dân ở các nước đang phát triển Hiện nay, nhiều nghiên cứu đang tập trung phát triển vaccine uống chống lại các

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

tác nhân vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa Một số vaccine uống đã được sản xuất và đưa vào sử dụng như bảng 1.1

Bảng 1.1 Các vaccine uống đã được cấp phép [11].

Tác nhân gây bệnh Thành phần Khả năng phòng bệnh

Salmonella Typhi Sống, nhược độc Lớn hơn 90%

Vibrio cholera Bất hoạt Lớn hơn 85% Mặc dù vaccine uống có rất nhiều ưu điểm, nhưng số lượng vaccine đường uống vẫn còn bị giới hạn ở con số rất hạn chế do việc nghiên cứu và phát triển vaccine uống gặp phải rất nhiều khó khăn [11] Điều kiện khắc nghiệt ở dạ dày và ruột như pH thấp (2-3,5), hệ thống enzyme phân giải như protease và peptidase dẫn đến hiện tượng phân cắt kháng nguyên đưa vào cơ thể Diện tích bề mặt của ruột quá lớn (khoảng 32m2 [13]) nên gây ra sự phân tán kháng nguyên Bên cạnh đó, ruột là nơi chịu trách nhiệm tiêu hóa thức ăn nên kháng nguyên đưa vào dễ bị hiện tượng dung nạp miễn dịch, làm giảm khả năng gây đáp ứng miễn dịch của vaccine Chính vì thế, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để khắc phục những nhược điểm của vaccine uống Các hệ thống dẫn truyền vaccine uống đã được phát triển nhằm bảo vệ và vận chuyển vaccine nhắm trúng đích vào tế bào M (Microfold), một loại tế bào tuy chiếm tỉ lệ rất ít trong lớp tế bào biểu mô ruột, nhưng đóng vai trò quan trọng kích hoạt quá trình đáp ứng miễn dịch [10] [12]

1.2 Đáp ứng miễn dịch thông qua tế bào M

1.2.1 Giới thiệu chung

Hệ thống miễn dịch niêm mạc ruột giúp cơ thể chống lại sự xâm nhiễm của

vi sinh vật và các tác nhân gây bệnh khác Trong đó, bề mặt niêm mạc ruột được cấu thành bởi nhiều loại tế bào, bao gồm: tế bào biểu mô, tế bào Goblet, tế bào Paneth và tế bào M (microfold) đóng góp những chức năng khác nhau Các tế bào biểu mô ruột liên kết chặt chẽ với nhau nhờ các nút liên kết liên bào, tạo nên hàng rào phòng vệ vững chắc và kiểm soát có chọn lọc sự khuếch tán thụ động của các

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

ion và dưỡng chất hòa tan thông qua các kênh vận chuyển Tế bào biểu mô có chức năng như một hàng rào biểu mô, hấp thu các chất dinh dưỡng, và tiết các chất điện giải nhằm ngăn cản sự tấn công của mầm bệnh Tế bào Goblet tiết ra mucin glycoprotein tạo thành lớp glycocalyx bao phủ bề mặt tế bào biểu mô nhằm ngăn cách vi sinh vật đường ruột và bề mặt biểu mô ruột Đồng thời, tế bào Paneth tiết

ra các chất kháng khuẩn như: α-defensin và criptdin, lectin kháng khuẩn C-type, β-1,4-glycosidase (lysozyme C), và phospholipid-sn-2 esterases ức chế sự phát triển của vi sinh vật Thêm vào đó, tế bào M là tế bào biểu mô chuyên biệt có thể vận chuyển kháng nguyên đến các tế bào miễn dịch nằm bên dưới, kích hoạt quá trình đáp ứng miễn dịch Hơn nữa, nhu động ruột cũng có tác dụng loại bỏ vi sinh vật tiếp cận bề mặt niêm mạc [14] Chính về thế, hệ thống miễn dịch niêm mạc ruột trở nên hiệu quả, góp phần bảo vệ cơ thể khỏi sự tấn công của các mầm bệnh

1.2.2 Tế bào M

Tế bào M (Microfold cells) lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1965, là một loại tế bào biểu mô có chức năng vận chuyển kháng nguyên, chiếm tỉ lệ rất ít – chỉ khoảng 10% trong tổng số các tế bào biểu mô ruột Tế bào M được tìm thấy chủ yếu ở bề mặt các mô lympho trong ruột non – cụ thể ở nang tế bào biểu mô (follicle-associated epithelium – FAE), phía trên cấu trúc Peyer’s Patch (PPs) Tế bào M có vai trò trong việc hình thành các đáp ứng miễn dịch đường ruột nhờ khả năng vận chuyển kháng nguyên đến các tế bào miễn dịch bên dưới, giúp bảo vệ cơ thể khỏi sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây bệnh đường ruột Có nhiều nghiên cứu đã và đang sử dụng cơ chế này để tạo ra vaccine uống giúp gia tăng khả năng gây đáp ứng miễn dịch hệ thống và đáp ứng miễn dịch tại vị trí niêm mạc ruột [15]

Tế bào M có những đặc điểm hình thái đặc trưng riêng rất dễ nhận ra và phân biệt với các loại tế bào khác trong ruột như: bề mặt đỉnh có rất ít lông nhung, lớp gycocalyx mỏng, phía trong tế bào M có một hốc lõm vào tạo thành cấu trúc túi (basolateral) Bề mặt nhẵn và lớp gycocalyx mỏng giúp tế bào M có khả năng tiếp xúc tốt hơn với các kháng nguyên Cấu trúc túi là nơi chứa tế bào B, tế bào T, đại thực bào và các tế bào DC (Dendritic cells) Đây là vùng tiếp cận của tế bào lympho và các tế bào trình diện kháng nguyên (Hình 1.1) Chính nhờ cấu trúc này

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

mà khoảng cách từ đỉnh tới đáy của tế bào M được thu hẹp lại, giúp rút ngắn thời gian và quãng đường vận chuyển của kháng nguyên từ vị trí tiếp nhận đến các tế bào miễn dịch Bên cạnh đó, thể tích lysosome và hoạt tính lysozyme trong tế bào

M kém hơn rất nhiều, khoảng 16 lần, so với với tế bào biểu mô ruột bình thường; nhờ vậy kháng nguyên ít bị biến đổi cấu trúc khi được từ tế bào M vận chuyển vào nang lympho [16]

Hình 1.1 Đặc điểm cấu trúc tế bào M [17].

Những đặc điểm đặc trưng của tế bào M đã được đề cập ở trên cho thấy tế bào M không đảm nhiệm chức năng tiêu hóa và hấp thụ chất dinh dưỡng như tế bào biểu mô ruột khác Ở đây tế bào M có chức năng là vận chuyển các kháng nguyên đường ruột cho các tế bào miễn dịch Kháng nguyên được vận chuyển nguyên vẹn đến các tế bào miễn dịch tập hợp trong cấu trúc hình vòm gọi là SED (subepithelial dome) Đại thực bào và tế bào DCs thu nhận và xử lý kháng nguyên,

di chuyển đến vùng nang lympho trình diện kháng nguyên cho tế bào T, kích hoạt tế bào T từ tế bào T trinh nguyên thành tế bào T đáp ứng Đồng thời, tế bào T CD4+ đáp ứng với kháng nguyên biểu hiện phối tử CD40 tương tác thụ thể CD40 trên tế bào B Tế bào B được kích hoạt sẽ biệt hóa thành tương bào sản xuất kháng thể IgA, và quá trình hình thành tế bào nhớ sẽ diễn ra Kháng thể IgA đặc hiệu cho kháng nguyên được tạo ra, liên kết với nhau tạo thành dạng dimeric và di chuyển đến khoang ruột dưới dạng sIgA thông qua thụ thể Dectin-1 [11] [15]

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.2 Đáp ứng miễn dịch niêm mạc thông qua tế bào M [18].

Để vận chuyển kháng nguyên đến các tế bào miễn dịch ở ruột, tế bào M có nhiều cách tiếp nhận và vận chuyển các vật chất khác nhau vào trong tế bào; cơ chế của các phương thức vận chuyển này phụ thuộc vào kích thước và bản chất của vật chất mà nó vận chuyển (hình 1.3) Đối với vi khuẩn và các hạt có kích thước lớn, tế bào M thường sử dụng phương thức thực bào bằng cách biến đổi màng tế bào và sắp xếp lại khung actin, tạo thành các bóng thực bào bao gói vật chất và vận chuyển vào trong tế bào Đối với virus và các hạt bám dính khác được nhập bào thông qua các bóng clathrin Đối với các hạt không bám dính thì được vận chuyển bằng ẩm bào [19]

Hình 1.3 Cơ chế vận chuyển kháng nguyên xuyên tế bào của tế bào M [19]

Đặc biệt, tế bào M có một cơ chế vận chuyển kháng nguyên đặc hiệu dựa vào tương tác giữa phối tử (ligand) và thụ thể (receptor) chuyên biệt trên tế bào M (hình 1.4) [11]

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.4 Cơ chế vận chuyển kháng nguyên thông qua tương tác phối tử và thụ

thể [11]

Đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện củng cố kiến thức về tế

bào M Người ta tạo ra được mô hình in vitro của tế bào M (Kerneis et al., 1997; Verbrugghe et al., 2006; Kanaya et al., 2008) và một loạt các nghiên cứu về các

thụ thể trên bề mặt tế bào M cũng đã được tiến hành Từ đó các thụ thể trên tế bào

M cùng với phối tử bám đặc hiệu với nó dần được công bố (Bảng 1.2) Cụ thể vào năm 2007, các nhà nghiên cứu người Nhật Bản tại Viện Khoa học Y khoa, Đại học Tokyo đã phát hiện ra phối tử – kháng thể NKM 16-2-4 có khả năng gắn đặc hiệu với thụ thể α(1, 2) fucose-containing carbohydrates trên tế bào M Các nhà khoa học ứng dụng sự tương tác đặc hiệu này để làm mô hình vaccine đường uống chống lại độc tố Botulinum, với mục tiêu nhắm đến đích tế bào M để tăng hiệu quả sử dụng vaccine và cảm ứng sản xuất kháng thể đặc hiệu IgA [20] Gần đây, vào năm

2016, Gicheva và cộng sự tìm ra Siglec F - một thụ thể mới trên tế bào M và phối tử của nó Bằng cách tạo kháng thể đơn dòng anti Siglec F, các nhà khoa học đánh giá khả năng biểu hiện của Siglec F trên bề mặt tế bào M, và tương tác giữa thụ thể Siglec F và phối tử anti Siglec F dựa trên sự phân tích đoạn ruột được cắt từ chuột thí nghiệm kết hợp với kỹ thuật đếm tế bào (flow cytometry) và quan sát dưới kính hiểu vi huỳnh quang [21]

Bảng 1.2 Các phối tử tương ứng với các thụ thể trên bề mặt tế bào M [11] [21].

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

liên kết với nhau

carbohydrate

FimH (E coli, Salmonella) Glycoprotein 2/uromodulin

Hsp60 của Brucella abortus Cellular prion protein

Lipid A domain of LPS (Vi khuẩn gram

âm)

AnxA5

Vùng độc tố đầu C của Clostridium

perfringens

Claudin 4

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.3 Peptide CPE30 (Clostridium perfringens enterotoxin)

Protein độc tố Clostridium perfringens (CPE) là một trong những tác nhân

có khả năng gây ngộ độc thực phẩm và tổn thương biểu mô ruột CPE là một polypeptide đơn có kích thước 35 kDa Cấu trúc của CPE bao gồm 3 vùng: (1) vùng domain I là đầu C của CPE (C-CPE) nhận diện và bám lên các thụ thể là Claudin 3 và Claudin 4 hiện diện trên tế bào M, (2) vùng domain II chịu trách nhiệm cho quá trình hình thành phức hợp CH-1 xen vào màng tế bào, (3) vùng domain III tham gia vào chuyển đổi cấu trúc, tạo lỗ hổng trên màng và làm thay đổi tính thấm của màng, gây ly giải tế bào [22] [23]

Ngoài khả năng bám lên thụ thể, CPE có thể gây độc và làm chết tế bào, do đó nhiều thực nghiệm đã được tiến hành nhằm cải thiện vấn đề này Các bằng chứng khoa học phát hiện ra rằng vùng C-CPE vừa có khả năng nhận diện và bám lên các thụ thể Claudin trên tế bào M với ái lực cao một cách độc lập, vừa không gây độc cho tế bào Trong đó, peptide chứa 30 amino acid ở vùng đầu C là CPE290-

319 (CPE30) có khả năng bám lên vùng loop ngoại bào thứ hai (Ecl2) của Claudin

4 tại vị trí giữa phiến beta 8 và 9 mà vẫn giữ được ái lực cao (hình 1.5) [22] [23] [24] Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chứng minh CPE30 vẫn có khả năng hình thành liên kết với phối tử Claudin 4 khi dung hợp với các protein khác như

hemagglutinin của virus cúm, kháng nguyên của virus Coxsackie B3, và protein A trên bề mặt của Streptococcus pneumoniae Chứng tỏ rằng liên kết được hình thành

giữa CPE30 và Claudin 4 trên tế bào M có thể được duy trì trong điều kiện khác nhau [24] [25] [26] Các nghiên cứu này mở ra hướng ứng dụng mới, tạo ra vaccine uống bằng cách dung hợp phối tử CPE30 với các loại kháng nguyên khác nhau để vận chuyển nhắm trúng đích đến tế bào M thông qua sự liên kết của CPE30 với các thụ thể Claudin 4, nhằm phân phối vaccine và gây đáp ứng miễn dịch một cách hiệu quả

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.5 Cấu trúc của CPE [23].

1.4 Protein phát huỳnh quang lục GFP

GFP (Green Fluoescent Protein) là protein lần đầu tiên được tìm thấy vào những năm 1960 – 1974 như một hợp chất phát sáng – aequorin – có ở loài sứa jellyish Aequorea victoria sống ở vùng nước lạnh biển bắc Thái Bình Dương [27] Protein GFP có dạng hình trụ, bao gồm mười một sợi phiến β bao bọc xung quanh và một sợi xoắn α nằm bên trong Phần đỉnh của hình trụ được bao phủ bởi ba đoạn xoắn

ốc ngắn và một đoạn xoắn ốc ngắn khác nằm ở phần đáy Trong đó, phân tử phát quang (Chromophore) được bảo vệ ở trung tâm cấu trúc hình trụ, đảm bảo đặc tính phát ra ánh sáng huỳnh quang của protein GFP (hình 1.6) Chromophore được tạo

ra nhờ sự hình thành cấu trúc vòng thơm do số lượng liên kết Cα-Cβ giảm để tạo liên kết mới, kết hợp với sự đóng vòng và oxy hóa của 3 peptide: Ser65 (Thr65) – Tyr66 - Gly67 Do đó, nhiều ứng dụng đã được tiến hành để tạo ra các đột biến

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

điểm định hướng trên GFP và chuỗi bên đặc biệt liên quan đến quá trình hình thành chromophore, nhằm tăng khả năng phát quang của GFP [28]

Hình 1.6 Cấu trúc protein GFP [29]

Gene gfp được đánh giá cao vì những đặc điểm nổi bật như trên Hiện nay gene gfp được quan tâm sử dụng như hệ thống marker gene, reporter gene cho

những vi sinh vật biến đổi gene Ngoài ra với đặc tính dễ quan sát, độ chính xác cao, không phá hủy tế bào, không gây độc cho tế bào, tan tốt, biểu hiện cường độ cao nhưng vẫn giữ được hoạt tính phát huỳnh quang và có thể kiểm tra từng tế bào chỉ có một bản sao Người ta thường dùng quan sát quá trình hoạt động bên trong khi vi sinh vật xâm nhập vào kí chủ (Ví dụ như quan sát Agrobacterium, Rhizobium khi nó kí sinh vào rễ cây), quan sát sự hình thành khuẩn lạc và mật độ tế bào qua các phase cũng tương đương cường độ phát sáng [27] Chính vì thế, protein GFP có thể được sử dụng như một marker - một protein dung hợp với kháng nguyên mục tiêu để theo dõi sự vận chuyển kháng nguyên đến các tế bào miễn dịch ở ruột

1.5 Biểu hiện protein tái tổ hợp ở Escherichia Coli (E coli)

1.5.1 Giới thiệu chung

Vào những năm 1970, các thí nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp đầu tiên đã thành công ở vi khuẩn như hormone somatostatin, sau đó là insulin đều có giá trị cao ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học Trong

những chủng vi sinh vật dùng để sản xuất protein tái tổ hợp, Escherichia coli là tế

bào chủ được sử dụng phổ biến vì có những ưu điểm nổi bật như: tốc độ tăng

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

trưởng nhanh chóng, đạt được mật độ tế bào cao, phát triển trên môi trường đơn giản, rẻ tiền, các đặc tính di truyền đã được biết rõ, sản lượng protein sản xuất cao (có thể lên đến 50%), có nhiều chủng biến đổi gen (bảng 1.3), nhiều vector tạo dòng thích hợp và thao tác di truyền dễ dàng [30] [31]

Bảng 1.3 Các chủng E coli thường được dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp

[32]

Chủng Đặc điểm

AD494 Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất

BL21(DE3) Bất hoạt protease lon và ompT

BL21 trxB Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất

Bất hoạt protease lon và ompT

BL21

CodonPlus -

RP

Hỗ trợ biểu hiện protein eukaryote với các codon hiếm như

AGG, AGA, CCC Bất hoạt protease lon và ompT

BLR Đột biến recA làm ổn định các vùng lặp

Bất hoạt protease lon và ompT

C41/ C43 Đột biến dành cho biểu hiện protein màng

JM 83 Tiết protein tái tổ hợp ra vùng ngoại vi tế bào chất

Origami B Đột biến trxB/gor hỗ trợ tốt cho việc tạo thành liên kết disulfide

ở tế bào chất Bất hoạt protease lon và ompT

Hỗ trợ biểu hiện protein của eukaryote với các codon hiếm như AUA, AGG, AGA, CGG, CUA, CCC và GGA

Rosetta-gami

Bất hoạt protease lon và ompT Đột biến trxB/gor hỗ trợ tốt cho việc tạo liên kết disulfide ở tế bào chất

Tuy nhiên, quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp ở E coli gặp phải một số

nhược điểm cần khắc phục Thứ nhất, protein được biểu hiện quá nhanh và nhiều

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

dẫn đến protein mục tiêu tạo ra có thể ở dạng tan hay không tan (thể vùi) không có hoạt tính do cấu hình không chính xác Vấn đề thứ hai cần quan tâm là sản xuất

những protein tái tổ hợp có cầu nối disulfide trong tế bào chất của E coli Các chủng E coli có tính khử của môi trường nội bào cao, không có quá trình biến đổi

sau dịch mã nên protein tạo ra thường ở dạng thể vùi, không có hoạt tính Để cải thiện những nhược điểm này, nhiều phương pháp đã được tiến hành nhằm tăng

tính tan của protein tái tổ hợp như sử dụng các chủng E coli khác nhau, giảm nhiệt

độ nuôi cấy vi sinh vật, đồng biểu hiện với chaperone, và đồng biểu hiện DsbA và DsbB để giúp tăng cường khả năng hình thành cầu nối disulfide [31] [32]

1.5.2 Hệ thống cảm ứng biểu hiện ở E coli bằng IPTG

1.5.3.1 Hệ thống vector pET

Các vector pET được thiết kế đầu tiên bởi Studier và các đồng nghiệp (1986) Hiện nay, hệ thống vector pET trở thành hệ thống tạo dòng và biểu hiện

protein tái tổ hợp mạnh trong tế bào E coli Nhiều vector pET đã được cải tiến bổ

sung nhiều đặc tính vượt trội nhằm hỗ trợ cho việc tạo dòng, biểu hiện và tinh chế protein mục tiêu một cách dễ dàng Để lựa chọn được vector pET phù hợp với protein mục tiêu cần biểu hiện, có thể xét đến 3 yếu tố quan trọng là mục đích sản xuất protein mục tiêu, những đặc tính sinh học của protein và chiến lược tạo dòng

Hệ thống vector pET được sử dụng phổ biến để tạo dòng và biểu hiện

protein tái tổ hợp trong E coli Vector pET chứa vùng multiple cloning site (MCS)

tập trung các vị trí cắt giới hạn chuyên biệt giúp dễ dàng trong việc dòng hóa gen

mục tiêu Vùng MCS được thiết kế nằm ở vùng hạ lưu của của T7 promoter Khi enzyme T7 RNA polymerase được tế bào chủ tạo ra, T7 RNA polymerase gắn với

T7 promoter giúp phiên mã gen đích Ngoài ra, vector pET còn có vị trí lac operator

và gen lacI mã hóa cho lac repressor để kiểm soát, điều hòa sự hoạt động của

T7 promoter

Vì T7 promoter là một promoter mạnh, có tốc độ phiên mã nhanh gấp 5 lần RNA polymerase của E coli, và chỉ gắn đặc hiệu với T7 RNA polymerase có nguồn gốc từ thực khuẩn thể λT7 nên protein mục tiêu được điều hòa biểu hiện

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

một cách hiệu quả Sau vài giờ cảm ứng, protein mục tiêu có thể chiếm đến 50% trong tổng số protein tế bào sản xuất Bên cạnh đó, hệ thống vector pET có khả năng giữ ổn định gen mục tiêu, ngăn chặn biểu hiện gen khi dòng hóa vào tế bào

chủ không chứa gen mã hóa cho T7 RNA polymerase

Tuy nhiên, trong một số trường hợp, protein vẫn có biểu hiện rò rỉ mặc dù

không được cảm ứng Trường hợp này gây lợi cho tế bào chủ E coli khi gen mục

tiêu cần biểu hiện có thể gây độc, làm ảnh hưởng đến sức sống của tế bào Để khắc

phục nhược điểm này, có thể tiến hành đồng biểu hiện T7 lysozyme để phân hủy

số lượng T7 RNA polymerase rò rỉ Nhờ vậy protein có khả năng gây độc đối với

tế bào chủ sẽ không được biểu hiện cho đến khi thêm chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy [31] [33]

1.5.3.2 Cơ chế cảm ứng biểu hiện bằng IPTG

Trong hệ thống biểu hiện được cảm ứng bằng IPTG, gen mã hóa T7 RNA

polymerase nằm trên plasmid đưa vào tế bào vi khuẩn, và được chèn trực tiếp vào

bộ gen tế bào chủ bằng thực khuẩn thể λDE3, chịu sự kiểm soát của lac promoter Trong đó, lac promoter được cảm ứng bởi isopropylthiogalactosidase (IPTG)

Chính vì thế hóa chất này được đưa vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng quá trình phiên mã gen mục tiêu

Khi không có mặt chất cảm ứng IPTG, lac repressor gắn lên lac operator làm promoter lac bị bất hoạt, gen mã hóa cho T7 RNA polymerase không được biểu hiện Khi có sự hiện diện chất cảm ứng IPTG, IPTG sẽ gắn với lac repressor làm protein này không thể gắn với lac operator Lúc này, lac promoter được hoạt hóa, gen mã hóa cho T7 RNA polymerase được biểu hiện tạo ra T7 RNA polymerase Đồng thời, IPTG cũng giải phóng T7 promoter trên vector pET khỏi sự kiểm soát của lac repressor T7 RNA polymerase được tổng hợp sẽ gắn lên

T7 promoter khởi động quá trình phiên mã gen mục tiêu đã được dòng hóa vào

vector, tạo ra protein tái tổ hợp (hình 1.7) [31] [33] [34] [35]

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.7 Cơ chế điều hòa của T7 promoter [35]

2 VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Dụng cụ và thiết bị

- Bộ pipetman 10, 20, 100, 1000, 5000μl, các loại đầu tip tương ứng

- Các loại eppendorf 0,2ml, 1,5ml

- Erlen 100ml, 250ml, 1000ml, ống đong, bercher, đĩa petri

- Đèn cồn, que cấy, bình tia chứa cồn, nước cất

- Cân kỹ thuật (Ohaus, Mỹ)

- Cân phân tích (Precisa, Thụy Sĩ)

- Máy ly tâm Mikro 22 (Hettich, Đức)

- Máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich, Đức)

- Máy lắc ổn nhiệt (Stuart Scientific)

- Máy đo nồng độ DNA Nanodrop (Thermo scientific, Mỹ)

- Máy PCR Mastercycler (Eppendorf, AG Đức)

- Thiết bị chuyển màng lai Trans-Blot SD Semi-Dry (Biorad, Mỹ)

- Bộ điện di protein (Biorad, Mỹ)

- Bộ điện di DNA Gel X Ultra V-2 (Labnet, Mỹ) và hộp đèn soi UV (Hoefer, Mỹ)

- Tủ cấy vô trùng (NUAIRE, Mỹ)

- Máy phá tế bào bằng sóng siêu âm Bioruptor

- pH kế (Thermo scientific, Mỹ)

- Tủ sấy (Memmert, Đức)

- Tủ ấm 37˚C (Memmert, Nhật)

- Tủ lạnh -20˚C (Medical Class, Nhật)

- Tủ lạnh -80˚C (SANYO, Nhật)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

- Tủ mát 4˚C (SANYO, Nhật)

- Máy sonicate (Microson Misonix incorporation, Mỹ)

- Máy spin (Corning, Mỹ)

- Máy đo OD Geneesys 10UV (Thermo scientific, Mỹ)

- Máy Vortex (IKA, Mỹ)

- Máy heat nhiệt (Stuart Scientific, Anh)

- Nồi hấp khử trùng Autoclave (TOMY, Nhật)

2.1.2 Hóa chất và môi trường

2.1.2.1 Hóa chất tách chiết plasmid từ vi khuẩn

- Dung dịch I: glucose 50mM, tris-hcl 2,5mM pH 8,0, EDTA10 mM pH 8.0

- Dung dịch II: 100µl sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%, 40µl NaOH 5N, 860µl dH2O

- Dung dịch III: KOAc 5M, glacial acetic 0,2M, pH 4,8

- Guanidine 6M – Tris 50mM, pH 7,5

- Dung dịch TE: tris-hcl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0

- Bộ kit tinh sạch DNA: EZ-10 Spin Column (Biobasic, Canada)

2.1.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR

- MyTaq DNA polymerase (Bioline, Mỹ)

- Mồi đặc hiệu cpe30-F, cpe30-R (Phù sa Biochem, Việt Nam)

- Mồi T7promoter, T7terminator (Phù sa Biochem, Việt Nam)

- MiliQ

2.1.2.3 Hóa chất dùng cho biến nạp DNA plasmid vào E coli

- Dung dịch CaCl2 100mM vô trùng (giữ ở 40C)

- Dung dịch CaCl2 20mM, MgCl2 80mM vô trùng (giữ ở 40C)

- Dung dịch glycerol 80% vô trùng (giữ ở 40C)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

2.1.2.4 Hóa chất dùng điện di DNA

- Dung dịch TAE: tris acetate 40 mM, EDTA 0.1M (pH 8,0)

- Agarose (Bioline, Mỹ)

- Dung dịch nạp mẫu DNA: xylene cyanol 0.25%, bromophenol blue 0.25%, glycerol 30% trong TAE

- Ethidium bromide 10 mg/ml

2.1.2.5 Hóa chất dùng cho phản ứng cắt và nối

- Enzyme BamHI 10 U/μl (Thermo Scientific, Mỹ)

- Enzyme NdeI 10 U/μl (Thermo Scientific, Mỹ)

- Buffer Tango 10X (Thermo Scientific, Mỹ)

- Enzyme T4 DNA ligase 1U/μl (Thermoscientific, Mỹ)

- T4 DNA ligase buffer 10X (Thermoscientific, Mỹ)

- MiliQ

2.1.2.6 Hóa chất dùng tinh sạch sản phẩm PCR và sản phẩm cắt

- Bộ kit tinh sạch DNA: EZ-10 Spin Column (Bio Basic, Canada)

2.1.2.7 Hóa chất dùng cho điện di SDS - PAGE

- Dung dịch ly giải: tris HCl 50mM, pH 8,0

- Tris – HCl 1,5M pH 8,8 (giữ ở 40C)

- Tris – HCl 0,5M pH 6,8 (giữ ở 40C)

- SDS 10%

- 40% acrylamide - 0,8% bis acrylamide (giữ ở 40C)

- Ammonium persulphate (APS) (giữ ở 40C)

- TEMED (N, N, N’, N’- tetramethylethylene diamine) (giữ ở 40C)

- Dung dịch nạp mẫu protein 6X: glyrerol 30%, DTT 0.6 mM, bromophenol blue 0.01%, SDS 12%, tris hcl 0,5 M, pH 6,8

- Dung dịch điện di 5X (Tris - glycine buffer pH 8,3): tris base 15,1g, SDS 5g, glycine 72 g, pH 8,3 pha trong 1 lít nước