Nghiên cứu sự hiện diện và tính đa dạng di truyền của họ Picornaviridae có khả năng lây truyền từ động vật sang người trong các mẫu bệnh phẩm tiêu chảy và viêm màng não thu nhận tại Việt Nam

Picornaviridae là họ virus cực kỳ lớn, bao gồm nhiều tác nhân gây ra các bệnh lâm sàng nghiêm trọng ở người và động vật như: bệnh bại liệt, viêm gan A, bệnh tay chân miệng, viêm màng não vô khuẩn… Các virus thuộc họ Picornaviridae cũng gây một số bệnh mãn tính ở vật nuôi và đặc biệt là dịch bệnh lở mồm long móng do Aphthovirus gây ra ở động vật móng guốc chẻ 2. Bên cạnh đó, Picornaviridae còn cho thấy có sự đa dạng lớn về mặt di truyền do khả năng đột biến và tái tổ hợp xảy ra thường xuyên, điều này làm tăng nguy cơ xuất hiện các chủng mới với những thay đổi trong đặc tính hướng tế bào chủ (host cell tropism) cũng như khả năng lây nhiễm và sao chép trong các loài vật chủ khác nhau 22. Trong một số nghiên cứu gần đây cho thấy, một số enterovirus (họ Picornaviridae) nhiễm ở người cũng được phát hiện ở động vật 323757. Điều này cho thấy động vật có thể là nguồn lây truyền picornavirus sang người.

1

MỞ ĐẦU

Picornaviridae là họ virus cực kỳ lớn, bao gồm nhiều tác nhân gây ra các bệnh lâm sàng nghiêm trọng ở người và động vật như: bệnh bại liệt, viêm gan A, bệnh tay chân miệng, viêm màng não vô khuẩn… Các virus thuộc họ

Picornaviridae cũng gây một số bệnh mãn tính ở vật nuôi và đặc biệt là dịch bệnh

lở mồm long móng do Aphthovirus gây ra ở động vật móng guốc chẻ [2] Bên cạnh

đó, Picornaviridae còn cho thấy có sự đa dạng lớn về mặt di truyền do khả năng đột

biến và tái tổ hợp xảy ra thường xuyên, điều này làm tăng nguy cơ xuất hiện các chủng mới với những thay đổi trong đặc tính hướng tế bào chủ (host cell tropism) cũng như khả năng lây nhiễm và sao chép trong các loài vật chủ khác nhau [22]

Trong một số nghiên cứu gần đây cho thấy, một số enterovirus (họ Picornaviridae)

nhiễm ở người cũng được phát hiện ở động vật [32][37][57] Điều này cho thấy động vật có thể là nguồn lây truyền picornavirus sang người

Bệnh tiêu chảy và viêm màng não ở người là hai trong số 200 bệnh lây truyền

từ động vật sang người đã được tổ chức y tế thế giới mô tả [111] Tác nhân gây tiêu chảy và viêm màng não khá đa dạng Theo các báo cáo gần đây trên thế giới, khoảng 34% các ca viêm dạ dày-ruột cấp và hơn 50% các ca viêm màng não ở người không xác định được nguyên nhân [46][60][91][96] Tuy nhiên, gần đây các

kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến đã giúp phát hiện nhiều virus mới thuộc họ

Picornaviridae trong các mẫu bệnh phẩm liên quan đến bệnh viêm dạ dày-ruột và

bệnh viêm màng não vô khuẩn ở người [23][26][33][41][93]

Việt Nam là một trong những nước được coi là "điểm nóng" về các bệnh truyền nhiễm mới nổi có nguồn gốc từ động vật, trong đó có những bệnh có thể gây đại dịch [111] Do đó, nghiên cứu về bệnh lây truyền giữa người và động vật (dự án VIZIONS) đang được quan tâm và thực hiện tại Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng Trường Đại học Oxford (OUCRU), Tp Hồ Chí Minh Những kết quả ban đầu của VIZIONS cho thấy một số picornavirus được phát hiện trong phân động vật với tỉ lệ

khá cao: Enterovirus G dương tính trên 81,6% lợn nuôi và 8,9% trên lợn hoang dã,

2

trong đó phát hiện 4 genotype mới EV-G8 đến EV-G11; Aichivirus C dương tính trên 42,2% lợn hoang dã và 29,3% trên lợn nuôi; Aichivirus A dương tính trên 17,7% chuột; Cardiovirus dương tính trên 0,1% heo và 7,3% trên chuột Tuy vậy ở

Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu nhằm phát hiện những picornavirus này trong mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân tiêu chảy và viêm màng não

Xuất phát từ kết quả thực tiễn trên, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài

“Nghiên cứu sự hiện diện và tính đa dạng di truyền của họ Picornaviridae có

khả năng lây truyền từ động vật sang người trong các mẫu bệnh phẩm tiêu chảy và viêm màng não thu nhận tại Việt Nam”

 Mục tiêu: Sàng lọc nhóm picornavirus trên đối tượng bệnh nhân tiêu chảy

và bệnhnhân viêm màng não không rõ nguyên nhân nhằm tìm hiểu hơn nữa các tác nhân virrus gây tiêu chảy và gây viêm màng não, ngoài những tác nhân thông thường phổ biến ở Việt Nam và thế giới Đồng thời qua đó đánh giá mối liên hệ của các tác nhân này giữa người và động vật, nhằm hiểu rõ hơn về sự lan truyền và sự

đa dạng của các virus có khả năng lây truyền từ động vật sang người, cụ thể là các

virus thuộc họ Picornaviridae ở Việt Nam

 Ý nghĩa: Cung cấp những kiến thức cơ bản về nhóm picornavirus phát hiện ở Việt Nam để mở đầu cho những nghiên cứu tiếp theo Bên cạnh đó chúng tôi hi vọng nghiên cứu này sẽ hỗ trợ cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh viêm dạ dày-ruột

và viêm màng não do picornavirus ở Việt Nam hiện nay

 Nội dung:

- Sàng lọc 4 giống thuộc họ Picornaviridae: Enterovirus, Kobuvirus, Cardiovirus, Cosavirus trên phân từ bệnh nhân tiêu chảy và dịch não tuỷ từ

bệnh nhân viêm màng não

- Với mẫu bệnh phẩm tiêu chảy, phân tích các đặc điểm về dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng, các yếu tố nguy cơ liên quan giữa bệnh tiêu chảy và khả năng nhiễm các virus thuộc họ Picornavirus

Chương 1: Tổng quan

4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh truyền từ động vật sang người

Theo số liệu cập nhật từ các nghiên cứu giám sát các tác nhân gây bệnh mới nổi ở người, cũng như thông tin từ tổ chức y tế thế giới năm 2014, khoảng 60% các bệnh ở người được tin là có nguồn gốc từ động vật, và 75% các bệnh truyền nhiễm mới nổi có thể có nguồn gốc từ động vật [103][111] Theo định nghĩa của Tổ chức

Y tế thế giới (WHO), bệnh truyền từ động vật sang người là những bệnh truyền nhiễm có nguồn gốc từ động vật có xương sống nhưng có thể lây nhiễm cho người

và đôi khi dẫn đến lây truyền từ người sang người [111] Theo số liệu mới nhất của WHO, cho đến nay đã có hơn 200 bệnh lây truyền từ động vật sang người được mô

tả, và những bệnh này có thể được phân loại theo tác nhân gây bệnh như: vi khuẩn, virus, ký sinh trùng, nấm hay các tác nhân truyền nhiễm khác Bệnh lây truyền từ động vật sang người với những đặc điểm lâm sàng và dịch tễ học khác nhau là mối

đe dọa đối với y tế công cộng, sức khỏe cộng đồng Mặc dù phần lớn bệnh từ động vật có thể phòng tránh được, vẫn có nhiều bệnh chưa được hệ thống y tế quốc gia và quốc tế ưu tiên giải quyết, và được gọi là những bệnh “bị lãng quên”[111]

Sự xuất hiện của các bệnh lây truyền từ động vật sang người rất phức tạp và

do nhiều yếu tố tạo nên như sự tiến hóa của hệ sinh thái, sự thích nghi của vi khuẩn, nhân khẩu học và hành vi, du lịch và thương mại quốc tế, thực hành nông nghiệp, công nghệ và công nghiệp Nguy cơ các bệnh lây truyền từ động vật sang người xảy

ra khi có sự tiếp xúc giữa con người với động vật, qua sự phơi nhiễm trực tiếp hoặc gián tiếp với động vật, sản phầm từ động vật hoặc môi trường sống của chúng Cả vật nuôi và động vật hoang dã đều có thể là ổ chứa tác nhân gây bệnh của những bệnh này Những bệnh chúng gây ra ở người bao gồm từ bệnh ở thể nhẹ và tự hồi

phục (như phần lớn các ca bệnh viêm dạ dày-ruột do Campylobacter) đến bệnh

nặng có thể gây tử vong (như Ebola) [111]

Nhiều tác nhân lây nhiễm ở cả người và động vật nhưng ở người không gây triệu chứng lâm sàng rõ ràng như ở vật chủ là động vật Điều này chứng tỏ có

Chương 1: Tổng quan

5

những bệnh lây truyền từ động vật sang người vẫn chưa được xác định có thể đe dọa sức khỏe con người Ngoài các bệnh lây truyền từ động vật sang người mới nổi trong vài thập niên gần đây như: bệnh cúm gia cầm A/H5N1, cúm A/H1N1, hội chứng viêm đường hô hấp cấp nặng (SARS), Ebola, còn có một số bệnh lây truyền

từ động vật sang người quan trọng khác đã được biết từ lâu như: bệnh tiêu chảy do

Campylobacter, bệnh dại do rabivirus, bệnh do liên cầu khuẩn ở lợn Streptococcus suis…vẫn tiếp tục xảy ra ở các nước, nhất là các nước đang phát triển, trong đó có

Việt Nam [111]

1.2 Bệnh tiêu chảy và bệnh viêm màng não

Theo định nghĩa của Tổ chức Y tế Thế giới, tiêu chảy là bệnh khi bệnh nhân

có số lần đi phân lỏng ba lần hoặc nhiều hơn mỗi ngày hoặc bệnh nhân đi tiêu nhiều phân hơn lúc khỏe mạnh, một chứng bệnh còn được gọi là viêm dạ dày-ruột Nguyên nhân phổ biến nhất của viêm dạ dày-ruột là do vi khuẩn, virus hoặc ký sinh trùng gây ra Các trường hợp nhiễm này thường là do ăn thức ăn hoặc uống nước đã

bị nhiễm trước đó hoặc lây nhiễm trực tiếp từ người mắc bệnh [112] Bệnh tiêu chảy xảy ra phổ biến ở trẻ em, đặc biệt là trẻ em dưới 5 tuổi Dù tỉ lệ tử vong do tiêu chảy gây ra đã giảm trong 30 năm qua, đây vẫn là nguyên nhân gây tử vong phổ biến đứng thứ hai trên thế giới ở trẻ dưới 5 tuổi [100] Theo số liệu thống kê năm 2011, trên thế giới ước tính có 712.000 trường hợp tử vong do tiêu chảy, chiếm 9,9% trong tổng số 6,9 triệu trường hợp tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi Ngoài ra, khoảng 34% trường hợp tiêu chảy không xác định được nguyên nhân [46]

Theo định nghĩa của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh của Mỹ (CDC), viêm màng não là bệnh chứng viêm lớp màng mỏng bao bọc não và hệ thần kinh cột sống, tình trạng viêm nhiễm này thường do chất dịch não tủy bao quanh não và tủy sống bị nhiễm khuẩn Viêm màng não đa số là do vi khuẩn hay virus từ nơi khác trong cơ thể qua máu lan vào dịch não tủy, nhưng một số rất ít cũng có thể

do nấm hay ký sinh trùng, một số khác gây ra bởi chấn thương, ung thư, do phản ứng với hóa chất hay bệnh tự miễn Mức độ nghiêm trọng của bệnh và điều trị bệnh

Chương 1: Tổng quan

6

viêm màng não khác nhau tùy thuộc vào nguyên nhân Hầu hết bệnh nhân viêm màng não có biểu hiện sốt đột ngột cộng với những triệu chứng khác như: đau đầu, cứng cổ, lơ mơ, biếng ăn và cũng có thể cảm thấy buồn nôn, tiêu chảy, đau họng và phát ban Ở trẻ sơ sinh, các triệu chứng viêm màng não thường không rõ ràng [113] Trong các tác nhân gây viêm màng não, viêm màng não do virus là dạng viêm màng não phổ biến nhất hay còn gọi là viêm màng não vô khuẩn Bệnh này được mô tả là bệnh viêm màng não nhưng không xác định được tác nhân vi khuẩn trong dịch não tủy Viêm màng não do virus thường ít nghiêm trọng hơn so với viêm màng não do

vi khuẩn, và hầu hết mọi người thường tự hồi phục mà không cần điều trị Tuy nhiên, ở trẻ dưới 1 tháng tuổi và những người có hệ miễn dịch bị suy yếu có nhiều khả năng bệnh trầm trọng hơn [114] Trong số các tác nhân virus gây ra viêm màng

não vô khuẩn, giống Enterovirus thuộc họ Picornaviridae là tác nhân phổ biến nhất,

ở hầu hết mọi lứa tuổi Theo ước tính, viêm màng não do enterovirus chiếm khoảng 80% các trường hợp viêm màng não do virus [51] Viêm màng não do enterovirus thường không có triệu chứng, thường gây nhiễm toàn thân, tuy nhiên nhiễm

enterovirus có khuynh hướng lan truyền đến hệ thần kinh Giống Enterovirus bao

gồm: Coxsackievirus A, Coxsackievirus B, echovirus, poliovirus, enterovirus và một số virus mới được xác định gần đây như EV-71, hầu hết đều ảnh hưởng đến hệ thần kinh từ viêm màng não vô khuẩn đến viêm não màng não và bệnh bại liệt Coxsackievirus B và echovirus chiếm hầu hết các trường hợp viêm màng não do enterovirus [51]

1.3 Phân loại picornavirus

Picornavirus được đặt tên theo đặc điểm chung của các virus thuộc họ

Picornaviridae là các virus có bộ gien là RNA rất nhỏ (pico-rna-virus) Picornaviridae là họ virus lớn nhất thuộc Bộ Picornavirales Bốn họ virus khác cũng thuộc bộ Picornavirales gồm: Dicistroviridae, Marnaviridae, Iflaviridae, Secoviridae Bộ này bao gồm các loài virus khác nhau có bộ gien là ribonucleic acid

(RNA) sợi đơn dương, được xếp vào cùng một nhóm dựa trên sự giống nhau về cấu trúc capsid và chu trình sống Các thành viên của bộ Picornavirales có khả năng

Chương 1: Tổng quan

7

nhiễm trên phổ vật chủ rộng, bao gồm: người và động vật có xương sống (họ

Picornaviridae), thực vật (họ Secoviridae), động vật chân khớp (họ Dicistroviridae

và Iflaviridae) và sinh vật đơn bào (họ Marnaviridae) Tuy nhiên đặc tính lây

truyền và đặc hiệu trên vật chủ khác nhay tùy thuộc vào từng giống [83]

Các picornavirus thuộc cùng một loài, gồm các serotype (kiểu huyết thanh) có quan hệ với nhau về phát sinh loài hoặc các chủng có chung: (1) giới hạn phổ vật chủ và các thụ thể trên tế bào chủ, (2) mức độ tương đồng đáng kể trong quá trình phân giải protein, sao chép, đóng gói và tái tổ hợp di truyền, (3) cách sắp xếp bộ gien cơ bản giống nhau Virus thuộc các giống khác nhau thì khác nhau ít nhất 58 % trong trình tự acid amin của polyprotein Nếu tên của virus trùng với tên của loài thì tên virus được thêm số type, ví dụ: virus encephalomyocarditis được đặt tên là encephalomyocarditis virus 1 (EMCV-1) Tiêu chuẩn để xác định các thành viên

của cùng một giống thuộc họ Picornaviridae là sự tương đồng giữa các chuỗi

polypeptide quan trọng nào đó (đặc biệt là vùng mã hóa protein L, 2A, 2B và 3A);

sự tương đồng cấu trúc RNA ở vị trí tiếp nhận ribosome (internal ribosomal entry site_IRES) và giống nhau hơn 40% trong trình tự amino acid của vùng mã hóa P1

và P2 và hơn 50% của vùng mã hóa P3 [43]

Việc đặt tên của các chủng hoặc type picornavirus do các chuyên gia của Nhóm Nghiên cứu Picornavirus (Picornavirus Study Group) thuộc Hội đồng quốc tế

về Phân loại Virus (ICTV_The International Committee for the Taxonomy of Virus), đảm trách Nhóm Nghiên cứu Picornavirus cũng có trách nhiệm đề xuất lên ICTV những thay đổi trong phân loại của picornavirus như thêm loài hoặc giống mới

Hiện nay họ Picornaviridae có 50 loài thuộc 29 giống bao gồm: Aphthovirus,

Aquamavirus, Avihepatovirus, Avisivirus, Cardiovirus, Cosavirus, Dicipivirus,

Enterovirus, Erbovirus, Gallivirus, Hepatovirus, Hunnivirus, Kobuvirus, Kunsagivirus, Megrivirus, Mischivirus, Mosavirus, Oscivirus, Parechovirus, Pasivirus, Passerivirus, Rosavirus, Sakobuvirus, Salivirus, Sapelovirus,

Chương 1: Tổng quan

8

Senecavirus, Sicinivirus, Teschovirus và Tremovirus [115]

Trong giới hạn đề tài này, chúng tôi đặc biệt quan tâm đến 4 giống thuộc họ

Picornaviridae, bao gồm: Cardiovirus, Cosavirus, Enterovirus, Kobuvirus vì những

giống này thường được phát hiện trong các mẫu bệnh phẩm ở người và có thể là tác nhân gây bệnh ở người [23][26] [33][41][93] Phân loại serotype và phổ vật chủ của

4 giống trên như trong Bảng 1.1

Bảng 1.1: Bảng phân loại 4 giống picornavirus trong nghiên cứu này và vật

Cardiovirus B

14 type: Theiler‟s murine encephalomyelitis virus (TMEV), Vilyuisk human encephalomyelitis virus (VHEV), Thera virus (TRV), Saffold virus (SAFV) 1-9

Chuột Người

Cardiovirus C 2 type: boone cardiovirus 1 (BCV-1),

Aichivirus B

3 type: bovine kobuvirus (BKV) 1 &

ovine kobuvirus 1 (OKV-1), ferret kobuvirus 1

Bò, cừu, chồn

Aichivirus C 1 type: porcine kobuvirus 1 (PKV-1) heo

BA13

Người Linh trưởng

Enterovirus B

65 type: coxsackievirus B1 (CV-B1), CV-B2CV-B6, CV-A9, echovirus 1 (E-1)E-7, E-9, E-11E-21, E-24E-

27, E-29E-33, enterovirus B69 B69), EV-B73EV-B75, EV-B77EV-B88, EV-B93, EV-B97, EV-B98, EV-B100, EV-B101, EV-B106, EV-B107, EV-B110, EV-B111, EV-B112, EV-B113 & SA5

(EV-Người Linh trưởng Heo

Enterovirus C

23 type: poliovirus (PV) 1, PV-2, PV-3, coxsackievirus A1 (CV-A1), CV-A11, CV-A13, CV-A17, CV-A19, CV-A20, CV-A21, CV-A22, CV-A24, EV-C95, EV-C96, EV-C99, EV-C102, EV-C104, EV-C105, EV-C109, EV-C113, EV-C116, EV-C117 & EV-118

Người Linh trưởng

Enterovirus D 5 type: D68, D70, D94,

EV-D111 & EV-D120

Người Linh trưởng

Enterovirus E 4 type: EV-E1 đến EV-E4 Bò

Enterovirus F 6 type: EV-F1 đến EV- F6 Bò

Thú có túi

Enterovirus G 16 type: EV-G1 đến EV-G16

Heo Cừu Heo rừng

Enterovirus H 1 kiểu: EV-H1 Linh

trưởng

Enterovirus J 6 type: simian virus 6 (SV6), EV-J103,

EV-J108, EV-J112, EV-J115 và EV-J121

Linh trưởng

Rhinovirus A 80 type Người

Rhinovirus B 32 type Người

Rhinovirus C 55 type Người Thông tin cập nhật từ trang web của ICTV Picornavirus Study Group

(www.picornaviridae.com)

Chương 1: Tổng quan

10

1.4 Đặc điểm sinh học chung của picornavirus

1.4.1 Đặc điểm hình thái của picornavirus

Virion (Hình 1.1) bao gồm vỏ capsid, không có màng bao, bao quanh lõi RNA sợi đơn dương Hạt virus ở dạng tự nhiên được hydrat hóa có đường kính 30nm, quan sát dưới kính hiển vi điện tử thì đường kính khoảng từ 22 đến 30nm do bị bay hơi trong quá trình chuẩn bị Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy hầu hết các picornavirus không có hình dạng cụ thể, hạt virus hình cầu không có đặc điểm riêng biệt Capsid gồm 60 đơn vị giống nhau (gọi là protomer), mỗi protomer gồm 3 protein bề mặt 1B, 1C và 1D kích thước khoảng 24-41 kDa và protein 1A ở bên trong có kích thước 5,5-13,5 kDa Ngoài ra, một vài virus có protein 1AB (VP0) không bị phân cắt Tổng kích thước protomer là 80-90 kDa Protein 1A, 1B, 1C và 1D được đặt tên theo thứ tự là VP4, VP2, VP3 và VP1 Các protein 1B, 1C, 1D đều chứa một cấu trúc lõi với 8 cấu trúc β-sandwich (“β-barrel”) Các β-sandwich xếp chặt vào trong capsid đối xứng 20 mặt Hầu hết các thành viên của bộ

Picornavirales đều có hình dạng cấu trúc này Sự khác nhau giữa các giống tùy

thuộc vào các vòng cuộn (loop) ở bên ngoài gắn vào các sợi β Những vòng cuộn này tạo độ dày của vỏ capsid, đây là điểm khác nhau giữa các giống Sự lắp ráp được tiến hành thông qua chất trung gian pentameric Các protein trong mỗi pentamer được nhóm lại với nhau nhờ cầu nối bên trong được tạo ra bởi đầu N- của

3 protein capsid chính (CPs), đầu C- nằm phía ngoài bề mặt capsid Các capsid rỗng được tạo ra bởi một vài picornavirus, giống với hạt virus, ngoại trừ protein 1A và 1B thường được thay thế bởi tiền chất protein 1AB không phân cắt [43]

Chương 1: Tổng quan

11

1.4.2 Tổ chức bộ gien của picornavirus và quá trình phân cắt protein

Bộ gien của tất cả picornavirus gồm sợi đơn dương, RNA không phân đoạn, khoảng 7-9 kilobase (kB) Bộ gien gồm một vùng mã hóa duy nhất với 2 đầu là các vùng không dịch mã (5‟UTR và 3‟UTR có chiều dài khác nhau) Đuôi 3‟polyA có kích thước khác nhau đáng kể giữa các giống có vai trò quan trọng trong khả năng lây nhiễm của virus [74] VPg (viral protein genome-linked) là protein nhỏ liên kết cộng hóa trị với đầu 5‟ của bộ gien và hoạt động như là mồi trong quá trình sao chép VPg được mã hóa bởi vùng bảo tồn có kích thước ngắn là 3B [24] (Hình 1.2)

Bộ gien picornavirus chứa 1 khung đọc mở và được dịch mã tạo 1 sợi polyprotein Tuy nhiên sợi polyprotein được cắt ra cùng lúc với quá trình dịch mã nên trong tế bào sợi polyprotein hoàn chỉnh không bao giờ hiện diện [74] RNA của picornavirus thiếu cấu trúc mũ chụp được methyl hóa ở đầu 5‟ và sự khởi đầu dịch

mã được tiến hành tại ribosome ở vùng IRES trong vùng 5‟UTR Polyprotein được cắt thành vùng protein cấu trúc (protein capsid) và protein không cấu trúc: Vùng P1

mã hóa các 4 protein cấu trúc, vùng P2 và P3 mã hóa 7 protein không cấu trúc có liên quan đến quá trình sao chép Các vùng này được phân cắt bởi các proteinase do virus mã hóa trong quá trình phân giải protein (Hình 1.2) Liên kết giữa vùng mã hóa P1 và P2 được phân cắt bởi proteinase 2A Tuy nhiên ở một vài giống khác

như: Cardiovirus, Parechovirus, Hepatovirus và Apthovirus, liên kết này được phân

Hình 1.1: Cấu trúc hạt virion picornavirus [122]

Chương 1: Tổng quan

12

cắt bởi proteinase 3C vì protein 2A không có hoạt tính phân giải protein [74] Một

vài giống picornavirus (Apthovirus, Cardiovirus, Erbovirus, Kobuvirus và Sapelovirus) có chức năng mã hóa thêm protein leader (L) tại vị trí từ đầu 5‟ của

protein capsid VP4 Protein L có chức năng tương tự proteinase ở apthovirus và có vai trò trong ức chế tổng hợp protein của tế bào chủ [20] Tuy nhiên, ở cardiovirus,protein leader không có hoạt tính phân giải protein nên polyprotein được phân cắt nhờ proteinase 3C Các phân cắt khác, bao gồm phân cắt giữa P2 và P3 được thực hiện bởi proteinase 3C hoặc 3CDpro, một loại protein trung gian có chức năng như

là proteinase Protein 2B, 2BC và 3AB là các protein liên kết màng, có vai trò trong sao chép hạt virus VP1 và VP4 lắp ráp thành cấu trúc capsid hoàn chỉnh và sự kiện cuối cùng là sự phân cắt VP0 thành VP4 và VP2 [74]

Hình 1.2: Tổ chức bộ gien của enterovirus Quá trình phân cắt từng phần

polyprotein và lắp ráp các protein capsid [50]

(Bộ gien được dịch mã tạo polyprotein và phân cắt thành 4 protein cấu trúc VP1, VP2, VP3, VP4 (màu đen) và 7 protein không cấu trúc (màu xám & vàng) Protein VP1, VP2, VP3, VP4 sắp xếp tạo thành protein capsid, trong đó VP1, VP2, VP3 nằm bên ngoài, VP4 nằm bên trong hạt)

Chương 1: Tổng quan

13

1.4.3 Chu trình sống của picornavirus

Picornavirus nhân lên trong tế bào chất của tế bào chủ Virus gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ sẽ làm thay đổi cấu trúc capsid cho phép bộ gien RNA cởi vỏ

và xâm nhập vào trong tế bào Picornavirus không xâm nhập trực tiếp vào tế bào qua màng sinh chất mà theo cơ chế nhập bào Khi đã vào trong tế bào chất, RNA

bộ gien trước tiên được dịch mã để cung cấp protein cần thiết cho quá trình sao chép bộ gien virus vì các protein nay không có sẵn trong tế bào chủ Khi protein được tổng hợp đầy đủ, quá trình dịch mã ngừng lại và quá trình sao chép được khởi động vì cả hai quá trình không thể xảy ra cùng một lúc trên cùng một RNA RNA polymerase mà được mã hóa bởi vùng gien 3D, chịu trách nhiệm tổng hợp RNA Protein ngắn VPg có hoạt tính như là mồi trong quá trình phiên mã tổng hợp cả RNA sợi dương và RNA sợi âm Sợi âm được tổng hợp trước và sợi này được sử dụng làm khuôn để tổng hợp sợi dương Một số RNA virus sợi dương mới tạo thành được dịch mã tạo protein capsid của virus Mỗi RNA sợi dương liên kết với một protein VPg và được bao bọc bởi vỏ capsid tạo thành hạt virus trưởng thành và được giải phóng ra ngoài tế bào Trước khi phá vỡ tế bào, VP0 được phân cắt thành VP4 và VP2 Toàn bộ quá trình hoàn tất trong khoảng từ 5-10 giờ [10][47][74] (Hình 1.3)

Picornavirus truyền bệnh theo cơ chế truyền ngang, chủ yếu qua con đường phân-miệng, qua các vật truyền bệnh hoặc qua không khí Cơ chế truyền bệnh do vector là động vật chân khớp vẫn chưa được biết, mặc dù EMCV được phân lập từ muỗi và ve và poliovirus được phân lập từ ruồi Vì vậy khả năng lây truyền gián tiếp qua vector như muỗi, bọ ve là có thể có

Hầu hết picornavirus gây phân giải tế bào nhưng ở một số ít loài virus sự nhiễm xảy ra dai dẳng Nhiễm picornavirus có thể đi kèm với ức chế nhanh chóng

Hình 1.3 Quá trình sao chép của picornavirus [50]

((1): virus xâm nhập tế bào; (2): giải phóng RNA; (3): dịch mã tạo các polyprotein; (4): phân cắt protein tạo các protein cấu trúc capsid (VP0, VP1, VP3) và protein không cấu trúc sử dụng trong sao chép (2A, 2B, 3A, 3AB, 3C) ; (5): tổng hợp RNA sợi âm; (6): tổng hợp RNA sợi dương; (7): lắp ráp vỏ capsid; (8): phá vỡ tế bào giải phóng hạt virus)

(4)

(5)

(6) (7) (8)

Chương 1: Tổng quan

15

sự dịch mã các mRNA của tế chủ (2A pro của poliovirus và L pro của aphthovirus

là các chất ức chế chủ yếu), quá trình tổng hợp mRNA, và tiết ra ngoài tế bào (liên

quan đến protein 2B và 3A của poliovirus)

1.5 Xác định serotype picornavirus trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng bằng

kỹ thuật sinh học phân tử

Khả năng gây bệnh của picornavirus, đặc biệt là enterovirus khác nhau tùy

serotype Trước đây enterovirus thường được phát hiện bằng phương pháp phân lập

nuôi cấy trên tế bào và xác định serotype bằng phương pháp ngưng kết miễn dịch

dựa trên các type kháng nguyên đặc hiệu [54] Tuy nhiên, phương pháp này phức

tạp và tốn nhiều công sức, hơn nữa, một số EV rất khó nuôi cấy trên tế bào Hiện

nay ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nhân bản gien bằng phương pháp RT-PCR

(reverse-transcription - polymerase chain reaction), xác định trình tự nucleotide,

phân tích quan hệ di truyền là kỹ thuật tiêu chuẩn để xác định và phân loại EV [36][69][71][76]

Trong bộ gien virus, vùng 5‟UTR - vùng bảo tồn cao nhất - được sử dụng để

phát hiện tất cả các enterovirus trong các bệnh phẩm lâm sàng bằng kỹ thuật sinh

học phân tử [9] Tuy nhiên trình tự nucleotide vùng 5‟UTR không xác định được

serotype mà dựa vào trình tự gien mã hóa protein capsid VP1chứa vị trí kháng

nguyên chính của virus để xác định serotype Các nghiên cứu cho thấy có sự tương

quan giữa serotype và các gien mã hóa protein cấu trúc (như VP1, VP4) Nhóm

nghiên cứu về Picornavirus cũng như ICTV đã và đang sử dụng VP1 thay cho

phương pháp huyết thanh học (phương pháp ngưng kết miễn dịch) để xác định

serotype của enterovirus Chiến lược này đã được ứng dụng hiệu quả trong xác định

enterovirus và các nghiên cứu về dịch tễ học của enterovirus Virus thuộc cùng một

serotype thì giống nhau ít nhất 75% trong trình tự nucleotide của VP1 (hoặc giống

85% trong trình tự amino acid) Ngược lại, các serotype khác nhau ít nhất 25%

trong trình tự nucleotide acid của VP1[62–64]

Chương 1: Tổng quan

16

1.6 Những giống picornavirus trong nghiên cứu này và khả năng gây bệnh của chúng

Picornavirus là tác nhân gây nhiều bệnh quan trọng ở người và động vật, trong

đó enterovirus là tác nhân gây bệnh phổ biến nhất

Enterovirus (EV) đầu tiên bao gồm chỉ những virus được phân lập từ người

và được chia thành 4 nhóm chính dựa trên cơ chế sinh bệnh của chúng ở người và ở chuột mới đẻ Virus Coxsackie A (CAV) được phân lập đầu tiên vào năm 1948 trong phân trẻ em có triệu chứng lâm sàng giống bệnh bại liệt [19] Virus Coxsackie

B (CBV) được phân lập đầu tiên vào năm 1949 từ những ca viêm màng não vô khuẩn [55] Echovirus được phân lập đầu tiên năm 1951 từ nuôi cấy mô bệnh phẩm bệnh nhân bại liệt [79] Song song với sự đa dạng di truyền của EV là sự đa dạng kiểu hình, ngay cả những EV rất giống nhau trong trình tự amino acid và thuộc cùng một loài có thể liên quan đến các bệnh khác nhau từ cảm lạnh thông thường đến bệnh liệt mềm cấp (AFP_Acute Flaccid Paralysis) Hầu hết các ca nhiễm EV không có triệu chứng lâm sàng, tuy nhiên hơn 20 triệu chứng lâm sàng thường có liên quan với nhiều kiểu HEV Trong số này có bệnh bại liệt ở trẻ em do enterovirus (poliovirus) gây ra, viêm não, viêm màng não vô khuẩn, bệnh nhiễm enterovirus phổ biến ở phụ nữ mang thai, viêm cơ tim, viêm màng ngoài tim, chứng đau nhói ngực, bệnh về hô hấp, sốt, hội chứng Reye, chứng ngoại ban, nội ban, viêm kết mạc, viêm màng bồ đào, viêm dạ dày, viêm gan, viêm khớp, viêm tụy, viêm màng kết xuất huyết cấp, chứng liệt mềm cấp và nhiễm trùng mãn tính ở người suy giảm miễn dịch [94]

Trước đây EV chỉ gồm những virus phân lập từ người và được phân loại dựa trên khả năng gây bệnh của virus Sau này các dữ liệu trình tự nucleotide cho thấy các phân nhóm này không tương quan với mối quan hệ phát sinh loài [35] Hơn nữa, mỗi type virus được mô tả có khả năng gây ra phổ rộng các bệnh nên sự phân loại dựa trên biểu hiện lâm sàng không phù hợp nữa Vì vậy, EV lúc đầu được phân loại thành 4 loài (EV-A, -B,- C, -D) dựa trên sự giống nhau trong trình tự và mối

Chương 1: Tổng quan

17

quan hệ phát sinh loài Trong mỗi loài, các type khác nhau được xác định bởi đặc điểm huyết thanh hoặc mức độ giống nhau trong trình tự Tuy nhiên, sự phân loại

này cho thấy nhiều virus tìm thấy trên động vật cũng thuộc giống Enterovirus Ví

dụ: EV-A, EV-B, và EV-D chủ yếu gồm virus gây bệnh ở người trong đó một vài

EV cũng lây nhiễm ở linh trưởng [31][32][65] Do một loài EV có thể có nhiều loài vật chủ khác nhau nên tên vật chủ đã được loại bỏ khỏi tên loài của EV Giống

Enterovirus hiện gồm 9 loài EV được đặt tên từ EV-A đến EV-J và 3 loài

Rhinovirus A đến C [45][116] Phân loại các type huyết thanh của enterovirus và vật chủ lây nhiễm như trong Bảng 1.1

Cho đến nay, enterovirus là một trong những tác nhân gây bệnh truyền nhiễm phổ biến ở người Enterovirus, cũng như coxsackievirus, echovirus lây nhiễm qua đường phân-miệng vì vậy mọi người đều có thể nhiễm non-polio enterovirus, nhưng

ở trẻ sơ sinh và trẻ em dễ nhiễm và dễ chuyển thành bệnh nặng hơn do thiếu hệ miễn dịch bảo vệ Theo số liệu thống kê từ CDC, trên thế giới mỗi năm có hàng triệu ca nhiễm enterovirus và virus này thường được tìm thấy trong các chất tiết hô hấp (nước bọt, đờm, chất nhầy mũi) và phân của những bệnh nhân nhiễm bệnh [117] Các đợt bùng phát dịch bệnh do non-polio enterovirus ở Mỹ được báo cáo bởi CDC bao gồm: Coxsackievirus A16 thường gây bệnh tay chân miệng (HFMD_hand, foot and mouth disease), tuy nhiên năm 2011 và 2012 Coxsackievirus A6 gây bệnh HFMD phổ biến ở Mỹ, trong đó có một vài trường hợp chuyển thành bệnh trầm trọng; Coxsackievirus A24 và enterovirus 70 liên quan đến bệnh viêm màng kết xuất huyết; echovirus 13, 18, 30 gây các đợt bùng phát bệnh viêm màng não vô khuẩn; enterovirus 71 gây dịch bệnh HFMD trên toàn thế giới, đặc biệt ở trẻ em Châu Á, trong đó một vài trường hợp biến chứng xấu đến thần kinh như bệnh viêm não; năm 2014 enterovirus D68 gây dịch bệnh suy hô hấp trên toàn nước Mỹ [118]

Aichivirus (AiV) thuộc giống Kobuvirus được phân lập đầu tiên trên tế bào

BS-C1 vào năm 1989 từ phân bệnh nhân viêm dạ dày-ruột [104] và năm 1998 trình

tự bộ gien của aichivirus được giải mã [105] Aichivirus đã được báo cáo như là

Chương 1: Tổng quan

18

một nguyên nhân gây viêm dạ dày ruột cấp tính ở người Các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của viêm dạ dày-ruột do Aichivirus như: tiêu chảy, đau bụng, buồn nôn, nôn và sốt [104][106] Hơn nữa, các nghiên cứu giám sát về huyết thanh học đối với Aichivirus cho thấy tỉ lệ dương tính của kháng thể kháng Aichivirus ở người tăng theo độ tuổi của người tham gia nghiên cứu, trong đó tỉ lệ dương tính ở độ tuổi từ

30 đến 40 lên đến 80-95%, điều này cho thấy sự lưu hành và lây nhiễm của Aichivirus ở người ở các lứa tuổi là khác nhau [25][66][82]

Theo cập nhật mới nhất trên website của Nhóm nghiên cứu Picornavirus,

giống Kobuvirus gồm 3 loài: Aichivirus A (tên trước đây là Aichivirus), Aichivirus B (tên trước đây là Bovine kobuvirus), và Aichivirus C (tên trước đây là Porcine kobuvirus) Trong đó Aichivirus A thường gây bệnh viêm dạ dày-ruột trên người, Aichivirus B và C thường gây bệnh trên gia súc, heo, bò, chó và mèo [5][119]

Cardiovirus bao gồm chủ yếu là các virus gây bệnh ở động vật như: heo,

ngựa, voi, sóc và khỉ, chuột [6][94] Năm 2007, cardiovirus được phân lập đầu tiên bằng nuôi cấy tế bào từ mẫu phân thu thập vào năm 1981 của một bé gái 8 tháng tuổi ở Mỹ bị sốt không rõ nguyên nhân và được đặt tên là “Saffold virus” (SAFV) [38] Các virus này sau đó được phân loại là SAFV1 và SAFV2 thuộc loài Theilovirus [49] Các nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh cho thấy sự khác nhau trong phân bố địa lý của các kiểu gien của SAFV, trong đó SAFV-2 và -3 thường được tìm thấy trong phân và dịch tiết hô hấp ở Mỹ, Châu Á và Châu Âu [33],trong khi SAFV-4 và SAFV-11 chủ yếu được tìm thấy trong các mẫu phân ở Nam Á (Pakistan và Afghanistan) [8] Từ 2007 đến nay một số nghiên cứu phát hiện SAFV trong các bệnh phẩm lâm sàng khác nhau như: phân, phết họng, dịch não tủy của những bệnh nhân sốt không rõ nguyên nhân, suy hô hấp, viêm dạ dày-ruột, viêm màng não nhưng sự liên quan giữa virus này và các triệu chứng bệnh vẫn còn chưa

rõ ràng [33]

Theo cập nhật mới nhất trên website của Nhóm nghiên cứu Picornavirus,

Cardiovirus được phân loại gồm 3 loài: Cardiovirus A (Encephalomyocarditis

virus), Cardiovirus B (Theilovirus) và Cardiovirus C Cardiovirus A gồm 2

Chương 1: Tổng quan

19

serotype của encephalomyocarditis virus (EMCV) Cardiovirus B gồm Theiler virus

gây viêm não chuột (TMEV), Vilyuisk virus gây viêm não ở người (VHEV), Thera virus (TRV) phân lập từ chuột, Saffold virus (SAFV) phân lập từ người gồm SAFV-

1 đến SAFV-11.Cardiovirus C gồm: boone cardiovirus 1 (BCV-1), BCV-2 [120]

Cosavirus được tìm thấy đầu tiên năm 2008 trong phân trẻ em ở Pakistan và

Afghanistan bị liệt mềm cấp không do poliovirus và được đặt tên là Human cosavirus (HCoSV_ common stool-associated virus) Trong nghiên cứu này, bằng cách sử dụng các tiêu chuẩn phân loại của giống Enterovirus, Kapoor và cộng sự [40] đề xuất giống Cosavirus gồm 4 loài (Cosavirus A đến D) Cũng trong năm

2008, nghiên cứu ở Úc tiến hành trên trẻ em bị tiêu chảy cấp, phát hiện loài HCoSV thứ 5 và đặt tên là HCoV-E1 [34] Tuy nhiên, ICTV Picornavirus Study Group mới

công nhận 1 loài là Cosavirus A với 24 type [121] Gần đây, HCoSV được tìm thấy

trong phân trẻ em bị tiêu chảy cấp ở Trung Quốc, Thái Lan và Braxin Sự phổ biến của HCoSV khác nhau tùy thuộc vào tuổi của bệnh nhân, khu vực địa lý và sự phơi nhiễm với các virus đường ruột trước đó [11]

1.7 Các nghiên cứu về picornavirus trên mẫu bệnh phẩm tiêu chảy và viêm màng não

Tại Ấn Độ, một số nghiên cứu trên bệnh nhân tiêu chảy được tiến hành tìm tác nhân non-polio enterovirus (NPEV) Năm 2009, nghiên cứu trên 119 trẻ từ 1-5 tuổi nhập viện do viêm dạ dày-ruột cấp tại một thành phố thuộc Ấn Độ phát hiện 15/119

Chương 1: Tổng quan

20

trẻ (12.6%) dương tính với enterovirus, trong đó 40% là Coxsackievirus A, 20% là echovirus [69] Trong một nghiên cứu khác, mẫu phân thu thập từ năm 2008 – 2012

từ trẻ em từ 0 – 9 tuổi (gồm 2330 mẫu từ trẻ có triệu chứng viêm dạ dày-ruột cấp,

và 1800 mẫu phân từ trẻ khỏe mạnh) được sàng lọc để phát hiện NPEV.Tỉ lệ dương tính là 19,01% (380/2330 mẫu) Sau khi loại trừ các ca tiêu chảy đã uống vaccine bại liệt và dương tính với NPEV (khoảng 1,81%) thì tỉ lệ phát hiện NPEV trong phân trẻ tiêu chảy cấp là 17% và ở trẻ khỏe mạnh là 6% Trong nghiên cứu này, 37 loại serotype của NPEV được phát hiện, trong đó serotype echovirus (E) 1, 7, 11,

13, 14, 30, 33 thường xuyên được phát hiện, E11 phổ biến nhất sau đến E30 [76] Mới đây, năm 2014, một nghiên cứu về các tác nhân virus gây bệnh viêm dạ dày-ruột ở trẻ nhập viện được tiến hành ở Ấn Độ NPEV được phát hiện với tỉ lệ 14%, trong đó tỉ lệ nhiễm NPEV ở trẻ có triệu chứng viêm dạ dày-ruột và không có triệu chứng viêm dày-ruột lần lượt là 13,7% và 4,9% Tỉ lệ kiểu gien được phát hiện trong nghiên cứu này bao gồm: EV-B (56,5%), EV-C (16,7%), EV-A (13,8%) và nhiễm phối hợp NPEV (13%) [70]

Kobuvirus

Theo các báo cáo của các nhà nghiên cứu từ Viện Y tế công cộng Nagoya và Viện nghiên cứu các bệnh truyền nhiễm quốc gia Tokyo, năm 1989, Aichivirus lần đầu tiên được phân lập được từ phân của những bệnh nhân viêm dạ dày-ruột có liên quan đến sò mà không tìm thấy tác nhân vi khuẩn gây bệnh Năm 1993, Aichivirus cũng được tìm thấy với tỉ lệ 28% trong các đợt bùng phát dịch viêm dạ dày-ruột có liên quan đến sò Đến năm 1998, Aichivirus được tìm thấy ở trẻ em bị bệnh viêm dạ dày- ruột ở Pakistan và ở những người Nhật du lịch trở về từ các nước Nam Á [105] Nghiên cứu về Aichivirus trên 727 mẫu phân từ bệnh nhân viêm dạ dày-ruột

ở các nước: Nhật Bản, Bangladesh, Thái Lan, kết quả cho thấy tổng cộng có 25 mẫu (3.4%) dương tính với Aichivirus, trong đó 14 mẫu (6,5%) được thu thập từ Nhật Bản, 10 mẫu (2.5%) từ Bangladesh và 1 mẫu (0.9%) từ Thái Lan [59] Aichivirus cũng được phát hiện lác đác trong một số nghiên cứ gần đây trên trẻ em bị viêm dạ

Chương 1: Tổng quan

21

dày-ruột ở một số nước trên thế giới, với tỉ lệ dương tính thấp: 1,5% ở Hungari năm

2009 [78], 0,5% ở Phần Lan năm 2010 [39] và 1,1% ở Ấn Độ năm 2011 [98] Một nghiên cứu khác về Aichivirus ở bệnh nhân trưởng thành bị tiêu chảy được tiến hành ở Thái Lan năm 2014, trong số 332 mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy, tỉ lệ phát hiện là 0,9% (3/332) [81] Nghiên cứu Aichivirus tại Hàn Quốc năm 2014, Aichivirus được tìm thấy với tỉ lệ 1,7% (27/1568 ) từ mẫu phân bệnh nhân bị viêm

dạ dày-ruột cấp trong suốt vụ dịch xảy ra ở Seoul từ 1/2011 đến 3/2012 [29] Mặc

dù chưa có bằng chứng trực tiếp nào về khả năng gây bệnh của virus này nhưng những nghiên cứu trên cho thấy Aichivirus là một trong những tác nhân gây bệnh viêm dạ dày-ruột ở người

Cardiovirus

Từ khi được phát hiện vào năm 2007, nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo sự hiện diện của SAFV trong các mẫu từ bệnh nhân viêm dạ dày-ruột [68–70] Năm 2008 6/844 trường hợp nhiễm SAFV được tìm thấy trong phân trẻ em bị viêm dạ dày-ruột ở Đức và Braxin [21] Năm 2009, trong một nghiên cứu về sự phân bố và tỉ lệ nhiễm SAFV ở trẻ em có triệu chứng viêm dạ dày-ruột cấp được thực hiện tại bệnh viện Nhi Bắc Kinh, Trung Quốc, SAFV được tìm thấy trong 12/373 mẫu phân, chiếm tỉ lệ 3,2% Các SAFV này đều thuộc genotype SAFV-1 và trong nghiên cứu này, các mẫu dương tính với SAFV đều đồng nhiễm với các virus gây tiêu chảy khác [77] Trong một nghiên cứu khác mới đây tại Trung Quốc, SAFV được tìm thấy trong 12/2013 mẫu phân từ bệnh nhân tiêu chảy thu thập từ năm 2009 - 2012, trong đó 4 mẫu thuộc kiểu gien SAFV-2, 5 mẫu thuộc kiểu gien SAFV-3 và 3 mẫu không xác định được kiểu gien [109]

Cosavirus

HCoSV được tìm thấy trong phân trẻ em bị tiêu chảy cấp ở Úc năm 2008 và

được phân vào một loài mới thuộc giống Cosavirus là HCoSV-E [34] Năm 2010, ở

Trung Quốc, 3,2% trẻ nhập viện và 1,6% trẻ khỏe mạnh được phát hiện dương tính với HCoSV, tất cả đều thuộc HCoSV loài A [18] Tại Thái Lan, giám sát dịch tễ học

Chương 1: Tổng quan

22

của HCoSV được tiến hành trên 150 mẫu phân từ trẻ em và 150 mẫu phân người trưởng thành bị tiêu chảy được thu thập từ tháng 1 đến tháng 12 năm 2008 Sau khi sàng lọc bằng kỹ thuật RT-PCR, HCoSV được tìm thấy trong duy nhất một mẫu phân từ bệnh nhân trưởng thành bị tiêu chảy mà không có ở trẻ em bị tiêu chảy cấp [44] Một nghiên cứu khác cũng tại Thái Lan được tiến hành trên tổng số 411 mẫu phân thu thập từ trẻ em nhập viện với triệu chứng viêm dạ dày-ruột từ năm 2010 đến 2011, HCoSV được phát hiện trong một mẫu phân từ một bé trai 3 tuổi, và đây

là báo cáo đầu tiên một trường hợp nhiễm HCoSV ở trẻ em với triệu chứng tiêu chảy ở Thái Lan Phân tích toàn bộ trình tự gien mã hóa (VP4, VP2, VP3, VP1, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C và 3D) cho thấy HCoSV tìm thấy trong nghiên cứu này tương đồng với chủng HCoSV-A SH1 được tìm thấy ở Trung Quốc và thuộc genotype A6 [99] Ở Braxin, tỉ lệ dương tính với HCoSV ở nhóm trẻ có triệu chứng tiêu chảy là 3,6%, gần giống với số liệu báo cáo ở Trung Quốc Trong khi đó, ở nhóm trẻ không

bị tiêu chảy, tỉ lệ nhiễm HCoSV cao hơn và có sự sai khác lớn (từ 6,5% đến 49,2%) giữa những lần thu mẫu khác nhau Trong nghiên cứu này HCoSV cũng được phát hiện ở bệnh nhân trưởng thành dương tính với HIV có triệu chứng viêm dạ dày-ruột cấp và khoảng 75% bệnh nhân có triệu chứng dương tính với HCoSV đồng nhiễm với các virus gây viêm dạ dày-ruột khác [88]

Năm 2012, một nghiên cứu rộng rãi về HCoSV trong phân từ trẻ em khỏe mạnh

và trẻ em bị bệnh liệt mềm cấp ở Pakistan, Nigeria, Tunisia và từ người trưởng thành khỏe mạnh và bị tiêu chảy ở Nepal Phân tích cây phát sinh loài dựa trên gien mã hóa protein VP3-VP1, cho thấy sự đa dạng rất lớn của HCoSV và chia HCoSV thành các genotype như sau: loài A gồm 24 genotype (A1-A24), loài D gồm 5 genotype (D1-D5), loài E gồm 2 genotype (E1-E2) và loài F có 1 genotype Trong đó, tỉ lệ phát hiện của HCoSV trong phân người trưởng thành bị tiêu chảy và người khỏe mạnh ở Nepal theo thứ tự là 12% (12/100) và 15% (15/100) [41] Năm 2013, ở Ý, một bệnh nhân được cấy ghép phổi bị bệnh tiêu chảy mãn tính cùng với sự nhiễm dai dẳng HCoSV thuộc genotype HCoSV-E1 trong phân Phát hiện mới này cho thấy HCoSV có thể liên quan đến tình trạng suy giảm miễn dịch ở người [11]

Chương 1: Tổng quan

23

1.7.1.2 Các nghiên cứu trên mẫu bệnh phẩm viêm màng não

Các đợt bùng phát dịch bệnh viêm màng não vô khuẩn do echovirus (E) 30 đã được báo cáo ở nhiều nước trên thế giới như: Thỗ Nhĩ Kỳ, Rumani, Thụy Sĩ, Braxin, Trung Quốc, Hàn quốc và một số nước khác trong hai thập kỷ qua [13][42][67][73][85][110] Năm 2012, một nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm tác nhân gây dịch viêm màng não vô khuẩn xảy ra suốt mùa xuân/hè ở 2 thành phố Plovdiv và Stara Zagora thuộc Bungari với tổng số 220 mẫu (85 mẫu phân, 90 mẫu dịch não tủy, 21 mẫu phết họng, 24 mẫu huyết thanh) từ 157 bệnh nhân viêm màng não vô khuẩn Trong nghiên cứu này, sử dụng 3 phương pháp để phát hiện virus bao gồm: phân lập trên tế bào, xét nghiệm huyết thanh học và kỹ thuật sinh học phân tử Kết quả cho thấy đa số các mẫu dương tính với enterovirus, trong đó serotype E30 chiếm 74,5% (117/157) Hầu hết các virus được tìm thấy từ mẫu phân (72,9%, 62/85) và một số ít trên mẫu dịch não tủy (32,3%, 29/90); và ít nhất là từ mẫu phết họng (19·1%, 4/21) [56] Enterovirus cũng được tìm thấy với tỉ lệ 10,16% trong dịch não tủy từ trẻ dưới 13 tuổi bị viêm màng não vô khuẩn trong một nghiên cứu được tiến hành ở Iran năm 2012, trong nghiên cứu này 3 serotype được phát hiện là E14, E5 và E30 [52]

Ở Trung Quốc, một số nghiên cứu về tác nhân của các đợt bùng phát dịch bệnh viêm màng não vô khuẩn, phát hiện một số serotype của enterovirus như: E30

ở tỉnh Giang Tô trong đợt bùng phát dịch năm 2003 [110], E6 ở tỉnh An Huy năm

2005 [53], coxsackievirus (CV) A9 ở tỉnh Cam Túc năm 2005 [14], E30, CVB3 và CVB5 ở tỉnh Sơn Đông theo thứ tự năm 2003, 2008 và 2009 [16][92][101] Mới đây, một nghiên cứu rộng rãi về bệnh viêm màng não vô khuẩn được tiến hành ở tỉnh Sơn Đông, Trung Quốc, trong đó các mẫu dịch não tủy, phết họng, phân của các bệnh nhân viêm màng não vô khuẩn nhập viện ở 5 bệnh viện trọng điểm, được thu thập từ năm 2006 đến 2012 Kết quả cho thấy, 84 (19,2%) trong tổng số 437 bệnh nhân dương tính với enterovirus và tỉ lệ dương tính với các serotype của enterovirus như sau: E30 (27,4%), EV71 (13,1%), CVB1 (9,5%), CVB3 (7,1%), CVB5 (7,1%), E6 (7,1%), E9 (7,1%), CVA9 (6,0%), và CVA10 (3,6%) [93]

và astrovirus Nghiên cứ này ứng dụng kỹ thuật RT-PCR nhân bản một đoạn ngắn trong vùng 3CD của aichivirus và tỉ lệ phát hiện aichivirus ở bệnh nhân viêm dạ dày-ruột thu nhận tại Việt Nam là 1,6% [59].

Trong một nghiên cứu trên mẫu dịch não tủy thu thập từ bệnh nhân có triệu chứng viêm não/màng não tại Bệnh viện Nhi Trung ương Hà Nội từ năm 2001-2002 và Bệnh viện Đa khoa Bắc Giang từ năm 1999-2008, có 88 ca dương tính với E30, trong

đó 80 ca chẩn đoán bằng phương pháp trung hòa huyết thanh và 8 ca chẩn đoán bằng phân lập trên tế bào, RT-PCR nhân bản đoạn gien VP1và giải trình tự [89] Năm 2011,

352 mẫu dịch não tủy từ bệnh nhân trưởng thành (tuổi từ 13-85) nghi viêm não/màng não thu nhận tại Bệnh viện Chuyên khoa Hà Nội từ tháng 5/2007 – 8/2008 được sàng lọc để tìm tác nhân gây bệnh Trong nghiên cứu này, 95/352 mẫu xác định được tác nhân, trong đó 2 mẫu dương tính với enterovirus[96] Mới đây, tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh tiến hành nghiên cứu sàng lọc 14 tác nhân virus gây nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương trên bệnh nhân viêm não/màng não từ năm 1996 – 2008 Kết quả là enterovirus được phát hiện với tỉ lệ 2,7% (8/291 mẫu) [91]

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

25

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Sơ đồ thí nghiệm

- 683 mẫu phân từ bệnh nhân tiêu chảy của dự án VIZIONS

- 294 mẫu dịch não tủy từ bệnh nhân viêm màng não của nghiên cứu BMD

Tách chiết RNA virus

so với các type tham khảo

- Đánh giá các yếu tố nguy cơ liên

quan đến khả năng nhiễm picornavirus

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

26

2.2 Đối tƣợng nghiên cứu

- Mẫu phân sử dụng trong nghiên cứu này gồm: 683 mẫu phân từ bệnh nhân tiêu chảy cấp nhập viện thuộc dự án “Nghiên cứu các tác nhân gây các bệnh

lý tiêu chảy, vàng da, nhiễm trùng đường hô hấp và nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương tại các bệnh viện tuyến tỉnh ở Việt Nam” (VIZIONS - Vietnam Initiative on Zoonotic Infections) Mẫu được thu thập tại các bệnh viện tỉnh đại diện cho các khu vực khác nhau xuyên suốt Việt Nam như: Bệnh viện Đa khoa Đồng Tháp (Đồng bằng sông Cửu Long), Bệnh viện Đa khoa tỉnh Khánh Hòa (vùng duyên hải Việt Nam), Bệnh viện Đa khoa tỉnh Đắk Lắk (Tây Nguyên), Bệnh viện Trung ương Huế (miền trung Việt Nam), Bệnh viện Đa khoa huyện Ba Vì – Hà Nội (miền Bắc), từ năm 2012-2015 Các mẫu phân trong nghiên cứu này đã được sàng lọc với các tác

nhân gây bệnh đường ruột thông thường như: các vi khuẩn đường ruột, Rotavirus, Norovirus, Adenovirus, Sapovirus và Astrovirus

- Mẫu dịch não tủy sử dụng trong nghiên cứu này gồm: 294 mẫu dịch não tủy từ bệnh nhân viêm màng não chưa xác định được nguyên nhân, một phần của nghiên cứu BMD - nghiên cứu các tác nhân gây viêm màng não ở Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh từ năm 1997 đến 2008

2.3 Thiết bị:

- Cân phân tích (AND)

- Cân kỹ thuật (Eppendorf)

- Máy đo pH (Jenway)

- Máy ly tâm thường và ly tâm lạnh (Eppendorf)

- Máy vortex (Jencons)

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

27

- Máy tách chiết RNA tự động (Roche)

- Máy NanoDrop ND1000 (Thermo Scientific)

- Máy PCR (Eppendorf)

- Máy Realtime - PCR LightCycle480 (Roche)

- Bộ điện di DNA (Bio-Rad)

- Máy chụp hình gel (Bio-Rad)

- Pipette các loại

- Micropipette và đầu típ các loại (Eppendorf)

- Eppendorf các loại

- Máy giải trình tự 3130XL (Applied Biosystems)

- Máy sấy khô DNA (Thermo Savant)

2.4 Vật liệu:

2.4.1 Hóa chất tách chiết RNA bộ gen

Trong nghiên cứu này sử dụng bộ kit “MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume” và máy tách chiết tự động MagNA Pure 96 (của hãng Roche) tách chiết nucleic acid tổng số (DNA/RNA) theo phương pháp Boom Kit gồm các thành phần:

- Dung dịch rửa1 & 2 (gồm Guanidine hydrochloride, ethanol, Tris-HCl) có tác dụng loại bỏ tạp chất

- Dung dịch đệm ly giải/ gắn kết (gồm Guanidine thiocyanate, Triton, Tris HCl) có tác dụng ly giải màng tế bào, vỏ bao virus, tăng khả năng bám của nucleic acid

- Proteinase K (gồm Proteinase K, Glycerol) có tác dụng loại bỏ protein

- Dung dịch phân giải acid nucleic (gồm dung dịch Tris-HCl)

- Dung dịch rửa 3 (gồm dung dịch Na-acetate): có tác dụng loại bỏ tạp chất

- Chai 1: dung dịch chứa các hạt từ (magnetic particle) và isopropanol có tác dụng gắn kết các acid nucleic

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

- Dung dịch nhuộm DNA trên agarose: Nancy-520

2.4.3 Hóa chất dùng trong tổng hợp cDNA

Hóa chất dùng trong tổng hợp cDNA như: dung dịch đệm 5X (gồm: 250mM Tris-HCl, 375mM KCl, 15mM MgCl2), DTT 0,1M, SuperScript III Reverse Transcriptase (200U/µl), RNase OUT Ribonuclease Inhibitor được cung cấp bởi Invitrogen (Singapore), dNTP, mồi ngẫu nhiên (random hexamers) do Roche (Singapore) cung cấp

2.4.4 Hóa chất dùng trong phản ứng nested PCR

Hóa chất dùng trong phản ứng nested PCR gồm: MgCl2, dNTP được cung cấp

bởi Roche, dung dịch đệm cho PCR (buffer 10X), Taq DNA polymerase được cung

cấp bởi Qiagen, mồi được cung cấp bởi Sigma-Aldrich (Singapore)

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

Cardiovirus 160 bp

Cosavirus 260 bp

2.4.5 Hóa chất dùng trong phản ứng real-time PCR

Hóa chất dùng trong phản ứng real-time PCR như: dung dịch đệm 10X, MgCl2, dNTP, Taq DNA polymerase (Qiagen), Mẫu dò TaqMan, mồi (Sigma-

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

30

2.4.6 Hóa chất dùng trong phản ứng one - step RT-PCR

Hóa chất dùng trong phản ứng one - step RT-PCR gồm: Kít Superscript III One-Step RT-PCR system with platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen) và mồi (Sigma-Aldrich)

Bảng 2.3: Hệ thống mồi đặc hiệu gien VP4/VP2 của enterovirus

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

2.4.7 Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm của PCR

Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm của phản ứng PCR bằng các hạt từ (Agencourt AMpure XP bead-Beckman coulter) có ái lực với DNA, gồm các thành phần:

- Vi hạt từ tính ở dạng dung dịch

- Ethanol 70% có tác dụng rửa trôi những thành phần không cần thiết (mồi,

Taq DNA polymerase, muối,…)

- Nước không có nuclease (Sigma), dùng trong sinh học phân tử (trong khóa

luận này chúng tôi gọi tắt là nước SHPT)

2.4.8 Hóa chất dùng trong giải trình tự

Bộ kít phản ứng PCR giải trình tự BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems), gồm các thành phần:

- Dung dịch đệm cho phản ứng PCR giải trình tự

- Dung dịch BigDye Terminator (chứa ddNTP, DNA polymerase)

2.4.9 Thang DNA

Thang DNA 100bp (Biolab) và thang DNA 1Kb (Invitrogen) có kích thước như hình:

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

32

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Tách chiết RNA bộ gien của virus

- Để kiểm soát sự hiện diện của chất ức chế PCR cũng như chất lượng RNA tách chiết, bổ sung vào 180µl dịch nổi 20 µl RNA chứng nội (EAV- equine arterivirus) (EAV được cung cấp bởi OUCCRU) trước khi tách chiết

Các giai đoạn cơ bản của tách chiết RNA bao gồm:

- Ly giải màng, giải phóng acid nucleic và làm biến tính enzyme nuclease

Hình 2.1 Thang 100 bp (hình A) và thang 1Kb (hình B)

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

33

- Các acid nucleic được gắn lên bề mặt hạt từ silica nhờ điều kiện muối và nồng độ ion cao có trong dung dịch đệm ly giải/gắn kết

- Các hạt từ có gắn acid nucleic được tách ra khỏi hỗn dịch ly giải ban đầu

- Các chất không gắn kết trên silica như: protein, mảnh vụn tế bào và các chất ức chế PCR được loại bỏ nhờ các dung dịch rửa

- Acid nucleic tinh sạch được thu nhận lại từ các hạt silica trong 50µl nước không chứa nuclease

2.5.2 Tổng hợp cDNA từ RNA của virus (RT)

nước đá ít nhất 1 phút để phá vỡ cấu trúc thứ cấp của RNA

- Thêm 7µl của Mix 2 (Bảng 2.6) vào Mix 1

- Chạy chương trình tổng hợp cDNA như trong bảng 2.7

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

- cDNA sau khi được tổng hợp lưu giữ ở nhiệt độ -200C cho đến khi sử dụng

- Để đảm bảo tính chính xác cho kết quả, tất cả chứng dương và âm được sử dụng trong các phản ứng PCR đều bao gồm trong phản ứng RT cDNA được tổng hợp ở bước RT bằng mồi random hexamer, được sử dụng để

sàng lọc các picornavirus trong nghiên cứu này

2.5.3 Sàng lọc 4 giống virus thuộc họ Picornaviridae

Trong nghiên cứu này, real-time PCR và nested PCR nhân bản những vùng

có độ bảo tồn cao của bộ gien virus được sử dụng để sàng lọc virus thuộc 4 giống:

Enterovirus (real-time PCR), Cardiovirus, Cosavirus và Kobuvirus (nested PCR)

2.5.3.1 Phát hiện Cardiovirus, Cosavirus và Kobuvirus bằng phương pháp

b) Các bước tiến hành:

cDNA tổng hợp từ RNA bộ gien virus tách chiết từ mẫu phân và dịch não tủy được dùng làm khuôn để chạy phản ứng nested PCR với các mồi chuyên biệt như sau: cardiovirus và cosavirus dựa trên trình tự nucleotic ở vùng bảo tồn 5‟UTR,

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

35

kobuvirus dựa trên trình tự nucleotic của gien không cấu trúc 3D [61] (Bảng 2.1) Thành phần phản ứng và Chương trình chạy nested PCR như trong Bảng 2.8 & 2.9 [61]

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

36

Bảng 2.9: Chương trình chạy Nested-PCR

Vòng 1

Biến tính 94oC 30 giây

Vòng 2

Biến tính 94oC 30 giây

2.5.3.2 Điện di và phát hiện trình tự nucleotide được nhân bản

a) Nguyên tắc điện di

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các acid nucleic Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều khắp trên bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường

Nancy-520 là chất phát huỳnh quang có khả năng gắn xen vào DNA mạch đôi

Do đó khi miếng gel được nhuộm với Nancy-520 và sau đó được chiếu dưới đèn

UV thì có thể phát hiện được các vạch DNA

b) Các bước tiến hành

Đổ gel 2%: Cân 2g agarose cho vào 100 ml dung dịch TE, đun tan agarose, sau đó để nguội khoảng 500C và cho Nancy-520 vào với hàm lượng 3,5 µl/100 ml dung dịch Lắc đều dung dịch rồi đổ vào khuôn, gắn lược để tạo giếng, chờ gel đông trong thời gian khoảng 30 phút

Chạy điện di: lấy 5 µl sản phẩm PCR hòa vào 1 µl loading buffer 6X, cho hỗn hợp vào các giếng của bảng gel rồi tiến hành chạy điện di cùng với thang 100bp/1Kb Quá trình điện di được thực hiện trong vòng 1h, ở 140 vol

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

37

2.5.3.3 Phát hiện Enterovirus bằng phương pháp real-time PCR

a) Nguyên tắc của real-time PCR

Real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích tương tự PCR, trong đó kết quả nhân bản trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng nhân bản xảy

ra nhờ vào chất phát huỳnh quang

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng mẫu dò được đánh dấu chất phát huỳnh quang Khi có sản phẩm nhân bản đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của mẫu dò lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm nhân bản, và khi có sự bắt cặp này thì sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận được nguồn sáng kích thích Mẫu dò TaqMan là những oligonucleotide có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích, trình tự này dài khoảng 24 đến 30 base với đầu 5‟ có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) còn đầu 3‟ có gắn chất hấp phụ tương ứng (quencher) để hấp phụ được ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter [1, tr 32-49]

Cơ chế hoạt động của mẫu dò TaqMan như sau: (1) Khi chưa có sản phẩm nhân bản đặc hiệu từ DNA đích thì mẫu dò TaqMan vẫn còn nguyên vẹn nên huỳnh quang phát ra từ reporter ở đầu 5‟ sẽ bị quencher ở đầu 3‟của mẫu dò hấp phụ, không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích (2) Khi phản ứng đạt được nhiệt độ bắt cặp thích hợp, mẫu dò TaqMan bắt cặp lên mạch khuôn của DNA mục tiêu (sản phẩm đặc hiệu của phản ứng PCR) Đến giai đoạn kéo dài, hoạt tính 5‟ – 3‟ exonuclease của enzyme Taq polymerase kéo dài mạch bổ sung tương ứng với mạch khuôn của DNA mục tiêu, cắt bỏ mẫu dò TaqMan nằm trên mạch khuôn, khiến cho reporter và quencher tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang

từ reporter được phát hiện khi có nguồn sáng kích thích (do không bị quencher hấp phụ) Càng nhiều sản phẩm nhân bản xuất hiện thì số lượng reporter tự do càng nhiều và khi cường độ huỳnh quang đủ mạnh máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra [1, tr 32-49]

Ngưỡng chu kỳ (Cycle threshold - Ct) là số chu kỳ PCR mà tại đó thiết bị time ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang

real-Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

38

nền Ngưỡng chu kỳ được xác định bằng số chu kỳ mà ở đó đường nền cắt được đường biểu diễn nhân bản Dựa vào đồ thị này, ta có thể dễ dàng phân tích kết quả phản ứng realtime PCR Kết quả là dương tính nếu đồ thị biểu diễn đường cong nhân bản của mẫu có dạng chuẩn, tức là có giai đoạn lũy thừa, giai đoạn bình nguyên (hình 2.2)

b) Các bước tiến hành

cDNA tổng hợp từ RNA tách chiết từ phân trẻ bị tiêu chảy và bệnh nhân bị viêm màng não được sử dụng làm khuôn trong phản ứng real-time PCR với các mồi

và mẫu dò đặc hiệu dựa trên trình tự nucleotic ở vùng bảo tồn 5‟UTR (Bảng 2.2)

Tất cả các phản ứng đều sử dụng chứng nội là cDNA của EAV

Hình 2.2: Đồ thị biểu diễn đường cong khuếch đại dạng chuẩn

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

39

Phản ứng real-time PCR diễn ra trong máy real-time PCR Light Cycler 480 (Roche) với chứng dương là virus EV71 phân lập tại Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng Đại học Oxford, Tp Hồ Chí Minh Bộ lọc FAM (483nm – 533nm) để nhận biết tín hiệu từ mẫu dò enterovirus; bộ lọc Cy5 (615 – 670nm) để nhận biết tín hiệu từ mẫu

dò EAV Thành phần phản ứng và chương trình chạy real-time PCR như trong bảng 2.10 & 2.11 [7]

Bảng 2.11: Chương trình chạy real-time PCR

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

40

2.5.4 Phân loại di truyền enterovirus

(Sero)type của enterovirus trong các mẫu dương tính được xác định thông qua nhân bản và giải trình tự gien VP1 Tuy nhiên, do vùng VP1 có sự đa dạng lớn trong trình tự, mồi được thiết kế thường chỉ có thể nhân bản cho những trình tự VP1 của từng loài enterovirus [48] Trong khi đó, vùng VP4/VP2 có độ bảo tồn tốt hơn

và một bộ mồi đã được thiết kế có thể nhân bản hầu hết trình tự VP4/VP2 của enterovirus Ngoài ra, vùng này cho biết được virus thuộc loài enterovirus nào [102] Do đó, chúng tôi trước tiên xác định loài enterovirus thông qua vùng VP4/VP2 Sau đó, dựa trên thông tin loài của enterovirus trong mẫu, những bộ mồi phù hợp cho từng loài sẽ được sử dụng để nhân bản và giải trình tự gien VP1

Các bước phân loại di truyền enterovirus

Blast trình tự VP4/VP2 để xác định:

- Giống thuộc họ Picornaviridae

- Loài thuộc giống Enterovirus

- Vùng và chiều dài gien được giải trình tự