Tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch tiểu phần bám dính (receptor binding domain) của protein FimH dung hợp với GFP

Vắc xin đường uống thể hiện ưu điểm của nó ở nhiều khía cạnh khác nhau. Đầu tiên, nếu vắc xin đường uống được phát triển thành công, nó có thể ngăn chặn tác nhân gây bệnh ngay từ bước đầu xâm nhập. Đồng thời, vắc xin đường uống có khả năng kích hoạt được không chỉ riêng hệ thống miễn dịch tại vị trí xâm nhiễm mà còn cả hệ thống miễn dịch trong toàn cơ thể. Do đó vắc xin đường uống ngoài phòng ngừa việc xâm nhiễm của vi sinh vật theo con đường tiêu hóa, nó còn có thể ngăn chặn sự phát tán của vi sinh vật theo con đường máu. Tiếp theo, việc phát triển thành công vắc xin đường uống có thể sẽ là một hướng giải quyết triệt để đối với tình trạng kháng kháng sinh trong chăn nuôi hiện nay. Với tình hình thị trường tiêu dùng ngày càng tẩy chay các thực phẩm chăn nuôi có sử dụng kháng sinh, và dự thảo cấm sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi đang sắp được thực hiện, vắc xin đường uống ra đời có thể sẽ là một hướng giải quyết tốt vì ưu điểm của nó là có thể dễ dàng sử dụng và áp dụng trên quy mô lớn.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐINH THỊ PHƯƠNG LINH

TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH TIỂU PHẦN BÁM DÍNH (RECEPTOR BINDING DOMAIN)

CỦA PROTEIN FIMH DUNG HỢP VỚI GFP

KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC

NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÔNG NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: ThS Nguyễn Thanh Thảo

CN Nguyễn Thị Thanh Hòa

Thành phố Hồ Chí Minh - 2016

Quãng thời gian được học tập và làm việc trong nhóm nghiên cứu GMIF đối với tôi là điều tuyệt vời mà cuộc đời đã cho tôi, là điều quý giá mà mọi người dành cho tôi

Trước hết, con xin cảm ơn ba mẹ, tuy không sống gần con, tuy không thể lúc nào cũng kề vai sát cánh bên con, nhưng con biết ba mẹ luôn luôn ủng hộ những bước

đi của con và con chưa một lần nào nghi ngờ về điều đó

Em xin cảm ơn Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử và Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TP HCM đã tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành Khóa luận

Có một người Thầy mà em luôn kính trọng và yêu quý, không chỉ bởi những tận tình Thầy dành cho Sinh viên chúng em, mà còn bởi cái cách Thầy gần gũi, vui tươi với chúng em phía ngoài phòng thí nghiệm Em xin cảm ơn Thầy, Thầy Trần Văn Hiếu – Trưởng nhóm nghiên cứu GMIF Cảm ơn Thầy đã cho em cơ hội được học tập, làm việc và giúp đỡ em hoàn thiện bản thân

Em xin cảm ơn chị Nguyễn Thanh Thảo, người luôn vui vẻ giúp đỡ em mọi lúc có thể, cho em những lời khuyên bổ ích và hướng đi đúng đắn

Em xin cảm ơn chị Nguyễn Thị Thanh Hòa đã luôn bên cạnh em trong suốt thời gian thực hiện Khóa luận Cảm ơn chị vì những kiến thức và kĩ năng quý giá chị

đã truyền dạy cho em Cảm ơn chị vì những hôm “đi sớm về trễ” cùng em làm thí nghiệm Cảm ơn chị vì tất cả thời gian chị dành cho em Những hiểu lầm hay xích mích dù lớn hay nhỏ cũng không thể nào làm mờ nhạt đi kết quả cuối cùng rằng, chị

và em, chúng ta đã cùng nhau hoàn thành Khóa luận này, điều mà nếu không có chị, một mình em chẳng bao giờ dám mơ tưởng đến

Cường, anh Công Thuận, chị Xuân Mai, anh Hoàng An, anh Minh Quân, anh Hiếu Nghĩa, anh Minh Vũ đã giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện Khóa luận, cho em được học tập thêm nhiều kiến thức từ các anh chị

Linh xin cảm ơn tất cả các bạn Việt Anh, Thùy Dung, Hoàng Phương, Văn Hảo, Kiến Quang, Kim Tuyền, Minh Tâm, Phương Thảo, Minh Thư, Cẩm Nhung,

Lê Văn đã giúp đỡ Linh, cùng Linh trải qua quãng thời gian đáng nhớ khi làm việc tại phòng thí nghiệm

Cuối cùng, em xin cảm ơn Anh, người tuy không cùng máu mủ, nhưng lại xem

em như là ruột thịt Cảm ơn Anh đã luôn sẵn sàng giúp đỡ em, động viên em Cảm

ơn Anh đã không những cho em những bài học về kiến thức, mà còn giúp em trưởng thành hơn qua những câu chuyện về cuộc sống Trăm câu nghìn chữ viết ra cũng không thể nào diễn tả hết lòng biết ơn của em đối với Anh

Một lần nữa, em xin cảm ơn mọi người

Xin cảm ơn, cảm ơn, cảm ơn…

“Những gì đã qua em sẽ để dành suốt đời”

Đinh Thị Phương Linh

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC CÁC HÌNH iii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.VẮC XIN ĐƯỜNG UỐNG 5

1.1.1 Hiện trạng các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa 5

1.1.2 Vắc xin đường uống 6

1.2.ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH THÔNG QUA TẾ BÀO M 10

1.2.1 Khái quát hệ thống miễn dịch ở ruột non 10

1.2.2 Tế bào M 13

1.3.PROTEIN FIMH 16

1.3.1 Cấu trúc protein FimH 17

1.3.2 Protein FimH gắn định hướng tế bào M thông qua thụ thể Glycoprotein 2 19

1.4.PROTEIN PHÁT HUỲNH QUANG LỤC GFP 20

1.4.1 Khái quát về protein GFP 20

1.4.2 Ứng dụng của GFP 20

1.5.BIỂU HIỆN PROTEIN TRONG VI KHUẨN Escherichia coli 21

1.6.TINH SẠCH PROTEIN 22

1.6.1 Các phương pháp sắc ký 23

1.6.2 Sắc ký ái lực (Affinitive Chromatography – AC) 23

2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 25

2.1.VẬT LIỆU 26

2.1.1 Thiết bị - Dụng cụ 26

2.1.2 Hóa chất 27

2.1.3 Môi trường 30

2.1.4 Nguyên vật liệu 30

2.2.PHƯƠNG PHÁP 31

2.2.1 Tạo dòng tế bào E coli mang vector tái tổ hợp pET22b-fimHrb-gfp 32

2.2.2 Biểu hiện protein dung hợp FimHrb-GFP 39

2.2.3 Tinh sạch protein FimHrb-GFP 42

3.1.TẠO DÒNG TẾ BÀO E coli MANG VECTOR TÁI TỔ HỢP

pET22b-fimHrb-gfp 46

3.1.1 Thu nhận gen fimHrb và thu nhận plasmid pET22b-gfp 46

3.1.2 Sàng lọc dòng tế bào E coli DH5 mang sản phẩm nối pET22b-fimHrb-gfp bằng kĩ thuật PCR khuẩn lạc 47

3.1.3 Kiểm tra plasmid pET22b-fimHrb-gfp bằng giải trình tự 49

3.2.KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN DUNG HỢP FimHrb-GFP 49

3.2.1 Sàng lọc tế bào BL21 (DE3) mang plasmid pET22b-fimHrb-gfp 49

3.2.2 Kiểm tra sự biểu hiện protein FimHrb-GFP 50

3.2.3 Quan sát protein FimHrb-GFP bằng kính hiển vi huỳnh quang 52

3.3.TINH SẠCH PROTEIN FimHrb-GFP 53

4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 56

4.1.KẾT LUẬN 57

4.2.ĐỀ NGHỊ 57

5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

6 PHỤ LỤC iv

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

MHC II Major Histocompatibility Complex

PBST Phosphate buffered saline – Tween

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamide gel

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tác động của vắc xin đối với một số bệnh nhiễm khuẩn thường gặp 7Bảng 1.2 Một số vắc xin đang được sử dụng hiện nay 9Bảng 1.3 Ligand và thụ thể đặc hiệu trên tế bào M 15

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc các lớp trong ruột non 11

Hình 1.2 Cấu trúc biểu mô ruột non 11

Hình 1.3 Cấu trúc Peyer’s Patch 12

Hình 1.4 Đáp ứng miễn dịch màng nhầy sản sinh kháng thể IgA 13

Hình 1.5 Tế bào M 14

Hình 1.6 Cấu trúc gồm nhiều tiểu phần của lông roi loại 1 17

Hình 1.7 Cấu trúc protein FimH và cấu trúc tiểu phần bám dính của protein FimH 18

Hình 2.1 Plasmid pET22b-gfp 31

Hình 2.2 Plasmid pET22b 31

Hình 2.3 Thang phân tử lượng 31

Hình 2.4 Sơ đồ tóm tắt quy trình tạo dòng E coli mang vector pET22b-fimHrb-gfp 32

Hình 3.1 Thu nhận, xử lý gen fimHrb và plasmid pET22b-gfp với enzyme cắt giới hạn NdeI/BamHI 46

Hình 3.2 Biến nạp sản phẩm nối giữa gen fimHrb và pET22b-gfp vào vi khuẩn E coli DH5 47

Hình 3.3 Sàng lọc thể biến nạp E coli DH5 mang pET22b-fimHrb-gfp bằng mồi đặc hiệu trên gen fimHrb 48

Hình 3.4 Sàng lọc thể biến nạp E coli DH5 mang pET22b-fimHrb-gfp bằng mồi trên plasmid 48

Hình 3.5 Biến nạp plasmid pET22b-fimHrb-gfp vào vi khuẩn E coli BL21(DE3) 50 Hình 3.6 Sàng lọc thể biến nạp E coli BL21(DE3) mang pET22b-fimHrb-gfp bằng mồi trên plasmid 50

Hình 3.7 Kiểm tra biểu hiện protein FimHrb-GFP bằng SDS-PAGE và Western Blot 51

Hình 3.8 Ảnh chụp huỳnh quang mẫu tế bào và các pha protein 52

Hình 3.9 Kết quả tinh sạch protein FimHrb-GFP bằng sắc kí ái lực với dung dịch bám cột Tris 50 mM pH 7,5 53

Hình 3.10 Kết quả tinh sạch protein FimHrb-GFP bằng sắc kí ái lực với dung dịch bám cột Acetate 50 mM pH 7,5, dịch rửa không bổ sung Imidazole 54

Hình 3.11 Kết quả tinh sạch protein FimHrb-GFP bằng sắc kí ái lực với dung dịch bám cột Acetate 50 mM pH 7,5, dịch rửa có bổ sung Imidazole 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ lâu, những vấn đề về vệ sinh an toàn thực phẩm đã trở thành một trong những mối quan tâm hàng đầu trong cộng đồng Vấn đề này không chỉ dừng lại ở mức độ ngộ độc thực phẩm, việc ăn phải các thực phẩm không an toàn cũng có thể dẫn đến hàng loạt các căn bệnh nguy hiểm khác lây truyền qua con đường tiêu hóa Nhiều biện pháp phòng tránh đang được tập trung phát triển nhằm ngăn chặn nguy

cơ lây nhiễm các bệnh liên quan đến vệ sinh an toàn thực phẩm hiện đang gia tăng Hằng ngày, cơ thể con người luôn phải tiếp xúc thường xuyên và trực tiếp với các tác nhân gây bệnh có trong thực phẩm thông qua con đường tiêu hóa Chính vì vậy, việc tìm ra phương thức hỗ trợ ngăn chặn sự lan truyền của các tác nhân gây bệnh ngay từ bước xâm nhiễm đầu tiên này là một phương pháp hiệu quả trong việc phòng chống các bệnh lây nhiễm Vì thế, một phương pháp tiềm năng với nhiều ưu điểm đang được hướng tới chính là vắc xin đường uống

Vắc xin đường uống thể hiện ưu điểm của nó ở nhiều khía cạnh khác nhau Đầu tiên, nếu vắc xin đường uống được phát triển thành công, nó có thể ngăn chặn tác nhân gây bệnh ngay từ bước đầu xâm nhập Đồng thời, vắc xin đường uống có khả năng kích hoạt được không chỉ riêng hệ thống miễn dịch tại vị trí xâm nhiễm mà còn cả hệ thống miễn dịch trong toàn cơ thể Do đó vắc xin đường uống ngoài phòng ngừa việc xâm nhiễm của vi sinh vật theo con đường tiêu hóa, nó còn có thể ngăn chặn sự phát tán của vi sinh vật theo con đường máu Tiếp theo, việc phát triển thành công vắc xin đường uống có thể sẽ là một hướng giải quyết triệt để đối với tình trạng kháng kháng sinh trong chăn nuôi hiện nay Với tình hình thị trường tiêu dùng ngày càng tẩy chay các thực phẩm chăn nuôi có sử dụng kháng sinh, và dự thảo cấm sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi đang sắp được thực hiện, vắc xin đường uống ra đời

có thể sẽ là một hướng giải quyết tốt vì ưu điểm của nó là có thể dễ dàng sử dụng và

áp dụng trên quy mô lớn

Mặc dù vắc xin đường uống mang nhiều ưu điểm vượt trội, việc phát triển của loại vắc xin này vẫn còn gặp nhiều khó khăn Việc thành phần vắc xin phân tán trực tiếp trên niêm mạc ruột, cụ thể là khu vực màng nhầy, cản trở kháng nguyên đến đúng

vị trí mà nó cần kích hoạt quá trình đáp ứng miễn dịch, là rào cản đầu tiên đối với vắc xin đường uống Mặc dù hệ thống miễn dịch màng nhầy có cơ chế hiệu quả ngăn

ngừa sự xâm nhiễm của vi sinh vật thông qua việc tiết kháng thể IgA vào trong lòng ruột, bắt lấy kháng nguyên và đào thải chúng ra ngoài theo nhu động ruột, khu vực này lại có xu hướng dung nạp miễn dịch cao hơn đáp ứng miễn dịch Xu hướng dung nạp miễn dịch nhằm tránh các đáp ứng không mong muốn đối với các kháng nguyên

lạ mà cơ thể phải tiếp xúc hằng ngày Có nhiều giải pháp hiện nay được tập trung nghiên cứu để hỗ trợ sự phát triển của vắc xin đường uống Gần đây, có nhiều nghiên cứu hướng tới sử dụng tế bào M, một tế bào đặc biệt bên trong niêm mạc ruột, có khả năng thu nhận và vận chuyển kháng nguyên đến khu vực gây đáp ứng Tế bào M là cửa ngõ đầu tiên cho sự xâm nhập của kháng nguyên Kháng nguyên khi được định hướng đến tế bào M, nó sẽ được vận chuyển xuống hệ thống mô miễn dịch bên dưới

và kích hoạt phản ứng đáp ứng miễn dịch Mặc dù đảm nhận vai trò quan trọng đối với hệ thống miễn dịch màng nhầy của cơ thể, nhưng tế bào M chỉ chiếm một tỉ lệ nhỏ trong tổng số các tế bào ruột Chính vì thế, việc định hướng kháng nguyên đến

tế bào này là hết sức cần thiết Do đó, cần tìm ra một yếu tố định hướng kháng nguyên đến đúng đích là tế bào M để đạt hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch Theo nhiều nghiên

cứu, protein FimH – một tiểu phần trong cấu trúc lông roi loại 1 của vi khuẩn E coli

có khả năng bám dính đặc hiệu với thụ thể Glycoprotein 2 trên bề mặt tế bào M Chính khả năng bám dính của protein FimH đã hỗ trợ vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể

Do đó, protein FimH có khả năng bám định hướng tế bào M được nghiên cứu để ứng dụng làm yếu tố định hướng cho vắc xin đường uống

Trong một nghiên cứu trước đây, việc biểu hiện protein FimH trong tế bào vi

khuẩn E coli gặp phải vấn đề là protein FimH biểu hiện ở thể vùi, do đó gây cản trở

quá trình tinh sạch và thử hoạt tính Vì vậy, cấu trúc protein FimH đã được tìm hiểu

và chúng tôi nhận thấy rằng protein FimH có cấu trúc gồm hai domain có vai trò khác nhau: domain bám dính (FimHrb) có vai trò trong việc bám dính, và domain gắn (FimHp) có chức năng đính FimH với các tiểu phần phía dưới của lông roi loại 1 Việc biểu hiện chỉ domain bám dính FimHrb của protein FimH có thể mở ra hướng khả quan hơn về khả năng biểu hiện và tính tan của protein này Nhằm mục đích theo dõi khả năng định hướng tế bào M của protein FimHrb, protein này được dung hợp với protein GFP nhằm đánh giá khả năng bám dính thông qua hoạt tính phát huỳnh quang

Chính vì thế, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Tạo dòng, biểu hiện và

tinh sạch tiểu phần bám dính (receptor binding domain) của protein FimH dung

hợp với GFP” trên hệ thống E coli nhằm cung cấp những thông tin ban đầu cho dự

án phát triển vắc xin đường uống

4

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VẮC XIN ĐƯỜNG UỐNG

1.1.1 Hiện trạng các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa

Hiện nay, những vấn đề về an toàn thực phẩm và sức khỏe của người tiêu dùng thực phẩm đang ngày càng được quan tâm Hàng loạt các vụ ngộ độc thực phẩm xảy

ra liên tiếp trong thời gian gần đây đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe và thậm chí là cướp đi sinh mạng của nhiều người

Theo số liệu thống kê của tổ chức Y tế thế giới WHO vào năm 2010, trên thế giới có 582 triệu trường hợp mắc các bệnh liên quan đến thực phẩm, trong đó có 351.000 trường hợp dẫn đến tử vong [1] Tình trạng bệnh do thực phẩm này có thể bắt nguồn từ nhiều nguyên nhân: thực phẩm bị lây lan độc tố, bị nhiễm độc từ môi trường tự nhiên, gây ra bởi vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng, hoặc nhiễm độc thông qua

sự nhiễm các chất hóa học từ thực phẩm hoặc nguồn nước Trong các nguyên nhân được dự đoán trên, Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh dịch Hoa Kỳ (The Centers for Disease Control and Prevention – CDC) đã xác định được 31 nguồn gây

bệnh cụ thể, trong đó có 90% nguồn gây bệnh là từ các vi sinh vật: Salmonella, Campylobacter, Toxoplasma, E coli O157:H7, Listeria Clostridium perfringens và

norovirus [2]

Ở Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, từ năm 2004-2009 đã có 1.058 vụ ngộ độc thực phẩm, trung bình 176,3 vụ/năm Số người bị ngộ độc thực phẩm trung bình mỗi năm là 5.302 người/năm Tổng số người chết là 298 người, trung bình 49,7 người/năm Riêng trong năm 2010, trên cả nước đã xảy ra 175 vụ ngộ độc thực phẩm làm 5.664 người mắc bệnh và trong đó có 42 trường hợp tử vong Tìm hiểu về nguyên nhân, Bộ Y tế đã xác định được nguyên nhân chính xác của 58,5% vụ ngộ độc thực phẩm Các nguyên nhân bao gồm ngộ độc do hóa chất hoặc do thực phẩm có sẵn độc

tố trong tự nhiên, trong đó nguyên nhân do vi sinh vật chiếm đến 51% [3]

Bên cạnh đó, vấn đề về thực trạng kháng kháng sinh ngày một tăng lên ở vi sinh vật đã mang tính toàn cầu Nhóm nghiên cứu Quốc gia GARP ở Việt Nam, thuộc

tổ chức CDDEP (Center for Disease Dynamics, Economics & Policy) – Hoa Kỳ đã thực hiện một cuộc nghiên cứu, khảo sát “Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng sinh

và kháng kháng sinh ở Việt Nam” Theo đó, tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam

hiện nay đang ở mức độ cao, điển hình như các chủng Streptococcus pneumoniae có

tỉ lệ kháng lần lượt là 71,4% và 92,1% đối với penicillin và erythromycin Một nghiên

cứu giám sát đã cho thấy thực phẩm bao gồm thịt và cá phát hiện nhiễm Salmonella

đa kháng kháng sinh Campylobacter phân lập từ thịt gà cũng có mức kháng cao:

90% kháng với nalidixic acid, 89% với tetracycline và 82% đối với ciprofloxacin Vi khuẩn phân lập từ trẻ bị tiêu chảy cũng có tỉ lệ kháng kháng sinh cao Các vi khuẩn gram âm đa số là kháng kháng sinh: 42% các chủng vi khuẩn gram âm kháng với ceftazidime, 63% kháng với gentamicin và 74% kháng với acid nalidixic [4] Bên cạnh đó, châu Âu đang dự định đưa ra lệnh cấm sử dụng và nhập sản phẩm có sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi Bộ Nông nghiệp – Phát triển nông thôn Việt Nam cũng đã đưa ra dự kiến cho ngừng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi từ năm

2018 [5]

Với tình hình bệnh gây ra bởi vi sinh vật lan truyền qua con đường thực phẩm nghiêm trọng như hiện nay, việc tìm ra một giải pháp mới và hiệu quả để ngăn ngừa các bệnh gây ra bởi vi sinh vật thông qua con đườnng ăn uống là cần thiết Đồng thời, cùng với tình trạng kháng kháng sinh gia tăng, cần phải tìm ra một giải pháp mới ngăn ngừa các bệnh gây ra từ vi sinh vật trong chăn nuôi vừa hiệu quả, vừa tốn ít chi phí, đáp ứng điều kiện sản xuất hàng hóa trong và ngoài nước Vắc xin đường uống

là một giải pháp tiềm năng, với nhiều ưu điểm sẵn có, sẽ đáp ứng được rất lớn nhu cầu phòng bệnh cho người tiêu dùng thực phẩm và vật nuôi

1.1.2 Vắc xin đường uống

Hơn một thế kỉ trước, các căn bệnh như sởi, bạch hầu, đậu mùa đã hoành hành trên khắp thế giới, đứng vào nhóm các căn bệnh nguy hiểm hàng đầu và đã cướp đi sinh mạng của nhiều người Mãi cho đến khi có sự ra đời của phương thức phòng bệnh là vắc xin, các căn bệnh này mới dần được đẩy lùi Vắc xin đầu tiên được công nhận và cấp phép sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới vào thế kỉ XIX là vắc xin bại liệt giảm độc lực [6] Tính đến nay, vắc xin là phương thức thành công, hiệu quả và phổ biến trong việc ngăn ngừa lại các bệnh (Bảng 1.1)

Có thể phân loại vắc xin theo phương thức sử dụng: vắc xin sử dụng đường tiêm và vắc xin sử dụng qua bề mặt niêm mạc (niêm mạc ruột, niêm mạc phổi và niêm mạc đường tiết niệu) Vắc xin đường tiêm đã được nghiên cứu từ sớm và tính đến nay, người ta đã phát triển được một số lượng lớn các loại vắc xin tiêm được sử

dụng rộng rãi Không thể phủ nhận vai trò vô cùng quan trọng của vắc xin đường tiêm, bởi hàng loạt các căn bệnh nguy hiểm đến tính mạng đã được phòng ngừa ngay

từ đầu bằng vắc xin tiêm như: bại liệt, uốn ván, sởi, … Tuy nhiên, với những ưu điểm nổi bật riêng của mình, vắc xin đường uống đã được tập trung nghiên cứu gần đây và cho được những kết quả khả quan trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh

Bảng 1.1 Tác động của vắc xin đối với một số bệnh nhiễm khuẩn thường gặp [7]

nhiều nhất

Số ca mắc bệnh vào năm 2004

Phần trăm giảm

Hơn nữa, vắc xin đường uống không đòi hỏi độ tinh sạch cao của sản phẩm giống như vắc xin tiêm Việc loại bỏ hoàn toàn các sản phẩm phụ sinh ra bởi vi khuẩn trong vắc xin uống là không cần thiết, bởi vì môi trường ruột vốn đã là nơi khu trú của một số lượng lớn vi sinh vật [8] Trong khi đó, vắc xin tiêm không được phép chứa nội độc tố của vi sinh vật Đặc điểm này giúp giảm chi phí trong quá trình tinh sạch sản phẩm

Khu vực niêm mạc là nơi cơ thể tiếp xúc trực tiếp với môi trường bên ngoài

và hầu hết tất cả các vi sinh vật gây bệnh đều xâm nhập vào cơ thể thông qua con đường này Khả năng có thể kích thích được tốt đáp ứng miễn dịch ở khu vực màng nhầy, đặc biệt là khu vực ruột đối với vắc xin đường uống trở thành ưu điểm nổi bật

của loại vắc xin này [9] Vắc xin đường uống có thể kích thích đáp ứng miễn dịch màng nhầy thông qua việc kích thích tiết IgA giúp ngăn chặn sự bám của vi sinh vật lên biểu mô ruột, ngăn ngừa khả năng vi sinh vật xâm nhập sâu hơn vào các cơ quan bên trong Bên cạnh đó, vắc xin đường uống còn có thể kích thích đáp ứng miễn dịch của toàn bộ cơ thể tạo ra IgG để ngăn ngừa thành phần của vi sinh vật trong máu Ví

dụ, Rotarix và RotaTeq là hai loại vắc xin uống từ rotavirus giảm độc lực, có khả năng phòng bệnh đến 90%, kích hoạt tiết được kháng thể IgA ở màng nhầy, tiết IgG

ở hệ thống và kích thích được đáp ứng của tế bào lympho T độc [10] Chính khả năng gây đáp ứng miễn dịch ngay từ bước đầu xâm nhiễm của vi sinh vật mà vắc xin đường uống sẽ là một rào cản ngăn chặn vô cùng hiệu quả đối với tác động xấu của vi sinh vật lên cơ thể

1.1.2.1 Nhược điểm của vắc xin đường uống

Mặc dù sở hữu nhiều ưu điểm so với vắc xin đường tiêm, số lượng vắc xin đường uống vẫn còn bị giới hạn lại ở con số rất hạn chế (Bảng 1.2), do việc nghiên cứu phát triển vắc xin đường uống gặp phải khá nhiều khó khăn

Môi trường khắc nghiệt bên trong ruột chính là một cản trở lớn Ruột có pH giao động từ 6,5 – 7,5, bên trong có hệ thống enzyme protease và peptidase có chức năng phân hủy protein đi vào ruột, cùng với một hệ thống các enzyme protease tiết

ra từ tuyến tụy như trypsinogen, chymotrypsinogen, carboxypeptidase, … Các enzyme này phân hủy gần như toàn bộ tất cả các epitope kháng nguyên đưa vào cơ thể ở dạng hòa tan [11]

Bên cạnh đó, diện tích rộng lớn của bề mặt biểu mô ruột cũng gây ra khó khăn cho hoạt động của kháng nguyên Diện tích tổng cộng của bề mặt niêm mạc ruột khi trải ra được tăng lên gấp 600 lần so với diện tích của ống ruột lúc bình thường Đó là nhờ sự gấp nếp của các cấu trúc hình thành niêm mạc ruột: các nếp gấp ngang của niêm mạc ruột giúp tăng diện tích lên gấp ba lần; các cấu trúc nhung mao xếp liên tiếp nhau làm tăng diện tích bề mặt ruột lên khoảng 10 lần; trên mỗi nhung mao lại

có các tế bào biểu mô ruột được bao phủ khắp bề mặt bởi các lông siêu nhỏ, giúp diện tích bề mặt ruột tăng lên 20 lần [12] Cấu trúc gấp nếp của ruột này hoàn toàn phù hợp với chức năng hấp thụ chất dinh dưỡng của ruột, tuy nhiên diện tích quá lớn của

ruột lại gây ra sự phân tán kháng nguyên được đưa vào ruột, đây là một trong những trở ngại trong việc phát triển vắc xin đường uống

Bảng 1.2 Một số vắc xin đang được sử dụng hiện nay [6]

Anthrax Yellow Fever Tuberculosis Rota Teq; Rotarix Cervical Cancer Typhoid Meningococcal Orimune; OPV DTaP; Tdap; DT; Td Tetanus Cholera Vivotif; Ty21 A

Haemophilus

influenzae type b

(Hib)

Human Papillomavirus

(HPV)

Japanese encephalitis

NASOVAC Dukoral; Shancol

Thêm vào đó, vì ruột là nơi tiếp nhận rất nhiều tác nhân lạ từ môi trường bên ngoài, trong đó có các chất dinh dưỡng, nên cơ thể có xu hướng dung nạp miễn dịch cao hơn đáp ứng miễn dịch Dung nạp miễn dịch là trạng thái ức chế đáp ứng của hệ thống miễn dịch đối với kháng nguyên nhằm mục đích tránh các đáp ứng không mong muốn cho cơ thể Do đó, việc gây được đáp ứng miễn dịch ở ruột một cách chính xác

và hiệu quả gặp nhiều khó khăn [9]

1.1.2.2 Các phương pháp hỗ trợ phát triển vắc xin đường uống

Trước những nhược điểm của vắc xin đường uống, người ta đã nghiên cứu tìm

ra nhiều cách khắc phục để phát triển vắc xin đường uống tận dụng được đầy đủ những ưu điểm vượt trội của nó

Người ta lựa chọn các vật mang thích hợp như các hạt bao gói kháng nguyên

để đưa kháng nguyên đi vào cơ thể tránh được tác động của các enzyme trong ruột cũng như môi trường khắc nghiệt của ruột: sử dụng các vật liệu polymer, tế bào thực vật hoặc các sinh vật sống Các cấu trúc hạt được thiết kế bao gói kháng nguyên lại bên trong để tránh sự phân hủy bởi môi trường ruột như vi hạt polymer, lyposome hoặc cochleate, … Việc sử dụng các hạt bao gói kháng nguyên này đã được chứng minh là giúp bảo vệ kháng nguyên khỏi sự phân hủy của dịch ruột, đồng thời tăng khả năng vận chuyển được kháng nguyên tới hệ thống miễn dịch Gần đây, người ta cũng đã phát triển hệ thống thực vật biểu hiện protein kháng nguyên trong tế bào của chúng Protein kháng nguyên biểu hiện với số lượng lớn trong tế bào thực vật, vì thế

liều lượng yêu cầu có thể đạt được dễ dàng, đồng thời chi phí tiêu tốn lại thấp Tuy nhiên, vấn đề gặp phải khi sử dụng tế bào thực vật mang kháng nguyên là việc kiểm soát độ đồng đều và chất lượng của sản phẩm, mức độ rủi ro về sinh thái và sự chấp thuận của công chúng đối với cây trồng biến đổi gen Sử dụng vector là sinh vật sống mang kháng nguyên là một hướng có tiềm năng khá lớn trong việc khắc phục nhược

điểm của vắc xin đường uống Các chủng vi sinh vật được ưa thích là Salmonella và Lactoccocus Các chủng vi sinh vật được biến đổi để biểu hiện kháng nguyên mong

muốn, khi đưa vào cơ thể, chúng vượt qua được các điều kiện khắc nghiệt của môi trường ruột và đưa kháng nguyên đến trúng đích [8]

Ngoài ra, giải quyết xu hướng dung nạp miễn dịch ở ruột, tá dược hỗ trợ kháng nguyên đã được sử dụng để tăng khả năng gây đáp ứng miễn dịch Tá dược làm tăng cường phản ứng miễn dịch chủ yếu bằng cách làm tăng các phản ứng miễn dịch bẩm sinh thông qua điều hòa tăng cường các phân tử đồng kích thích, chemokine, cytokine Một số tá dược đã sử dụng cho vắc xin đường niêm mạc mũi như CD80, CD86, CD40, interferon‑α (IFNα), nhân tố kích hoạt tế bào B (BAFF), và các ligand của các Toll-like receptor [9]

Hiện nay, một giải pháp giải quyết trở ngại của vắc xin đường uống đang được rất nhiều người quan tâm, vừa giải quyết được vấn đề kháng nguyên dễ bị phân tán

do diện tích lớn của bề mặt ruột, vừa khắc phục được tình trạng ưu tiên xu hướng dung nạp miễn dịch hơn đáp ứng miễn dịch của ruột Đó là định hướng kháng nguyên đến đúng mục tiêu là tế bào Microfold (M), một loại tế bào tuy chiếm tỉ lệ rất nhỏ trong lớp tế bào biểu mô ruột, nhưng đóng vai trò quan trọng kích hoạt quá trình đáp ứng miễn dịch

1.2 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH THÔNG QUA TẾ BÀO M

1.2.1 Khái quát hệ thống miễn dịch ở ruột non

1.2.1.1 Vị trí hệ thống miễn dịch ở ruột non

Cấu trúc ruột non bao gồm bốn lớp: lớp màng thanh dịch, lớp cơ, lớp dưới niêm mạc và trên cùng là lớp niêm mạc (Hình 1.1) Màng thanh dịch là lớp màng trơn bao gồm một lớp mỏng mô liên kết và một lớp mỏng tế bào là nơi tiết ra dịch huyết thanh Lớp cơ là khu vực tiếp giáp với lớp dưới niêm mạc, thường cấu trúc bởi hai

lớp cơ vòng và cơ dọc, chịu trách nhiệm cho nhu động ruột Lớp dưới niêm mạc là lớp mô liên kết, chứa nhiều mạch máu Niêm mạc là lớp mô trên cùng của ruột non, bao gồm lớp tế bào biểu mô và lớp lamina propria bên dưới [11]

Hình 1.1 Cấu trúc các lớp trong ruột non [13]

Hệ thống ba thành phần bao gồm lớp biểu mô, lớp lamina propria và một lớp

cơ mỏng nằm dưới lamina propria tạo thành màng nhầy ruột Màng nhầy ruột chính

là vị trí tương tác giữa hệ thống miễn dịch ở phía dưới và môi trường bên trong lòng ruột, bao gồm cả thức ăn và các sản phẩm từ vi sinh vật Lớp lamina propria gồm các

mô liên kết lỏng lẻo làm giá nâng đỡ cho các lông nhung, đồng thời chứa các tế bào miễn dịch và các cấu trúc nang lympho [14] Lớp biểu mô trên cùng là nơi tiếp xúc trực tiếp với môi trường trong khoang ruột Lớp biểu mô ruột gấp nếp tạo thành cấu trúc lông nhung và hốc đặc trưng cho bề mặt của ruột Đây là vị trí tập trung các tế bào tiết chất nhầy, lysozyme, hormone, … [15]

Hình 1.2 Cấu trúc biểu mô ruột non [16]

Ngoài những vị trí gấp nếp tạo thành cấu trúc lông nhung và hốc, bề mặt ruột còn có các vị trí khác đó chính là các nang lympho ruột (Hình 1.2) Trong hệ thống

các phương thức bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhiễm của các tác nhân gây hại từ đơn giản đến phức tạp, thì cơ chế đáp ứng miễn dịch hiệu quả và quan trọng nhất được thực hiện ở nang lympho ruột

1.2.1.2 Nang lympho Peyer’s Patch ở khu vực ruột non

Tập hợp nang lympho ruột lần đầu tiên được mô tả bởi Marco Aurelio Severino vào năm 1645, sau đó cấu trúc này được nghiên cứu kĩ hơn và được công

bố với tên gọi là Peyer’s Patch (PPs) bởi Conrad Peyer vào năm 1677 [17] PPs là mô đặc trưng nhất cho mô lympho màng nhầy ở ruột, nằm ở vị trí phía trên màng treo ruột của ruột non [18] (Hình 1.3) PPs là một tập hợp các nang lympho, được phân chia thành ba vùng Vùng dưới cùng chứa một số lượng lớn các nang (follicle) chứa

tế bào lympho B và các tế bào lympho T Tập hợp này được bao quanh bởi một cấu trúc hình vòm gọi là SED (subepithelial dome) chứa hỗn hợp các tế bào B, tế bào T, đại thực bào và tế bào DC PPs kết nối với cơ thể nhờ mạch lympho và tĩnh mạch nhỏ nội mô Phía dưới là cấu trúc hạch lympho màng treo ruột (mesenteric lymph nodes - MLN) có vai trò là nơi cung cấp các tế bào lympho trinh nguyên đến lớp PPs Phía trên cùng PPs là lớp nang tế bào biểu mô (follicle-associated epithelium – FAE) hình thành mặt ngăn cách giữa cấu trúc mô lympho bên trong và môi trường trong lòng ruột [15] Thành phần lớp FAE bao gồm các tế bào biểu mô ruột và một tế bào đặc biệt gọi là tế bào Microfold – tế bào M Tế bào M có khả năng vận chuyển kháng nguyên và vi sinh vật qua lớp biểu mô ruột đến các tế bào miễn dịch, thông qua đó kích hoạt hoặc ức chế quá trình đáp ứng miễn dịch, dẫn đến một trong hai khả năng của cơ thể là đáp ứng miễn dịch hay dung nạp miễn dịch [17]

Hình 1.3 Cấu trúc Peyer’s Patch [10]

1.2.1.3 Quá trình gây đáp ứng miễn dịch ở Peyer’s Patch

Quá trình tiếp nhận kháng nguyên và gây kích thích đáp ứng miễn dịch diễn

ra trong lớp PPs bắt nguồn bởi tế bào M Đầu tiên, kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể được tiếp nhận bởi tế bào M và được vận chuyển nguyên vẹn đến cho tế bào DC (Hình 1.4) Sau đó, tế bào DC mang kháng nguyên đến cư trú trong vùng nang tế bào

T và kích hoạt việc biến đổi tế bào T trinh nguyên thành tế bào T đáp ứng Tế bào T CD4+ đáp ứng đặc hiệu kháng nguyên biểu hiện ligand CD40 tương tác với tế bào B biểu hiện thụ thể CD40 kích hoạt sự tiết kháng thể IgA, cùng với sự tiết của cytokine IL-4 và IL-10 Bào tương IgA+ di chuyển đến vị trí đáp ứng của màng nhầy và kháng thể IgA được tiết ra, sau đó chuyển đến khoang ruột ở dạng sIgA thông qua tương tác với thụ thể polymeric Ig [10]

Hình 1.4 Đáp ứng miễn dịch màng nhầy sản sinh kháng thể IgA [9]

1.2.2 Tế bào M

1.2.2.1 Đặc điểm của tế bào M

Tế bào M chiếm tỉ lệ 10% trong tổng số các tế bào biểu mô ruột Trái ngược với các tế bào biểu mô ruột có hệ thống các lông ruột nhỏ dày đặc trên bề mặt, tế bào

M có bề mặt với các lông ngắn bất thường, số lượng lại rất ít Tế bào M không có lớp glycoprotein-polysaccharide dày phía trên bề mặt giống như các tế bào hấp thụ của ruột, mà thay vào đó là lớp glycoprotein-polysaccharide mỏng Người ta cho rằng chính cấu trúc khác biệt này giúp tế bào M thuận lợi hơn trong việc tiếp xúc với kháng nguyên [19]

Hình 1.5 Tế bào M [20]

Phía trong tế bào M có một hốc lõm vào tạo thành cấu trúc túi chứa tế bào B,

tế bào T, đại thực bào và các tế bào DC Cấu trúc túi này là vùng tiếp cận của tế bào lympho và các tế bào trình diện kháng nguyên (Hình 1.5) Nhờ cấu trúc này mà khoảng cách từ đáy tới đỉnh tế bào M được thu hẹp lại, giúp rút ngắn quãng đường vận chuyển của kháng nguyên từ vị trí tiếp nhận đến tế bào lympho [19]

Trong quá trình vận chuyển kháng nguyên từ tế bào M đến tế bào trình diện kháng nguyên, người ta cho rằng kháng nguyên được vận chuyển nguyên vẹn đến khoang tế bào M mà không trải qua bất kì một sự biến đổi cấu trúc nào Sự giữ nguyên cấu trúc này là do lượng lysosome chứa trong tế bào M rất ít, ít hơn 16 lần so với các

tế bào ruột bình thường, đồng thời hoạt động của lysozyme cũng giảm Thực tế, có một vài bằng chứng cho thấy ở tế bào M vẫn có hoạt động của enzyme Người ta đã tìm thấy các prelysosome giàu acid phosphatase, MHC nhóm II và proteinase Cathepsin E ở tế bào M của chuột, đặt ra nghi ngờ rằng ở tế bào M có hoạt động biến đổi kháng nguyên khi nó được tiếp nhận Tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng nào rõ ràng về sự biến đổi của kháng nguyên tại tế bào M [19]

1.2.2.2 Phương thức tiếp nhận và vận chuyển kháng nguyên của tế bào M

Tế bào M có nhiều cách tiếp nhận và vận chuyển các vật chất khác nhau vào trong tế bào Cơ chế của các phương thức vận chuyển này phụ thuộc vào kích thước

và bản chất của vật chất mà nó vận chuyển Đối với vi khuẩn và các hạt có kích thước lớn, tế bào M thường sử dụng phương thức thực bào bằng cách biến đổi màng tế bào

và sắp xếp lại khung actin, tạo thành các bóng thực bào bao gói vật chất và vận chuyển

vào trong tế bào Đối với virus và các hạt bám dính khác, tế bào M sử dụng protein clathrin tạo thành các bóng vận chuyển đưa vào tế bào, còn các hạt không bám dính thì được vận chuyển bằng ẩm bào [21]

Ngoài các phương thức vận chuyển trên, tế bào M còn có phương thức vận chuyển kháng nguyên mang tính đặc hiệu hơn, đó là dựa vào tương tác giữa ligand

và thụ thể Thời gian trước đây, những hiểu biết về tế bào M và hệ thống các phân tử trên bề mặt tế bào M vẫn còn hạn chế Cho đến khi người ta tạo ra được mô hình

in vitro của tế bào giống với tế bào M của người, một loạt các nghiên cứu về các thụ

thể trên bề mặt tế bào M được thực hiện, kết quả là một số lượng khá lớn các thụ thể trên tế bào M cùng với ligand bám đặc hiệu với nó đã được công bố [22]

Bảng 1.3 Ligand và thụ thể đặc hiệu trên tế bào M [10]

oligosaccharide

Lipid A domain của LPS (vi khuẩn Gram âm) AnxA5

Phương thức tiếp nhận và vận chuyển kháng nguyên bằng liên kết giữa ligand

và thụ thể là phương thức vận chuyển đặc hiệu nhất Đặc điểm cấu trúc bề mặt tế bào

M khá bằng phẳng là một lợi thế lớn, bởi vì các thụ thể không bị che lấp bởi các cấu trúc lông nhỏ li ti, nên cơ hội gặp gỡ và tạo liên kết giữa ligand và thụ thể được tăng lên nhiều lần Hơn nữa, phương thức vận chuyển này cho phép vận chuyển kháng

nguyên một cách đặc hiệu Hệ thống các ligand và thụ thể của nó trên bề mặt tế bào

M được thể hiện trong Bảng 1.3

Những hiểu biết về hệ thống ligand và thụ thể đặc hiệu tương ứng trên bề mặt

tế bào M mở ra một hướng vô cùng tiềm năng cho việc phát triển vắc xin đường uống

Có thể lợi dụng đặc tính bám dính đặc hiệu này của ligand mà sử dụng nó để định hướng kháng nguyên di chuyển đến trúng đích là thụ thể trên bề mặt tế bào M Việc quan trọng là cần phải lựa chọn chính xác được loại ligand thích hợp nhất

Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng một vài thụ thể của tế bào M nêu trên không chỉ biểu hiện trên bề mặt tế bào M mà còn xuất hiện ở các tế bào khác PAFR

và TLR-2 được chứng minh là biểu hiện với số lượng rất nhiều trên bề mặt tế bào biểu mô ruột, cũng như trên bề mặt tế bào M [22] Thụ thể UEA-1 ngoài biểu hiện trên bề mặt tế bào M, còn biểu hiện trên tế bào Goblet [23] Những nghiên cứu khác chỉ ra rằng một số ligand có thể gây độc cho tế bào Lipopolysaccharide (LPS) trong thành ngoài của vi khuẩn Gram âm cùng với lipid A của nó gây được đáp ứng miễn dịch trong tế bào động vật, tuy nhiên khi dùng với liều lượng cao thì tế bào có phản ứng bị sốc độc [24] Tương tự đối với Lipoteichoid acid khi vào cơ thể cũng gây sốc nhiễm trùng [25]

Do đó, với hệ thống ligand và thụ thể tương ứng trên tế bào M, lựa chọn được một loại ligand mang nhiều ưu điểm sẽ hỗ trợ rất lớn trong việc giải quyết các trở ngại của phát triển vắc xin đường uống Protein FimH nằm trên tiểu phần lông roi

loại 1 của vi khuẩn E coli có khả năng bám vào thụ thể đặc hiệu trên tế bào M là ứng

cử viên tiềm năng

1.3 PROTEIN FIMH

Sự xâm nhập của nhiều vi khuẩn vào cơ thể vật chủ có liên quan đến sự hiện diện của các cấu trúc có khả năng bám dính như lông hoặc tua trên bề mặt tế bào vi

khuẩn [26] Vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa E coli là một trong số các vi khuẩn

có biểu hiện cấu trúc bám dính này Một vài cơ quan thực hiện chức năng bám dính

ở E coli như lông roi P, lông roi loại 1, lông roi S và lông roi F1C Trong số đó, lông roi loại 1 được biểu hiện với tỉ lệ lớn hơn 80% trên tổng số các vi khuẩn E coli gây

bệnh Người ta suy đoán rằng, lông roi loại 1 chính là yếu tố quyết định khả năng

bám dính của E coli [27]

Cấu trúc của lông roi loại 1 bao gồm nhiều tiểu phần: FimA, FimF, FimG, FimH (Hình 1.6) Protein FimH là tiểu phần nằm ở vị trí đầu lông roi Đã có rất nhiều thí nghiệm được tiến hành nhằm chứng minh vai trò của protein này đối với khả năng bám dính của lông roi loại 1 Từ những thí nghiệm đột biến gen, kháng thể ức chế FimH, và đột biến mất hoàn toàn FimH đều cho thấy khả năng bám đường mannose

và sự tồn tại trong cơ thể vật chủ của vi khuẩn đều giảm hẳn Gần đây, những kết quả tinh thể hóa của protein FimH chung với đường α-mannose đã khẳng định vai trò của protein này trong việc bám dính với thành phần mannose trên bề mặt tế bào trong cơ thể [27]

Hình 1.6 Cấu trúc gồm nhiều tiểu phần của lông roi loại 1 [28]

1.3.1 Cấu trúc protein FimH

Protein FimH tiền thân sau khi dịch mã có kích thước 300 amino acid, protein khi trưởng thành có kích thước 279 amino acid Cấu trúc protein FimH gồm hai tiểu phần chức năng: tiểu phần nằm ở đầu N có chức năng bám dính, gọi là lectin domain hay receptor binding domain (FimHrb) ở vị trí từ amino acid 1 – 156; tiểu phần nằm

ở đầu C gọi là pilin domain (FimHp) ở vị trí từ amino acid 160 – 279, có chức năng giúp liên kết FimH với các thành phần còn lại của lông roi [29] Hai tiểu phần của protein FimH liên kết với nhau nhờ một cấu trúc khá linh hoạt hình thành bởi hai amino acid Glycine ở vị trí 159 và 160 [30] (Hình 1.7A)

Hình 1.7 Cấu trúc protein FimH (A)

và cấu trúc tiểu phần bám dính của protein FimH (B) [30]

Tiểu phần FimHrb được mô tả với cấu trúc gồm 11 phiến , hốc liên kết với mannose là cấu trúc vòng nằm giữa phiến  thứ 10 và 11, được gấp cuộn độc lập, chỉ gồm một chuỗi amino acid mà không kết hợp với protein nào khác Cấu trúc tiểu phần FimHrb được mô tả với hình dạng cuộn Ig, có phần lõi được tạo thành từ những cấu trúc vòng lớn là các chuỗi B, C, E, F, G tạo thành một cấu trúc hoàn chỉnh (Hình 1.7B) Trong khi đó, tiểu phần FimHpcó cấu trúc cuộn Ig không hoàn chỉnh do thiếu

đi chuỗi G thứ 7 [30] Việc này gây ra tính kém bền nhiệt của tiểu phần FimHp, do

đó protein không gấp cuộn được [31] Để giải quyết vấn đề này, trong quá trình hình thành tiểu phần FimHp cần có hoạt động của chaperone FimC giúp hỗ trợ việc gấp cuộn [32] Vai trò của chaperone là ngăn chặn việc gấp cuộn sai hỏng của các protein trong tế bào bằng cách thực hiện các phản ứng năng lượng hỗ trợ quá trình gấp cuộn Đối với tiểu phần pilin FimHp, chaperone FimC hỗ trợ làm hoàn chỉnh cuộn Ig bằng cách chèn chuỗi G1 vào song song với chuỗi F của tiểu phần Sau đó tiểu phần FimHp vẫn còn liên kết với chaperone để việc gấp cuộn tiếp tục diễn ra, ổn định cấu trúc tiểu phần [33]

Do đó, có thể nhận thấy sự thiếu ổn định của protein FimH khi thiếu sự hỗ trợ của Chaperone FimC Trở ngại này có thể giải quyết bằng cách hướng tới biểu hiện độc lập chỉ một tiểu phần bám dính FimHrb vẫn giữ được hoạt tính vốn có của protein FimH

1.3.2 Protein FimH gắn định hướng tế bào M thông qua thụ thể Glycoprotein 2

Glycoprotein 2 (GP2) là protein tiết ra ở tuyến tụy và được chứa trong dịch tụy, có chức năng tham gia vào quá trình miễn dịch bằng cách bám dính vào các vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm và tạo điều kiện bài tiết chúng ra ngoài qua phân Quá trình này diễn ra tương tự như protein Tamm-Horsfall (THP), một protein được biểu hiện ở vùng sinh trưởng của tế bào biểu mô ống thận THP có khả năng gắn đặc

hiệu với vi khuẩn E coli gây bệnh đường ruột và thúc đẩy thải loại chúng qua nước

tiểu [34] Điều đáng chú ý là GP2 có 52% trình tự amino acid giống với protein THP

và có cấu trúc các domain tương tự như protein THP Từ những dữ liệu này có thể

suy đoán rằng GP2 có khả năng bám đặc hiệu với vi khuẩn E coli [35]

Các nghiên cứu của Koji Hase đã chứng minh được sự biểu hiện của GP2 trên

bề mặt tế bào M Nhóm nghiên cứu cũng đã tiến hành một loạt các thử nghiệm để xác

định xem liệu GP2 bắt giữ được vi khuẩn E coli có phải nhờ vào liên kết với tiểu

phần FimH trên lông roi loại 1 hay không Những kết quả thí nghiệm gián tiếp thông qua việc đột biến cả FimH hay GP2 đều ảnh hưởng đến khả năng vận chuyển FimH xuống cấu trúc miễn dịch phía dưới tế bào M Bên cạnh đó, những kết quả trực tiếp quan sát thấy FimH tương tác với GP2 nằm trên bề mặt tế bào M, và sau đó bị bắt giữ bởi tế bào tua đã chứng minh GP2 biểu hiện đặc hiệu trên bề mặt tế bào M là thụ thể bắt giữ chủng vi khuẩn FimH+ Có thể kết luận rằng, GP2 biểu hiện đặc hiệu trên

bề mặt tế bào M là thụ thể bắt dính chủng vi khuẩn E coli gây bệnh thông qua liên

kết với protein FimH trên lông roi loại 1

Tiểu phần bám dính FimHrb của lông roi loại 1 có cấu trúc hốc liên kết với mannose Người ta dự đoán rằng tương tác giữa protein FimH và GP2 là dựa trên liên kết với nhóm mannose này Thử nghiệm sử dụng peptide N-glycosidase để loại bỏ chuỗi glycan của GP2 hoặc bổ sung chất cạnh tranh α-mannose đối với FimH cho thấy khả năng liên kết với FimH giảm rõ rệt đến trên 86% so với GP2 bình thường [35]

Protein FimH là một ligand tiềm năng khi có khả năng bám dính với thụ thể đặc hiệu trên tế bào M trong khu vực ruột Tuy nhiên, với bản chất bất ổn định của protein FimH thì khó có thể sử dụng protein làm ligand định hướng tế bào M trong việc phát triển vắc xin đường uống Tuy nhiên có nghiên cứu đã cho thấy rằng khi

biểu hiện domain bám dính của protein FimH thì tiểu phần FimHrb có thể biểu hiện

ổn định, ở trạng thái tan, đồng thời vẫn giữ nguyên được khả năng bám với

-D-mannose Kết quả này mở ra một hướng phát triển tiềm năng cho vắc xin đường uống, sử dụng tiểu phần FimHrb làm ligand định hướng đến thụ thể GP2 trên bề mặt

tế bào M [27]

1.4 PROTEIN PHÁT HUỲNH QUANG LỤC GFP

1.4.1 Khái quát về protein GFP

Từ lâu, người ta đã biết đến các loại sứa có khả năng phát ra ánh sáng trên cơ thể Đến khoảng thập niên 1960-1970, Shimumora đã phân lập được protein GFP từ

sứa Aequorea victoria và xác định protein GFP chính là nguồn gốc của khả năng phát

ra ánh sáng lục [36] Đến năm 1994, trình tự gen mã hóa cho protein GFP đã được công bố bởi Chalfie Gen mã hóa protein phát huỳnh quang lục GFP được đánh giá cao vì khả năng cấu trúc nên thể màu phát ra ánh sáng độc lập mà không cần sự trợ giúp của bất kỳ enzyme chuyên biệt nào trong cơ thể vật chủ [37] Về sau, với những nghiên cứu rõ hơn về protein GFP cùng với những thử nghiệm thành công khi đưa GFP vào các sinh vật khác như vi khuẩn, nấm men và kể cả động vật có vú, nhiều hướng ứng dụng của protein GFP đã được mở ra, trong đó hướng nghiên cứu sử dụng GFP như là nhân tố đánh dấu dòng tế bào được ứng dụng khá nhiều

1.4.2 Ứng dụng của GFP

Protein GFP không gây độc và được biểu hiện ở mức độ cao trong các sinh vật khác nhau Gen GFP được dung hợp cùng với gen của một protein nào đó đang được quan tâm và thông thường không gây ảnh hưởng đến sự biểu hiện của protein mục tiêu cũng như khả năng phát sáng của protein GFP Do đó, có thể kiểm soát vị trí, sự di chuyển và hoạt động của protein mục tiêu thông qua quan sát các dấu hiệu của protein GFP [38] Dựa trên các lợi thế này, protein GFP được quan tâm sử dụng nhiều trong các hoạt động nghiên cứu

- GFP được sử dụng để chỉ thị sự biểu hiện của gen mục tiêu thông qua quan sát

sự biểu hiện của GFP Đồng thời GFP còn có thể sử dụng để phân biệt sự biểu hiện protein trong các tế bào sống với tế bào không sống,

- GFP được sử dụng cho mục đích sàng lọc tế bào nhờ khả năng được nhận biết

dễ dàng và nhanh chóng Thông qua sự biểu hiện của GFP, có thể xác định được các dòng tế bào mang gen mục tiêu được biểu hiện đồng thời với GFP,

- GFP đã được sử dụng thành công để xây dựng các cảm biến để đo các thông

số trong tế bào như pH, nồng độ Ca2+ hoặc nồng độ các chất chuyển hóa khác nhau,

- GFP còn được sử dụng rộng rãi trong chụp ảnh các mô và tế bào nhờ khả năng phát sáng [38]

Trong khuôn khổ này, chúng tôi sử dụng GFP để chỉ thị sự biểu hiện của gen mục tiêu, đồng thời hỗ trợ cho việc theo dõi khả năng tiếp cận của protein FimHrb đối với tế bào M trong tương lai

1.5 BIỂU HIỆN PROTEIN TRONG VI KHUẨN Escherichia coli

Trong những năm gần đây, nhờ sự phát triển của công nghệ gen, một số lượng lớn protein tái tổ hợp đã được sản xuất và mang lại nhiều ứng dụng to lớn trong đời sống Trong số đó không thể không nhắc đến protein tái tổ hợp Insulin được sản xuất vào năm 1982 Trong những chủng vi sinh vật dùng để sản xuất protein tái tổ hợp,

E coli được đánh giá cao bởi những ưu điểm vượt trội như: môi trường nuôi cấy đơn

giản, tăng trưởng nhanh, bộ gen đã được hiểu biết rõ và các thao tác cũng được thực hiện dễ dàng trên bộ gen Cùng với đó, người ta cũng đã phát triển được một hệ thống phong phú các plasmid, các chủng tái tổ hợp và các chủng đột biến cho lượng protein tái tổ hợp biểu hiện chiếm đến 50% tổng số protein của tế bào [39]

Tuy nhiên, việc biểu hiện protein tái tổ hợp ở E coli cũng gặp phải một số vấn

đề khó khăn Do sự biểu hiện protein quá nhanh dẫn tới việc protein không gấp cuộn hoặc gấp cuộn sai, đặc biệt là đối với các protein đòi hỏi thời gian gấp cuộn dài hơn hoặc các protein cần có chaperone hỗ trợ đi kèm [39] Bên cạnh đó, môi trường có tính khử cao trong tế bào chất vi khuẩn cùng với việc không có các bước biến đổi protein sau dịch mã, dẫn đến protein bị biểu hiện ở dạng vùi, do đó mất hoạt tính Chính vì thế, người ta đã tạo ra một hệ thống các chủng biểu hiện protein tái tổ hợp được biến đổi, như các chủng đột biến loại bỏ protease, chủng bổ sung các codon hiếm, chủng hỗ trợ biểu hiện protein Chaperone, chủng hỗ trợ hình thành cầu nối disulfide [40]

Một chủng E coli đột biến loại bỏ protease được sử dụng để biểu hiện protein

mục tiêu trong khuôn khổ khóa luận là chủng BL21(DE3) Hoạt động của protease

trong tế bào có thể làm giảm sản lượng protein tái tổ hợp tạo ra Do đó, chủng E coli

BL21 được thiết kế làm đột biến mất gen mã hóa hai protease chính là Lon và OmpT Protease Lon có chức năng phân hủy các protein không còn chức năng hoặc protein không đúng cấu trúc trong nội bào Protease OmpT bám màng có chức năng phân hủy protein ngoại bào, vì vậy nó sẽ phân hủy protein mục tiêu sau khi thực hiện ly giải tế bào [40] Do đó chủng BL21(DE3) được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp nhằm hạn chế việc phân hủy protein mục tiêu

Bên cạnh đó, promoter sử dụng trong sản xuất protein tái tổ hợp ở E coli cũng

được nghiên cứu khá nhiều và đã tìm ra một hệ thống các promoter điều hòa tốt hoạt động của gen T7 promoter nằm trong hệ thống vector pET, là vector rất phổ biến trong biểu hiện protein tái tổ hợp Trong hệ thống này, promoter T7 hoạt động được khi có mặt của T7 RNA Polymerase Gen mã hóa T7 RNA Polymerase nằm trên plasmid đưa vào tế bào vi khuẩn, hoặc được chèn trực tiếp vào bộ gen vi khuẩn bằng thực khuẩn thể λDE3, chịu sự kiểm soát của lacUV5 promoter Trong điều kiện bình thường, yếu tố kiểm soát promoter lacUV5 là protein LacI luôn được biểu hiện Do

đó, ở điều kiện bình thường protein tái tổ hợp không được sản xuất Tuy nhiên, khi

có yếu tố kìm hãm là lactose hoặc isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) thì các yếu tố này ngăn cản hoạt động của protein LacI, do đó promoter lacUV5 hoạt động cho phép tạo ra T7 RNA Polymerase, kích hoạt quá trình sản xuất protein tái tổ hợp mục tiêu [41]

1.6 TINH SẠCH PROTEIN

Protein tái tổ hợp mục tiêu thường được biểu hiện cùng với các protein khác, tạo thành một hỗn hợp chứa nhiều loại protein khác nhau Tinh sạch protein là việc thu thập protein tinh sạch từ hỗn hợp các protein khác nhau đó Có thể thu nhận protein tinh sạch bằng phương pháp tủa hoặc sắc ký Dựa trên các đặc điểm như tính tan, kích thước, độ tích điện và khả năng liên kết với phân tử đặc biệt mà lựa chọn phương pháp tinh sạch thích hợp, thu được protein tái tổ hợp tinh sạch, giữ được cấu trúc nguyên vẹn và hoạt tính sinh học Phương pháp sắc ký là phương pháp được sử dụng khá phổ biến

1.6.1 Các phương pháp sắc ký

Sắc ký được xem là một công nghệ dùng để phân tách các phân tử trong hỗn hợp, nó dựa trên nguyên tắc là dùng dung môi hòa tan phân tử và khi dung môi cùng các phân tử di chuyển qua một loại vật chất cố định, chúng được giữ lại trong vật chất

đó và nhờ đó phân tách thành từng pha khác nhau Cụ thể đối với sắc ký cột, vật chất dùng để cố định được gọi là “pha tĩnh” sẽ được nạp vào một cột, dung môi gọi là

“pha động” được bơm qua “pha tĩnh” Khi hỗn hợp phân tử được nạp vào “pha tĩnh”,

sự vận chuyển của chúng bị trì hoãn, cho nên tùy đặc tính từng loại phân tử mà tốc

độ vận chuyển của chúng sẽ khác nhau, do đó chúng sẽ tách ra khỏi nhau [42]

Tùy vào mức độ hấp thụ và khả năng tương tác giữa protein với pha cố định,

mà sắc ký cột được chia thành nhiều loại khác nhau: sắc ký trao đổi ion, sắc ký kị nước, sắc ký lọc gel, sắc ký đảo pha, sắc ký ái lực Trong khuôn khổ khóa luận, phương pháp sắc ký ái lực IMAC được sử dụng để tinh sạch protein tái tổ hợp

1.6.2 Sắc ký ái lực (Affinitive Chromatography – AC)

Phương pháp sắc ký ái lực được sử dụng để tách protein dựa trên sự tương tác giữa protein và một ligand đặc hiệu nằm trong chất nền sắc ký Kỹ thuật này được sử dụng đối với các protein có ligand liên kết phù hợp với nó Phương pháp sắc ký ái lực có tính chọn lọc cao, độ phân tách cao và thường mang được một lượng lớn protein mục tiêu trong chất nền sắc ký của nó Mẫu protein được nạp vào cột với một điều kiện thuận lợi nhất cho sự bám đặc hiệu của protein lên ligand của nó Các vật chất không mong muốn bị rửa trôi ra ngoài, sau đó protein mục tiêu được tách ra khỏi chất nền sắc ký nhờ điều kiện chuyên biệt là sử dụng chất cạnh tranh, hoặc điều kiện không chuyên biệt là thay đổi pH, lực ion của dịch ly giải [42]

Một số lượng lớn các vật chất cố định sử dụng trong phương pháp sắc ký ái lực IMAC dùng để phân tách protein tái tổ hợp đã được tìm ra Vật chất cố định này

có nguyên tắc dựa trên tương tác giữa các ion kim loại chuyển tiếp (Co2+, Ni2+, Cu2+,

Zn2+) được cố định trên chất nền và chuỗi amino acid [43] Một trong những amino acid được sử dụng khá phổ biến trong phương pháp sắc ký này là histidine Một chuỗi gồm sáu amino acid histidine tạo thành đuôi polyhistidine thường được thiết kế nằm

ở vị trí đầu N hoặc đầu C của protein tái tổ hợp, tùy thuộc vào từng protein cụ thể Sau quá trình tinh chế, không nhất thiết phải loại bỏ đuôi polyhistidine này khỏi

protein mục tiêu, nhưng nếu cần có thể loại bỏ nó bằng cách chèn vị trí nhận biết của protease cắt đứt vào giữa đuôi polyhistidine và protein tái tổ hợp

Histidine là amino acid có tương tác lực mạnh nhất với ion Ni2+ Đuôi polyhistidine liên kết với Ni2+ phụ thuộc vào pH Tại pH cao, polyhistidine gắn với

Ni2+ nhờ vào lực liên kết ion, khi thay đổi pH về mức thấp thì polyhistidine trở về trạng thái tích điện dương và rời khỏi Ni2+ Mẫu protein khi nạp vào cột sắc ký ái lực

sử dụng Ni2+ là vật chất cố định, các protein có chứa cấu trúc chuỗi polyhistidine sẽ được giữ lại, sau đó được thoát ra khỏi cột nhờ dung dịch ly giải được điều chỉnh pH hoặc bổ sung imidazole là cơ chất cạnh tranh với histidine Protein mục tiêu được tinh sạch [44]

Như vậy, với mục tiêu tạo protein dung hợp FimHrb-GFP để tiến tới đánh giá khả năng bám dính tế bào M của tiểu phần protein FimH thông qua hoạt tính phát

huỳnh quang của protein GFP, chúng tôi tiến hành đề tài “Tạo dòng, biểu hiện và

tinh sạch tiểu phần bám dính (receptor binding domain) của protein FimH dung hợp với GFP” Kết quả này sẽ cung cấp cơ sở cho việc phát triển vắc xin đường uống

sau này

2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Thiết bị - Dụng cụ

Một số thiết bị dụng cụ dùng trong khóa luận

Máy PCR Mastercycle (Eppendorf, AG Đức)

Bộ điện di DNA Gel Xl ultra V2 (Labnet, Mỹ) và hộp đèn soi UV (Hoefer, Mỹ)

Bộ điện di protein và bộ nguồn (Biorad, Mỹ)

Bộ điện chuyển thẩm (Biorad, Mỹ)

Cột tinh sạch tự nhồi

Cân kỹ thuật (Ohaus, Mỹ)

Máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich, Đức)

Máy ly tâm Mikro 22 (Hettich, Đức)

Máy lắc ổn nhiệt Orbital Incubator S150 (Stuard Scientific, Anh)

Máy sonicate (Microson Misonix incorporation, Mỹ)

Máy Vortex (IKA, Mỹ)

Nồi hấp khử trùng Autoclave (TOMY, Nhật)

Máy do Nanodrop (Thermo, Mỹ)

Máy lắc nước Grant GLS400 (Grant, Mỹ)

Máy lọc chân không WJ15 (Sibata, Nhật)