THỬ NGHIỆM BIỂU HIỆN PROTEIN MÀNG (OUTER MEMBRANE PROTEIN) của VI KHUẨN CANDIDATUS LIBERIBACTER ASIATICUS gây BỆNH VÀNG lá gân XANH TRÊN cây có múi

THỬ NGHIỆM BIỂU HIỆN PROTEIN MÀNG (OUTER MEMBRANE PROTEIN) của VI KHUẨN CANDIDATUS LIBERIBACTER ASIATICUS gây BỆNH VÀNG lá gân XANH TRÊN cây có múi THỬ NGHIỆM BIỂU HIỆN PROTEIN MÀNG (OUTER MEMBRANE PROTEIN) của VI KHUẨN CANDIDATUS LIBERIBACTER ASIATICUS gây BỆNH VÀNG lá gân XANH TRÊN cây có múi THỬ NGHIỆM BIỂU HIỆN PROTEIN MÀNG (OUTER MEMBRANE PROTEIN) của VI KHUẨN CANDIDATUS LIBERIBACTER ASIATICUS gây BỆNH VÀNG lá gân XANH TRÊN cây có múi

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

THỬ NGHIỆM BIỂU HIỆN PROTEIN MÀNG (OUTER MEMBRANE PROTEIN) CỦA VI KHUẨN CANDIDATUS LIBERIBACTER ASIATICUS GÂY BỆNH VÀNG LÁ GÂN XANH TRÊN CÂY CÓ MÚI

dẫn :

PGS.TS Hà Viết Cường

Sinh viên thực hiện : Phạm Thị Ngọc Ánh

Mã sinh viên : 591215Lớp : K59CNSHB

Hà Nội, 01/2018

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ

và động viên tận tình từ các thầy cô, gia đình và bạn bè.

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Hà Viết Cường – Trưởng Bộ môn Bệnh cây, khoa Nông học – người đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian, đóng góp những ý kiến vô cùng quan trọng và tạo mọi điều kiện để tôi có thể thực hiện và hoàn thành đề tài này.

Trân trọng cám ơn tất cả các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập đại học cũng như thực hiện đề tài.

Tôi cũng xin chân thành cám ơn các cán bộ nhân viên của Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới đã luôn giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành đề tài này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè những người

đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Một lần nữa tôi xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 19 tháng 12 năm 2017

Sinh viên

Phạm Thị Ngọc Ánh

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong báo cáo này là hoàn toàn trung thực và chưa được sử dụng, công bố trong các báo cáo, luận văn, luận án và các công trình nghiên cứu khoa học trước đây

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn được sử dụng trong luận văn đều được ghi nguồn gốc rõ ràng, đảm bảo trích dẫn theo đúng quy định

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan này

Hà Nội ngày 19 tháng 12 năm 2017

Sinh viên

Phạm Thị Ngọc Ánh

ii

MỤC LỤC

PHẦN I: MỞ ĐẦU xi

1.1 Đặt vấn đề xi

1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu xiii

2.1.1 Mục đích xiii

2.1.2 Nội dung nghiên cứu xiii

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU xiv

2.1 Bệnh vàng lá gân xanh trên cây có múi xiv

2.1.1 Lịch sử và phân bố bệnh xiv

2.1.2 Vi khuẩn Candidatus Liberibacter xv

2.1.3 Triệu chứng xv

2.1.4 Truyền bệnh xvi

2.1.5 Chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh xviii

3.1 Các hệ thống biểu hiện xix

2.1.1 Hệ thống biểu hiện ở sinh vật nhân sơ (vi khuẩn) xix

2.1.2 Hệ thống biểu hện ở sinh vật nhân chuẩn xx

4.1 Hệ thống vector biểu hiện xxi

5.1 Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu xxii

2.1.1 PCR (Poly Chain Reaction) xxii

2.1.2 Điện di xxiv

2.1.3 Cơ chế cảm ứng biểu hiện bằng IPTG trong E coli xxv

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU xxvi

3.1 Vị trí và thời gian nghiên cứu xxvi

3.2 Vật liệu nghiên cứu xxvi

iii

3.2.1 Sinh phẩm xxvi

3.2.2 Chất kháng sinh xxvii

3.2.3 Hóa chất xxvii

3.2.4 Các thiết bị máy chủ yếu xxviii

3.3 Nội dung nghiên cứu xxviii

3.4 Phương pháp nghiên cứu xxviii

3.4.1 Tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩn bằng NaOH xxviii

3.4.2 Tách chiết DNA bằng CTAB xxviii

3.4.3 PCR xxix

3.4.4 Điện di Agarose xxix

3.4.5 Phục hồi dòng vi khuẩn Rosetta xxx

3.4.6 Chuẩn bị plasmid tái tổ hợp pET28a xxx

3.4.6.3 Xây dựng cấu trúc biểu hiện pET28a và OMP gen xxxi

3.4.7 Tinh sạch cấu trúc pET28a xxxi

3.4.8 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli dòng Rossetta bằng kĩ thuật xung điện xxxiii

3.4.9 Nghiên cứu cảm ứng biểu hiện gen mã hóa protein màng OMP trong tế bào vi khuẩn E.coli dòng Rosetta xxxiv

3.4.10 Điện di SDS – PAGE xxxiv

3.4.11.Tinh chiết protein tái tổ hợp bằng NI-NTA Agarose xxxvi

4.1 Dòng hóa các cấu trúc biểu hiện protein OMP (outer membrain protein) của vi khuẩn Cadidantus Liberibater asiaticus xxxviii

4.1.1 Chuẩn bị các nguồn vi khuẩn xxxviii

4.1.2.Nhân 2 phân đoạn gen đầu C của gen OmpA bằng phương pháp PCR 41

4.1.3 Dòng hóa 2 phân đoạn gen đầu C của gen OmpA trên vector pET28a 42

iv

4.1.4 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn biểu hiện Rosetta 2(DE3) 46

4.2 Nghiên cứu biểu hiện cấu trúc C5m/3m-1 và pET28a-OMP-N-1 trong vi khuẩn Rosetta 2 (DE3) 50

4.2.1 Nghiên cứu biểu hiện cấu trúc pET28a-OMP-C5m/3m-1 trong vi khuẩn Rosetta 2 (DE3) 51

4.2.2 Nghiên cứu biểu hiện cấu trúc pET28a-OMP-N-1 trong vi khuẩn Rosetta 2 (DE3) 53

4.3 Đặc trưng phân tử phân đoạn gen OMP-C5m/3m 57

NHư trình bày ở mục 4.1, 2 phân đoạn gen mã hóa 2 đoạn protein đầu C của OMP đã được dòng hóa Cả 2 phân đoạn đã được giải trình tự từ 2 cấu trúc pET28a-OMP-C5m/3m-1 và pET28-OMP-F1/R1-1 Do đoạn OMP-F1/R1 nằm trùng trong phân đoạn pET28a-OMP-C5m/3m-1 (Hình 4.3) nên chúng tôi chỉ tiến hành phân tích trình tự của phân đoạn OMP-C5m/3m 57

4.3.1 Giải trình tự pET28a-OMP-C5m/3m-1 57

Kết quả giải trình tự cho thấy phân đoạn OMP-C5m/3m có kích thước 1047 bp, mã hóa cho 1 protein gồm 342 amino acid (MW = 37.7kDa), cụ thể như sau: 57

4.3.2 So sánh trình tự 58

STT 59

Vi khuẩn 59

Viết tắt 59

Mã GenBank 59

Mức đồng nhất trình tự (%) 59

1 59

Candidatus Liberibacter asiaticus 59

C.Las 59

KC473160 59

v

100 59

2 59

C.Las 59

KC473159 59

100 59

3 59

JQ928887 59

99.9 59

4 59

AY842431 59

99.8 59

5 59

JQ686728 59

94.2 59

6 59

Candidatus Liberibacter africanus 59

C.Laf 59

CP004021 59

65.4 59

7 59

Candidatus Liberibacter solanacearum 59

C.Lso 59

CP002371 59

64.6 59

vi

8 59

Candidatus Liberibacter crescens 59

C.Lcr 59

CP010522 59

57.1 59

9 59

Candidatus Liberibacter americanus 59

C.Lam 59

CP006604 59

56.5 59

4.3.3 Đặc điểm kháng nguyên của protein OMP-C5m/3m 60

Kết quả cho thấy trên phân tử OMP-C5m/3m xuất hiện rất nhiều các epitope tiềm tàng rất thuận lợi cho việc sử dụng tạo kháng thể chẩn đoán bệnh VLGX trên cây cam quýt 61

5.1 Kết luận 63

5.1 Kiến nghị 63

PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CTAB Cetyl trimethylammonium bromide

ELISA Enzyme Linked Immono Sorbent Assay

E Coli Escherichia coli

IPTG Isopropyl – b, D – thiogalactoside

SOC Super Optimal Catabolite

SDS-PAGE Sodium dedecyl sulfate- polyacrylamide gel

DANH MỤC HÌNH

x

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây ăn quả vó múi (cam, quýt, chanh, bưởi…) là nhóm cây ăn quả quan trọngtrong sản xuất nông nghiệp ở nước ta Năm 2011, diện tích cây ăn quả có múi ở ViệtNam đạt 124.057 ha, trong đó diện tích trồng cam quýt tới 70.300 ha, bưởi 45.000 ha

và chanh là 18.000 ha (FAOSAT, 2011) Các loại quả có múi không chỉ là hàng hóađáp ứng cho tiêu thụ nội địa mà còn là loại mặt hàng xuất khẩu có giá trị kinh tế cao.Nghề trồng cây ăn quả có múi được phát triển mạnh mẽ ở nhiều nước thuộc vùng nhiệtđới, á nhiệt đới và ôn đới.Tuy nhiên với sự đa dạng khí hậu ở các vùng trồng trọt làđiều kiện thích hợp cho nhiều loại sâu bệnh phát sinh gây hại trên cây có múi, đặc biệt

là bệnh vàng lá gân xanh (Greening) Bệnh lan truyền với tốc độ chóng mặt và gây hạicho nhiều vườn cam trên toàn thế giới

Bệnh vàng lá gân xanh (tên tiếng Anh là Greening) là bệnh nguy hiểm nhất trêncây có múi trên thế giới, đặc biệt trên cây cam Tương tự tại Việt Nam, khắp cả nước,bệnh là một trong các nguyên nhân chính cản trở việc phát triển sản xuất cây có múi.Tại miền Bắc, các vùng trồng cây có múi chính đều bị nhiễm bệnh vàng lá gân xanhvới tỷ lệ bệnh thường 50 %, nhiều vườn có thể nhiễm tới 100 % (Lê Mai Nhất, 2014).Theo thống kê của Cục Trồng trọt và BVTV, trong những năm gần đây, diện tích cây

có múi bị nhiễm bệnh vàng lá gân xanh tại các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long đềuxấp xỉ 5000 ha

Cây bị bệnh vàng lá gân xanh sinh trưởng rất còi cọc; bộ lá, đặc biệt là lá non,

bị biến vàng; quả nhỏ, lệch, bị biến vàng phần cuống trước khi chín, không có giá trị

sử dụng

Tác nhân gây bệnh là một loài vi khuẩn biệt dưỡng (Ca L asiaticus) nên không

thể nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo Vi khuẩn lan truyền ngoài tự nhiên qua

các vật liệu ghép và rầy chổng cánh (Diaphorina citri).

Các chiến lược quản lý bệnh chủ yếu trên thế giới dựa vào (i) sử dụng vật liệugiống sạch bệnh, (ii) loại bỏ sớm cây bệnh, (iii) phòng chống vector và (iv) tạo giống

xi

kháng bệnh

Tất cả các chiến lược trên đều yêu cầu một kỹ thuật chẩn đoán chính xác Chẩnđoán bệnh vàng lá gân xanh dựa vào triệu chứng rất khó vì bệnh biểu hiện triệu chứng

không đặc trưng Nhiều tác nhân như virus tàn lụi (Citrus tristeza virus, CTV) cũng

gây triệu chứng tương tự Xác định trực tiếp vi khuẩn trong cây bằng kính hiển vi điện

tử hoặc PCR rất phức tạp và đắt, đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt Chính vì vậy, việc pháttriển các kít chẩn đoán bệnh nhanh, rẻ, dễ sử dụng, dựa trên kháng thể đặc hiệu, nhưELISA, que thử nhanh là yêu cầu cấp thiết cho nông dân trồng cam trong quá trình tạogiống sạch bệnh và loại bỏ cây bệnh trong sản xuất Hiện nay, trên thế giới, kít chẩnđoán bệnh vàng lá gân xanh cũng đã được thương mại, nhưng giá thành rất đắt,khoảng 18 triệu đồng/ 500 phản ứng (Hãng Agdia, Mỹ) Tại Việt Nam, chưa có mộtnghiên cứu nhằm tạo kít chẩn đoán bệnh này

Để có thể chẩn đoán bệnh bằng các kỹ thuật miễn dịch như ELISA cần phải có

kháng thể đặc hiệu được tạo ra từ kháng nguyên phù hợp Vì vi khuẩn Ca L asiaticus

không nuôi cấy được nên việc tạo kháng nguyên trực tiếp từ vi khuẩn có nhiều nhượcđiểm: protein thu được là protein tổng số (protein của vi khuẩn + protein cây) nên sẽtạo ra nhiều kháng thể không đặc hiệu, lượng protein vi khuẩn thu được ít Hậu quảcác kháng thể thu được ít được sử dụng trong chẩn đoán

Gần đây, Lau et al (2011), Lu et al (2013) và Ding et al (2015) đã chứng tỏ cácđoạn protein của protein màng ngoài (Outer membrane protein A, OmpA) của vikhuẩn Ca L asiaticus có hoạt tính kháng nguyên tốt và đặc hiệu Các đoạn proteinmàng ngoài đã được gây miễn dịch trên thỏ và có thể sử dụng để chẩn đoán bệnh vàng

lá gân xanh

Do tầm quan trọng của cây có múi, đặc biệt cây cam, trong sản xuất nôngnghiệp của Việt Nam và tầm quan trọng của bệnh vàng lá gân xanh, chúng tôi đề xuất

đề tài : Thử nghiệm biểu hiện protein màng (Outer membrane protein, OMP) của

vi khuẩn Candidatus Liberibacter asiaticus gây bệnh vàng lá gân xanh trên cây

có múi

xii

1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục đích

Tạo được phân đoạn protein màng ngoài tái tổ hợp của vi khuẩn Ca L asiaticus

phục vụ nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu vi khuẩn

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

1 Dòng hóa các cấu trúc biểu hiện protein OMP của Las (Ca L asiaticus) trên

vector biểu hiện vi khuẩn pET28a Xác nhận cấu trúc bằng giải trình tự

2 Biểu hiện protein trong vi khuẩn E coli, chủng biểu hiện (Rosetta).

3 Phân tích trình tự của các phân đoạn protein OMP đã được dòng hóa và giảitrình tự

xiii

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Bệnh vàng lá gân xanh trên cây có múi

2.1.1 Lịch sử và phân bố bệnh

Bệnh vàng lá gân xanh trên cây cam quýt được ghi nhận lần đầu tiên tại TrungQuốc vào năm 1919 với tên gọi Huanglongbing hay chồi vàng (yellow shoot) và đượctài liệu hóa năm 1943 Các nghiên cứu về bệnh vàng lá gân xanh đã đưuọc tiến hành ởmiền nam Trung Quốc năm 1941-1955 Các nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh đãchứng minh các triệu chứng vàng lá gân xanh lốm đốm vàng trên lá không phải do rốiloạn sinh lí, thiếu hụt khoáng, cũng không phải bệnh truyền nhiễm qua đất do tuyếntrùng hoặc nấm Fusarium

Năm 1929, triệu chứng bệnh tương tự vàng lá gân xanh đưuọc tìm thấy ở Nam

Phi (Oberholzer et al 1965) Khi giải phẫu chồi cây bị vàng trên cam ngọt ở Nam Phi.

(Schneider, 1968) đã phát hiện mạch libe có những đốm hoại tử trong hệ thống mạchtrưởn thành, mạch trở nên tắc nghẽn và cản trở sự vận chuyển của các chất dinhdưỡng Các nghiên cứu tiếp theo đã chứng minh được bệnh vàng lá gân xanh ở NamPhi đưuọc truyền qua mắt ghép (McClean and Schwartz,1970)

Năm 1921, bệnh được mô tả lần đầu tiên tại Philipine và được cho rằng là có liênquan đến sự thiếu hụt kẽm ở cây Năm 1986, các nghiên cứu đã chứng minh mô giới

truyền bệnh lở Philipin là loài rầy chổng cánh (psyliid) Diaphorina citri (Martinez

and Wallace, 1967) Salibe and Cortez (1968) đã tìm thấy sự tương đồng của cácchứng bệnh ở Philipin với các triệu chứng “ vàng lốm đốm” ở Trung Quốc và triệuchứng “greening” ở Nam Phi

Hiện nay bệnh được tìm thấy ở hơn 40 quốc gia trên toàn thế giới từ châu Á,châu Phi, châu Đại Dương, phía Nam và Tây châu Mĩ Tác nhân gây bệnh là một loại

vi khuẩn Gram âm không nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo gây ra các triệuchứng như “greening” ở Nam Phi, đốm lá ở Philipin, “dieback” ở Ấn Độ, thoái hóamạch phoelm ở Indonesia

xiv

2.1.2 Vi khuẩn Candidatus Liberibacter

Ca L là một chi vi khuẩn Gram âm thuộc họ Rhizobiaceae.vi khuẩn không định

hình, có vách dầy, không có nhân, không nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo, vikhuẩn di chuyển theo dòng nhựa cây (Bové, 2006) Vi khuẩn được lan truyền qua mắt

ghép, cành chiết và qua côn trồng môi giới là loài rầy chổng cánh Trioza erytreae ở châu Phi và Diaphorina citri ở châu Á.

Vi khuẩn gây bệnh vàng lá gân xanh có bề dày khoảng 25 mm với 3 lớp của vikhuẩn Gram âm Vi khuẩn này có 2 dạng: dạng dài và dạng hình cầu Dạng dài cóchiều dài từ 1-4mm, đường kính 0,15-0,3mm và dạng hình cầu có đường kính khoảng0,1mm

Một số loài bao gồm:

- Libacteria africanus có nguồn gốc từ châu Phi, là một tác nhân gây ra bệnh

vàng lá gân xanh ở châu Phi và được truyền qua vector là loài rầy chổng cánh châu Phi

- Libacteia crecens được phân lập từ cây đu đủ được trồng ở Puerto Rico.

- Libacteria psyllaurous là loài mới được phát hiện vào năm 2008, kí chủ trên các

cây họ cà như cà chua, khoai tây và có vector truyền bệnh là loài rầy chổng cánh trên

cây cà chua khoai tây Bactericera cockerelli L psyllaurous.

- Liberibacter solanacearum là tác nhân gây ra bệnh đốm vàng trên khoai tây và

có vector truyền bệnh là loài rầy chổng cánh cà chua Bactericera cockerelli

2.1.3 Triệu chứng

Người ta thường nghĩ rằng rất khó để chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh dựa trêncác triệu chứng vì hầu như không có triệu chứng nào trong số đó là cụ thể, và cây cómúi thường bị ảnh hưởng bởi các vấn đề khác.Tuy nhiên, vẫn có một số triệu chứng rấtđặc trưng, và những biểu hiện này sẽ được nhấn mạnh ở đây Chúng áp dụng cho hầu

xv

hết các loài cây có múi, vì gần như tất cả cây giống cây có múi đều rất nhạy cảm.

- Triệu chứng của bệnh được thể hiện trên khắp bộ phận của cây bao gồm:

- Trên lá: Biểu hiện đặc trưng là phiến lá hẹp, khoảng cách giữa các lá ngắn lại,

có màu vàng nhưng gân chính và gân phụ vẫn còn màu xanh, nhỏ, mọc thẳng đứnggiống như tai thỏ, vì vậy nên có tên là bệnh vàng lá gân xanh Trên lá già, là bị dày lên,nhám, gân lồi sần sùi và hóa bần (nâu đen)

- Trên quả: Quả nhỏ hơn bình thường, khi bổ dọc thì tâm quả bị lệch hẳn sangmột bên, có quầng đỏ từ dưới lên Hạt trên quả bị bệnh thường bị thối, có màu nâu

- Trên rễ: Khi cây bị bệnh, hệ thống rễ trên cây bị thối nhiều, đa phần rễ tơ khônghút được chất dinh dưỡng để nuôi cây

Cây bị rụng quả cùng với sự phát triển của bệnh, cây sẽ chết sau 2-3 tùy mức độ

nhiễm (Aubert et al 1988).

Hình 1.1 Triệu chứng của bệnh vàng lá gân xanh

1 triệu chứng thiếu kẽm; 2 Biến vàng ;3 Biến màu trên quả ;4 Quả biến dạng

2.1.4 Truyền bệnh

Bệnh vàng lá gân xanh ban đầu được cho là một bệnh do vi rút gây ra nhưng sau

đó được phát hiện là do côn trùng gây ra Nhiễm Greening có thể xuất hiện ở các thời

kì khác nhau và thường liên quan đến các loài rầy chổng cánh khác nhau Ví dụ, cây cómúi ở Châu Phi bị nhiễm bệnh trong điều kiện mát vì vi khuẩn lây truyền qua loài

xvi

Trioza ertreae, một loại côn trùng xâm lấn có lợi cho điều kiện mát và ẩm để tăng

trưởng tối ưu Tuy nhiên,ccây có múi ở Châu Á bao gồm cả Việt Nam thường bị nhiễmbệnh trong điều kiện ấm vì vi khuẩn này lây truyền qua loài rầy chổng cánh châu Á

Diaphorina citri.

Rầy chổng cánh châu Á, Diaphorina citri, là một loài rầy thuộc họ rầy Psyllidae,

chúng là một loài côn trùng có hại đối với các cây ăn quả có múi mà điển hình là cam,quýt, chanh, là là tác nhân chính của bệnh vàng lá gân xanh hay bệnh vàng lá cam(Greening) ở cây có múi Đây được xem là đối tượng côn trùng gây hại nguy hiểmnhất trên cây có múi

Rầy chổng cánh sinh trưởng và phát triển trong nhiều điều kiện nhiệt độ khácnhau, rầy trưởng thành có thể tồn tại được ở nhiệt độ lạnh – 4˚C và cả vùng khí hậunóng và khô Thân hình chúng rất nhỏ, thành trùng dài từ 2-3mm, ít bay nhảy, có cánhdài, màu xám đen với vệt trắng lớn chạy từ đầu đến cuối cánh Vào mùa mưa, khi các

họ cây có múi (cam, quýt, bưởi ) bắt đầu ra đọt non hoặc trổ bông, là lúc rầy chổngcánh xuất hiện và gây hại

Hình 1.2 Rầy chổng cánh châu Á.

Loài này gây thiệt hại cho cây có múi trực tiếp bằng cách ăn lá mới phát triển.Việc này có thể làm các chồi non không phát triển được hoặc làm cho lá bị xoắn hoặc

bị rụng khi chúng trưởng thành Nghiêm trọng hơn, côn trùng là một vector của vi

khuẩn Ca L asiaticus, có liên quan đến bệnh vàng lá gân xanh trên cây cam quýt hay

còn gọi là bệnh Greening Rầy chổng cánh đưa vi khuẩn vào cơ thể của nó khi chúng

xvii

ăn các cây bị nhiễm vi khuẩn, bệnh sẽ được lan truyền khi một loài này chứa vi khuẩnbay tới một cây khỏe mạnh và tiêm vi khuẩn vào trong khi ăn.

2.1.5 Chẩn đoán bệnh vàng lá gân xanh

2.5.1 Chẩn đoán bằng PCR

Phương pháp PCR đã được ứng dụng phổ biến để chẩn đoán bệnh vàng lá gânxanh Dựa trên gen 16S rDNA, các cặp mồi OI1/OI2c có khả năng nhận biết được cảloài vi khuẩn châu Á và châu Phi, cặp mồi OA1/OI2c ưu tiên cho loài châu Phi Đểnhận biết được loài châu Á và châu Phi trên cùng một phản ứng, 2 mồi xuôi là OI1 +OA1, và 1 mồi ngược OI2c được sử dụng tròng cùng 1 phản ứng PCR (Jagoueix etal., 1996)

Các kỹ thuật dựa trên DNA khác như PCR-RFLP (Jagoueix et al, 1996), lai blot (Garnier and Bove, 1993), nested PCR và TaqMan® PCR (Lin et al 2010) cũngđược thử nghiệm nhưng ít được ứng dụng trong thực tiễn

dot-2.5.2 Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA.

Kỹ thuật Enzyme-Linked Immuno-Sorbant Assay (ELISA) rẻ hơn, có thể chẩnđoán cho một lượng lớn mẫu Tuy nhiên kỹ thuật yêu cầu có nguồn kháng thể đặchiệu

Khoảng 10 kháng thể đơn dòng đặc hiệu Ca L asiaticus đã được tạo ra bằngphương pháp sử dụng kháng nguyên là protein được tinh chiết từ cây dừa cạn được lâynhiễm với vi khuẩn Ca L asiaticus Việc tạo kháng nguyên vi khuẩn Ca L asiaticusbằng cách này có nhiều nhược điểm vì:

+ Quá trình tinh chiết kháng nguyên phức tạp

+ Protein (kháng nguyên) thu được là protein tổng số (protein của vi khuẩn +protein cây dừa cạn) nên sẽ tạo ra nhiều kháng thể không đặc hiệu Mặc dù đã cónghiên cứu nhằm tinh chiết chỉ protein vi khuẩn từ cây dừa cạn nhưng qui trình cực kỳphức tạp và vẫn không thể loại bỏ được potein cây

+ Lượng protein vi khuẩn thu được ít

xviii

Hậu quả các kháng thể thu được ít được sử dụng trong chẩn đoán.

Gần đây (Lu et al., 2013), kháng thể đặc hiệu với Ca L asiaticus đã được tạo từnguồn kháng nguyên tái tổ hợp là protein OmpA và kháng thế đã chứng tỏ có thể sửdụng trong chẩn đoán vi khuẩn Ca L asiaticus

Bộ gen của Ca L asiaticus đã được giải mã toàn bộ và gen OmpA của vi khuẩn

có kích thước 2364 nucleotide Nghiên cứu cho thấy gen này rất bảo thủ trong loài(trình tự đồng nhất 99.9% ) và khác xa gen tương ứng của 2 loài gần gũi là Ca L.africanus (trình tự đồng nhất 75%) và Ca L solanacearum (trình tự đồng nhất 69) Kếtquả này cho thấy gen OmpA là lựa chọn rất tốt để tạo kháng nguyên tái tổ hợp của vikhuẩn Ca L asiaticus Do biểu hiện toàn bộ gen OmpA trong vi khuẩn E coli khôngthành công nên các phần gen khác nhau đã được nghiên cứu biểu hiện Kết quả 2 vùnggen ở phần đầu N (tương ứng đoạn POTRA) và phần đầu C (tương ứng đoạn ống beta)

đã được biểu hiện Kháng thể đa dòng được tạo ra từ 2 kháng nguyên tái tổ hợp này cótính đặc hiệu rất cao và có thể phát hiện được Ca L asiaticus bằng ELISA ở độ chínhxác +90% so với PCR (Lau et al., 2011; Lu et al., 2013; Ding et al., 2015)

2.1.1 Hệ thống biểu hiện ở sinh vật nhân sơ (vi khuẩn)

Hiện nay tế bào E.coli là hệ thống tế bào chủ được sử dụng rộng rãi nhất vì rất dễ

nuôi cấy, dễ giữ, nhân giống, cảm ứng dễ dàng bằng cách sử dụng IPTG Ngoài ra dođặc tính sinh trưởng nhanh nên rất nhanh chóng thu được protein mong muốn, việctinh chiết rất đơn giản nhờ sử dụng hệ thống sắc ký ái lực

E.coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, dài khoảng 1µm, không gây bệnh thường

xix

gặp trong đường ruột của người E.coli có nhiễm sắc thể dạng vòng nằm trong vùng

nhân Kích thước của phân tử khoảng 4.106 bp Các quá trình biểu hiện gen như phiên

mã, dịch mã được xảy ra đồng thời Sau khi được phiên mã thì mARN sẽ được sửdụng để dịch mã mà không qua quá trình sửa đổi sau phiên mã do vậy hệ thống này rấtthích hợp cho việc biểu hiện các gen khi các gen này không có quá trình biến đổi sau

dịch mã Đặc biệt nhiều năm qua, các đặc điểm về di truyền và sinh lý của E coli đã được nghiên cứu rất cặn kẽ Trên thị trường đã thương mại nhiều chủng E coli cùng

nhiều loại vector cải tiến trở thành vật chủ hữu hiệu trong kĩ thuật tách dòng và biểuhiện gen

Tuy nhiên ở hệ biểu hiện E coli cũng bộc lộ một số nhược điểm như E coli

không có khả năng sản xuất hiệu quả các loại protein có kích thước quá lớn hoặc quánhỏ Các gen của sinh vật nhân chuẩn không thể biều hiện được hoặc có biểu hiệnđược nhưng không được cải biến chính xác Đồng thời các protein thường biểu hiện ởdạng thể vùi do việc tổng hợp protein một cách ồ ạt hay thiếu các phân tử đặc hiệugiúp cuộn xoắn cấu trúc, điều này tuy có thuận lợi cho quá trình tinh sạch protein

nhưng sau đó protein rất khó phục hồi hoạt tính sinh học (Yin et al., 2007) Ngoài ra, trong nghiên cứu sản xuất các protein trị liệu bằng E coli luôn tiềm ẩn nhiều nguy cơ

gây ra phản ứng phụ trên người và động vật bởi một số chất (nội độc tố) sinh ra trongquá trình biểu hiện

Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã cho thấy, hiệu suất tổng hợp một số protein ngoại

lai trong E coli rất cao nếu sử dụng plasmid phù hợp Chính vì vậy, E coli vẫn đang là

hệ biểu hiện được sử dụng rộng rãi nhất trong việc tạo protein tái tổ hợp

2.1.2 Hệ thống biểu hện ở sinh vật nhân chuẩn

Các tế bào chủ nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các vi sinh vật nhân chuẩnbậc thấp như nấm men, nấm mốc, tảo cho đến các sinh vật đa bảo phức tạp như độngvật, thực vật Hệ thống nay có mức độ biểu hiện cao, các protein dễ tinh chiết bằngcách sử dụng các đuôi đặc biệt được gắn vào trong các vector như His, Myc Đồngthời rất thuận tiện trong việc thu protein mà không phải phá vỡ tế bào Ngoài ra cácprotein biểu hiện ở dạng tan, lại không bị ảnh hưởng bởi các biến đổi hậu dịch mã nên

xx

rất thuận lợi cho các nghiên cứu tương tác protein

Nấm men (S.cerevisiae) được sử dụng rộng rãi trông công nghệ di truyền Chúng

có thể nuôi cấy quy mô lớn để thu sinh khối tế bào Một số nấm men có promotor

mạnh và plasmid YAC biều hiện gen S.cervisiae có khả năng biến đổi sau dịch mã

như đường hóa, phosphoril hóa… để protein có đầy đủ hoạt tính sinh học Đặc biệt,

S.cerevisiae bình thường tổng hợp ít loại protein của bản thân nó, nếu đưa gen lạ tổng

hợp protein mới thì sản phẩm dễ làm tinh sạch Các vi nấm khác cũng được sử dụng

như Aspergilus nidulans, Neurospora crassa hoặc Pechia pastoris

Các tế bào chủ thực vật được sử dụng chủ yếu là các loài tảo đơn bào như loài

Chramydomonas Rainhardii Loài này có đầy đủ các đặc tính ưu việt của vi sinh vật

cộng với cấu trúc và chức năng của tế bòa thực vật do vậy chúng ngày càng được sửdụng rộng rãi trong thao tác di truyền Tuy nhiên người ta cũng còn dùng các tế bàothực vật nuôi cấy trong những môi trường thích hợp để làm tế bào chủ

Đối với các tế bào động vật mặc dù việc nuôi khá phức tạp nhưng trong nhữngđiều kiện cần thiết cho sự biểu hiện ra các protein có hoạt tính sinh học người ta vẫn

sử dụng Ví dụ như: tế bào thận của khỉ xanh châu Phi, của chuột đồng nhỏ, phôingười, tế bào tử cung chuột bạch, tế bào côn trùng để nuôi Baculovirus biều hiện

protein người, tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans.

4.1 Hệ thống vector biểu hiện

Vector biểu hiện là vector có thể mang gen ngoại lai mong muốn, cho phép thựchiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã của các mRNA củachúng trong hệ biểu hiện, từ đó tổng hợp protein mong muốn từ gen ngoại lai Vector

có thể là các DNA plasmid, cosmid hay phage…đây là các DNA có khả năng nhận đôi,phiên mã, dịch mã độc lập với DNA của vật chủ Vector phải chứa gen mã hóa choprotein chức năng dùng làm dấu hiệu chọn lọc (thường là gen kháng kháng sinh).Một trong những vector đang được sử dụng khá phổ biến và hiệu quả trong việc

biểu hiện protein trong E coli hiện nay là pET nhờ khả năng sản xuất hàng loạt

protein, thao tác sinh học phân tử dễ dàng, chứa promoter T7 có đặc tính dựa trên

xxi

promoter mạnh và có tính đặc hiệu cao Vector pET28a là thành viên đại diện trong họpET do Novagen cung cấp Nó chứa các vùng cần thiết cho biểu hiện gen trong vikhuẩn (hình 1.8): 1 gen kháng Kanamycin chọn lọc, 1 vùng MCS chứa nhiều vị trí cắtphục vụ quá trình cắt nối gen, 1 vùng promoter T7 polymerase, 2 vùng chứa nhãnHistidin (Hig-tag) giúp cho quá trình tinh chiết protein tái tổ hợp Đặc biệt là trênvector này chứa 1 chuỗi lac operator sát đầu 3’ của T7 promoter, giúp ngăn cản sự biểuhiện của gen đích khi chưa cảm ứng IPTG và rất có ý nghĩa khi protein biểu hiện làđộc với tế bào

Hình 1.3 Vector pET28a và các vùng chức năng quan trọng

(pET System Manual, 2006) 5.1 Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.1.1 PCR (Poly Chain Reaction)

Kĩ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp – Poly Chain Reaction) là phương pháp

xxii

invitro để nhân nhanh một đoạn DNA nào đó, có độ nhạy rất cao mà chỉ cần sử dụngmột lượng mẫu ban đầu rất hạn chế Kĩ thuật này được sáng tạo bởi K.Mullins cùngcộng sự vào năm 1985 Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân

tử, kỹ thuật PCR được nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chuẩn đoán các bệnh về virus,

vi khuẩn, các bệnh ký sinh trùng và cho kết quả rất chính xác Mặt khác, sự phân tíchthành phần và trật tự nucleotide trên phân tử DNA trong hệ gen còn có ý nghĩa to lớntrong phân loại các loài sinh vật

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNAdựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượngbản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzymepolymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này Primer là nhữngđoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn vànhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thànhmạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase,đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đếnmức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạnDNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, để khuếchđại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự củaDNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sungchuyên biệt (trích dẫn bởi Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003)

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bướcBước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation) Giai đoạn này được thực hiện ởnhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 – 95 0 C) trong vòng 30 giây đến

1 phút, làm cho phân tử DNA mạch Các kỹ thuật PCR và ứng dụng 4 kép tách thành 2mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch

bổ sung mới

Bước 2: (Bắt cặp, annealing) Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt

độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn.Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65 0 C Tùy thuộc vào

xxiii

Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây

Bước 3: (kéo dài, elongation – extension) Nhiệt độ được tăng lên 72 0 C giúpcho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Dưới tác động của DNA polymerase, cácnucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời giancủa giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ

30 giây đến vài phút Sự khuếch đại này có thể được tính như sau: Tổng lượng DNAkhuếch đại = m x 2n m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa n: Là số chu kỳ Như vậy,qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu

kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bảnđược thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao

Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng PCR (poly chain reaction)

2.1.2 Điện di

Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động củađiện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA, RNA, proteindựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực của chúng

Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ

thuật để phân tích các phân tử DNA,RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của

chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point) Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản

gel (thường là agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các

xxiv

phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) đểphát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vàolực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thểnền (gel) Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết chéo với nhautạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độchất cao phân tử (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo Các phân tửđược phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhaucủa (a) lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau)(b) kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và (c) hình dạng, độ cồng kềnhcủa phân tử.

2.1.3 Cơ chế cảm ứng biểu hiện bằng IPTG trong E coli

Bộ gen của vi khuẩn E coli được biến đổi để có thể chứa gen mã hóa T7polymerase (T7 gen 1) và gen lacI (tạo lac repressor) T7 gen 1 bị kiểm soát bởi lacpromoter Khi không có sự hiện diện của IPTG trong môi trường, lac repressor sẽ liênkết với lac operator làm cho lac promoter bị bất hoạt và gen mã hóa T7 polymerasekhông được biểu hiện

Vector pET được thiết kế có T7 promoter và vùng MCS nằm sau T7 promoter.Gen mục tiêu được thiết kế chèn vào vector ở vùng MCS để được kiểm soát biểu hiệnbởi T7 promoter Ngoài ra, trên vector pET cũng có vị trí lac operator và gen lacI mãhóa cho lac repressor để kiểm soát sự biểu hiện của T7 promoter Khi có IPTG, IPTG

sẽ gắn vào lac repressor ở vị trí làm protein này thay đổi cấu hình và không thể gắnvào lac operator Nhờ đó lc promoter được hoạt hóa, gen mã hóa cho T7 polymeraseđược biểu hiện và tạo T7 polymerase IPTG cũng giải phóng T7 promoter trên vectorpET ra khỏi sự kiểm soát của lac repressor Enzyme T7 tạo thành sẽ gắn vào T7promoter đã được hoạt hóa giúp biểu hiện gen mục tiêu đã được tạo dòng vào vector(Lê Trần Bình et al., 2003)

xxv

Hình 1.5 Sơ đồ cơ chế điều hòa của T7 promoter

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vị trí và thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu này được thực hiện tại phòng thí nghiêm trung tâm Nghiên cứu Bệnhcây nhiệt đới học viện Nông nghiệp Việt Nam từ ngày 1 tháng 7 đến ngày 23 tháng 12năm 2017

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Sinh phẩm

- Vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu: E.coli chủng Rossetta, XL1Blue.

- Cấu trúc plasmid tái tổ hợp pET28a-OMP của trung tâm bệnh cây nhiệt đới

- Cấu trúc plasmid pET28a (rỗng)

xxvi

3.2.2 Chất kháng sinh

- Kanamycin 100 μg/μl: hòa 0,1 g trong 1 ml nước cất hai lần

- Choloramphenicol 34 μg/μl: hòa 0, 034 g trong 1 ml ethanol 100%

- Tetracyline 100 μg/μl: hòa 0,1 g trong 1 ml nước cất hai lần

Các kháng sinh được bảo quản ở tủ lạnh sâu –20°C

- Hóa chất điện di Agarose: marker 1kb, TAE 0,5x, TAE 50x

- Các hóa chất cảm ứng biểu hiệ protein: IPTG 100mM (ready-to-use)

- Hóa chất dùng trong điện di SDS-PAGE, tinh chiết protein:

+ Acrylamide 30% (30%T, 2.67%C)

+ Tris-HCl 1,5M, pH 8.8, Tris-HCl 0.5M, pH 6.8

+ SDS 10%: 10g SDS/100ml nước cất

+ APS 10%: 10g amonium persulfate/100ml

+ TEMED: Sử dụng dung dịch đậm đặc mua từ công ty hóa chất

+ Đệm mẫu: nước vô trùng 3.55ml, Tris-HCl 0.5M pH6.8 1.25ml; Glycerol2.5ml; SDS 10% 2ml; Bromophenol blue 0.5% 0.2ml; β-ME 50µl

+ Đệm điện di: Tris-based 0.05M, Glycine 0.192M, SDS 0.1%

+ Dung dịch nhuộm: Brilliant Blue R Staining B6529

3.2.4 Môi trường

- LB lỏng (1L): 10 g Tryptone; 5 g Yeast extract; 5 g NaCl

- LB agar (1L): 10g Tryptone; 5g Yeast extract; 5g NaCl; 15g agar

- SOB lỏng (1L): 20g Tryptone; 5g Yeast extract; 0,5g NaCl; 0,186g KCl; 10mMMgCl2; 10mM MgSO4

- SOC lỏng (1L): 20g Tryptone; 5g Yeast extract; 0,5g NaCl; 0,186g KCl; 10mMMgCl2; 10mM MgSO4; 20ml glucose 1M

xxvii

Môi trường được hấp khử trùng 121°C/ 20 phút Kháng sinh được thêm vào môitrường ấm khoảng 55°C trước khi sử dụng.

3.2.4 Các thiết bị máy chủ yếu

Buồng cấy vô trùng, nồi hấp, máy PCR, bể nhiệt (tách chiết DNA, RNA), bộđiện di agarose, bộ điện di protein, tủ nuôi + lắc…

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Tinh chiết DNA vi khuẩn gây bệnh VLGX và kiểm tra các nguồn vi khuẩn sẵn

có Rosetta; XL1Blue

- Biến nạp cấu trúc biểu hiện pET28a-HLB vào vi khuẩn Rosetta; XL1 Blue

- Biểu hiện và tinh chiết protein trong các dòng vi khuẩn biến nạp

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩn bằng NaOH

Lấy đơn khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa môi trường cho vào ống eppendorf chứa10µl NaOH 0.5M Bổ sung thêm 100 µl dung dịch Tris-HCl 1M trộn đều Sử dungdịch sau đó làm DNA mạch khuôn với các cặp mồi tương ứng

3.4.2 Tách chiết DNA bằng CTAB

Quy trình tinh chiết DNA bằng phương pháp CTAB:

1 Ủ đệm chiết CTAB đã bổ sung β-ME (1ml CTAB : 10µl β-ME) ở 60° trong 30phút

2 Cân 0.1g mô bệnh nghiền trong 1ml CTAB bằng chày cối sứ Chuyển dịch chiếtvào ống eppendorf Ủ ở 65°C/10 phút/RT

3 Ly tâm ở 13000 rpm/ 5-10 phút Dịch trên tủa được chuyển sang tube 1.5mlmới

4 Bổ sung thể tích tương đương Chloroform:isoamylalcolhol (24:1) đảo đều và đểlạnh 5 phút trên đá

5 Ly tâm ở 13000rpm/15 phút Dịch trên tủa cho vào tube 1.5ml mới

xxviii

6 Kết tủa DNA bằng isopropanol 10M với thể tích bằng ¼ Trộn đều Để lạnh-20°C/30 phút.

7 Ly tâm ở 13000rpm/15 phút thu cặn (DNA tổng số)

8 Rửa cặn bằng Ethanol 70% 2 lần

9 Phơi khô cặn hoàn toàn trong không khí (box cấy)/30 phút/RT

10 Cặn được hòa trong 20-50µl TE và bảo quản ở -20°C

Quy trình thực hiện phản ứng PCR:

94°C 4 phút

94°C 35 giây 54°C 35 giây x 35 72°C 1 phút

72°C 5 phút

3.4.4 Điện di Agarose

Đệm điện di: TAE 0.5x (được chuẩn bị từ dung dịch gốc TAE 50x)

Chuẩn bị gel Agarose 1%: Cân 0.5g Agarose cho vào trong lọ bổ sung 50ml TAE0.5x Hòa tan gel trong lò vi sóng (2 phút), để nguội gel xuống 40-50°C thì thêm

xxix

0.5mg/ml Ethidium bromide Đổ gel vào khay có xếp lược để tạo giếng khoảng 15-20phút Cho đệm điện di TAE 0.5x ngập khay khuôn Tiếp theo, load mẫu sản phẩmPCR, RT-PCR vào các giếng cùng Marker (1kb) Mẫu trên gel được điện di với hiệuđiện thế ổn định 100V/30 phút Bản gel sau điện di được kiểm tra dưới tia UV của máysoi gel,quan sát băng hình thành và so sánh với thang Marker

3.4.5 Phục hồi dòng vi khuẩn Rosetta

Nguồn vi khuẩn được bảo quản trong nước cất vô trùng, sau đó được cấy phụchồi trên đĩa môi trường LB agar có chứa Choloramphenicol Đặt đĩa mới cây trong tủnuôi qua đêm ở 37°C Kiểm tra sự hình thành khuẩn lạc (nhỏ, tròn, bóng)

3.4.6 Chuẩn bị plasmid tái tổ hợp pET28a

3.4.6.1 Cắt kép plasmid pET 28a và gen OMP bằng enzyme cắt giới hạn.

Plasmid pET28a và gen OMP được cắt bằng cặp enzyme và mồi tương ứngtheo bảng 1.2

Phản ứng cắt kép pET28a (cắt hoàn toàn):

Bảng 1.2.Thành phần phản ứng cắt kép pET28a bằng cặp enzyme cắt giới hạn

di trên gel agarose 1% bổ sung 5mg/ml Ethidium Bromide 100V trong 15 phút

3.4.6.2 Phản ứng cắt kép gen OMP (cắt hoàn toàn):

Bảng 1.3.Thành phần phản ứng cắt kép gen OMP bằng cặp enzyme cắt giới hạn

Thành phần Thể tích (µl)

xxx

RE1 1

3.4.6.3 Xây dựng cấu trúc biểu hiện pET28a và OMP gen

Cấu trúc biểu hiện được xây dựng theo công thức sau:

Bảng 1.4 Thành phần phản ứng nối pET28a và gen OMP

Ủ ở 4˚C qua đêm và cất giữ ở -20 ˚C

3.4.7 Tinh sạch cấu trúc pET28a

Plasmid tái tổ hợp được tinh chiết bằng GenJet plasmid miniprep Kit (ThermoScientific) và bảo quản ở -20˚C

xxxi

Hình 1.6 GeneJET Plasmid Miniprep Kit

Tiến hành:

1 Thu dịch vi khuẩn đã nuôi qua đêm trên đĩa petri môi trường LB ( chứaKanamycine 0.1ml/1L; Chloramphenicol 0.1ml/1L) bằng cách rửa bằng nướccất vô trùng chia đều vào các ống effendoff 2ml

2 Li tâm 13.000rpm trong 3 phút thu cặn Rửa bằng nước cất vô trùng lặp lại 3lần

3 Hòa cặn trong 250 µl Resuspension Buffer ( điều chỉnh lượng phù hợp với cặnthu được)

xxxii

4 Thêm 250µl đệm Lysis buffer đảo đều nhẹ nhàng 4-6 lần

5 Bổ sung 350µl Neutralization Solution đảo đều nhẹ nhàng Li tâm 13000rpmtrong 1 phút, hút phần dịch trong chuyển sang cột GenejET Spin Column tiếptục li tâm 13000 rpm trong 1 phút Đổ bỏ phần dịch trong

6 Bổ sung 500µl Wash Solution vào cột Li tâm 13000 rpm/ 1 phút loại bỏ phẩndịch trong bên dưới

7 Lặp lại bước rửa bằng đệm Wash Solution thêm lần nữa Spin 1 phút để loại bỏhết phần đệm sót lại

8 Chuyển cột sang ống effendoff 1.5ml sạch Bổ sung 50µl Solution Buffer đểyên trong 2 phút, sau đó li tâm 13000 rpm/3 phút thu phần dịch trong

3.4.8 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli dòng Rossetta bằng kĩ thuật xung điện

1 Dùng đĩa vi khuẩn Rossetta được nuôi cấy trên môi trường LB agar (chọn lọcbằng Chloramphenicol) Cho nước cất vo trùng vào đĩa, rửa và thu dịch vikhuẩn vào ống eppendorf 1,5ml

2 Li tâm 10000v/3-5 phút, thu cặn Rửa bằng nước cất vô trùng và li tâm 3 lần.Sau đó thu cặn

3 Chia lượng tế bào vi khuẩn ra 2 eppendorf tube (~150 µl/tube) Một ống giữnguyên để cấy vào đĩa đối chứng (LB chứa Chloramphenicol và Kanamycin)bằng phương pháp cấy chan Một ống đem đi biến nạp bằng xung điện

4 Tube mang xung điện: cho plasmid tái tổ hợp (OMPF1/R1 và OMPC5m/3m) vào tube chứa vi khuẩn Rossetta, để 15 – 20 phút Chuyển dịch

pET28a-vi khuẩn + plasmid tái tổ hợp vào Cuvet để đem đi xung điện (bằng máy xungđiện, set với 1500V + 5ms).Ghi kết quả xung điện (thực tế)

5 Bổ sung 200µl môi trường SOC vào cuvet trộn đều chuyển sang ống efendoff1,5 ml để yên trong 5 phút

xxxiii

6 Li tâm 800rpm/3 phút loại bỏ gần hết dịch trong chỉ giữ lại khoảng 50µl trộnđều với cặn.

7 Hút dịch trong ống effendoff cấy chan trên đĩa môi trường LB(Chloramphenicol + Kanamycin) cho đến khi bề mặt môi trường khô

3.4.9 Nghiên cứu cảm ứng biểu hiện gen mã hóa protein màng OMP trong

tế bào vi khuẩn E.coli dòng Rosetta

Sử dụng IPTG (Isopropyl – b, D – thiogalactoside)

Môi trường: SOB lỏng + Kanamycin + Chloramphenicol

Dung dịch gốc IPTG: 100mM (Thermo fisher scientific)

Trình tự:

1 Cấy một đơn khuẩn lạc dòng vi khuẩn Rosetta mang cấu trúc pET28a+insertvào ống nghiệm chứa 2ml SOB lỏng (Kanamycin 0.1ml/1L; Chloramphenicol0.1ml/1L) Ủ với shaking 220-250 vòng/phút ở 20-30°C qua đêm (ODA550~0.6)

2 Sáng hôm sau, cấy 1 ml dịch vi khuẩn vào 100 ml môi trường LB lỏng(Kanamycin 0.1ml/1L; Chloramphenicol 0.1ml/1L) trong lọ 500 ml Ủ vớishaking 220-250 vòng/phút ở 30-37°Ccho tới khi OD600 ~0.6-1 (khoảng vàigiờ ở 37°C) Nên kiểm tra OD 2h/lần (lấy trong buồng cấy vô trùng) để kiểmtra sự sinh trưởng của vi khuẩn

3 Cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG cho tới nồng độ cuối 1mM Ủ với lắc220-300 vòng/phút ở 25-37°C (khoảng vài giờ ở 37°C)

4 Thu hoạch tế bào: Ly tâm ở 5000g/15 phút/4°C

5 Giữ tế bào ở -20°C hoặc thực hiện luôn việc tinh chiết

3.4.10 Điện di SDS – PAGE

3.4.10.1 Chuẩn bị gel polyacrylamide

Protein được phát hiện và định lượng tương đối trên gel polyacrylamide 2 lớptheo phương pháp của Laemmli (1970) Gel polyacrylamide 2 lớp gồm gel cô

xxxiv