Nghiên cứu bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân (xanthomonas campestris pv campestris) hại cây rau họ hoa thập tự tại gia lâm, hà nội

Nghiên cứu bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân (Xanthomonas campestris pv. campestris) hại cây rau họ hoa thập tự tại Gia Lâm, Hà Nội Nghiên cứu bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân (Xanthomonas campestris pv. campestris) hại cây rau họ hoa thập tự tại Gia Lâm, Hà Nội Nghiên cứu bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân (Xanthomonas campestris pv. campestris) hại cây rau họ hoa thập tự tại Gia Lâm, Hà Nội Nghiên cứu bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân (Xanthomonas campestris pv. campestris) hại cây rau họ hoa thập tự tại Gia Lâm, Hà Nội Nghiên cứu bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân (Xanthomonas campestris pv. campestris) hại cây rau họ hoa thập tự tại Gia Lâm, Hà Nội Nghiên cứu bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân (Xanthomonas campestris pv. campestris) hại cây rau họ hoa thập tự tại Gia Lâm, Hà Nội

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA NÔNG HỌC

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Nghiên cứu bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân (Xanthomonas campestris pv campestris) hại cây rau họ hoa thập tự tại Gia Lâm,

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt khoảng thời gian thực hiện khóa luận này, ngoài sự nỗ lực củabản thân, em còn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất

từ phía các thầy cô để em hoàn thành đề tài

Đầu tiên em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới thầy giáoPGS TS Đỗ Tấn Dũng đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian emthực hiện khóa luận này

Em xin cảm ơn tới các thầy cô giáo và cán bộ, Bộ môn Bệnh cây, KhoaNông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã quan tâm và tạo mọi điều kiệncho em thực hiện khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn bà con tại các xã Đặng Xá, Kim Lan, Văn Đức

đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình điều tra và thu thập mẫu bệnhhại trên đồng ruộng

Cảm ơn các bạn, các anh, các chị và người thân đã động viên, chia sẻ giúp

đỡ tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt bài khóa luận này

Hà Nội, ngày 30 tháng 7 năm 2017

Sinh viên

Ngô Thị Ngọc Diệp

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC ĐỒ THỊ vii

DANH MỤC ĐỒ THỊ vii

DANH MỤC HÌNH ix

DANH MỤC HÌNH ix

PHẦN I : MỞ ĐẦU 12

1.1 Đặt vấn đề 12

1.2 Mục đích và yêu cầu 13

1.2.1 Mục đích của đề tài 13

1.2.2 Yêu cầu của đề tài 13

PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 14

2.1 Những nghiên cứu ngoài nước 14

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu, tác hại, phân bố của bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân Xanthomonas campestris hại họ hoa thập tự 14

2.1.2 Triệu chứng bệnh 17

2.1.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân Xanthomonas campestris hại rau họ hoa thập tự 20

2.1.4 Nguyên nhân gây bệnh 20

2.1.5 Nghiên cứu quá trình xâm nhiễm, lan truyền và sự tồn tại của loài vi khuẩn vàng lá đen gân hại cây rau họ hoa thập tự 22

2.1.6 Biện pháp phòng chống bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cây rau họ hoa thập tự 24

2.2 Những nghiên cứu trong nước 27

PHẦN III : VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

29

3.1 Đối tượng nghiên cứu 29

3.2 Vật liệu nghiên cứu 29

3.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 30

3.4 Nội dung nghiên cứu 30

3.5 Phương pháp nghiên cứu 30

3.5.1 Phương pháp điều tra bệnh ngoài đồng ruộng 30

3.5.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 31

3.5.3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn Xanthomonas campestris 34

3.5.4 Nghiên cứu đặc tính gây bệnh, tính độc của vi khuẩn Xanthomonas campestris 34

3.5.5 Nghiên cứu các phản ứng sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn Xanthomonas campestris 35

3.5.6 Khảo sát hiệu lực ức chế của một số thuốc kháng sinh với các isolate vi khuẩn gây bệnh vàng lá đen gân Xanthomonas campestris 38

3.5.7 Phương pháp xử lý số liệu 39

PHẦN IV : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

4.1 Điều tra bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân Xanthomonas campestris hại cây rau họ hoa thập tự vụ đông xuân năm 2017 vùng Gia Lâm, Hà Nội 40

4.1.1 Diễn biến bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân Xanthomonas campestris hại cây cải bắp tại Gia Lâm, Hà Nội 40

4.1.2 Diễn biến bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân Xanthomonas campestris hại cây súp lơ xanh tại Gia Lâm, Hà Nội 43

4.1.3 Diễn biến bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân Xanthomonas campestris hại cây súp lơ trắng tại Gia Lâm, Hà Nội 45

4.1.4 Diễn biến bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân Xanthomonas campestris

hại cây su hào tại Gia Lâm, Hà Nội 47

4.2.1 Phân ly nuôi cấy, một số đặc điểm triệu chứng nhận biết bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại rau họ hoa thập tự 49

4.2.2 Phân ly nuôi cấy vi khuẩn Xanthomonas campestris 50

4.2.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các isolate vi khuẩn Xanthomonas campestris trên các môi trường nhân tạo 56

4.2.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cây rau họ hoa thập tự bằng kỹ thuật lam ép 58

4.2.4 Một số thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hoá của các isolate vi khuẩn Xanthomonas campestris 59

4.2.5 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của các isolate vi khuẩn Xanthomonas campestris 62

4.2.6 Khảo sát hiệu lực ức chế của một số thuốc kháng sinh với các isolate vi khuẩn gây bệnh vàng lá đen gân Xanthomonas campestris 69

4.2.7 Nghiên cứu tính gây bệnh của các isolate vi khuẩn Xanthomonas campestris phân lập trên các cây kí chủ tại Gia Lâm - Hà Nội và phụ cận 74

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 86

5.1 Kết luận 86

5.3 Đề nghị 88

TÀI LIỆU THAM KHẢO 89

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1: Diễn biến bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cây cải bắp vụ đông

xuân năm 2017 tại Gia Lâm, Hà Nội 41Bảng 4.3: Diễn biến bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cây súp lơ trắng vụ

đông xuân năm 2017 tại Gia Lâm, Hà Nội 46Bảng 4.4: Diễn biến bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại trên cây su hào vụ

đông xuân năm 2017 tại Gia Lâm, Hà Nội 48Bảng 4.5: Một số đặc điểm và triệu chứng nhận biết bệnh vi khuẩn vàng lá

đen gân hại rau họ hoa thập tự 50Bảng 4.6: Danh mục các isolate vi khuẩn Xanthomonas campestris phân

lập trên cây rau họ hoa thập tự tại Gia Lâm, Hà Nội 51Bảng 4.7: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các isolate vi khuẩn

Xanthomonas campestris trên các môi trường nhân tạo 57Bảng 4.8: Một số thử nghiệm đặc tính sinh lý của các isolate vi khuẩn

Xanthomonas campestris 60Bảng 4.9: Kết quả nghiên cứu một số phản ứng sinh hoá của các isolate vi

khuẩn Xanthomonas campestris 61Bảng 4.10: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của

isolate Xc – CB – ĐX 62Bảng 4.11: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của

isolate Xc - CBẹ – ĐX 63Bảng 4.12: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của

isolate Xc - CN` - ĐX 64Bảng 4.13: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của

isolate Xc - SLX – VĐ 65Bảng 4.14: Ảnh hưởng của môi trường nôi cấy đến sự phát triển của

isolate Xc - SLT - KL 66

Bảng 4.15: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của

isolate Xc - SH – ĐX 67Bảng 4.16: Hiệu lực ức chế của một số thuốc hóa học và thuốc kháng sinh

với isolate vi khuẩn cải bắp trên môi trường nhân tạo PSA 70Bảng 4.17: Hiệu lực ức chế của 1 số thuốc hóa học, thuốc kháng sinh với

isolate vi khuẩn cải ngồng trên môi trường nhân tạo PSA 71Bảng 4.18: Hiệu lực ức chế của 1 số thuốc hóa học, thuốc kháng sinh với

isolate vi khuẩn su hào trên môi trường nhân tạo PSA 72Bảng 4.19: Kết quả lây nhiễm nhân tạo của các isolate vi khuẩn

Xanthomonas campestris trong điều kiện chậu vại trên cây cải bắp 74Bảng 4.20: Kết quả lây nhiễm nhân tạo của các isolate vi khuẩn

Xanthomonas campestris trong điều kiện chậu vại trên cây súp lơxanh 77Bảng 4.21: Kết quả lây nhiễm nhân tạo của các isolate vi khuẩn

Xanthomonas campestris trong điều kiện chậu vại trên cây su hào 81Bảng 4.22: Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên hạt giống một số cây kí chủ

với các isolate vi khuẩn Xanthomonas campestris 83

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1: Diễn biến bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cây cải bắp vụ

đông xuân năm 2017 tại Gia Lâm, Hà Nội 41

Đồ thị 4.2: Diễn biến bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cây súp lơ xanh

vụ đông xuân 2017 tại Gia Lâm, Hà Nội 44

Đồ thị 4.3: Diễn biến bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cây súp lơ trắng vụ

đông xuân 2017 tại Gia Lâm, Hà Nội 46

Đồ thị 4.4: Diễn biến bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại trên cây su hào tại

Gia Lâm, Hà Nội 48

Đồ thị 4.5: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của

Đồ thị 4.11: Hiệu lực ức chế của một số thuốc hóa học và thuốc kháng sinh

với isolate Xc - CB - ĐX trên môi trường nhân tạo PSA 69

Đồ thị 4.12: Hiệu lực ức chế của 1 số thuốc hóa học, thuốc kháng sinh với

isolate Xc – CN` - ĐX trên môi trường nhân tạo PSA 70

Đồ thị 4.13 : Hiệu lực ức chế của 1 số thuốc hóa học, thuốc kháng sinh với

isolate Xc - SH – ĐX trên môi trường nhân tạo PSA 71

Đồ thị 4.14: Kết quả lây nhiễm nhân tạo của các isolate vi khuẩn

Xanthomonas campestris trong điều kiện chậu vại trên cây cải bắp

74

Đồ thị 4.15: Kết quả lây nhiễm nhân tạo của các isolate vi khuẩn

Xanthomonas campestris trong điều kiện chậu vại trên cây súp lơ

xanh 76

Đồ thị 4.16: Kết quả lây nhiễm nhân tạo của các isolate vi khuẩn

Xanthomonas campestris trong điều kiện chậu vại trên cây su hào 80

Đồ thị 4.17: Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên hạt giống của một số cây kí

chủ với các isolate vi khuẩn Xanthomonas campestris 82

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Các mạch dẫn biến màu trong thân cây cải bắp bị nhiễm vi

khuẩn gây bệnh vàng lá đen gân 17Hình 2.2: Các mạch dẫn biến màu trong lá cây cải bắp bị nhiễm vi khuẩn

gây bệnh vàng lá đen gân 18Hình 4.1: Ruộng cải bắp nhiễm bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân tại xã Đặng

Xá 42Bảng 4.2: Diễn biến bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cây súp lơ xanh vụ

đông xuân 2017 tại Gia Lâm, Hà Nội 44Hình 4.3: Triệu chứng bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại súp lơ trắng tại

xã Kim Lan 47Hình 4.4: Triệu chứng bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại su hào tại xã

Văn Đức 49Hình 4.5: Triệu chứng bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cải bắp tại xã

Đặng Xá 51Hình 4.6: Mạch dẫn trong thân cây cải bắp bị thâm đen do nhiễm vi khuẩn

Xanthomonas campestris 51 Hình 4.7: Khuẩn lạc của vi khuẩn Xanthomonas campestris phân lập trên

cải bắp tại Kim Lan 51

Hình 4.8: Triệu chứng bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cải bẹ tại xã

Đặng Xá 52

Hình 4.9: Khuẩn lạc của vi khuẩn Xanthomonas campestris phân lập trên

cải bẹ Đặng Xá 52Hình 4.10: Triệu chứng bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cải ngồng tại

xã Đặng Xá 53

Hình 4.11: Khuẩn lạc của vi khuẩn Xanthomonas campestris phân lập trên

cải ngồng Đặng Xá 53Hình 4.12: Triệu chứng bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại súp lơ xanh tại

xã Văn Đức 54

Hình 4.13: Khuẩn lạc của vi khuẩn Xanthomonas campestris phân lập trên

súp lơ xanh Văn Đức 54Hình 4.14: Triệu chứng bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại súp lơ trắng tại

xã Kim Lan 55

Hình 4.15: Khuẩn lạc của vi khuẩn Xanthomonas campestris phân lập trên

súp lơ trắng tại Kim Lan 55

Hình 4.16: Khuẩn lạc của vi khuẩn Xanthomonas campestris phân lập trên

súp lơ trắng tại Văn Đức 55Hình 4.17: Triệu chứng bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại su hào tại xã

Kim Lan 55Hình 4.18: Khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên cây su hào tại xã Đặng Xá 56

Hình 4.19: Các isolate vi khuẩn Xanthomonas campestris trên môi trường

Hình 4.26: Ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của khuẩn lạc của

isolate cải bắp sau 120 giờ nuôi cấy 68Hình 4.27: Khảo sát hiệu lực ức chế của một số thuốc hoá học, thuốc

kháng sinh 72

Hình 4.28: Kết quả lây nhiễm nhân tạo vi khuẩn Xanthomonas campestris

bằng phương pháp không sát thương trên cây cải bắp sau 7 ngày 74

Hình 4.29: Kết quả lây nhiễm nhân tạo vi khuẩn Xanthomonas campestris

bằng phương pháp không sát thương trên cây cải bắp (a: sau 14ngày; b: sau 21 ngày) 75Hifnh 4.30: Kết quả lây nhiễm chéo isolate Xc - CB - ĐX bằng phương

pháp không sát thương trên cây cải bắp và súp lơ xanh sau 21 ngày 75

Hình 4.31: Kết quả lây nhiễm nhân tạo vi khuẩn Xanthomonas campestris

bằng phương pháp không sát thương trên cây súp lơ xanh (a: sau 7ngày, b : sau 21 ngày) 77Hình 4.32: Thực hiện phương pháp sát thương trên cây kí chủ súp lơ xanh

78

Hình 4.33: Kết quả lây nhiễm nhân tạo vi khuẩn X campestris bằng

phương pháp sát thương trên cây súp lơ xanh (a: sau 14 ngày, b:sau 21 ngày) 78Hình 4.34: Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên hạt giống cải ngồng với các

isolate vi khuẩn Xanthomonas campestris 83

PHẦN I : MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là một nước nông nghiệp lâu đời nằm trong vùng khí hậu nhiệtđới gió mùa, nóng ẩm quanh năm tạo điều kiện thuận lợi cho việc gieo trồngnhiều loại cây Nhưng bên cạnh đó, khí hậu nóng ẩm quanh năm cũng là điềukiện thuận lợi cho sự phát triển của dịch hại, đặc biệt là bệnh hại Bệnh hại đãxuất hiện và gây hại ở hầu hết các cây trồng ở nước ta Theo tính toán của FAOđến năm 1986, thiệt hại do nấm, vi khuẩn, virus, mycoplasma gây ra là rất lớntrong đó thiệt hại lớn nhất do nấm, có đến 80% bệnh hại cây trồng là do nấm gây

ra, 20% là do vi sinh vật khác

Rau không chỉ là thực phẩm thiết yếu cho cuộc sống mà còn là loại câytrồng đem lại hiệu quả kinh tế cao, một mặt hàng xuất khẩu có giá trị Vì vậydiện tích trồng rau của nước ta không ngừng tăng lên trong những năm gần đây.Năm 2000, diện tích trồng rau của nước ta là 340 nghìn ha, đến năm 2004 thìdiện tích trồng rau đã tăng lên tới 614.5 nghìn ha, chiếm xấp xỉ 7% đất sản xuất

nông nghiệp và 10% đất cây hàng năm Họ Cải (danh pháp khoa học:

Brassicaceae), còn gọi là họ Thập tự (Cruciferae), là một họ thực vật có hoa

gồm nhiều loại cây như: cải bắp, cải xoăn, bông cải xanh, cải làn,…Rau họ thập

tự chiếm 50% tổng sản lượng rau và xuất hiện gần như quanh năm trong cảnước, giải quyết vấn đề rau trái vụ Đây là những loại cây có giá trị dinh dưỡngcao chứa nhiều loại vitamin và khoáng chất được nhiều người ưa thích

Trong những năm gần đây, để đáp ứng nhu cầu của xã hội thì rau họ thập

tự hầu như được trồng quanh năm, diện tích sản xuất được mở rộng đã dẫn đến

sự tích lũy của nhiều nguồn bệnh gây hại và trở thành một vấn đề đáng quantâm, đặc biệt cần chú ý đến bệnh vàng lá đen gân do vi khuẩn gây ra Đây là mộttrong những bệnh quan trọng và nguy hiểm trên họ rau thập tự và có thể dẫn tớithiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng

Bệnh vàng lá đen gân hại họ hoa thập tự còn được gọi là bệnh đen gân

hay bệnh tắc mạch dẫn do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv campestris gây

nên Bệnh có thể dễ dàng lây lan nhanh trên đồng ruộng và thiệt hại do bệnh gây

ra có thể vượt quá 50% trong điều kiện thời tiết ấm áp và ẩm ướt (Mohammad,1990) Đây là bệnh khá phổ biến trên cải bắp, bệnh nặng làm cháy lá, giảm trọnglượng, năng suất của cây trồng Bệnh phát triển mạnh ở các vùng có khí hậunhiệt đới nóng ẩm (Alvarez, 2000; Vicente và Holub, 2012) Bệnh được pháthiện đầu tiên vào năm 1889 ở Mỹ do Harman Bệnh phổ biến ở Châu Á, Châu

Âu, Châu Mỹ và Châu Phi (Bradbury, 1986; CABI, 2012) Đây là một bệnh có ýnghĩa kinh tế quan trọng đối với cây họ Cải trên toàn thế giới và là mối đe doạhàng năm ở các vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới Việc phòng trừ bệnh gặpnhiều khó khăn do phụ thuộc nhiều vào yếu tố thời tiết Do đó, việc xác địnhđược tác nhân gây bệnh là điều cần thiết để làm cơ sở cho các biện pháp phòngchống bệnh một cách có hiệu quả

Xuất phát từ những nhu cầu thực tiễn hiện nay và được sự phân công củaKhoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của

PGS.TS Đỗ Tấn Dũng, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu bệnh vi khuẩn

vàng lá đen gân ( Xanthomonas campestris pv campestris) hại cây rau họ hoa thập tự tại Gia Lâm, Hà Nội”.

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích của đề tài

Tìm hiểu tình hình bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cây rau họ hoa thập

tự vùng Gia Lâm, Hà Nội Nghiên cứu xác định nguyên nhân gây bệnh, một sốđặc điểm hình thái, đặc tính sinh học và khảo sát biện pháp phòng trừ bệnh

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

- Điều tra thực trạng và mức độ phổ biến của bệnh vi khuẩn vàng lá đengân hại một số cây rau họ hoa thập tự tại Gia Lâm, Hà Nội

- Phân ly nuôi cấy vi khuẩn Xanthomonas campestris pv campestris (X campestris) hại trên một số cây ký chủ, xác định nguyên nhân gây bệnh

- Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm sinh học của các

isolate vi khuẩn X campestris.

- Khảo sát hiệu lực ức chế của một số thuốc hóa học và kháng sinh với

các isolate vi khuẩn X campestris trên môi trường nhân tạo.

PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1 Những nghiên cứu ngoài nước

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu, tác hại, phân bố của bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân Xanthomonas campestris hại họ hoa thập tự

Bệnh vàng lá đen gân hại rau họ hoa thập tự, còn được gọi là bệnh đen

gân hay bệnh tắc mạch dẫn Bệnh vàng lá đen gân do vi khuẩn X campestris gây

ra trên rau họ hoa thập tự, bệnh có thể lây nhiễm trong bất kỳ giai đoạn sinhtrưởng nào của cây và tồn tại trong hạt giống Đây là bệnh khá phổ biến và đượccoi là bệnh quan trọng nhất trên cây rau họ thập tự Bệnh làm cháy lá, giảmtrọng lượng của cây ký chủ, ảnh hưởng đến năng suất cây trồng Bệnh lần đầutiên được mô tả bởi nhà thực vật học và côn trùng học Harrison Garman tạiLexington, Kentucky, Hoa Kỳ vào năm 1889

Bệnh được phát hiện tại Thái Lan vào năm 1983 (Schaad và Thaveechai,1983) Kể từ đó, nó đã được tìm thấy trong hầu hết các nước, chúng đã được ghinhận có mặt ở khoảng 85 quốc gia khắp Châu Phi, Châu Á, Bắc Mỹ và Nam Mỹ(Bradbury, 1986; Walangululu và Mushagalusa, 2000; CABI, 2012; Vicente vàHolub, 2012)

Năm 1893, bệnh thối đen vi khuẩn lần đầu tiên được mô tả thành côngbởi Louis Pammel trên cây củ cải tại tiểu bang New York Năm 1939, tại

Montenegro cũng đã tìm thấy sự xuất hiện của loài vi khuẩn Xanthomas campestris (Pammel, 1895).Tại đây, các mẫu bệnh cây được thu thập từ các địa

phương khác nhau được phân lập, xác định các loài vi khuẩn bằng các phươngpháp phòng thí nghiệm của Schaad (1980), Lelliott và Stead (1987) Các kết quả

thu được đã khẳng định sự hiện diện của X campestris (Pammel, 1895), trên cải

bắp, cải xoăn và bông cải xanh tại Montenegro Đây là bằng chứng thực nghiệm

đầu tiên chứng minh sự xuất hiện của loài vi khuẩn X campestris ở Montenegro,

nó gây ra thiệt hại lớn ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới có khí hậu ẩmướt, nhưng cũng gây hại nặng ở vùng lạnh hơn, các vùng ven biển ở phía bắc

- Ern Châu Âu và Bắc Mỹ Cây có thể bị nhiễm trong các thời kỳ sinh trưởng

và tồn tại trong hạt giống Theo số liệu thống kê, đến năm 2009 tạiMontenegro, tổng diện tích cây trồng là 18.403 ha, trong đó diện tích trồng cảibắp và cải xoăn là trên 1.968 ha, với năng suất bình quân 25.44 tấn / ha Năngsuất có thể bị giảm 40 - 50% do sự gây hại của loài vi khuẩn này

Tại miền trung Serbia, loài vi khuẩn X campestris (Arsenijević, 1988;

Balaž năm 2005; Obradovic, 2010) được mô tả đầu tiên vào năm 1964, khi nó gâythiệt hại khoảng 80% trong thức ăn gia súc cây cải xoăn (Perisic và hoảng loạn,năm 1964, cit Balaž, 2001)

Vào đầu những năm 1990, Balaž đã quan sát thấy sự xuất hiện của loài vi

khuẩn X campestris trên một số loại rau trong Vojvodina: súp lơ, cải xoăn, cải

bắp, su hào Obradovic và Arsenijević (1999) đã mô tả vi khuẩn này trên cải

bắp, cải xoăn, su hào, súp lơ xanh, súp lơ trắng Obradovic et al (2000b) đã tiến

hành nghiên cứu chi tiết sinh hóa và vật lý đặc điểm của vi khuẩn này ở Serbia,bởi cựu amining phân lập của nó thu được từ các mẫu phân lập cải bắp, su hào,súp lơ và cải thảo khu vực ở Serbia, trong khoảng thời gian 1995 - 1999

Theo CABI (2012), bệnh vàng lá đen gân X campestris cho đến nay đã

xuất hiện tại nhiều quốc gia Ở châu Âu bao gồm: Bungary, CH Séc, Đan Mạch,Pháp, Đức, Hy Lạp, Thủy Điển, Thụy Sĩ, Anh

Ở châu Á: Brunei, Campuchia, Trung Quốc, Nhật, Malayxia, Nepan,Philippin, Srilanka, Thái Lan, Đài Loan, Thổ Nhĩ Kỳ và Việt Nam

Ở Châu Phi gồm có Angola, Ethiopia, Ghana, Libya, Malawi,Mozambique, Ở Châu Đại Dương bệnh xuất hiện ở New South Wales,Queensland thuộc Australia

Bệnh vàng lá đen gân được coi là bệnh quan trọng ở các khu vực sản xuấtchính của Bắc Mĩ và Tây Âu Vào cuối những năm 1960, đầu những năm 1970tần xuất và mức độ nghiêm trọng của bệnh không ngừng tăng lên Năm 1973, tại

Mỹ khoảng 70% cây con bị nhiễm bệnh trên 1 triệu ha diện tích trồng (Williams,1980) Đến năm 1976, ước tính lên tới 1 triệu diện tích trồng bị nhiễm bệnh

(Kennedy và Alcorn, 1980) Tại Canada, bệnh gây hại nặng cây củ cải ThụyĐiển dẫn tới thiệt hại năng suất lên tới 60% vào mùa đông năm 1979 - 1980(McKeen, 1981).

Năm 1983 tại Hungary, Nemeth và Laszlo đã đưa ra báo cáo về mức độthiệt hại của bệnh trên cây cải bắp và súp lơ Cho đến năm 2012, Radunovic vàBalaz đã tìm thấy sự hiện diện của bệnh vàng lá đen gân trên các cây cải bắp, cảixoăn, súp lơ xanh và củ cải

Tại một số khu vực của Nga, bệnh vàng lá đen gân gây ra thiệt hại năng suất

lên tới 57% trên các giống cải bắp nhạy cảm (Ignatov, 1992; Djalilov et al., 1989)

Tại Italy, bệnh vàng lá đen gân được thông báo thành dịch trong năm

1992 - 1994 và 1997 (Caponero và Iacobelis, 1994; Scortichini et al, 1994; Catara et al., 1999).

Tại Israel, bệnh vàng lá đen gân gây thiệt hại lớn về kinh tế, làm giảmnăng suất của các cây cải bắp, súp lơ, củ cải và su hào, đặc biệt là trong mùađông (Kritzman và Ben - Yephet, 1990)

Ở Ấn Độ, bệnh lần đầu tiên được phát hiện trên cây cải bắp tại Bombay,Pradesh Kể từ đó bệnh vàng lá đen gân cũng đã xuất hiện tại các khu vực kháccủa Ấn Độ Bệnh vàng lá đen gân cải bắp là bệnh gây thiệt hại lớn nhất do gâychết lá non và cũng ảnh hưởng đến chất lượng của cây cải bắp Theo ghi nhận thìmức độ nghiêm trọng của bệnh này được ghi nhận với giống mẫn cảm của cải bắp

như Golden Acre của Ấn Độ, các cây có thể bị nhiễm bất cứ lúc nào trong khoảng

thời gian sinh trưởng tức là từ giai đoạn cây con cho đến khi thu hoạch Trên câycải bắp, các triệu chứng sớm nhất xảy ra như tổn thương hoại tử trên lá mầm hoặc

lá phân lập thu được đã được tiến hành trong phòng thí nghiệm

Theo kết quả nghiên cứu của Day và CS, 1992; Onsando năm 1992;Mguni, 1996; Massomo, 2002) cho rằng vi khuẩn vàng lá đen gân tồn tại tronghạt Nếu lô hạt giống nhiễm bệnh ở mức 0.05% thì tỷ lệ bệnh phát sinh thể ở

mức cao (Schaad et al., 1980) Năm 1989, Schaad đã phân lập được vi khuẩn Xathomonas campestris từ hạt giống (Schaad năm 1989; Franken, 1992) Theo

Mguni et al (1999), việc sử dụng nguồn carbon mô hình trong hệ thống nhận

dạng vi sinh vật là cách nhận biết được các chính xác và là phương pháp nhanh

chóng xác định sự khác biệt giữa các chủng trong loài vi khuẩn X campestris từ

đó làm tăng độ tin cậy trong việc chẩn đoán, nghiên cứu dịch tễ học và kiểmsoát bệnh khuẩn vàng lá đen gân

Ngoài ra, loài X campestris gây bệnh vàng lá đen gân có thể tồn tại trên

và trong cỏ dại họ cải, chúng có thể đóng vai trò như là một trong những hìnhthức bảo tồn nguồn bệnh, đặc biệt là các khu vực cỏ dại tồn tại quanh năm(Kuan và cs, 1986 ; Schaad và Dianese 1981) Theo Kocks và Zadoks (1996)thì tàn dư ngoài đồng ruộng sau khi thu hoạch cũng có thể trở thành nơi trú ngụcủa loài vi khuẩn này

Trong một nghiên cứu của Shelton và Hunter vào năm 1985, họ đã dùng

bọ chét bắp cải (Phyllotreta Cruciferae - thuộc Bộ cánh cứng Coleoptera) rải

cùng với vi khuẩn X campestris để chứng minh loài côn trùng này có khả năng

truyền bệnh vi khuẩn thối đen này, nhưng chúng không phải là vector truyềnbệnh hiệu quả bởi sau đó chúng quay lại ăn lá cây bị bệnh một cách tự nhiên

Theo Alvarez (2000), bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân đã trở thành bệnhhại phổ biến làm ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng của giống cải bắp

(Brassica oleracea var capitata) trồng ở Châu Phi, đặc biệt là trong điều kiện thời tiết ấm áp và vào mùa mưa Theo Zhao et al (2000), bệnh vàng lá đen gân

do vi khuẩn X campestris gây ra thiệt hại nặng nề cho các vùng trồng rau họ thập tự tại bang Oklahoma, Hoa Kỳ Ở Argentina, vi khuẩn X campestris là tác

nhân gây bùng phát thành dịch trên cây cải ngọt (Gaetan và Lopez, 2005)

Các tác nhân gây bệnh thối đen cây họ thập tự đã được phân lập và xác

định rõ ràng (Ignatov et al, 1998; Vicente et al, 2001) Tuy nhiên, thông tin về

sự xuất hiện và phân bố của các chủng vi khuẩn X campestris gây bệnh trên hạt

giống thương mại còn khan hiếm

2.1.2 Triệu chứng bệnh

Theo kết quả nghiên cứu của Alvarez (1994), triệu chứng ở cây được lây

bệnh ở giai đoạn lá mầm ở dạng các vệt hoại tử Triệu chứng điển hình của bệnhvàng lá đen gân là do nhiễm vi khuẩn, các mô bị nhiễm biến màu từ xanh nhạtsang màu vàng và sau đó chuyển sang màu nâu và chết Triệu chứng có thể xuấthiện ở bất kỳ giai đoạn sinh trưởng nào của cây trồng Các mạch dẫn trong lá bịnhiễm bệnh sẽ chuyển sang màu thâm đen, thân và rễ đôi khi trở thành màu đen(Mohammad, 1999; Alvarez, 2000).

Trong cây súp lơ, rất nhiều vết nứt màu nâu tương tự với những đốm láchè có thể xuất hiện Toàn bộ lá có thể chuyển sang màu vàng hoặc héo và cuốicùng rơi xuống mặt đất Đôi khi, các cây bị ảnh hưởng có thân cây phát triển vớimột bó lá ở phía trên (Sherf và MacNab, 1986) Ở một số giống mẫn cảm, đôikhi xuất hiện triệu chứng nhiễm bệnh trên thân, gây ra hiện tượng đen bên trongcác mô mạch dẫn làm cây lùn, héo hoặc phát triển không đều hoặc xoắn (Goto,1992) Các triệu chứng thối rữa gây ra bởi vi khuẩn thối đen được đặc trưng bởi

sự xuất hiện của các vùng màu vàng nâu đến đen trên rìa bề mặt bu lông thường

đi kèm với bùn vi khuẩn trong thời tiết ướt và ẩm Sự thối rữa lan ra phía dướinền của các cành hình thành màu nâu sẫm và các vệt đen Các vùng bị ảnh

hưởng có thể nằm ở gần khu vực ngã rẽ (Shyam et al., 1994) Trên súp lơ, bệnh

thường xuất hiện trên những chiếc lá gần trên Lá cải bắp và súp lơ nhiễm vi

khuẩn X campestris thường còi cọc, lá chuyển sang màu vàng nâu, héo, gân lá

chuyển sang màu thâm đen, trong trường hợp bệnh nặng cây có thể chết(Mohammad, 1999; Alvarez, 2000)

Ở những cây non được nuôi cấy từ các hạt bị nhiễm bệnh, cho thấy sự đổimàu tối ở mép lá mầm mà sau đó biến thành màu đen, héo và rụng (Matsumoto,1975) Ở cây già nhiễm bệnh thường xảy ra từ lá dưới thông qua lỗ hở tự nhiên Những thương tổn lớn, màu vàng đến nâu sẫm tạo thành dọc theo lề của lá dưới.Cây nhiễm bệnh có triệu chứng vết bệnh điển hình dạng chữ “V” Các tổnthương ban đầu được bao quanh bởi một khu vực màu xanh lá cây nhợt nhạt,khô héo Khi tiến triển của bệnh, các mạch chuyển màu nâu đậm sang màu đenvới một quầng vàng hẹp (Goto, 1992) Có thể quan sát được sự co lại của lá và

sự phân huỷ, biến dạng của cây trồng (Matsumoto, 1975) Các vết bệnh có thểxuất hiện với tình trạng khô, trung tâm vết bệnh màu nâu Một mạng lưới cáctĩnh mạch màu đen hoặc nâu có thể xuất hiện (tùy thuộc vào giống cây trồng vàchủng vi khuẩn) trong các vết bệnh

Tên thối đen bắt nguồn từ sự xuất hiện của các tĩnh mạch đen, sự thối rữacủa cây trồng (Schaad và Thaveechai, 1983) Khi cắt gân lá có thể thấy rõ sự đổimàu nội bộ của các mô mạch dẫn Các đốm có màu vàng hoặc “đốm nhạt”(Cook và cộng sự, 1952, Alvarez và cộng sự, 1994) có thể xuất hiện trên lá nontrước khi xuất hiện các triệu chứng thông thường như héo và mạch dẫn biến đen.Các triệu chứng xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn cây con cho đến khi ra hoa

Sự nhiễm bệnh trên cây thường dẫn đến sự nhiễm bệnh của các hạt giống (Cook

và cộng sự, 1952)

Hình 2.1: Các mạch dẫn biến màu trong thân cây cải bắp bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh

vàng lá đen gân

(Nguồn ảnh: Michael Celetti - Kristen Callow, internet)

Hình 2.2: Các mạch dẫn biến màu trong lá cây cải bắp bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh vàng

lá đen gân

(Nguồn ảnh: Michael Celetti - Kristen Callow, internet)

Sau khi vi khuẩn xâm nhập và di chuyển đến các mô mạch dẫn sẽ gây ratổn thương cho hệ thống mạch dẫn và tạo cơ hội tốt để tác nhân gây bệnh thối

mềm như loài Pectobacterium carotovorum (trước đây còn có tên gọi là Erwinia carotovora) và Pseudomonas marginalis tấn công và gây hại (Williams, 1980;

Mohammad, 1999; Alvarez, 2000)

2.1.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân Xanthomonas campestris hại rau họ hoa thập tự

2.1.3.1 Phương pháp chẩn đoán vi khuẩn bằng kỹ thuật lam ép

Từ các mẫu lá bệnh thu thập trên đồng ruộng, sau đó khử trùng bề mặt lábệnh bằng cồn 70% và chọn những vết bệnh điển hình bằng dao mổ đã vô trùng.Cắt ngang vết bệnh và đặt vào giọt nước cất vô trùng trên lam kính, sau đó quan

sát dịch vi khuẩn trên kính hiển vi (Schaad et al., 2001).

Phương pháp phân ly, nuôi cấy vi khuẩn X campestris trên môi trường

nhân tạo Khuẩn lạc màu vàng nhầy, không đều và có thể giữ nguồn bằng nướccất vô trùng để trong nhiệt độ thấp

2.1.3.2 Các phương pháp chẩn đoán khác

Ngoài các phương pháp thông thường dùng trong chẩn đoán, giám định vikhuẩn gây bệnh vàng lá đen gân hại cây rau họ thập tự, hiện nay trên thế giới đãứng dụng các kỹ thuật phân tử để phát hiện nhanh chóng và chính xác tác nhângây bệnh như phương pháp phân tích FAME (fatty acid methyl ester), SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate polyacryamide gel electrophoresis), rep-PCR

(Repetitive-element polymerase chain reaction), PCR, Dot-Blot,… (Chitarra et al., 2002; Massomo et al., 2003; Park et al., 2004; Berg et al., 2006; Simões et al., 2007, Zaccardelli et al., 2007; Lema et al., 2012).

2.1.4 Nguyên nhân gây bệnh

Bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân do vi khuẩn Xanthomonas campestris gây

ra Về phân loại, vi khuẩn Xanthomonas campestris thuộc (CABI, 2012):

Giới : Bacteria

Bộ : Xanthomonadales

Họ : Xanthomonadaceae

Chi : Xanthomonas

Loài : Xanthomonas campestris

Dạng chuyên hóa: Xanthomonas campestris pv campestris

Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv.campestris còn có tên gọi khác là

(CABI, 2012):

Bacillus campestris Pammel (1895)

Pseudomonas campestris (Pammel) Smith (1897)

Bacterium campestris (Pammel) Chester (1897)

Phytomonas campestris (Pammel) Bergey (1923)

Xanthomonas campestris pv campestris (Dowson) Dye et al (1980).

Các tác giả trên thế giới thường sử dụng thuật ngữ chủng để chỉ các

isolate vi khuẩn X campestris khác nhau về bất cứ đặc điểm nào như nguồn gốc

phân lập, hình thái, sinh học, sinh thái và di truyền Chủng (strain) của vi khuẩn

X campestris khác nhau tùy thuộc vào cây ký chủ, phân bố, độc tính, mối quan

hệ dịch tễ và đặc tính sinh lý của vi khuẩn (Alvarez, 1994) Bên cạnh phươngpháp truyền thống xác nòi dựa vào phạm vi ký chủ và dựa vào phản ứng sinhhóa, nhờ thành tựu của sinh học phân tử, ngày nay phân tích ADN trở thànhphương pháp chính xác và phù hợp để xác định chủng nhiều loại ký sinh, trong

đó có các nòi, chủng của vi khuẩn X campestris gây bệnh vàng lá đen gân hại

cây họ thập tự

Vi khuẩn X campestris là loài vi khuẩn có dạng hình gậy, thuộc gam âm

hiếu khí, kích thước 0,4-0,5 x 0,7-3 µm, có một lông roi ở đầu, có vỏ nhờn, hảokhí, khuẩn lạc màu vàng, phân giải rất chậm gelatin theo Schaad (1988), phân

giải đường glucose, lactose, saccharose tạo ra axit yếu, phân giải tinh bột,

không có khả năng khử nitrate, có khả năng tạo khí indole, H2S và NH3, catalase

dương tính và oxidase âm tính, vi khuẩn phát triển ở 35°C sản xuất Levan, cókhả năng tạo H2S, thủy phân Tween 80, gelatin, esculin có khả năng tạo indol vàphát triển ở 35°C và không phát triển trên môi trường TTC 0.1% và 0.02% Vi

khuẩn sản sinh axit từ đường arabinose, arginine, dulcitol, galactose, d-glucose, maltose, mannose, sorbitol, sucrose (Schaad, 1988; Schaad et al., 2001).

Theo Vicente et al (2001, 2006), Fargier và Manceau (2007) cho biết, bằng phân tích ADN qua phương pháp RFLP đã xác định vi khuẩn X campestris được xếp vào 3 nhóm độc tính gây 3 loại bệnh khác nhau trên cây

rau họ thập tự gồm:

i) Loài Xanthomonas campestris gây vàng lá đen gân.

ii) Loài X campestris pv raphani gây bệnh đốm lá

iii) Loài X campestris pv incanae gây bệnh cháy lá.

Vi khuẩn X campestris bao gồm có 6 nòi (race) từ nòi 1 đến nòi 6, trong

đó, nòi 1 và nòi 4 là các nòi quan trọng đối với cây cải bắp Brassica oleracea và các nòi này phân bố rộng rãi ở các vùng trên thế giới (Vicente et al., 2001, Taylor et al., 2002, Ignatov et al., 2007) Cho đến thời gian gần đây, nòi 7 của vi khuẩn Xanthomonas campestris cũng đã được xác định (Fargier và Manceau, 2007; Jensen et al., 2007, 2010) Tác giả Fargier và Manceau (2007) còn đưa ra

nòi 8 và nòi 9 vào hệ thống phân loại đối với các mẫu phân lập có phổ ký chủ

hẹp Theo Bila et al (2013), nòi 1 của vi khuẩn X campestris gây hại trên nhiều

cây họ hoa thập tự tại Mozambique

Toàn bộ genome của vi khuẩn X campestris đã được giải mã thành

công, đăng ký trên Ngân hàng Gen (GenBank) với các mã số NC_003902,

đoạn sinh trưởng Ban đầu triệu chứng xuất hiện làm đen dọc theo rìa của lá mầm.Sau đó, lá mầm héo và rụng, nhưng chỉ sau khi các vi khuẩn đã xâm nhập vào lánon và thân cây Cây con bị bệnh chuyển sang màu vàng nâu, héo và chết Các vikhuẩn thường gặp nhất xâm nhập vào cây thông qua lỗ khí khổng ở mép lá Kếtquả là lá cây héo, hình chữ “V” khu vực bị nhiễm bệnh nhỏ mà mở rộng vào phíatrong từ mép lá về phía gân chính làm đen gân.

Vi khuẩn xâm nhập vào cây, lá thông qua vết thương tổn gây ra bởi côntrùng, qua mưa, hoặc qua vết thương cơ giới khác, bệnh mở rộng và tiến vềtrong gân lá, chuyển sang màu vàng nâu và khô Gân lá bị nhiễm bệnh, thân và

rễ chuyển sang màu đen Vi khuẩn lây lan qua các gân lá vào thân Một mặt cắtngang điển hình của một thân cây bị nhiễm bệnh hoặc cuống lá cho thấy mộtvòng đen do vi khuẩn xâm nhập vào gân lá Cây bị ảnh hưởng có thể nhanhchóng thối trước khi hoặc sau khi thu hoạch do các sinh vật mềm mục nát thứcấp Vi khuẩn mềm thối thường xâm nhập tổn thương đen thối, có mùi hôi.(Mohammad, 1999; Alvarez, 2000)

Phạm vi nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát triển và phát triển triệu chứng

là từ 25°C đến 30°C, tốc độ tăng trưởng chậm hơn được quan sát thấy ở nhiệt

độ thấp như 5°C và đến 35°C Tuy nhiên dưới 18ºC các cây bị nhiễm bệnh vẫnxuất hiện các triệu chứng điển hình Độ ẩm, trời có sương, sương mù, hay mưa

là điều kiện thuận lợi cho khả năng lây và phát triển bệnh Trong điều kiện tối

ưu, cây nhiễm bệnh sẽ xuất hiện các triệu chứng sau 7 - 14 ngày Ở nhiệt độ

thấp, các triệu chứng sẽ phát triển chậm hơn (Miller et al., 1996; Mohammad,

1999; Alvarez, 2000)

Điều kiện ấm áp và ẩm ướt tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn và sự

phát triển của bệnh Độ ẩm là điều kiện cần thiết để vi khuẩn X campestris xâm

nhập vào cây qua các lỗ khí khổng Vào mùa xuân, khi cây giống xuất hiện, vikhuẩn di chuyển trực tiếp từ lá mầm vào lá non hoặc thông qua các lỗ khí Các

vi khuẩn di chuyển cho đến khi vào mô mạch và từ đó lan rộng ra Mầm bệnh

lây lan từ cây này sang cây khác bằng nước tưới, thiết bị nông nghiệp, côn trùng

và các động vật khác, chẳng hạn như súp lơ, trực tiếp thông qua khí khổng(Mohammad, 1999)

Vi khuẩn tồn tại trong hạt giống cây trồng, các tàn dư còn lại trên đồngruộng và trên nhiều loại cỏ dại gồm: mù tạt đen, mù tạc, su hào, súp lơ, cải

xoong (Mohammad, 1999; CABI, 2012; Vicente et al., 2012) trong thời gian hai

năm (Alvarez, 2000; Köhl và van der Wolf, 2005) nhưng không thể tồn tại quá 6tuần trong đất

Việc sử dụng hạt giống sạch bệnh có ý nghĩa quan trọng đối với sự phát sinhgây hại của bệnh vàng lá đen gân, một số kết quả thí nghiệm đã cho biết mức độlây nhiễm ban đầu là 0.5 có thể tăng lên 65% chỉ trong vòng ba tuần nếu lô hạt

giống bị nhiễm bệnh (Williams, 1980; Mohammad, 1999) Vi khuẩn X campestris

có thể lây lan từ hạt giống và tỷ lệ nhiễm là 0.03% Theo kết quả nghiên cứu của

Roberts et al (2007), sự lây lan của vi khuẩn gây bệnh vàng lá đen gân hại cây rau

họ thập tự có thể nhanh đến mức trong một thí nghiệm gần như 100% các cây cấyghép đã bị nhiễm khuẩn trong một khối 15 khay (xấp xỉ khoảng 4.500 cây) trongsáu tuần sau khi gieo từ một cây lây nhiễm chính duy nhất

Vi khuẩn X campestris là loài còn có khả năng tồn tại trong đất, lan

truyền nhờ nước tưới, nước mưa, gió bụi, qua hạt giống, côn trùng môi giới,tuyến trùng và qua dụng cụ chăm sóc, (CABI, 2012)

2.1.6 Biện pháp phòng chống bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cây rau họ hoa thập tự

Cho đến hiện nay đã có nhiều chiến lược phòng chống bệnh vàng láđen gân ở các nước trên thế giới đã được triển khai, nhưng trên thực tế bệnhvàng lá đen gân vẫn không nằm trong tầm kiểm soát của con người bởi nhiềuyếu tố như cây trồng, điều kiện kinh tế xã hội, điều kiện tự nhiên…Việc áp dụngbiện pháp phòng chống bệnh vàng lá đen gân riêng rẽ sẽ không mang lại hiệuquả như mong muốn Để phòng chống bệnh có hiệu quả thì phải áp dụng các

biện pháp phòng trừ tổng hợp, kết hợp hài hòa các biện pháp như chọn và dùnggiống kháng bệnh, biện pháp canh tác, biện pháp hóa học,…(CABI, 2012).

2.1.6.1 Biện pháp canh tác

Biện pháp canh tác một trong những biện pháp được coi là mang lại hiệuquả kinh tế nhất trong phòng chống bệnh vàng lá đen gân Việc áp dụng các biện

pháp luân canh cây trồng không phải là cây ký chủ của vi khuẩn X campestris

đặc biệt là với cây trồng nước được coi là một biện pháp hữu hiệu trong việcgiảm mật độ vi khuẩn tồn tại trong đất và tàn dư cũng như giúp hạn chế tối đanguồn bệnh từ vụ trước Biện pháp xen canh cũng đem lại hiệu quả trong phòngchống bệnh vàng lá đen gân vi khuẩn Thường xuyên vệ sinh đồng ruộng, nhặt

bỏ tàn dư cây bệnh và cây ký chủ của vi khuẩn gây bệnh (Taylor et al., 2002; Seebold et al., 2008).

2.1.6.2 Biện pháp sử dụng giống kháng bệnh

Là một trong những biện pháp được coi là mang lại hiệu quả kinh tế nhấttrong phòng chống bệnh vàng lá đen gân Trên thế giới, việc chọn lọc và pháttriển các giống kháng trong việc kiểm soát bệnh vàng lá đen gân đã thu đượcnhiều thành công Tuy nhiên, sự biểu hiện tính kháng chịu ảnh hưởng rất nhiềucủa các nhân tố môi trường như nhiệt độ, ẩm độ đất, lượng mưa, chu kỳ sáng, Các nguồn phổ biến nhất và có khả năng hữu ích của kháng bệnh vàng lá đen

gân xảy ra trong hệ gen cải bắp khác bao gồm Brassicaceae rapa, Brassicaceae nigra, Brassicaceae napus, Brassicaceae carinata và Brassicaceae juncea Sử dụng các giống cải bắp có khả năng kháng bệnh như Tenacity, Gideon, Gloria

(Shimelis, 2005) Tuy nhiên, rất khó để đạt được tính kháng một cách bền vữngtrong điều kiện nhiệt độ cao, ẩm ướt ở vùng nhiệt đới gió mùa

2.1.6.3 Biện pháp hóa học

Trong phòng chống bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân X campestris, thì biện

pháp hóa học không hiệu quả Việc sử dụng các chế phẩm kháng sinh được coi

là biện pháp triển vọng thay thế việc dùng các loại thuốc hóa học Tuy nhiên, sử

dụng các loại thuốc kháng sinh dễ tạo ra các dạng, chủng vi khuẩn mới khángthuốc Hơn nữa, giá thành thuốc kháng sinh cao là một trở ngại lớn cho việc ứngdụng rộng rãi.

Theo Gopalakrishnan và Artal (2013), sử dụng streptocycline (nồng độ

100 ppm) để xử lý hạt giống và dùng kết hợp streptocycline (nồng độ 100 ppm)+ copper oxychloride (nồng độ 0.3%) để phun có hiệu quả phòng trừ bệnh Theo

Krauthausen et al (2011), phun chlorine dioxide (ClO2), benzoic acid và copper hydroxide cũng có hiệu quả phòng trừ cao Hiện nay, nhiều hóa chất khác nhau được sử dụng để xử lý hạt giống như sodium hypochlorite, hydrogen peroxide, acetate cupuric và sulfat kẽm.Thuốc kháng sinh và các hợp chất đồng đều được

sử dụng nhưng các tùy chọn kiểm soát dịch bệnh hiệu quả được giới hạn với

thuốc trừ vi khuẩn trên đồng (Balestra et al, 2009) Tuy nhiên, việc sử dụng các

hóa chất tổng hợp ngày càng hạn chế vì dư luận quan tâm hơn đến dư lượng tồn

dư độc hại có thể có gây hại cho sức khỏe con người và gây ô nhiễm môi trường

(Rahman et al., 2008).

Ngoài ra còn một số biện pháp khác nhằm hạn chế sự phát sinh, phát triểncủa bệnh như vệ sinh đồng ruộng, thu hạt giống khỏe, sạch bệnh trên những câytrồng không bị nhiễm bệnh để giống, xử lý hạt giống trước khi gieo trồng Vikhuẩn gây bệnh vàng lá đen gân có thể tồn tại trên và trong hạt Xử lý nướcnóng có thể được sử dụng để tiêu diệt các vi khuẩn có thể xâm nhiễm vào tronghạt giống Đối với cải bắp và cải bruxen, ngâm hạt giống trong 25 phút ở 50°C,cải thảo, bông cải xanh, súp lơ, cải xoăn, su hào, củ cải, ngâm trong 20 phút ở50°C nước Mù tạc, cải xoong và củ cải ngâm trong nước 50°C trong 15 phút

(Seebold et al., 2008). Kiểm soát chính xác nhiệt độ và thời gian là rất quantrọng, nhưng hạt giống có thể bị hỏng do tác nhân gây bệnh có thể không được

loại bỏ hoàn toàn (Nega et al,2003).

Dùng các vi khuẩn đối kháng như Bacillus subtilis R14, B pumilus C116, B.megaterium pv.cerealis RAB7 và B.cereus C210, cũng có tác dụng

hạn chế tác hại của bệnh (Luna et al., 2002; Massomo et al., 2004)

Trong các biện pháp phòng chống bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân X campestris, thì biện pháp hóa học sử dụng không mang lại hiệu quả mong muốn.

Bên cạnh đó,việc sử dụng các chế phẩm kháng sinh được coi là biện pháp triểnvọng thay thế thuốc hóa học Tuy nhiên, dùng các kháng sinh dễ tạo ra các dạng,chủng vi khuẩn mới kháng thuốc

2.2 Những nghiên cứu trong nước

Thực tiễn sản xuất ở những vùng trồng rau họ hoa thập tự cho thấy bệnhvàng lá đen gân phát sinh, phát triển và gây hại ảnh hưởng tới quá trình sinhtrưởng, phát triển, năng xuất và cũng như chất lượng sản phẩm Tuy nhiên chưa

có nhiều nghiên cứu về tác nhân gây bệnh và phòng chống bệnh

Trên cây cải bông và một số loại rau ăn lá như cải thìa, cải xanh, cải ngọt

thì bệnh đốm lá do vi khuẩn Xanthomonas spp gây nên thường xuất hiện trong

vụ Đông Xuân, trên cây cải bông, bệnh đốm lá xuất hiện nhiều hơn so với cácgiống cải khác (Trần Thanh Tùng, 1997)

Theo Mai Thị Vinh (1998), bệnh đốm lá cải bông do vi khuẩn

Xanthomonas spp gây nên Triệu chứng bệnh ban đầu là các đốm vàng nhỏ,

màu sáng ở các lá thấp gần phía mặt đất, bệnh thường gây hại nặng vào gần cuối

vụ thu hoạch, tỷ lệ bệnh ở trên đồng ruộng ở giai đoạn phát triển thân lá đạtkhoảng 21%, nhưng ở giai đoạn ra bông, tỷ lệ bệnh có thể lên đến 50%

Theo kết quả nghiên cứu khoa học bvtv số 2/2008 do Trần Văn Kỳ, LêĐình Đôn Viện KHKTNN Miền Nam kết luận bệnh vàng đen gân hại cây rau

họ hoa thập tự là do vi khuẩn X campestris gây ra, thuộc nhóm Gram âm, khuẩn

lạc tròn, lồi, rìa nhẵn, màu vàng trên môi trường PDA và YDC Hóa lỏnggelatin, phân huỷ protein, tạo axít từ các đường glucose, arabinose và manose

Vi khuẩn thuộc nhóm ưa nhiệt trung bình, nhiệt độ thích hợp từ 25 - 35°C, sinhtrưởng chậm dưới 20°C, ngừng sinh trưởng từ 40C trở lên Theo Lê Lương Tề

và Vũ Triệu Mân (1999), đại bộ phận vi khuẩn có nhiệt độ thích hợp từ 20 30°C, tối đa khoảng 35 - 37°C Như vậy, vi khuẩn gây bệnh vàng lá đen gânthuộc nhóm ưa nhiệt trung bình Theo Schaad (1988), vi khuẩn gây bệnh cây

-thuộc loại (chi) Xanthomonas gồm 3 loài campestris, albilineans và axonopodis

có khả năng sinh trưởng phát triển ở nhiệt độ 35°C Do đó, loài vi khuẩn gâybệnh vàng lá đen gân có thể là một trong 3 loài trên gây bệnh Sự hoá lỏnggelatin của vi khuẩn sau 48 giờ nuôi cấy ở điều kiện 25°C và khi nhuộm môitrường bằng dung dịch HgCl2 thì vòng phân giải trong suốt xuất hiện xung

quanh khuẩn lạc của vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt và dòng đối chứng X campestris Như vậy, đã xảy ra phản ứng hoá lỏng gelatin Theo Schaad (1988), trong các loài vi khuẩn gây bệnh cây giống Xanthomans, chỉ có 2 loài Xanthomonas campestris và Xanthomonas fragariae gây hoá lỏng gelatin

Năm 2007, theo Lê Lương Tề và cộng sự thì bệnh vàng lá đen gân là do

vi khuẩn X campestris gây nên Vi khuẩn gây bệnh có hình gậy ngắn, kích

thước 0.4 -0.5 x 0.7 - 3 m, có một lông roi ở đầu, có vỏ nhờn, háo khí, khuẩnlạc màu vàng, phân giải rất chậm gelatin, phân giải đường glucose, lactose,saccharose tạo ra axit (yếu), phân giải tinh bột, không có khả năng khử nitrat, cókhả năng tạo indol, H2S và NH3 Để phòng chống bệnh này có nhiều biện phápđược áp dụng như : Vệ sinh, thu dọn sạch tàn dư cây bệnh, cày lật gốc cải bắp sauthu hoạch, tiêu diệt cỏ dại họ hoa thập tự ven bờ ruộng, sử dụng giống khoẻ vàsạch bệnh, xử lý hạt giống trước khi gieo, bón phân kali làm tăng sức chống chịubệnh

Theo Kim Ngọc Qúy (2015 ), bệnh vàng lá đen gân do vi khẩn X campestris

hại cây bắp cải, cải thảo, su hào, súp lơ trắng và súp lơ xanh ở tất cả các giai đoạnsinh trưởng của cây từ cây con cho đến thu hoạch, bệnh gây hại nặng từ giai đoạncuộn, ra hoa hoặc hình thành củ cho đến khi thu hoạch, đây là giai đoạn cây mẫncảm với bệnh nên bệnh dễ xâm nhiễm và gây hại nặng

Từ những nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước, chúng tôi

nhận thấy rằng vi khuẩn X campestris là một loài vi khuẩn gây hại trên cây rau

họ hoa thập tự, gây ảnh hưởng và nhiều thiệt hại cho sản xuất nông nghiệp Nhất

là ở nước ta, hiện nay bệnh vẫn chưa được quan tâm và nghiên cứu nhiều Vìvậy nghiên cứu về vi khuẩn bệnh vi khuẩn vàng lá đen gân hại cây rau họ hoathập tự là vấn đề cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn

PHẦN III : VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

Loài vi khuẩn Xanthomonas campestris pv campestris gây bệnh vàng lá

đen gân hại rau họ hoa thập tự tại Gia Lâm, Hà Nội và phụ cận

3.2 Vật liệu nghiên cứu

- Cây kí chủ: Một số cây trồng thuộc họ hoa thập tự tại Gia Lâm, Hà Nội

và phụ cận như: cải bắp, súp lơ xanh, súp lơ trắng, su hào,

- Môi trường nuôi cấy:

+ Môi trường SPA (Sacarose - Peptone - Agar) (Hayward, A C, 1960).+ Môi trường PGA (Potato - Glucose - Agar)

+ Môi trường PPSA (Potato – Peptone – Sacarose – Agar)

- Vi sinh vật đối kháng : Bacilus subtilus do bộ môn Bệnh cây cung cấp.

- Một số dụng cụ trang thiết bị thiết yếu khác phục vụ cho nghiên cứu tạiphòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệpViệt Nam

- Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm bao gồm:

+ Tủ lạnh, tủ định ôn, buồng cấy, nồi hấp, kính hiển vi, kính soi nổi, bếpđiện, lò vi sóng, cân điện tử, cân bàn

+ Đĩa petri, que cấy vi khuẩn, các loại cốc thủy tinh, ống đong, bình đựngnước, dao, kéo, đèn cồn, đũa thủy tinh, panh, khay đựng, túi nilon

- Hóa chất: Aga, Pepton, Sacaro, Glucose, Mg(SO4).7H2O, KH2PO4,Ca(NO3)2 Pb(CH3COO)2.3H2O, (C6H10O5)n.xH2O, quỳ tím, dung dịch Chì -acetat,thuốc thử Oxidase, dung dịch oxy già (H202), dung dịch Acid sulfanilic,acid acetis loãng 10%, thuốc thử Griess, dung dịch KOH 3%…

- Thuốc kháng sinh: Cloramphenicol 0.04%, Gentamicin 0.04%,Streptomycin 0.04%

3.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Các vùng trồng rau họ hoa thập tự tại Gia Lâm, Hà Nội và phụ cận.+ Nhà lưới Khoa Nông Học- Học Viện Nông Nghiệp Hà Nội

+ Phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nôngnghiệp Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu: 01/2017 – 07/2017

3.4 Nội dung nghiên cứu

- Điều tra diễn biến bệnh vàng lá đen gân trên một số cây cải bắp, su hào, súp

lơ xanh, súp lơ trắng vụ đông xuân tại Gia Lâm, Hà Nội và phụ cận năm 2017

- Phân li nuôi cấy, nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, đặc tính sinhhọc của các isolate vi khuẩn trên các cây ký chủ

- Nghiên cứu tính gây bệnh, tính độc của các isolate vi khuẩn X campestris.

- Khảo sát hiệu lực ức chế của một số thuốc kháng sinh với các isolate vi

khuẩn X campestris trên môi trường nhân tạo.

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp điều tra bệnh ngoài đồng ruộng

Điều tra bệnh hại cây trồng theo QCVN 01-38: 2010/BNN & PTNT, doBan soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiệndịch hại cây trồng biên soạn Cục Bảo vệ thực vật trình duyệt, Bộ Nông nghiệp

và PTNT ban hành tại Thông tư số71/2010/TT-BNNPTNT ngày 10 tháng 12năm 2010

* Điều tra diễn biến bệnh

Chọn cây ký chủ đại diện để điều tra trên các ruộng khác nhau, một ruộngđiều tra theo 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 5 cây Đếm toàn bộ số lạ bị bệnh trêntổng số lá điều tra Cố định điểm điều tra Điều tra định kỳ 7 ngày một lần

3.5.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

* Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn

- Phương pháp phân lập vi khuẩn theo Bradbury (1970)

Từ những vết bệnh thu thập được ngoài đồng ruộng, chúng tôi tiến hànhkiểm tra xác định sơ bộ tác nhân gây bệnh

Chọn những mẫu bệnh mới, vết bệnh trung bình, điển hình sau đó rửasạch Chuẩn bị dụng cụ: dao, panh, giấy thấm vô trùng, que cấy vi khuẩn, cốcthủy tinh đựng cồn 70%, nước cất, bàn thái

Khử trùng buồng cấy bằng cồn 70% Nhúng panh và dao mổ trong cồn

70% và hơ trên ngọn lửa đèn cồn Đồng thời nhúng nhanh mẫu bệnh vào cồn70%, rửa lại trong nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng.

Khử trùng một lam kính và nhỏ một giọt nước vô trùng lên lam, nhẹnhàng lau khử trùng bề mặt lá bằng giấy thấm cồn

vi khuẩn thuần và giữ nguồn

* Cấy truyền vi khuẩn

Chọn đĩa petri có nguồn vi khuẩn, tiến hành khử trùng que cấy vi khuẩn.Sau đó dùng que cấy và cấy vi khuẩn từ đĩa petri có nguồn vào đĩa petri có môitrường mới Cấy thuần nhằm tạo nguồn bệnh vi khuẩn cho thí nghiệm nhà lưới

* Môi trường để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng 4 loại môi trường nhân tạogồm: SPA (saccaro pepton agar), PGA (Potato glucose agar), PPSA (potatopepton saccaro agar), King’s B

- Môi trường SPA:

Thành phần: Agar 20g, đường Saccaro 20g, nước cất 1000ml, Pepton 5g,Mg(SO4).7H2O 0.25g, KH2PO4 0.5g

Cách điều chế: Khi đun sôi 1000ml nước cất thì cho từ từ các hóa chất

Agar 23g, đường Sacaro 20g, nước cất 1000ml, Pepton 5g, Mg(SO4).7H2O0.25g, KH2PO4 0.5g vừa cho vừa khuấy đều, nhẹ nhàng cho dung dịch hòa tanđồng thời đun sôi Môi trường được cho vào bình tam giác sau đó hấp khử trùng

ở 1210C trong thời gian 45 phút, để nguội 55 - 600C trước khi rót vào đĩa petri

đã được khử trùng

- Môi trường PGA:

Thành phần: Khoai tây 200g, agar 20g, đường glucose 20g

Cách điều chế: Khoai tây rửa sạch, thái nhỏ kích thước 1 x 2 x 1 cm chovào nồi chứa 1000ml nước cất đun sôi, sau khi đun sôi được 20 phút thì lọc lấyphần nước, bổ sung thêm nước cho đủ 1000ml Cho từ từ 20g agar, 20g đườngsaccaro vào dung dịch nước trên, khuấy nhẹ nhàng cho đến khi dung dịch đượchoà tan đồng thời đun sôi Môi trường được cho vào bình tam giác sau đó hấpkhử trùng ở 1210C trong thời gian 45 phút, để nguội 55 - 600C trước khi rót vàođĩa petri đã được khử trùng

- Môi trường PPSA:

Thành phần: Khoai tây 200g, agar 20g, đường Saccaro 20g, nước cất 1000ml,Pepton 5g, Mg(SO4).7H2O 0.25g, KH2PO4 0.5g, Ca(NO3)2 0.2g

Cách điều chế: Khoai tây rửa sạch, thái nhỏ kích thước 1 x 2 x 1 cm chovào nồi chứa 1000ml nước cất đun sôi, sau khi đun sôi được 20 phút thì lọc lấyphần nước, bổ sung thêm nước cho đủ 1000ml Cho từ từ 20g agar, đườngsaccaro 20g, nước cất 1000ml, pepton 5g, Mg(SO4).7H2O 0.25g, KH2PO4 0.5g

và Ca(NO3)2 0.2g vào dung dịch nước trên khuấy nhẹ tay cho dung dịch hòa tanđồng thời đun sôi Môi trường được cho vào bình tam giác sau đó hấp khử trùng

ở 1210C trong thời gian 45 phút, để nguội 55 - 600C trước khi rót vào đĩa petri

đã được khử trùng

- Môi trường King’S B:

Thành phần: Peptone 20g, glycerol 10ml, K2HPO4 1.5g, MgSO4 1.5g, agar 15g,nước cất 1000ml

Cách điều chế: Cho từ từ peptone 20g, glycerol 10ml, K2HPO4 1.5g,

MgSO4 1.5g, agar 15g vào 1000ml nước cất khuấy nhẹ cho dung dịch hoà tanđồng thời đun sôi Môi trường được cho vào bình tam giác sau đó hấp khử trùng

ở 1210C trong thời gian 45 phút, để nguội 55 - 600C trước khi rót vào đĩa petri

đã được khử trùng

3.5.3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn Xanthomonas campestris

Tiến hành nuôi cấy các isolates của vi khuẩn X campestris trên môi

trường nhân tạo (PPSA, King’S B, PSA) ở cùng một ngưỡng nhiệt độ 290C, sau

đó theo dõi sự hình thành, phát triển khuẩn lạc của vi khuẩn, màu sắc bề mặtkhuẩn lạc, sau 24h, 48h và 72h nuôi cấy trên môi trường nhân tạo

3.5.4 Nghiên cứu đặc tính gây bệnh, tính độc của vi khuẩn Xanthomonas campestris

* Lây nhiễm nhân tạo các isolate vi khuẩn Xanthomonas campestris trên các cây kí chủ

Sử dụng các isolate phân lập trên các cây ký chủ nhiễm bệnh : Xc CB

ĐX, Xc CBẹ ĐX, Xc CN` ĐX, Xc SLX – VĐ, Xc SLT – KL, Xc – SH

-ĐX tiến hành lây nhiễm chéo trên các cây ký chủ Lây bệnh nhân tạo bệnh vikhuẩn vàng lá đen gân gây hại trên cây rau họ hoa thập tự theo phương pháp củaViện Bảo Vệ Thực Vật, tuân theo quy tắc Koch

Tiến hành lây nhiễm bệnh nhân tạo bằng 3 phương pháp: Sát thương(tiêm ven), không sát thương và cắt clip Thí nghiệm lây bệnh gồm 3 công thức(CT), mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần lây 6 vết (tổng số vết lây ở mỗi côngthức là 18 vết) Tiến hành quan sát theo dõi số vết phát bệnh trên các cây ký chủsau 7, 14, 21 ngày

Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ bệnh (%) trong điều kiện chậu vại

* Lây nhiễm vi khuẩn Xanthomonas campestris trên hạt giống

Chuẩn bị hạt giống của các cây cải bắp, cải bẹ, cải ngồng Sử dụng 3 isolate

Xc -CB - KL, Xc - CBẹ - ĐX, Xc - CN` - ĐX Tiến hành ngâm hạt giống trực tiếp

vào dịch vi khuẩn trong thời gian 30 phút rồi đem gieo Thí nghiệm gồm 4 công thức(CT) mỗi công thức gồm 90 hạt.

CT1: Đối chứng - ngâm hạt trong nước cất

CT2: Ngâm hạt trực tiếp trong dịch vi khuẩn của isolate cải bắp

CT3: Ngâm hạt trực tiếp trong dịch vi khuẩn của isolate cải bẹ

CT4: Ngâm hạt trực tiếp trong dịch vi khuẩn của isolate cải ngồng

Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ nảy mầm của hạt giống (%) trong điều kiện chậu vại

3.5.5 Nghiên cứu các phản ứng sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn Xanthomonas campestris

* Thử một số phản ứng sinh hóa của các isolate vi khuẩn Xanthmonas campestris

- Phản ứng Oxidase

Làm ướt thanh giấy lọc đã được sấy vô khuẩn từ trước bởi thuốc thử oxidase(tetramethyl-p-phenylenediamine hydrochloride), lấy que cấy đã vô trùng lấy 1khuẩn lạc và quệt lên giấy đã tẩm thuốc thử oxidase

+ Quan sát kết quả trong vòng 10 giây đầu Phản ứng (+) cho kết quả màuxanh tím

- Phản ứng enzyme oxy hóa catalase

Mục đích: Kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh

- Phản ứng tạo H 2 S

Môi trường: Pepton 10g, NaCl 5g, cao thịt 10g, Cystein 0.5g, nước cất 1000ml, pH = 7.0 - 7.4

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4 - 5 ml), khử trùng ở 1210C trong

20 - 30 phút Cắt giấy lọc thành dải rộng 0.5 - 1cm, độ dài tùy thuộc vào ốngnghiệm và độ cao của môi trường Tẩm vào giấy dung dịch Chì - acetatPbCH3(COO)2 , sấy khô giấy trong tủ sấy đặt trong hộp petri và khử trùng Cấy

vi khuẩn mới cấy truyền sau 24 giờ Dùng panh vô khuẩn gắp giấy tẩm chì acetat đưa vào từng ống nghiệm, dài đến nút bông nhưng không chạm vào môitrường Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ thích hợp 28 - 300C, theo dõi và quan sát sựđổi màu của giấy sau 3, 7, 14 ngày Nếu giấy biến đen là phản ứng dương tính,nếu không đổi màu thì là âm tính

Phản ứng tạo NH 3

Môi trường: Peptone 5g, NaNO2 1g, nước cất 1000ml, pH = 7.3 – 7.4Phân môi trường vào các ống nghiệm, khử trùng ở 1210C trong 15 phút.Chuẩn bị thuốc thử Griess:

Dung dịch 1: Acid sulfanilic 0.5g, acid acetic loãng (khoảng 10%) 150ml.Dung dịch 2: Alpha Naphtylamin 0.1g, nước cất 20 ml, acid acetic loãng(khoảng 10%) 150ml

Cấy vi khuẩn, đặt ở 290C trong 1, 3, 7 ngày rồi làm phản ứng xác định.Nhỏ vào dịch nuôi cấy 1 giọt dung dịch 1 và 1 giọt dung dịch 2, lắc nhẹ Nếumất màu đỏ và sinh ra NH3 là kết quả dương tính, nếu vẫn giữ màu đỏ là phảnứng âm tính

- Phản ứng thủy phân tinh bột

Môi trường: Bổ sung tinh bột tan (0.2%) vào môi trường nước thịt pepton,khử trùng ở 1210C trong 20 phút rồi đổ ra đĩa petri

Lấy vi khuẩn mới cây truyền (24 - 72 giờ) cấy vạch hay cấy chấm lên đĩamôi trường Sau 2 - 5 ngày nhỏ thuốc thử Lugol lên vết cấy để quan sát khảnăng phân giải tinh bột Nếu thuốc thử Lugol không bắt màu quanh vết cấy tức

là vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột

- Phản ứng phân giải Arginine

Môi trường Thornley: Pepton 1g, NaCl 5g, K2HPO4 0.3g, Agar 6g, đỏ

Phenol 0.01g, L-Arginat 10g, nước cất 1000ml, pH = 7.0 - 7.2.

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4 - 5 ml), khử trùng ở 1210C trong

15 phút Để 1 ống làm đối chứng không có Arginat Cấy vi khuẩn mới cấytruyền sau 24 giờ, dùng vaselin bịt kín nút ống nghiệm, nuôi ở nhiệt độ thíchhợp 28 - 300C trong 3, 7, 14 ngày để quan sát Môi trường chuyển sang màu đỏ

là dương tính, không chuyển màu là âm tính

* Thử một số phản ứng sinh lý của các isolate vi khuẩn Xanthomonas campestris

Phản ứng Gram của vi khuẩn gây bệnh

Thử KOH 3% để phân biệt vi khuẩn Gram âm và Gram dương theophương pháp nghiên cứu của Gregerson (1978)

Khử trùng buồng cấy, lam kính, que cấy vi khuẩn bằng cồn 70%

Nhỏ 1 giọt KOH 3% vào lam kính, lấy que cấy vi khuẩn đã khử trùng lấy

vi khuẩn ở môi trường đã nuôi cấy cho vào lam đã nhỏ giọt KOH 3%, sau đódùng que cấy vi khuẩn đó ray khuẩn lạc một lúc và khi kéo vi khuẩn lên thấysợi, kết luận vi khuẩn đó có phản ứng Gram (-)

Nhuộm Gram của vi khuẩn gây bệnh ( phương pháp Hucker cải tiến)

- Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet): 2g tím kết tinh hoà tan trong20ml etanol 95% và 0.8g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất Trộn haidung dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc Bảo quản trong lọ tối, sửdụng vài tháng

- Dung dịch Iod: Hoà tan 1g Iod (Iodine) trong 3 - 5ml nước cất, thêm 2g

KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml Bảo quảntrong lọ tối

- Dung dịch tẩy màu: Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95%với 30ml aceton

- Dung dịch nhuộm bổ sung: Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O, 2.5%,trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5, để có dung dịch có nồng độ 0.5%

Dùng que cấy vô trùng lấy một lượng nhỏ vi khuẩn từ đĩa petri (sau khicấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khíbằng cách hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần Nhuộm bằng dungdịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô Nhuộm lại bằng dung dịchIod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô Nhỏ Etanol 95%, giữ khoảng 30 giây (chođến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô Nhuộm bổ sung bằng dung dịchSafranin trong 2 - 3 phút, rửa nước, để khô trong không khí Cuối cùng dùng vậtkính dầu 100 để soi dưới kính hiển vi.

Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ

* Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của khuẩn lạc của các isolate vi khuẩn Xanthomonas campestris

Cấy các isolate phân lập từ các cây kí chủ họ hoa thập tự lên 3 môi trườngPGA, SPA, PPSA, đặt trong điều kiện nhiệt độ 28 - 300C Mỗi môi trường lặplại 3 đĩa petri đối với một isolate

Tiến hành đo đường kính khuẩn lạc vi khuẩn của các isolate được cấy trêncác môi trường sau 24, 48, 72, 96 và 120 giờ

3.5.6 Khảo sát hiệu lực ức chế của một số thuốc kháng sinh với các isolate vi khuẩn gây bệnh vàng lá đen gân Xanthomonas campestris

Thí nghiệm gồm 4 công thức (CT): một CT đối chứng và 3 CT thí nghiệm(mỗi loại thuốc là một công thức với nồng độ 0.04%), mỗi CT nhắc lại 3 lần,mỗi lần nhắc lại 1 đĩa petri

Phương pháp tiến hành: chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường SPA, dùngpipet nhỏ 3 giọt thuốc láng đều lên bề mặt môi trường Sau đó dùng tăm (đã hấp

vô trùng) lấy vi khuẩn chấm đều lên 2 điểm cách mép đĩa petri 1cm Thí nghiệmđược đặt trong tủ định ôn ở ngưỡng 28 - 300C

CT1: Đối chứng (môi trường chỉ cấy vi khuẩn)

CT2: Môi trường được láng thuốc Cloramphenicol 0.04%

CT3: Môi trường được láng thuốc Streptomycin 0.04%

CT4: Môi trường được láng thuốc Gentamycin 0.04%

Theo dõi quan sát sự phát triển của khuẩn lạc trên môi trường nhân tạosau 24, 48, 72 giờ

Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi đường kính khuẩn lạc (mm) sau cấy 24, 48, 72 giờ