KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT, XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA CAO CHIẾT TỪ MỘT SỐ BỘ PHẬN CÂY SA KÊ (Artocapus altilis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT, XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT, XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA CAO CHIẾT TỪ MỘT SỐ BỘ PHẬN

CÂY SA KÊ (Artocapus altilis)

Sinh viên thực hiện : VÕ VĂN TRUNG Niên khóa : 2009 – 2013

Tháng 6/2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT

VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA CAO CHIẾT TỪ MỘT SỐ BỘ PHẬN

CÂY SA KÊ (Artocapus altilis)

LỜI CẢM ƠN

Xin gửi lời cám ơn đến Trường ĐH Nông Lâm TP HCM đã tạo điều kiện cho

tôi thực hiện đề tài này

Em xin chân thành cám ơn: PGS.TS Phan Phước Hiền và KS Trương Thị Bích

Liễu đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dành thời gian và công sức để truyền đạt những

kiến thức và kinh nghiệm quy giá, chỉnh sửa và tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành

khóa luận tốt nghiệp

Em xin cám ơn TS Trần Thị Lệ Minh, phó trưởng BM Công nghệ Sinh học

cùng các thầy cô đã truyên đạt những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian học

tại trường

Em xin cám ơn GVCN Tô Thị Nhã Trầm đã tận tình chỉ dạy, khuyên bảo trong

quá trình học tập và thực hiện khóa luận

Cám ơn các bạn trong lớp DH09SH đã chia sẽ niền vui, khó khăn trong quá

trình học tập và làm khóa luận này

Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ và những người thân trong gia đình

đã dày công khổ cực nuôi dưỡng và giáo dục con trưởng thành

TÓM TẮT

Quá trình công nghiệp hóa – hiện đại hóa ngày càng được đẩy mạnh, dân số ngày càng tăng đang là mối lo về lương thực và bệnh tật trở nên nghiêm trọng do tình trạng kháng thuốc kháng sinh như hiện nay Kết quả thống kê của Viện Dược liệu năm

2006 cho biết Việt Nam có khoảng 3.948 loài thực vật và nấm có giá trị làm thuốc, có khoảng 185 cây thuốc có giá trị dược lí cao Cây sa kê trồng nhiều ở vùng nhiệt đới vừa cung cấp lương thực thứ yếu vừa làm thực phẩm chức năng như làm trà, chế biến món ăn từ quả và có giá trị trong việc điều trị ung thu vú, xơ gan, kháng khuẩn, chống lão hóa Sa kê được nghiên cứu nhiều ở Ấn Độ, Thái Lan, Đài Loan… Còn ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào công bố chính thức về giá trị của cây sa kê Do đó đề tài:

“khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật và xác định khả năng kháng khuẩn, khả năng

chống oxy hóa của cao chiết từ một số bộ phận cây sa kê (Artocapus altilis).” được

tiến hành nhằm tìm ra nguồn lương thực và dược liệu mới tiến tới nghiên cứu trên đối

tượng này

Mẫu vỏ cây, lá tươi, lá sa kê khô được thu nhận tại Thủ Đức được xử lí và chiết với các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, đêm cô quay đuổi dung môi thu cao

Tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus aureus ATCC 43300,

Samonella spp., E coli ATCC 2592 và thử nghiệm hoạt tính đánh bắt gốc tự do DPPH

(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

Kết quả đã xác định được khối lượng nguyên liệu cao vỏ cây 11,11 g, cao lá tươi 17,82 g và cao lá vàng 17,23 g từ 100 g bột nguyên liệu Hiệu suất chiết xuất vỏ cây 11,11%, lá tươi 17,81%, lá khô 17,23% Khảo sát sơ bộ hóa thực vật cho thấy ở sa

kê có sự hiện diện các chất tinh dầu, carotenoid, flavonoid, polyphenol, acide hữu cơ, hợp chất khử, triterpenoid, alkaloid, anthraquinon, anthocyanoid Hoạt tính sinh học cao chiết từ ethyl acetate của lá sa kê tươi có khảng năng kháng khuẩn cao nhất trên vi

khuẩn E coli và S aureus Khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH các mẫu đều có hoạt

tính Trong đó, cao chiết từ lá sa kê tươi chiết bằng dung môi ethyl acetae có hoạt tính sinh học cao hơn (IC50 = 56,17), cao chiết từ vỏ cây và lá vàng có hoạt tính sinh học thấp hơn

The thesis: “Survey the chemical composition, antibacterial activity and

antioxidant activity of extracts crude of plant parts Artocapus altilis”

Artocapus altilis is one of the multipurpose crops provide food, medicine,

textiles, building materials and food for livestock In Viet Nam, there is no reported for study on this plant Thus, this study was conducted to find asource of food and medicine toward new research on this subject

The sample bark, fresh leaves, yellow leaveswere collected in Thu Duc district

in December, 2012 Power of those samples was extraction with solvent systems of different polarity Then, crude extracts was conducted testing high antibacterial

activity on Staphylococcus aureus ATCC 43300, Salmonella spp and E coli ATCC

2592 Finally, crude extracts were tested for antioxidant activity by DPPH free radical assay

Results we have identified in 11.11 g of bark extract, 17.82 g of fresh leaves extract, 17.23 g of yellow leaves extract to powder 100 g original material The performance of sample were 11.11 % of bark extract, 17.81 % of fresh leaves and the 17.23 % of yellow leaves Survey the chemical composition shows that the extract, involved: oils, carotenoids, flavonoids, polyphenols, organicacids, reductant,

triterpenoid, alkaloid, anthraquinone and anthocyanoid A altilis extract crude

obtained antibacterial activity on bacterial The biological activity of ethyl acetate

extracts of fresh leaves inhibited bacterial growth in the bacterium E coli ATCC 2592 and S aureus ATCC 43300 The ability to capture free radicals DPPH samples is activated In particular, extracts of fresh leaves A altilis by solvent extraction with

ethyl acetae higher biological activity (IC50 = 56.17), extracts of bark and leaves have lower biological activity

Keys words: Artocapus altilis, extraction, chemical componemts, bacterial

activity, antioxidant activity, MIC, DPPH

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây sa kê 3

2.1.1 Phân loại khoa học cây sa kê 3

2.1.2 Đặc điểm sinh thái cây sa kê 3

2.1.3 Điều kiện sinh thái và phân bố cây sa kê 4

2.2 Một số nghiên cứu về tác dụng của sa kê 4

2.3 Tổng quan về các hợp chất thiên nhiên 6

2.4 Kĩ thuật tách chiết hợp chất hữu cơ 8

2.4.1 Kĩ thuật chiết lỏng – lỏng 8

2.4.2 Kĩ thuật chiết ngấm kiệt 8

2.4.3 Kĩ thuật chiết ngâm dầm 9

2.4.4 Kĩ thuật chiết soxhlet 9

2.5 Tổng quan vi sinh vật gây bệnh đường ruột 9

2.5.1 E Coli 9

2.5.2 Salmonella spp 10

2.5.3 Staphylococcus aureus 10

2.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa 11

2.6.1 Khái niệm khả năng chống oxy hóa 11

2.6.2 Xác định khả năng kháng oxy hoá bằng thử nghiệm DPPH 11

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 13

3.2 Vật liệu 13

3.2.1 Mẫu thí nghiện 13

3.2.2 Chủng vi khuẩn 13

3.2.3 Hóa chất 13

3.2.4 Thiết bị và dụng cụ 14

3.3 Phương pháp nghiên cứu 14

3.3.1 Xác định ẩm độ nguyên liệu 14

3.3.2 Tính hiệu suất thu hồi cao chiết 15

3.3.3 Khảo sát tính kháng khuẩn của cao chiết sa kê 19

3.3.5 Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH 23

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả ẩm độ nguyên liệu và hiệu suất thu hồi cao 25

4.1.1 Ẩm độ nguyên liệu 25

4.1.2 Hiệu suất thu hồi cao sa kê 25

4.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật của cao chiết 27

4.3 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao sa kê 32

4.3.1 Thử nghiệm khảng năng kháng khuẩn bằng phương pháp gắn đĩa giấy 32

4.3.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn (MIC) 35

4.4 Kết quả thử nghiệm chống oxy hóa 37

4.4.1 Kết quả đo OD đối với dung dịch chuẩn vitamin C 37

4.4.2 Kết quả đo OD đối với dung dịch chuẩn Trolox 38

4.4.3 Kết quả đo OD đối với cao petroleum ether chiết từ vỏ cây sa kê 39

4.4.4 Kết quả đo OD đối với cao petroleum ether chiết từ lá sa kê tươi 39

4.4.5 Kết quả đo OD đối với cao petroleum ether chiết từ lá sa kê vàng 39

4.4.6 Kết quả đo OD đối với cao ethyl acetate chiết từ vỏ cây sa kê 40

4.4.7 Kết quả đo OD đối với cao ethyl acetate chiết từ lá sa kê tươi 40

4.4.8 Kết quả đo OD đối với cao ethyl acetate chiết từ lá sa kê vàng 40

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Đề nghị 43

Tài liệu tham khảo 44 Phụ lục

MIC: Minimum Inhibitory Concentration

OD: Optical Density

P: Petroleum ether

TSA: Trypticase Soy Agar

TSB: Trypticase Soy both

1H, 2H, 3H: cao chiết từ dung môi nước của vỏ cây, lá tươi và lá vàng

1Et, 2Et, 3Et: cao chiết từ dung môi ethanol của vỏ cây, lá tươi và lá vàng

1Ea, 2Ea, 3Ea: cao chiết từ dung môi ethyl acetate của vỏ cây, lá tươi và lá vàng 1P, 2P, 3P: cao chiết từ dung môi petroleum ether của vỏ cây, lá tươi và lá vàng

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của quả và hạt sa kê 5

Bảng 3.1 Sơ đồ phương pháp pha loãng mẫu và đánh giá kết quả 22

Bảng 3.2 Dãy nồng độ mẫu thử đánh bắt gốc tự do DPPH 23

Bảng 3.3 Pha mẫu thử nghiệm DPPH 24

Bảng 4.1 Ẩm độ nguyên liệu của các bộ phận cây sa kê 25

Bảng 4.2 Khối lượng cao chiết ở các hệ dung môi khác nhau của sa kê 26

Bảng 4.3 Hiệu suất chiết xuất cao thô sa kê ở các bộ phận khác nhau 27

Bảng 4.4 Định tính thành phần hóa thực vật của vỏ cây sa kê 28

Bảng 4.5 Định tính thành phần hóa thực vật của lá sa kê tươi 29

Bảng 4.6 Định tính thành phần hóa thực vật của lá sa kê vàng 30

Bảng 4.7 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn trên môi trường TSA 33

Bảng 4.8 Giá trị MIC của cao thử nghiệm trong môi trường TSB 35

Bảng 4.9 Giá trị IC50 của các mẫu, Vitamin C và Trolox 41

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Mẫu sa kê dùng thí nghiệm 13

Hình 3.2 Sơ đồ chiết cao tổng sử dụng trong nghên cứu 15

Hình 3.3 Sơ đồ khảo sát thành phần hóa học trên cao tổng 19

Hình 4.1 Dịch chiết sa kê 27

Hình 4.2 Định tính hợp chất hóa học 31

Hình 4.3 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cao chiết sa kê 34

Hình 4.4 Kết quả thử nghiệm MIC 36

Hình 4.5 Thử nghiệm đánh bắt gốc tự do DPPH của vitamin C 37

Hình 4.6 Đồ thị khả năng ức chế DPPH của vitamin C 38

Hình 4.7 Đồ thị khả năng ức chế DPPH của Trolox 38

Hình 4.8 Đồ thị khả năng ức chế DPPH cao petroleum ether vỏ cây sa kê 39

Hình 4.9 Đồ thị khả năng ức chế DPPH cao petroleum ether lá sa kê tươi 39

Hình 4.10 Đồ thị khả năng ức chế DPPH cao petroleum ether lá sa kê vàng 39

Hình 4.11 Đồ thị khả năng ức chế DPPH cao ethyl acetate vỏ cây sa kê 40

Hình 4.12 Đồ thị khả năng ức chế DPPH cao ethyl acetate lá sa kê tươi 40

Hình 4.13 Đồ thị khả năng ức chế DPPH cao ethyl acetate lá sa kê vàng 40

Hình 4.14 Biểu đồ gí trị IC50 mẫu cao và đối chứng 41

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong tình hình xã hội hiện nay vấn đề lương thực, dinh dưỡng và sức khỏe ngày càng được quan tâm và chú trọng phát triển hàng đầu Trong đó vấn đề thuốc chữa bệnh đang làm mục tiêu xa hơn mà con người nhắm tới vì một sức khỏe cộng đồng bền vững Cùng với thời gian phát triển của khoa học công nghệ các phương thuốc ở dạng tân dược hay cổ truyền Phần lớn các loại thuốc tổng hợp hóa học thường có tác dụng phụ, nên hiện nay không chỉ Việt Nam mà cả thế giới việc sử dụng thuốc có xu hướng với vị thuốc có nguồn gốc tự nhiên…

Artocarpus bao gồm hơn 50 loài trong đó một phần lớn trong số họ có thể được

tìm thấy ở Indonesia Một số loài Artocarpus, chẳng hạn như: A champeden, A

teysmanii, A laceifolius, A altilis, A bracteata và A reticulatus đã được thiết lập trong

hệ thống bản địa của y học ở Indonesia Một số loài đã được sử dụng chống viêm nhiễm

và sốt sốt rét (Surat Boonthong và cs, 2007) Về mặt hóa học một số các hợp chất

phenolic isoprenylated phân lập từ Artocarpus có hoạt tính hạ huyết áp, hoạt động

kháng viêm, kháng khuẩn và kháng u (Achmad, 1996; Chen; 1993; Nomura, 1988)

Sa kê là một trong những cây trồng kinh tế quan trọng ở Indonesia Những người

dân trong khu vực này sử cây như là một nguồn thực phẩm thương mại và điều trị ung thư dòng tế bào T47D (Enos Tangke Arung, 2009) Thân và rễ cũng là một cây thuốc quan trọng và có truyền thống được sử dụng tại Đài Loan trong điều trị xơ gan, cao huyết áp, kháng viêm và tác dụng giải độc

Theo lương y Phạm Như Tá, các bộ phận như quả, rễ, lá, vỏ và cả nhựa của cây

sa kê điều có nhiều dược tính, nên được dân gian và y học sử dụng làm thuốc trị bệnh Trong Đông y, quả sa kê có tác dụng bổ tỳ, ích khí Còn hạt sa kê có tác dụng bổ trung khí, lợi trung tiện Vỏ có tác dụng sát trùng và lá có tác dụng kháng sinh, tiêu viêm lợi tiểu và chống lão hóa…

Từ nhu cầu thực tiễn và triển vọng tương lai của cây sa kê, đề tài: “Khảo sát sơ

bộ thành phần hóa thực vật và xác định khả năng kháng khuẩn, khả năng chống oxy hóa của cao chiết từ một số bộ phận cây sa kê (Artocapus altilis)” nhằm đánh giá dược tính của cây sa kê

1.2 Yêu cầu của đề tài

 Khảo sát một số dược từ cây sa kê (Artocarpus altilis)

 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học từ dịch chiết và thử nghiệm hoạt tính sinh học bằng phương pháp kháng khuẩn và chống oxy hóa từ cao chiết của lá tươi, lá vàng và vỏ cây sa kê

1.3 Nội dung thực hiện

 Xác định ẩm độ nguyên liệu và hiệu suất thu hồi cao sa kê

 Chiết tách các hợp chất bằng các hệ dung môi khác nhau

 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật cao chiết từ một số bộ phận cây sa kê

 Thử tính kháng khuẩn của một cao chiết của một số bộ phận cây sa kê bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và pha loãng liên tiếp xác định nồng độ

ức chế tối thiếu (MIC)

 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết từ một số bộ phận cây sa kê bằng thử nghiệm DPPH

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây sa kê

2.1.1 Phân loại khoa học cây sa kê

Giới (regnum) : Plantae

Ngành :Angiospermae

Lớp : Eudicots

Bộ (ordo) : Rosales

Họ (familia) : Moraceae

Chi (genus) : Artocarpus

Loài (species) : A altilis

(Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Xa_k%C3%AA)

Tên khoa học là: Artocarpus altilis

Sa kê thuộc họ dâu tằm (Moraceae), còn được gọi là cây mít bột

2.1.2 Đặc điểm sinh thái cây sa kê

Cây sa kê thuộc họ dâu Moraceae, với nhiều tên gọi khác nhau Artocarpus

communis, Artocarpus altilis và Artocarpus incisa (Mayaki, 2003) Tên thường gọi là Artocarpus altilis (Fosberg, 1941)

Cây sa kê được trồng rộng rãi ở vùng nhiệt đới nóng ẩm Đông Nam Châu Á và đảo Thái Bình Dương Sa kê là loại cây lớn, có hình dáng đẹp và cao khoảng 15-20 m Cây có vỏ láng, màu nhạt, đường kính 1,2 m, thường cao đến 4 m trước khi phân cành

Gỗ có màu vàng rất đẹp, đổi sang màu sẫm khi tiếp xúc với không khí Lá sa kê dày, mặt lá có màu sẫm và bóng, phía dưới mặt lá mờ, gân lá nhô cao và có gân chính, viền ngoài mặt lá xẻ thùy và có sự biến thiên rất rõ Lá rộng có hình trứng, khác nhau về kích cỡ và hình dáng thậm chí trên cùng một cây Cụm hoa sa kê có lá kép và lưỡng tính, cụm hoa đực ra trước có đường kính tới 5 cm và dài 45 cm Trục hoa dày được tạo thành từ rất nhiều hoa nhỏ Trái sa kê có cấu trúc rất đặc biệt có hình cầu đến hình thuôn/chữ nhật dài 12 cm, rộng từ 12-20 cm Vỏ trái có màu xanh nhạt, xanh vàng hay vàng khi chín và khi xanh có màu trắng kem hay vàng nhạt Bề mặt trái biến thiên từ láng đến có gai nhẹ (Ragone, 1997)

2.1.3 Điều kiện sinh thái và phân bố cây sa kê

Sa kê có khả năng thích ứng với điều kiện sinh thái rộng, sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 21-32°C (Purseglove, 1968) Thậm chí cây vẫn có thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp tới 15°C và cao tới 40 °C (Singh và cs, 1967; Rajendran, 1992), dưới 5°C cây không sinh trưởng được (Crane và cs, 1990) Sa kê yêu cầu lượng mưa cao trung bình

2000 - 3000 mm/năm và lượng mưa tối ưu 1525-2540 mm Sa kê phù hợp trồng ở 170

vĩ độ Nam và Bắc, độ cao dưới 600 m, điều kiện lạnh làm giảm năng suất và chất lượng

sa kê (Rajendran, 1992)

Sa kê được cho là có nguồn gốc từ vùng tân Guinea Phân bố rộng rãi ở khu vực Thái Bình Dương: Indonesia, Malaysia đến Hawaii Cây thích hợp với nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, mưa nhiều

Sa kê là một trong những cây lương thực có sản lượng cao, với một cây có thể cho tới 200 quả mỗi mùa Tại miền nam Thái Bình Dương, cây kết quả 50-100 quả mỗi năm, còn ở miền nam Ấn Độ sản lượng thông thường 150-200 quả mỗi năm Quả sa kê

có chứa thành phần tinh bột, khoáng chất, các acid amin thiết yếu

Sa kê đã có thời gian được coi là cây lương thực quý được các nhà thám hiểm và thương buôn người Tây Ban Nha, Anh, Pháp coi trọng vận chuyển và buôn bán đến các vùng thuộc địa của họ, chủ yếu thường từ Philipines chuyển đến Mêxico và Trung Mỹ, Jamaica…Hiện nay, sa kê vẫn cập cảng Hoa Kỳ, Canada và Châu Âu từ Caribean để cung cấp cho nhu cầu thực phẩm của các sắc tộc thiểu số và làm nguyên liệu cho một số ngành chủ yếu là ngành công nghiệp thực phẩm

Sa kê đã được người Pháp đưa vào Việt Nam từ Indonesia và được trồng tại miền nam Việt Nam Cây không sống được trong vùng khí hậu miền bắc Việt Nam

2.2 Một số nghiên cứu về tác dụng của sa kê

Cây sa kê là một loại cây đặc biệt, các các bộ phận của cây chứa các thành phần

cơ bản như: protein, lipid, vitamin…Chúng còn chứa các thành phần dược tính như: geranyl dihydrochalcone, geranyl flavonoids, geranyl tetrahydrochalcone, papayotin và artocarpine

Sa kê là cây lương thực có giá trị dinh dưỡng ở các vùng nhiệt đới Ngoài trái sa

kê đã được nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng mà cả các bộ phận khác như lá, mủ,

vỏ và gỗ Hàm lượng hydrat carbon ở sa kê tốt bằng hoặc hơn các loại thực phẩm có nhiều hydrat carbon đang sử dụng rộng rãi So với các loại thực phẩm giàu tinh bột

khác, sa kê có nguồn protein tốt hơn một số loại cây có củ và thường được so sánh với

khoai lang và chuối Sa kê còn là nguồn sắt, canxi, kali, Vitamin B2 và Vitamin PP

(Ragone, 1997)

Sa kê là cây đa tác dụng cung cấp thực phẩm, thuốc, vật liệu dệt, vật liệu xây

dựng và thức ăn cho gia súc Sa kê là một trong những cây trồng lâu năm thân thiện với

môi trường ở Nigeria và là cây quan trọng trong hệ thống nông lâm kết hợp truyền

thống ở các đảo Thái Bình Dương (Raynor và cs, 1991) Cây này có thể trồng xen với

nhiều cây trồng như cây có củ, chuối, cây công nghiệp, đặc biệt cà phê và tiêu Trái sa

kê là loại thực phẩm đa năng có thể nấu hay ăn ở các giai đoạn khác nhau, được thu

hoạch và tiêu thụ như lương thực thiết yếu cung cấp tinh bột, khi nấu sẽ thành bánh,

cháo, nướng hoặc chiên Trái thuần thục có thể luộc và thay thế cho khoai tây Trái chín

rất ngọt và dùng để làm bánh, thức ăn tráng miệng, sirô, mứt, dấm và tinh bột (Ragone,

1997) Ở Nigeria, sa kê được dùng thay thế cho một số cây có củ bởi chi phí bằng 1/3

so với cây có củ Phần trong của vỏ hay sợi thường dùng để làm vải (Mayaki, 2003)

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của quả và hạt sa kê

Thành phần Hạt sa kê Quả sa kê

1 2 3 Chín Tươi Nước (%) 64,7 – 66,2 56,3 56 47,7 61,9

Surat và cs (2007) đã phân lập được 9 hợp chất flavon từ rễ cây sa kê có khả năng kháng lao và kháng sốt rét: Cycloartocarpin, artocarpin, morusin, cudraflavone B, cycloartobiloxanthone, artonin E, cudraflavone C và artobiloxanthone và những chất này kháng lại các dòng độc tế bào gây bệnh ung thư vòm miệng và ung thư vú

Taslim và cs (2000) đã cô lập một số isoprenylated flavonoid mới được đặt tên morusin, artonin E, cycloartobiloxanthone và artonol B từ vỏ rễ của cây sa kê, những hợp chất này có độc tính cao chống lại Artemia salina – một trong những vi sinh vật chuẩn để kiểm tra độc tính của hóa chất

Arung và cs (2009) khảo sát đánh giá tính chất kháng ung thư từ dịch chiết diethylether của gỗ sa kê Dịch chiết được kiểm tra với dòng tế bào T47D gây bệnh ung thư vú ở người và kết quả cho thấy dịch chiết này có khả năng kháng ung thư

Jatap và Bapat (2010) đã phân lập một số chất trong rễ của cây sa kê chống oxy hóa mạnh và ngăn cản quá trình oxy hóa làm hư hỏng DNA

2.3 Tổng quan về các hợp chất thiên nhiên

Hợp chất tự nhiên (natural products), phân tử sinh học tự nhiên (biological molecule)là các chất biến dưỡng thứ cấp (hợp chất thứ cấp) có trọng lượng phân tử nhỏ (M 1500 amu) được tạo ra bởi cơ thể sinh vật Các chất biến dưỡng này có thể cần thiết hoặc nhiều khi không cần thiết cho sự sống của sinh vật, đặc biệt là thực vật (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

-Các chất này có vai trò trong sự sống và sinh sản như: chống chịu với môi trường bất lợi, chống lại động vật ăn cỏ, tác nhân mầm bệnh…phân tán phấn hoa, hạt nhờ màu sắc và hương thơm của hoa Các chất biến dưỡng thứ cấp có thể đóng vai trò như một chất gây biến ăn, mất ngủ, dẫn dụ giới tính, chất kháng sinh, để bảo vệ loài đó không bị các loài khác gây hại

Các hợp chất thứ cấp có nhiều loại và được xếp vào những nhóm khác nhau Các hợp chất thứ cấp của thực vật thường thuộc nhóm: carotenoid , alkaloid, quinonoid, steroid, flavonoid, coumarin, glycosid…

Một số hợp chất thường gặp trong thực vật:

Carotenoid: là một dạng sắc tố hữu cơ có tự nhiên trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như là tảo, một vài loài nấm và một vài loài vi khuẩn Hiện nay người ta đã tìm được 600 loại carotenoid, sắp xếp theo hai nhóm: xanthophylls và carotene.

Carotenoid là nhóm các hợp chất có công thức cấu tạo và tác dụng bảo vệ cơ thể tương tự nhau Carotenoid khá quen thuộc với chúng ta là bêta -caroten hay còn gọi là tiền chất của vitamin A Trong mấy năm gần đây người ta còn nói nhiều đến các arotenoid khác như lycopen, lutein và zeaxanthin Carotenoid giúp chống lại các tác nhân oxy hóa từ bên ngoài

Alkaloid: là nhóm các bazơ nitơ hữu cơ có trong động và thực vật Đặc tính bazơ của các alkaloid được phản ánh trong tên gọi của lớp các hợp chất này (alkaloid - tương

tự chất kiềm) Trong thực vật, các alkaloid thường tồn tại dưới dạng muối với các axít hữu cơ Phần lớn các chất này tác dụng lên hệ thần kinh, liều thích hợp là thuốc chữa bệnh hiệu quả nhưng liều cao là thuốc độc

Flavonoid: là một nhóm hợp chất rất thường gặp trong thực vật, là một nhóm hoạt chất lớn trong dược liệu Phần lớn các flavonoid có màu vàng, ngoài ra còn có những chất màu xanh, tím, đỏ hoặc không màu

Flavonoid có mặt trong tất cả các bộ phận của các loài thực vật bậc cao, đặc biệt

là hoa, tạo ra những sắc màu rực rỡ để quyến rũ các loại côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây Trong cây, flavonoid giữ vai trò là chất bảo vệ, chống oxy hóa, bảo tồn acid ascorbic trong tế bào, ngăn cản một số tác nhân gây hại cho cây (vi khuẩn, virus, côn trùng, ) một số còn có tác dụng điều hòa sự sinh trưởng của cây cối

Tannin: là một hợp chất ester giữa đường glucose và một nhóm chất khác, thường là một phức hợp của acide phenolic hoặc acide oxyphenolic Theo Kumara và D’Mello (1995) tannin là những hợp chất có chứa phenolic hòa tan, có phân tử lượng

>500 kDa, có khả năng kết tủa với gelatin và các protein trong môi trường nước Trong thực vật có 2 loại tannin: một loại tannin có khả năng thủy phân gọi là hydrolysabletannin (HTs) và một loại không có khả năng thủy hóa gọi là condensed tannin (CTs)

Saponin: Saponin là một glycoside tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật Saponin có tính chất chung là khi hoà tan vào nước có tác dụng làm giảm sức căng

bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt, có tính chất phá huyết, độc đối với động vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với cholesterol, có vị hắc và làm hắt hơi mạnh Một vài động vật cũng có saponin như loài hải sâm, cá sao

Acid hữu cơ: Acide hữu cơ là hợp chất hữu cơ có tính acide thường gặp nhất là các acid carboxylic Ngoài ra còn một số nhóm chức khác có thể gây ra tính acide yếu: hydroxyl (–OH), alkenol, phenol, v.v

2.4 Kĩ thuật tách chiết hợp chất hữu cơ

Tùy thuộc vào tính chất và cấu trúc các chất mà có những phương pháp tách chiết hợp chất hữu cơ khác nhau Các kĩ thuật chính vẫn thường sử dụng để tách chiết họp chất thứ cấp là chiết lỏng - lỏng, chiết ngấm kiệt, chiết ngâm dầm và chiết bằng soxhlet (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

2.4.1 Kĩ thuật chiết lỏng – lỏng

Đây là kĩ thuật dùng để chiết các chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu khi mà có quá nhiều hợp chất từ không phân cực đến phân cực trong một một dung dịch Phương pháp này hay còn được gọi là phương pháp chiết bằng dung môi (Solvent extraction) Nguyên liệu ban đầu thường được chiết trong ethanol 70%, dung dịch chiết ban đầu thường chứa các hợp chất hữu cơ từ kém phân cực đến phân cực mạnh vì thế rất khó cô lập riêng những chất tinh khiết

Nguyên tắc là các dung môi không phân cực sẽ hòa tan các chất không phân cực (alcol béo, este béo… dùng ether dầu hỏa), dung môi phân cực yếu sẽ hòa tan các chất phân cực yếu (nhóm -O-, CH=O, -COO-, -CO-…) các dung môi độ phân cực mạnh (-OH, -COOH…)

2.4.2 Kĩ thuật chiết ngấm kiệt

Phương pháp chiết ngấm kiệt được sử dụng phổ biến hơn vì thiết bị và kĩ thuật không đòi hỏi phức tạp

Nguyên liệu được xây thành bột lọt qua rây 3 mm Mẫu quá to sẽ chiết không kiệt, quá nhỏ sẽ trương ra cản trở dòng chảy Đáy bình được lót bằng bông thủy tinh

và một tờ giấy lọc Bột được đặt lên trên lớp bông thủy tinh, đặt gần đầy bình Đậy lớp bột bằng một tờ giấy lọc và phủ lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Rót dung môi phù hợp vào bình phủ xấp xấp phía trên lớp mặt

Để yên nhiệt độ phòng từ 12-24 giờ Mở van bình ngấm kiệt cho dịch chiết chảy nhanh ra từng giọt và đồng thời mở khóa bình để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung môi chảy ra khỏi bình

2.4.3 Kĩ thuật chiết ngâm dầm

Kĩ thuật này tương tự chiết ngấm kiệt vì thiết bị và kĩ thuật không đòi hỏi phức tạp và có thể dễ dàng thao tác với một lượng mẫu cây lớn Ngâm bột cây trong một bình thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ Tránh dùng bình nhựa vì dung môi có thể hòa tan nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có trong mẫu

Rót dung môi vào xấp xỉ bề mặt bột cây, ngâm qua đêm cho dung môi xuyên thấm qua tế bào hòa tan các hợp chất, lọc thu dịch chiết và thu hồi dung môi ta được cao thô Tiếp tục rót dung môi mới vào và lặp lại quy trình cho đến khi chiết kiệt chất trong bột cây Phương pháp chiết này có thể kết hợp với gia tăng nhiệt độ giao động khoảng 30 -40oC và đánh sóng siêu âm hiệu quả cao hơn

2.4.4 Kĩ thuật chiết soxhlet

Kĩ thuật này được sử dụng chiết kiệt hợp chất trong bột cây vì dung môi được hồi lưu liên tục Dung môi ngấm vào bột cây và chiết những chất hữu cơ hòa tan trong dung môi Theo quá trình đun nóng dung môi từ bình cầu rơi vào bình chứa mẫu, dung môi nhiều sẽ tràn qua bình chứa mẫu đồng thời lôi cuốn hợp chất chiết xuống bình cầu Quá trình này hồi lưu khép kín cho đến khi chiết kiệt

Phương pháp này sử dụng lượng dung môi ít mà chiết kiệt được mẫu cây Nhưng hạn chế do kích thước của máy chiết làm hạn chế lượng bột chiết, trong quá trình đun nóng các hợp chất kém bền có thể bị phân hủy

2.5 Tổng quan vi sinh vật gây bệnh đường ruột

2.5.1 E coli

E coli là giống vi khuẩn đường ruột còn có tên là Bacterium coli commune,

Bacillus, colicommunis được Escherich phân lập năm 1885 từ phân trẻ em Vi khuẩn

E coli xuất hiện rất sớm trong ruột người và động vật sơ sinh (sau khi đẻ 2 giờ) thường

ở phần sau của ruột, dạ dày và ruột non và có thể tìm thấy ở niêm mạc của nhiều bộ

phận khác trong cơ thể E coli được phân chia type dựa vào cấu trúc kháng nguyên, có

3 loại kháng nguyên: O, H, K

Trong điều kiện thường E coli có sẵn trong ruột người và động vật nhưng chỉ

gây bệnh khi sức đề kháng giảm Gây bệnh kế phát từ những bệnh thiếu dinh dưỡng, bệnh do virus và ký sinh trùng và cho súc vật non mới sinh 2-3 ngày hoặc 4-8 ngày

Colibacillois là một bệnh đường ruột thường gặp ở: ngựa, bê, cừu, heo và gia

cầm non do E coli gây ra Ở người cũng có thể gây viêm phổi, viêm não, đặc biệt bệnh

tiêu chảy ở trẻ em E coli sinh nội độc tố, không sinh nha bào, chịu được nhiệt độ 55oC trong 1 giờ, 60oC trong 30 phút và 100oC chết ngay Các chất sát trùng thông thường như: acid phenic, biclorua thủy ngân, formon và hydroperoxit 1‰ diệt được vi khuẩn trong 5 phút

2.5.2 Salmonella spp

Salmonella là trực khuẩn Gram (-) thuộc họ Enterobacteriaceae có kích thước

khoảng 2-3 × 0,4-0,6 µm, hiếu khí hay yếm khí tuỳ nghi, có tiêm mao, không tạo bào

tử Salmonella có ba loại kháng nguyên (kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và kháng nguyên Vi) Salmonella gây bệnh đường ruột người, gia súc và gia cầm gọi là bệnh thương hàn và phó thương hàn Chủng Salmonella typhi là chủng nguy hiểm nhất

gây bệnh thương hàn cho người và động vật, ở gà mái mắc bệnh thì vi khuẩn truyền qua trứng và phôi gà, gây ngộ độc thực phẩm cho người

Số liệu thống kê từ tháng 12 năm 2000 đến tháng 4 năm 2001 ở Tân Phú Thạnh,

TP Cần Thơ trong 30 chủng Salmonella có 11 chủng đề kháng với kháng sinh chiếm

36,6%, trong đó 7 chủng kháng với 1 loại kháng sinh và 4 chủng kháng với 2 loại kháng sinh Tỉ lệ kháng ampicillin 54,5%, chloramphenicol 36%, tetracycline 36%, cephalexin 9% (Trần Thị Phận và cs, 2004)

2.5.3 Staphylococcus aureus

Một số vi khuẩn Staphylococcus có thể tạo ra enterotoxin - độc tố chịu nhiệt

Thông thường, trong vòng vài giờ sau khi ăn thực phẩm bị ô nhiễm thì xảy ra chứng viêm dạ dày - ruột Triệu chứng thông thường nhất khi nhiễm enterotoxin là buồn nôn, nôn mửa và tiêu chảy sau 2-6 giờ kể từ lúc ăn phải thực phẩm bị nhiễm

Đây là những cầu khuẩn Gram dương có đường kính 0,8 -1,0 µm, trong tiêu bản

có thể thấy phân bố riêng lẻ nhưng thường tạo khối gồm nhiều tế bào thành hình chùm nho, không có tiêm mao và thuộc họ Micrococcaceae là những vi khuẩn yếm khí tùy nghi

Vi khuẩn này phân lập được từ đường ruột, da và niêm mạc với tần số cao từ bệnh phẩm như là một nguyên nhân cảm nhiễm cơ hội Gần đây, sự xuất hiện các chủng

tụ cầu khuẩn đề kháng các chất kháng sinh hệ β-lactam (tụ cầu vàng đề kháng methicillin, đề kháng vancomycin) như là một bệnh nguyên chủ yếu làm vấn đề cảm nhiễm bệnh viện cũng như sự vô hiệu trong điều trị bệnh bằng thuốc ở người càng thêm

trầm trọng Các tụ cầu vàng sản sinh các loại enzyme ngoại bào và ngoại độc tố được coi là những nhân tố hình thành bệnh từ phía vi khuẩn

2.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa

2.6.1 Khái niệm khả năng chống oxy hóa

Các chất chống oxy hóa có chức năng bảo vệ tế bào cơ thể chống lại các tổn thương do thành phần gốc tự do gây ra Khi cơ thể sử dụng oxy cho các hoạt động hằng ngày sẽ tạo ra các thành phần gốc tự do ngăn cản quá trình hấp thu oxy làm cho tế bào

bị tổn thương Việc này có thể thúc đẩy nhanh quá trình lão hóa làm suy giảm chức năng hệ miễn dịch, gây ra nhiều bệnh thoái hóa mãn tính như là bệnh tim mạch và các loại bệnh ung thư khác

Trong bản thân sinh vật sống luôn có hệ thống enzyme điều hòa các loại phân tử oxy có hoạt tính cao như superoxide, dismutase, catalac, glutathione peroxide là các enzyme điều hòa duy trì sự an toàn trong giới hạn cho phép của anionsuperoxide, H2O2

và các hyroperoxide hữu cơ tương ứng, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc khử độc của cơ thể Hệ thống khử độc cũng bị tác động bởi các yếu tố như: hệ thống quá tải, không khí bị ô nhiễm, bụi, khói thuốc lá, bức xạ tử ngoại… Khi các loại oxy có hoạt tính cao này vượt quá giới hạn cho phép sẽ trở thành nguồn bệnh, thúc đẩy nhanh quá trình lão hóa Hệ thống bảo vệ cơ thể này được cải thiện cải thiện và hỗ trợ từ các hợp

chất thứ cấp trong thực vật như: carotenoid, flavonoid, vitamin C, E…

2.6.2 Xác định khả năng kháng oxy hoá bằng thử nghiệm DPPH

Nguyên tắc: Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế dập tắc gốc tự do sẽ làm giảm màu của dung dịch DPPH (1,1-diphenyl -2- picrylhydrazyl) Xác định khả năng này bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng có độ hấp thu cực đại tại giá trị

OD 517 nm

Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) được tính theo công thức:

Ao: độ hấp thu mẫu đối chứng (DPPH) ở bước sóng 517 nm A: độ hấp thu mẫu thử ở bước sóng 517 nm

Từ nồng độ mẫu và giá trị OD dựng được đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa giá trị OD và HTCO Dựạ vào phương trình đường chuẩn tính được giá trị

IC50 (khả năng đánh bắt 50% gốc tự do DPPH của mẫu)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 12 năm 2012 đến tháng 5 năm 2013 tại phòng thí nghiệm Hóa lí và phòng Vi sinh của Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM

DMSO (Prolabo)

Trolox Ampicilline Cồn 96o, 70o Vitamin E, Vitamin C Nước muối sinh lí 0,85%Methanol (Xilong – Chemical 99,5%)

Môi trường dinh dưỡng TSB (Tryptic soy broth)

H2SO4, HCl, chloroform, Na2CO3, NaOH, FeCl, Mg, gelatin Thuốc thử: Dragendorff, Mayer, Wanger, Fehlin

b

b

3.2.4 Thiết bị và dụng cụ

Máy Vortex (Đức) Micropippete Nichipet (Nhật)

Tủ sấy Memmert (Đức)

Máy xây mẫu Philip (Mỹ)

Tủ mát Darling (Việt Nam)

Cân điện tử Bp 210S- SAG (Đức) Giấy lọc (Việt Nam, Trung Quốc) Giấy bạc, túi nilong, bình định mức Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R – 200 (Đức)

Bồn siêu âm Power sonic 510 Hwashin (Hàn Quốc)

Đèn cồn, tủ sấy, tủ autoclave, ống nghiệm, đĩa petri, que cấy vòng

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Xác định ẩm độ nguyên liệu

Tất cả các dược liệu khi bảo quản ở nhiệt độ thường đều chứa một lượng nước

nhất định Xác định ẩm độ là tỉ lệ phần trăm (%) nước có trong mẫu phân tích nhằm

kiểm tra nguyên liệu có đạt tiêu chuẩn hay không (Trần Hùng, 2006)

Thông thường đối với hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao như tinh dầu người ta

thường dùng phương pháp chưng cất với dung môi để xác định ẩm độ Tuy nhiên, với

dược liệu chứa hợp chất bền với nhiệt thì thích hợp với phương pháp sấy (phương

pháp trọng lượng) Nước được đưa ra khỏi dược liệu bằng cách sấy ở 105oC dưới áp

suất thường trong tủ sấy hay thiết bị đặc biệt Phương pháp này được áp dụng rộng rãi

với đa số các loại dược liệu

Thực hiện:

Xác định lượng nước trong dược liệu theo tiêu chuẩn Dược điểm Việt Nam IV

(Bộ Y tế, 2010)

Cân chính xác khoảng 1-2 g nguyên liệu vào cốc thủy tinh có nắp mài (đã sấy

khô khối lượng không đổi) đem vào tủ sấy 105oC trong 4 giờ

Lấy cốc ra đưa vào bình hút ẩm, chờ cốc nguội đem cân và ghi nhận kết quả

Lập lại nhiều lần đến khi khối lượng giữa 2 lần cân không vượt quá 0,5 mg

Ẩm độ được tính theo công thức:

X: ẩm độ nguyên liệu (%) a: khối lượng nguyên liệu trước khi sấy (g)

b: khối lượng nguyên liệu sau khi sấy (g)

Thí nghiệm lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình

3.3.2 Tính hiệu suất thu hồi cao chiết

Hiệu suất thu hồi cao chiết là hàm lượng cao sau khi chiết so với khối lượng nguyên liệu ban đầu, được tính theo công thức sau:

H: hiệu suất thu hồi (%)

m1: khối lượng bình và cao sau sấy (g)

m2: khối lượng bình sau sấy (g)

m: khối lượng cao (g)

Khối lượng cao thu được bằng tổng các cao của các hệ dung môi

Tách chiết cao tổng bằng phương pháp ngâm dầm kết hợp đánh sóng siêu âm

Đây là phương sử dụng phổ biến vì kĩ thuật chiết đơn giản không đòi hỏi thiết

bị phức tạp và dễ thao tác với số lượng mẫu lớn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Ngâm bột nguyên liệu (100 g) trong bình chứa bằng thủy tinh Đánh sóng siêu

âm 30 phút/30oC Để yên nhiệt độ phòng qua đêm cho dung môi xuyên thấm qua các

tế bào thực vật, hòa tan các hợp chất thứ cấp có trong nguyên liệu

Hình 3.2 Sơ đồ chiết cao tổng sử dụng trong nghiên cứu

Chiết kiệt với petroleum ether

Lọc, thu hồi dung môi

Chiết kiệt với ethylacetate Lọc, thu hồi dung môi

Chiết kiệt với ethanol

Lọc, thu hồi dung môi

Chiết kiệt với nước Lọc, thu hồi dung môi

Bột khô

Cao petroleum Bã chiết còn lại

Cao ethylacetate Bã chiết còn lại

Cao Ethanol Bã chiết còn lại

Cao nước Bã còn lại bỏ

Dung môi vào bình sắp sắp bề mặt lớp bột nguyên liệu Lọc và thu dịch chiết đem cô quay chân không thu hồi dung môi đến cắn sẽ có được cao chiết Mỗi mẫu được chiết với 3 lần lặp lại cùng dung môi và lần lược chiết qua các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau như: Petroleum ether, Ethyl acetae, Ethanol, nước cất vô trùng Đánh sóng siêu âm 30 phút/30oC Để yên nhiệt độ phòng qua đêm cho dung môi xuyên thấm qua các tế bào thực vật, hòa tan các hợp chất thứ cấp có trong nguyên liệu

3.3.3 Các chỉ tiêu phân tích hóa thực vật

Dựa vào độ hòa tan của các hợp chất trong dược liệu mà sử dụng các dung môi thích hợp với độ phân cực tăng (Nguyễn Khắc Huỳnh Cứ, 2000; Nguyễn Kim Phi

Phụng, 2007)

Chuẩn bị dịch chiết:

Dịch chiết ether: Chiết 10 g bột nguyên liệu trong bình thủy tinh bằng petroleum ether trong bồn siêu âm 30 phút/lần Chiết cho đến khi dịch ether bốc hơi không còn vết mờ trên giấy thấm Gộp dịch chết lại đem cô quay còn khoảng 50 ml dịch chiết ether

Dịch chiết cồn: bã sau khi chiết bằng ether được chiết tiếp với cồn cao độ trong bồn siêu âm 30 phút/lần (lập lại 3 lần) Gộp dịch chiết lại và đem cô quay còn thể tích khoảng 50 ml dịch chiết cồn

Dịch chiết nước: bã sau khi chiết với cồn tiếp tục chiết với nước nóng trên bếp cách thủy Gộp dịch chiết lại để nguội lọc (đem cô quay nếu cần) còn khoảng 50 ml

dịch chiết nước

Các phản ứng hóa học khảo sát các nhóm chất:

 Xác định tinh dầu: lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào cốc sứ, bốc hơi tới cắn Nếu cắn có mùi thơm nhẹ, thêm vào cắn ít cồn cao độ và cho bốc hơi tới cắn Phần cắn

có mùi thơm nhẹ: có tinh dầu

 Xác định chất béo: lấy vài giọt dịch chiết nhỏ giọt lên mặt kính hay tờ giấy lọc mỏng, hơ hoặc sấy nhẹ bay hết dung môi (và hết mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu) Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết có vết mờ: có chất béo

 Định tính triterpenoid: lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào cốc sứ, bốc hơi tới cắn Hòa tan cắn trong 0,5 ml anhydride acetic và 0,5 ml dung dịch chloroform Chuyển phần dung dịch vào 1 ống nghiệm khô Thêm nhỏ giọt 1 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm Tại nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ tím, phần dung dịch phía trên chuyển sang màu xanh lục hay tím: có triterpenoid

 Định tính coumarin: thực hiện phản ứng đóng mở vòng lacton, dùng 2 ống nghiệm: mỗi ống chứa 1 ml dịch chiết, cho vào mỗi ống 1 ml NaOH 10% đun nhẹ, để nguội Sau đó, cho vào mỗi ống 5 ml nước cất ở ống 1 trong, ống 2 vẩn đục Tiếp tục acide hóa ống 1 bằng dung dịch H2SO4 25% có hiện tượng vẩn đục và ở ống 1 tủa đục như ống 2

 Định tính flavonoid: các flavonoid có nhân - pyron và - dihydropyron (flavanon, flavanonol, flavon, flavonol) định tính bằng phản ứng cyaniding Lấy khoảng 10 ml dịch chiết vào cốc sứ, bốc hơi tới cắn Hòa tan cắn với 2 ml cồn và gạch dịch cồn vào trong 1 nghiệm nhỏ Thêm ít bột magie kim loại và cho từ từ 0,5 ml HCl đậm đặc Dung dịch có màu đỏ hồng: có flavonoid

 Định tính anthocyanoid: lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Thêm 2-3 giọt dung dịch HCl 10% Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ và chuyển sang xanh khi kiềm hóa bằng NaOH 10%: có anthraquinon

 Định tính proanthocyanidin: lấy 5 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Thêm 2-3 giọt dung dịch HCl 10% và đun trên bếp cách thủy 10 phút Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ: có proanthocyanidin

 Định tính tannin: lấy khoảng 2 ml dịch chiết cho vào cốc sứ, bốc hơi tới cắn Hòa cắn trong 4 ml nước cất trên bếp đun cách thủy, lọc vào 2 ống nghiệm:

 Ống 1: pha loãng 0,5 ml dịch đã lọc với 1 ml nước cất Thêm 2- 4 giọt thuốc thử FeCl3 5% lắc đều Nếu dung dịch có màu xanh rêu hay xanh đậm: có polyphenol

 Ống 2: thêm vào dịch lọc 5 giọt dung dịch gelatin 0,5%, lắc đều và so sánh với dung chiết ban đầu Nếu có tủa bông trắng: có tannin

 Định tính saponin: lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào cốc sứ, bốc hơi tới cắn Hòa cắn trong 5 ml cồn 25% trên bếp đun cách thủy, lọc vào ống nghiệm Thêm 5 ml nước vào lắc theo chiều dọc ống Ống nghiệm có bọt bền : có saponin

 Định tính các chất khử: lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào cốc sứ, bốc hơi tới cắn Hòa cắn trong 3 ml nước cất trên bếp đun cách thủy, để nguội và lọc qua giấy lọc Thêm vào dịch lọc 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 ml dung dịch Fehling B Đun cách thủy 5 phút Xuất hiện đỏ gạch phần đáy ống nghiệm: có hợp chất chất khử

 Định tính acide hữu cơ: lấy 2 ml dịch chiết vào một ống nghiệm Thêm 1 ml nước cất và một ít tinh thể Na2CO3 Nếu có bọt khí nhỏ sủi lên: có acide hữu cơ

 Định tính polyuronid: nhỏ từng giọt dịch chiết vào ống nghiệm có sẵn 10 ml cồn 96% Nếu có tủa bông trắng được tạo thành: có polyuronid

 Định tính anthraquinon: các hợp chất anthraquinon trong dịch chiết ether (dạng

tự do, oxy hóa) được định tính bằng phản ứng Borntrager Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào 1 ml dung dịch NaOH 10% và lắc kĩ Nếu lớp kiềm có màu hồng tới đỏ: có anthraquinon

 Định tính carotenoid: lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào cốc sứ, bốc hơi tới cắn (gần như không còn mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu) Thêm vào cắn vài giọt

H2SO4 đậm đặc Dung dịch có màu xanh dương hay xanh đậm: có carotenoid

 Định tính alkaloid: lấy khoảng 10 ml dịch chiết vào vào cốc sứ, bốc hơi tới cắn Hòa cắn trong 4 ml dung dịch HCl 1% Chia dung dịch acide vào trong 4 ống nghiệm Định tính bằng các thuốc thử:

 Thuốc thử Mayer: kết tủa trắng – vàng nhạt

 Thuốc thử Wanger: tủa nâu đỏ

 Thuốc thử Dragendorff: tủa đỏ cam

Hình 3.3 Sơ đồ khảo sát thành phần hóa thực vật trên cao tổng

3.3.4 Khảo sát tính kháng khuẩn của cao chiết sa kê

Các phương pháp thường được sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn của của chất thử nghiệm nhằm đánh giá sự nhạy cảm của vi sinh vật đối một số hợp chất hay xác định lượng tối thiểu của chất thử nghiệm (hoặc kháng sinh) có thể ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật Có 2 phương pháp chính thực hiện kháng sinh đồ: phương pháp đĩa giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch và phương pháp pha loãng kháng sinh

trong môi trường lỏng xác định giá trị MIC (Nguyễn Ngọc Hải và cs, 2009)

Dịch chiết nước

Loại bã Chiết với nước

Chiết với cồn

Bã

Bột nguyên liệu

Dịch chiết

ether

Tinh dầu Chất béo Triterpenoid Coumarin Flavonoid Alkaloid Anthocyanoid Proanthocyanidin Tannin Saponin Các chất khử Acide hữu cơ Polyuronid Anthraquinon Carotenoid

Tinh dầu Chất béo Triterpenoid Coumarin Flavonoid Alkaloid Anthocyanoid Proanthocyanidin Tannin Saponin Các chất khử Acide hữu cơ Polyuronid Anthraquinon Carotenoid

Bã