KIỂM TRA, ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở HEO (PRRSV) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA VÀ RTPCR

Kháng thể PRRSV được phát hiện thông qua các kỹ thuật huyết thanh học như ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay - xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme, IFA indirect immunof

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KIỂM TRA, ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KIỂM TRA, ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP

Ở HEO (PRRSV) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ELISA VÀ RT-PCR

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI TRƯƠNG THỊ DIỄM HẰNG

Tháng 6/2013

cô đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian tôi theo học ở trường

Cảm ơn PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng vì học trò, tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong thời gian tôi thực hiện khóa luận

Cảm ơn KS Vương Thị Hồng Vy và KS Võ Tấn Hùng, công tác tại Phòng xét nghiệm chẩn đoán thú y Hàn - Việt, khoa Chăn nuôi thú y, trường Đại Học Nông Lâm

Tp Hồ Chí Minh đã trực tiếp giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện khóa luận

Cảm ơn KS Huỳnh Đăng Sang, KS Võ Khánh Hưng và các thầy cô, anh chị đang công tác tại Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học

và Môi trường đã giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện khóa luận

Cảm ơn các bạn sinh viên lớp DH09SH, đã giúp đỡ, góp ý và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian học tập và thực hiện khóa luận Cảm ơn các bạn, chúc các bạn thành công

Tp Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013 Trương Thị Diễm Hằng

TÓM TẮT

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS) đã và đang là mối lo ngại hàng đầu của các trang trại chăn nuôi Cho đến nay PRRS đã trở thành dịch bệnh lưu hành ở nhiều châu lục trên thế giới, là một trong những bệnh gây tổn thất nặng nề

về kinh tế cho ngành chăn nuôi ở nhiều quốc gia trong đó có Việt Nam Nhờ sự phát triển của khoa học, việc giám sát và kiểm soát PRRS trở nên có hiệu quả hơn Kiểm tra kháng thể PRRSV và sự hiện diện của PRRSV có vai trò quan trọng trong việc đánh giá và kiểm soát PRRS Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, đề tài “ Kiểm tra, đánh giá tình trạng vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRSV) bằng phương pháp ELISA và RT - PCR” được tiến hành làm nền tảng phục vụ cho công tác kiểm soát PRRS

Đề tài được thực hiện với nguyên liệu ban đầu là 75 mẫu máu heo thu từ 3 trại heo ở Bình Dương Mẫu được ly tâm nhẹ để tách huyết thanh, dùng làm nguyên liệu cho phản ứng ELISA và PCR Kết quả ELISA cho thấy cả 3 trại đều có heo dương tính với ELISA, 52% (39/75) mẫu huyết thanh dương tính, nhưng phân bố không đồng đều theo trại và nhóm tuổi heo Tiến hành PCR 75 mẫu nêu trên thu được 7/75 (9,333%) mẫu xét nghiệm dương tính với PRRSV và các mẫu này tập trung chủ yếu ở trại 3 Bằng việc sử dụng phối hợp 3 phương pháp là ELISA, RT - PCR và PCR bước

2 trên cùng một mẫu, nhận thấy rằng những mẫu có ELISA (+) : RT - PCR (-) : PCR -

2 (-) chiếm tỷ lệ cao nhất 48% (36/75), tổ hợp này xuất hiện trên cả 3 trại lấy mẫu trong đó cao nhất là trại 2 Tổ hợp ELISA (-) : RT - PCR (+) : PCR - 2(+) chiếm tỷ lệ 5,333% (4/75) và tổ hợp này tập trung ở trại 3 Tổ hợp ELISA (+) : RT - PCR (+) : PCR – 2 (+) chiếm tỷ lệ 4% (3/75) Những con heo trong 3 tổ hợp kết quả trên được cách ly hoặc loại khỏi đàn khẩn cấp để hạn chế sự lây nhiễm Trong tổng số 75 con heo được xét nghiệm thì có 32/75 (42,67%) heo âm tính với cả 3 phản ứng, trong đó 75% (24/32) mẫu ở trại 1, 18,75% ở trại 2 và 6,25% ở trại 3 Những con heo này được được kết luận là âm tính với PRRSV và được giữ lại đàn

SUMMARY

Testing and evaluation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus

(PRRSV) by ELISA and RT - PCR Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) has been a top concern

of the farm So far, PRRS which causing heavy losses to the breeding economy in many countries, has become endemic in many countries in the world, including Vietnam Thanks to the development of science, monitoring and controlling PRRS become more effective Testing PRRSV antibodies and the presence of PRRSV have

an important role in the evaluation and controlling of PRRS "Testing and evaluation

of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by ELISA and RT - PCR" was conducted as the basis for the PRRS control

The study was conducted with 75 blood samples collected from 3 farms in Binh Duong province To collect serums for ELISA and PCR reactions, samples were centrifuged ELISA results showed that all three pig farms are positive for ELISA, 52% (39/75) seropositive samples, but not distributed by age group and farms However, when those samples was PCR, 7/75 (9.333%) samples were positive for PRRSV and almost were in farm 3 By using the combination 3 methods are ELISA,

RT - PCR and PCR on the sample, it was found that samples with ELISA (+) : RT - PCR (-) : PCR - 2 (-) accounted for highest rate, 48% (36/75), this combination appears on all 3 farms and farm 2 had hightest rate Combination ELISA (-) : RT - PCR (+) : PCR - 2(+) accounted for 5.333% (4/75) and this status focused in farm 3 Combination ELISA (+) : RT - PCR (+) : PCR - 2(+) accounted for 4% (3/75) Pigs in

3 combinations were emergency removed from the farm to limit the infection In a total of 75 pigs were tested, 32/75 (42.67%) pigs were negative for 3 reactions, which 75% in farm 1, 18.75% in farm 2 and 6.25% in farm 3 The pigs were concluded negative with PRRSV and retained in farm

This topic is the first step of the protocol of test and removal for the elimination

of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) Test results provide

an overview the immunity level of PRRSV and the presence of PRRSV, contributing

to the development of strategies to control PRRS

Keywords: PRRSV, evaluation, removal, RT - PCR, ELISA

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo trên thế giới và Việt Nam 3 2.2 Vi rút PRRS 5

2.3 Cơ chế gây bệnh của PRRSV 8

2.4 Triệu chứng lâm sàng của PRRS 10

2.5 Bệnh tích của heo nhiễm PRRSV 11

2.6 Chẩn đoán PRRSV 12

2.6.1 Phân lập PRRSV 12

2.6.2 Xét nghiệm huyết thanh học PRRSV 12

2.6.3 Phản ứng dây chuyền nhờ vào polymerase 15

2.7 Tình hình nghiên cứu, phát hiện PRRSV ở trên thế giới và Việt Nam 18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

3.2 Vật liệu 21

3.2.1 Mẫu thí nghiệm và vật liệu phòng thí nghiệm 21

3.2.2 Hóa chất 21

3.2.2.1 Hóa chất dùng trong phản ứng ELISA 21

3.2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng RT - PCR 21

3.2.2.3 Hóa chất dùng trong điện di 22

3.2.2.4 Hóa chất dùng ly trích RNA 22

3.3 Phương pháp nghiên cứu 23

3.3.1 Lấy mẫu máu 23

3.3.2 Xử lý mẫu 24

3.3.3 Phản ứng ELISA 24

3.3.4 Ly trích RNA từ mẫu máu 25

3.3.4.1 Ly trích RNA bằng SV Total RNA Isolation System 25

3.3.4.2 Ly trích RNA bằng RNeasy Mini Kit 26

3.3.5 Phát hiện PRRSV trong mẫu bằng RT - PCR 27

3.3.5.1 Mồi phát hiện PRRSV 27

3.3.5.2 Phản ứng phiên mã ngược 27

3.3.5.3 Thực hiện phản ứng PCR 29

3.3.6 Phát hiện PRRSV trong mẫu bằng PCR bước 2 30

3.3.6.1 Mồi phát hiện PRRSV 30

3.3.6.2 Phản ứng PCR 31

3.3.7 Phân tích kết quả 32

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Kết quả ELISA 33

4.2 Kết quả PCR 35

4.2.1 Kiểm tra qui trình RT - PCR 35

4.2.2 Kết quả RT - PCR và PCR bước 2 38

4.3 Tương quan ELISA : PCR 42

4.3.1 Phân tích tổ hợp ELISA (+) : RT - PCR (+) : PCR - 2 (+) 44

4.3.2 Phân tích tổ hợp ELISA (+) : RT - PCR (-) : PCR - 2 (-) 45

4.3.3 Phân tích tổ hợp ELISA (-) : RT - PCR (+) : PCR - 2 (+) 46

4.3.4 Phân tích tổ hợp ELISA (-) : RT - PCR (-) : PCR - 2 (-) 47

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

5.1 Kết luận 49

5.2 Đề nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 56  

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

cDNA : Complementary Deoxyribonucleic Acid – DNA bổ sung

RNA : Ribonucleic Acid

ctv : Cộng tác viên

ELISA : Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay

OIE : World Organization for Animal Health – Tổ chức Thú y thế giới

ORF : Open Reading Frames – Khung đọc mở

IFA : Indirect immunofluorescence assay

IPMA : Immunoperoxidase monolayer assay

NCBI : National Center for Biotechnology Information – Ngân hàng gen thế giới

PRRSV : Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

Vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo

RT - PCR : Reverse transcriptase - Polymerase chain reaction

SVN : Serum virus neutralization

TCID50 : Tissue Culture Infective Dose 50% - Liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Sáu protein cấu trúc của PRRSV 7

Bảng 2.2 Những bệnh có triệu chứng tương tự PRRS 11

Bảng 3.1 Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng RT - PCR 27

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng phiên mã ngược với bộ kít Access RT - PCR System 28

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng phiên mã ngược với Access RT - PCR System 29

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR 29

Bảng 3.5 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 30

Bảng 3.6 Các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR bước 2 30

Bảng 3.7 Thành phần phản ứng PCR bước 2 31

Bảng 3.8 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR bước 2 31

Bảng 3.9 Các tổ hợp kết quả dự kiến 32

Bảng 4.1 Tỷ lệ dương tính với phản ứng ELISA của các trại 33

Bảng 4.2 Kết quả phản ứng RT - PCR và PCR bước 2 của các trại 39

Bảng 4.3 Kết quả phản ứng ELISA, RT - PCR và PCR bước 2 43

Bảng 4.4 Tương quan ELISA : RT - PCR : PCR bước 2 (PCR-2) 43

vi rút được phân lập năm 1991, tại Hà Lan, với tên gọi vi rút gây hội chứng rối loạn

sinh sản và hô hấp ở heo (PRRSV) PRRSV thuộc chi Arterivirus, họ Arteriviridae,

bộ Nidovirales (Cavanagh, 1997), là loại vi rút có vỏ bọc, cấu trúc RNA sợi đơn dương PRRS xảy ra hầu khắp các khu vực chăn nuôi heo lớn trên thế giới và gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi thế giới nói chung và ngành chăn nuôi của Việt Nam nói riêng

Để xác định sự hiện diện của PRRS trong đàn một cách chính xác cần có sự kiểm tra kháng thể PRRSV và sự hiện diện của PRRSV Kháng thể PRRSV được phát hiện thông qua các kỹ thuật huyết thanh học như ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme), IFA (indirect immunofluorescence assay - xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp), IPMA (immunoperoxidase monolayer assay - xét nghiệm đơn lớp miễn dịch oxy hóa)….Nhiều công trình đã chứng minh khả năng phát hiện kháng thể của các phương pháp này và cho rằng ELISA là phương pháp có độ nhạy cao nhất trong việc phát hiện kháng thể Với độ nhạy cao, qui trình đơn giản, dễ thực hiện cũng như tiết kiệm thời gian, ELISA đã và đang được sử dụng trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán thú y và bệnh ở người Tuy nhiên nếu chỉ dựa vào kết quả phản ứng huyết thanh học để đánh giá tình trạng PRRS thì chưa đủ, vì kháng thể và kháng nguyên có thể không cùng tồn tại, nên việc xác định sự hiện diện của PRRSV trong mẫu rất quan trọng Trong số các phương pháp phát hiện vi rút thì PCR (polymerase chain reaction – phản ứng dây chuyền nhờ polymerase) được coi là nhạy nhất So với nuôi cấy, phân lập vi rút (VI), PCR đơn giản hơn nhưng độ nhạy, độ đặc hiệu lại cao hơn rất nhiều và ít tốn thời gian hơn Dựa vào những lợi thế đó, ELISA và PCR trở thành 2 công cụ hữu ích cho việc chẩn đoán, phát hiện PRRS trong đàn Tuy nhiên, hiện nay ELISA và PCR thường

được sử dụng đơn lẻ mà ít khi được sử dụng kết hợp dẫn đến một số nhận định sai lầm

về tình trạng PRRS trong đàn, gây ảnh hưởng không nhỏ đến công tác kiểm soát PRRS Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên, đề tài “Kiểm tra, đánh giá vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRSV) bằng phương pháp ELISA, RT - PCR” được tiến hành, bước đầu thực hiện qui trình “Xét nghiệm và loại bỏ” đánh giá tình trạng PRRS trong đàn heo nhằm có những biện pháp ngăn chặn kịp thời

1.2 Yêu cầu

- Phát hiện kháng thể chống PRRSV trong huyết thanh heo bằng ELISA

- Phát hiện PRRSV trong huyết thanh heo bằng RT - PCR và PCR bước 2

- Phân tích kết quả

1.3 Nội dung thực hiện

- Lấy mẫu máu từ 3 trại ở tỉnh Bình Dương

- Thực hiện phản ứng ELISA xác định kháng thể PRRSV trong 75 mẫu huyết thanh heo lấy từ 3 trại heo ở Bình Dương

- Thực hiện phản ứng RT - PCR và PCR bước 2 xác định PRRSV trong 75 mẫu huyết thanh trên

- Phân tích tương quan ELISA, RT - PCR và PCR bước 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRS) trên thế giới

và Việt Nam

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (Porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS) được mô tả lần đầu tiên ở Mỹ tại vùng bắc của bang California, bang Iowa và Minnesota vào năm 1987 Rất nhanh sau đó, năm 1988, bệnh lây sang Canada Ở châu Âu nhiều vùng cũng ghi nhận dịch bệnh này như Đức (năm 1990), Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991), Pháp (1992) Năm 1998, bệnh được phát hiện ở các nước châu Á như: Hàn Quốc, Nhật Bản Từ năm 2006 đến năm 2010, khu vực các nước châu Á như Trung Quốc, Việt Nam, Philippines, Thái Lan, Lào và Campuchia liên tiếp bị các đợt dịch PRRS hoành hành do chủng PRRSV độc lực cao Thời gian đầu, do chưa xác định được nguyên nhân gây bệnh nên bệnh PRRS có nhiều tên gọi như bệnh bí ẩn ở heo (Mistery Disease of Swine – MDS), hội chứng hô hấp và sẩy thai ở heo (Porcine endemic abortion and respiratory syndrome – PEARS), và ở Việt Nam PRRS thường được gọi là bệnh heo tai xanh (Blue Ear Disease – BED) Năm 1992, Hội nghị quốc tế về hội chứng này được tổ chức ở Minnesota (Mỹ), tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã thống nhất tên gọi là Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo

Cho đến nay PRRS đã trở thành dịch bệnh lưu hành ở nhiều châu lục trên thế giới, là một trong những bệnh gây tổn thất nặng nề về kinh tế cho ngành chăn nuôi ở nhiều quốc gia Tại Trung Quốc, hai trận dịch PRRS được công bố vào giữa 1990 Từ tháng 6 đến tháng 9 năm 2006, dạng PRRS điển hình nhiễm trên 2 triệu con heo, với 400.000 con chết ở 16 tỉnh (theo Trung tâm Kiểm soát Dịch bệnh động vật Trung Quốc – CADC) Không giống như các chủng PRRSV trước đây, chủng PRRSV phát hiện tại Trung Quốc trong đợt dịch này có độc lực cao hơn nhiều, làm chết nhiều heo trưởng thành và heo nái mang thai (trích dẫn bởi Lê Thanh Hòa và ctv, 2009) Ban đầu, các nhà khoa học và nhà chăn nuôi nghi ngờ nguyên nhân làm tăng độc lực của PRRSV là

do sự nhiễm đồng thời các tác nhân như PRRSV cổ điển, sốt ở heo và circovirus heo

(OIE, 2010) Đầu năm 2007, dịch bệnh tái xuất hiện với 310.000 con heo bị nhiễm, với hơn 81.000 con bị chết và dịch xảy ra trên 26 tỉnh Tháng 8 năm 2007, hơn 314 triệu

liều vắc xin đã được tiêm phòng cho hơn 100 triệu con heo và đến tháng 10 năm 2007, Trung Quốc tuyên bố dịch bệnh đã được kiểm soát Ở châu Phi, tình hình bệnh dịch ít được biết đến Công bố đầu tiên về sự xuất hiện dịch PRRS vào tháng 6 năm 2004, có tổng số 2407 con heo từ 32 trang trại nhiễm bệnh (OIE, 2010) Hai trận dịch bùng nổ vào năm 2005 và năm 2007 châu Phi công bố dịch với hơn 21 trại chăn nuôi heo nhiễm bệnh (OIE, 2010)

PRRS xâm nhập vào Việt Nam từ năm 1996 từ đàn heo giống 51 con nhập từ

Mỹ, nhưng từ 1996 đến 2007, không có báo cáo về bệnh lâm sàng hoặc thiệt hại trực tiếp do vi rút gây ra Trong giai đoạn này đã có thống kê về các trường hợp dương tính với PRRS khi kiểm tra 478 mẫu huyết thanh heo ở Cần Thơ (trích dẫn bởi Lê Thanh Hòa và ctv, 2009) Cuối tháng 2/2007, bằng kỹ thuật RT - PCR, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương xác nhận nguyên nhân gây bệnh cho các đàn heo tại Hải Dương là

do vi rút PRRS và xác nhận PRRSV độc lực cao qua cộng tác và nghiên cứu với các nhà khoa học Trung Quốc và Bắc Mỹ (trích dẫn bởi Lê Thanh Hòa và ctv, 2009) Tháng 3/2008, PRRS tiếp tục bùng phát ở Thanh Hóa và Hà Tĩnh Đến 7/2008, bệnh lan ra 17 tỉnh trên cả nước bao gồm cả Đồng bằng Sông Cửu Long, gây thiệt hại nặng

nề cho ngành chăn nuôi cả nước Kể từ đó dịch bệnh liên tục hoành hành và cho đến nay chưa có một loại vắc xin nào sử dụng ở Việt Nam có thể ngăn ngừa hiệu quả bệnh tai xanh

Năm 2010 là năm dịch tai xanh diễn biến phức tạp nhất, dịch bệnh xảy ra trên

diện rộng từ miền Bắc - Trung - Nam, dịch bệnh xảy ra hai đợt lớn: Đợt 1/2010 (miền Bắc): Dịch heo tai xanh xảy ra từ ngày 23/3/2010 tại Hải Dương Tính đến hết tháng

6/2010, toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại 461 xã, phường, thị trấn của 71 quận, huyện thuộc 16 tỉnh, thành phố gồm Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hà Nội, Nam Định, Hà Nam, Nghệ An, Quảng Ninh, Hòa Bình, Cao Bằng, Sơn La Tổng số heo mắc bệnh là 14.6051 con trong đó số tiêu hủy là 65.911 con Đợt 2/2010 (miền Trung và miền Nam): Đợt dịch này bắt đầu từ ngày 11/6/2010 tại Sóc Trăng Sau đó dịch xuất hiện tại Tiền Giang (19/6), Bình Dương (27/6), Long An (15/7), Lào Cai (11/7), Quảng Trị (01/7) Trong đợt dịch này, toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại 42.080 hộ chăn nuôi của 1.517 xã, phường, thị trấn thuộc 215 quận, huyện của 36 tỉnh, thành phố là

số heo trong đàn mắc bệnh là 970.857 con, số mắc bệnh 717.830 con, trong đó số chết, tiêu hủy 413.540 con (www.sonongnghiepbp.gov.vn)

2.2 Vi rút PRRS

Vi rút PRRS (PRRSV) được phân lập lần đầu tiên vào mùa xuân năm 1991 tại Viện thú y ở Lelystad (Hà Lan) và trong khoảng thời gian ngắn sau đó phòng thí nghiệm ở Mỹ cũng phân lập được vi rút này Do vi rút được phân lập từ ổ dịch ở Lelystad nên gọi là vi rút Lelystad và tên gọi hiện nay là vi rút PRRS Dựa vào kiểu gen, PRRSV chia làm 2 kiểu: kiểu gen châu Âu (type 1), tương ứng là chủng Lelystad (LV) và kiểu gen Bắc Mỹ (type 2), đại diện tương ứng là VR2332 Tuy cách sắp xếp gen giống nhau, nhưng đặc tính gen và hệ gen, độ dài các gen và đặc tính sinh học của các chủng thuộc 2 kiểu này có sự khác biệt Gần đây, qua một nghiên cứu tại Trung

Hình 2.1 PRRS bùng phát tại châu Á được báo cáo năm 2007

(OIE, 2007)

Quốc đã xác định rằng vi rút gây bệnh PRRS tại Trung Quốc có khả năng là do vi rút PRRS type II, thể cường độc gây ra (trích dẫn bởi Lê Thanh Hòa và ctv, 2009)

PRRSV thuộc chi Arterivirus , họ Arteriviridae, bộ Nidovirales (Rossow,

1998) PRRSV là vi rút có vỏ bọc, cấu trúc RNA sợi đơn dương Hệ gen của PRRSV gồm các khung đọc mở: ORF1a, ORF1b, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 và ORF7 ORF1a và ORF1b chiếm gần 75% genome PRRSV, mã hóa RNA polymerase ORF2, ORF3, ORF4 và ORF5 lần lượt mã hóa cho GP2, GP3, GP4 (là các protein chức năng) và GP5 hay E (glycoprotein vỏ) Protein màng (M) của PRRSV được mã hóa bởi ORF6, đây là đoạn bảo tồn nhất trong các ORF của PRRSV và thường được dùng làm trình tự thiết kế mồi trong các phản ứng PCR phát hiện PRRSV ORF7 mã hóa cho protein cấu trúc nucleocapsid N GP2, GP3, GP4 và GP5 là các protein được glycosyl hóa, còn protein N và M là những protein nội màng, không được glycosyl hóa, nhưng có tính kháng nguyên và mức độ bảo tồn cao trong số các protein của vi rút (Helmi Mardassi và ctv, 1994)

PRRSV lưu hành trên thế giới với 2 dòng khác nhau: dòng châu Mỹ (tiêu biểu

là chủng VR-2332) và dòng châu Âu (tiêu biểu là Lelystad - LV) Những chủng PRRSV giữa 2 dòng châu Mỹ và châu Âu có sự khác biệt về đặc tính gây bệnh cũng như khác nhau về đặc điểm bộ gen và yếu tố kháng nguyên Việc giải trình tự của từng ORF là cơ sở dữ liệu quan trọng cho phép xác định và sử dụng trình tự phù hợp trong việc so sánh, chẩn đoán phân biệt các dòng PRRSV cũng như sự tiến hóa của chúng Khi phân tích sự thay đổi trình tự các dòng PRRSV, đã xác định được rằng PRRSV dòng Bắc Mỹ, các ORF6 và ORF7 có tính ổn định rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hóa của dòng này Tuy nhiên, lại có sự khác biệt giữa dòng châu Âu và Bắc Mỹ ở hai ORF này, sự tương đồng về trình tự acid amin của ORF7 giữa 2 dòng này chỉ vào khoảng 57 – 59% và của ORF6 là 70 – 81% Theo nghiên cứu, ORF5 biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng một dòng Bắc Mỹ (tương đồng 88 – 97%) và chỉ tương đồng với dòng châu Âu khoảng từ 51 – 59% Sự tương đồng về trình tự nucleotide của ORF2, ORF3 và ORF4 giữa các dòng châu Âu và Bắc

Mỹ chỉ ở mức độ lần lượt là 63%, 58% và 68% Đây chính là cơ sở cho việc sử dụng

kỹ thuật RT - PCR chẩn đoán PRRSV hoặc phân biệt dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Gần đây, Trung Quốc xuất hiện dòng mới là biến chủng của dòng châu Mỹ,

chủng này có độc lực cao hơn, nguyên nhân là do sự mất 30 acid amin của protein

Nsp2, gây bệnh không chỉ cho heo con mà còn cho cả heo trưởng thành, gây ra tỷ lệ

chết cao hơn, biến chủng này khó chẩn đoán và hiện nay chưa có vắc xin đặc hiệu, đây

là thách thức lớn trong công tác kiểm soát PRRS

Khi ở ngoài môi trường, PRRSV bị bất hoạt bởi nhiệt độ, sự khô hạn và pH

thấp PRRSV tồn tại được trong môi trường lạnh, ẩm cao và tồn tại lâu khi đông lạnh

Thực tế cho thấy vi rút này xâm nhiễm và lây lan nhanh hơn trong thời tiết lạnh, nhất

Hình 2.2 Cấu trúc PRRSV

(Nguồn: http://porcilis-prrs.com)

Bảng 2.1 Sáu protein cấu trúc của PRRSV

(Nguồn: Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

là các tháng mùa đông Khả năng nhiễm của chúng từ 1 đến 6 ngày ở 200C, 3 đến 24 giờ ở 36,70C, và 6 đến 20 phút ở 55,60C Khả năng gây nhiễm mất đi khi PRRSV ở trong môi trường có pH < 6 hoặc pH > 7,5

2.3 Cơ chế gây bệnh của PRRSV

Theo Trevor Drew: “Vi rút PRRS tiến triển rất nhanh và sự tiến triển này thực

sự đáng ngạc nhiên” Thông thường để tồn tại, bất cứ vi khuẩn, vi rút đều phải xâm nhập vào vật chủ, ban đầu gây ra bệnh rất nghiêm trọng nhưng sau đó độc lực của chúng sẽ giảm dần theo thời gian Đối với PRRSV có chiều hướng ngược lại, nghĩa là khi vi rút xảy ra, gây bệnh (tăng độc lực), độc lực này tăng dần, không giảm, vi rút này tiến hóa dần và gây bệnh nặng hơn Ở heo, PRRSV tấn công vào đại thực bào sẽ làm giảm chức năng của hệ thống bảo vệ cơ thể PRRSV có tính thích ứng cao với đại thực bào phế nang hoạt động ở phổi Khi PRRSV xâm nhập và gây bệnh, chúng tấn công, phá hủy đại thực bào, làm giảm số lượng và chức năng của đại thực bào, dẫn đến suy giảm miễn dịch (Rosssow, 1998), tạo điều kiên cho các nhiễm trùng thứ phát xâm nhập và nếu qua khỏi cũng rất khó lấy lại cân bằng miễn dịch Do vậy, khi vi rút PRRS xuất hiện trong đàn heo, chúng thường có xu hướng duy trì sự tồn tại và hoạt động âm thầm và khi đáp ứng miễn dịch ở cơ thể heo suy giảm thì heo dễ dàng bị nhiễm các bệnh thứ phát Những heo trưởng thành thường được hồi phục và phát triển

hệ thống miễn dịch, nhưng đối với heo con khi vi rút tấn công kết hợp với nhiễm trùng

thứ phát khác như: dịch tả, tụ huyết trùng, phó thương hàn, E.coli, Streptococus suis,

Mycoplasma, Salmonella,… sẽ gây chết nhiều hơn (Rosssow, 1998)

Heo giống Heo thịt

Tăng tỷ lệ chết, chậm lớn Sốt, chậm lớn

Heo đực giống Sốt, thay đổi chất lượng tinh dịch

Triệu chứng lâm sàng Heo nái Sẩy thai hoặc đẻ non Heo con chết non hoặc có sức sống yếu

Heo con mới sinh Khó thở, có dấu hiệu tổn thương

thần kinh, tỷ lệ chết cao

PRRSV Truyền bằng đường hô hấp, tiêu hóa, giao phối, tổn thương da, kim tiêm bị nhiễm 

Nhân rộng trong niêm mạc, phổi, hoặc đại thực bào Xâm nhiễm hạch lympho và nhiễm vi rút huyết (trong vòng 12 giờ sau khi nhiễm)

Lây lan sang các tế bào đơn nhân và đại thực bào ở mô Triệu chứng cận lâm sàng

Vi rút tồn tại trong cơ thể

Phát tán và lây lan theo

đường dịch tiết, máu, phân,

nước tiểu

Hình 2.3 Sơ đồ sinh bệnh PRRSV (Rossow, 1998)

A

2.4 Triệu chứng lâm sàng của PRRS

Hội chứng PRRS xuất hiện 2 pha rõ rệt:

- Rối loạn sinh sản bao gồm: Giảm

tỷ lệ thụ thai và số con đẻ ra, sẩy

thai, giảm tiết sữa hoặc mất sữa

hoàn toàn, thai khô, chết thai, gia

tăng số lượng heo con sinh ra chết

hoặc chết khi còn là bào thai có thể

tăng đến 25 - 35%, heo con sinh

non chiếm 10% và chứng biếng ăn,

tắt sữa ở heo nái nuôi con dẫn

đến heo con chết trước cai sữa

tăng 30-50% Heo chậm động dục hoặc không động dục trở lại Heo sốt 39 – 400C, bỏ

ăn, mệt mỏi

- Rối loạn hô hấp: “Hắt hơi", tăng tần số hô hấp, thở khó, thở đứt quãng, gầy, yếu, phù mắt, các nốt phồng rộp trên da, tiêu chảy, đi không vững và run, đứng choãi chân Heo thịt có các biểu hiện sốt nhẹ, bỏ ăn Các triệu chứng khác nhẹ hơn Heo đực giống có các biểu hiện giảm hưng phấn, giảm thể tích và chất lượng tinh dịch (hình thái, hoạt

lực và nồng độ tinh trùng) Ngoài ra, một số vi khuẩn như Streptococcus suis,

Escherichia coli, Salmonella choleraesuis, Haemophilus parasuis và Mycoplasma hyopneumoniae cũng như các loại vi rút ảnh hưởng đến đường hô hấp heo như

Hình 2.4 Sự khác biệt của đại thực bào nhiễm PRRSV và đại thực bào bình thường

A: Đại thực bào khỏe ; B: Đại thực bào bệnh

(Nguồn: http://porcilis-prrs.com)

Hình 2.5 Heo con sinh ra từ heo mẹ nhiễm PRRSV

(Nguồn: http://www.respig.com)

A B

(Nguồn: OIE, 2010)

Coronavirus và cúm heo có thể nhiễm cùng PRRSV gây viêm phổi lan tỏa cấp tính,

hình thành nhiều ổ áp xe, thể trạng gầy yếu (giảm 85% tăng trọng/ngày), da xanh, tiêu chảy, ho nhẹ, hắt hơi, chảy nước mắt, thở nhanh, tỷ lệ chết lên đến 15% (Tiêu Quang

An và Hoàng Hữu Nam, 2011)

Tuy nhiên các dấu hiệu lâm sàng nêu trên không hoàn toàn là đặc trưng cho bệnh PRRS, mà còn xuất hiện ở các bệnh lây nhiễm do các tác nhân khác gây nên Điều này dễ gây nhầm lẫn trong chẩn đoán bệnh nếu chỉ dựa vào biểu hiện lâm sàng Bệnh do vi rút PRRS gây ra kéo dài phụ thuộc vào điều kiện chuồng trại và đặc biệt là tình trạng sức khỏe ban đầu của đàn heo Các bệnh có dấu hiệu lâm sàng tương tự với PRRS được liệt kê trong Bảng 2.2

2.5 Bệnh tích của heo nhiễm PRRSV

- Bệnh tích đại thể biểu hiện rõ ở các nội tạng như phổi, tim, lách, ruột, hạch ruột Đặc biệt bệnh tích ở phổi, phổi xẹp áp sát vào khung sườn, mặt cắt của phổi có mủ, nhiều heo bệnh có bệnh tích viêm phổi dính sườn

- Bệnh tích vi thể ở phổi, hạch phổi, hạch amidan, hạch ruột, sự tăng sinh và thoái hoá

tế bào Bệnh tích vi thể đặc trưng khi heo mắc PRRS ở phổi, hạch phổi và hạch amidan rất rõ ràng 100% các tiêu bản thấy sung huyết và xuất huyết Các phế nang chứa đầy dịch rỉ viêm Sự xâm nhiễm tế bào và tăng sinh các nang lympho

Bệnh liên quan đến sinh sản Bệnh liên quan đến hô hấp

Bệnh trùng xoắn móc câu Nhiễm Haemophilus parasuis

Porcine parvovius Viêm phổi tăng sinh và hoại tử

Porcine enterovius Haemagglutinating encephalomyelitis virus Haemagglutinating encephalomyelitis virus Porcine respiratory coronavirus

Hội chứng Aujeszky Syncitial pneumonia và myocarditis

Hội chứng Porcine circovirus kết hợp Nhiễm Nipah vi rút

Bảng 2.2 Những bệnh có triệu chứng tương tự PRRS

- Đã phát hiện sự có mặt vi rút PRRS trong các mô bào bằng phương pháp nhuộm hóa

mô miễn dịch Ở phổi, vi rút tập trung ở phế nang, đặc biệt là các đại thực bào phế nang Ở tim, PRRSV thường khu trú trong tế bào cơ tim Ở lách và gan thấy chúng phân bố rải rác ở nhiều nơi Ở thận, PRRSV thường tập trung tại các tiểu cầu thận (Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam, 2011)

2.6 Chẩn đoán PRRSV

Kỹ thuật thường dùng trong chẩn đoán phát hiện PRRSV bao gồm phân lập vi rút, enzyme - linked immunosorbent assay (ELISA), kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA), phản ứng trung hòa vi rút trong huyết thanh (SNV), reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT - PCR), đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP)

và giải trình tự nucleotide Các phương pháp trên cung cấp thông tin về tình trạng nhiễm PRRSV trên thú hoặc trong đàn, từ đó giúp nhà chăn nuôi có biện pháp kiểm soát và ngăn chặn dịch bệnh một cách thích hợp

để phân lập vi rút, thì hiệu quả của việc phân lập vi rút trong tinh dịch bị giới hạn bởi một số yếu tố gây độc tế bào hiện diện trong tinh dịch Sự hiện diện của PRRSV trong nuôi cấy tế bào dựa vào bệnh tích tế bào (cytotoxicity effect – CPE) CPE thường được quan sát trong từ 2 đến 6 ngày Bởi vì phân lập vi rút cần sự hiện diện của vi rút trong mẫu, nên độ nhạy của thử nghiệm có thể bị ảnh hưởng bởi qui trình thực hiện, bao gồm nhiệt độ trữ mẫu, khoảng thời gian thu nhận mẫu (Dee, 2009)

2.6.2 Xét nghiệm huyết thanh học PRRSV

Huyết thanh học là phương pháp phát hiện kháng thể chống PRRSV trong huyết thanh hoặc huyết tương Kháng thể IgM có thể phát hiện trong 7 ngày sau khi nhiễm và kháng thể IgG có thể được phát hiện ở thời điểm 14 ngày sau khi nhiễm (Yoon và ctv, 2009)

Kháng thể PRRSV có thể được phát hiện bằng phương pháp ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) cũng như các phương pháp huyết thanh học khác như immunoperoxidase monolayer assay (IPMA), kiểm tra kháng thể huỳnh quang gián tiếp (indirect fluorescent antibody test - IFA) và kiểm tra phản ứng trung hòa huyết thanh (serum neutralization test - SN) Tuy nhiên, do tính tiện lợi và nhanh chóng nên ELISA được sử dụng phổ biến trên hầu hết các quốc gia

Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) có rất nhiều dạng Nguyên tắc chung là dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với 1 enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ

đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông thường qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện Kỹ thuật này nhạy và đơn giản cho phép xác định được kháng nguyên và kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) Kỹ thuật ELISA được dùng để xác định kháng thể nhiều tác nhân gây bệnh như: vi rút, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng Kỹ thuật ELISA gồm 3 thành phần tham gia phản ứng: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu, được thực hiện qua 2 phản ứng:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme là giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Có 3 phương pháp chính làm nền tảng cơ bản cho tất cả các dạng ELISA là:

- ELISA trực tiếp (Direct ELISA): đây là dạng cơ bản nhất của phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên về mặt giá thể và được phát hiện bằng 1 kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme)

- ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) : Trong phương pháp này kháng thể không gắn với enzyme mà gắng với một kháng thể khác (kháng thể thứ cấp), và kháng thể thứ cấp là thành phần sẽ gắn enzyme (Hình 2.6)

- Sandwich ELISA: là dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn vì nó cho phản ứng nhanh và mạnh Phản ứng này được gọi là “sandwich” là do kết quả thí

Hiện nay, kít IDEXX ELISA chẩn đoán, phát hiện sự hiện diện của kháng thể PRRSV trong mẫu, đang được ứng dụng phổ biến ở nhiều quốc gia như Mỹ, Canada, châu Á và châu Mỹ La - tinh Nhiều công trình cho thấy IDEXX ELISA có độ nhạy cao (100%), độ chuyên biệt cao (99,5%) và cho kết quả nhanh chóng trong vòng 24 giờ Tuy nhiên, giống như nhiều phương pháp khác, IDEXX ELISA cũng có thể có hiện tượng âm tính giả, vì thế, một lưu ý khi sử dụng IDEXX ELISA là nên áp dụng cho đàn hơn là cá thể Sự hiện diện của kháng thể PRRSV phát hiện bằng IDEXX ELISA được xác định bằng tỷ lệ số mẫu dương tính trên tổng số mẫu, hay tỷ số S/P

Hình 2.6 Minh họa các bước của phản ứng ELISA gián tiếp

(Nguồn: http://www.impehcm.org.vn)

Nếu S/P ≥ 0,4 thì mẫu dương tính với kháng thể PRRSV ELISA phát hiện kháng thể PRRSV (Immunoglobulin G – IgG) từ 7 đến 14 ngày sau khi nhiễm, đạt hiệu giá tối đa sau 30 đến 50 ngày, và giảm đi hoặc không phát hiện được khi heo bị nhiễm từ hơn 4 đến 6 tháng Tình trạng tiêm vắc xin, tuổi, khu vực, có thể ảnh hưởng đến kết quả ELISA và các phương pháp huyết thanh học khác, vì các phương pháp này không có khả năng phân biệt kháng thể do tiêm vắc xin và kháng thể khi bị nhiễm tự nhiên Hơn nữa, heo con thường có kháng thể thụ động từ mẹ truyền cho trong thời gian từ 3 đến 4 tuần tuổi Như vậy, kháng thể PRRSV được phát hiện bằng ELISA chỉ cho biết trình trạng phơi nhiễm của heo đối với PRRSV mà không trực tiếp chống lại PRRSV (Dee, 2012)

IFA được thực hiện bằng cách cho mẫu huyết thanh chứa các tế bào nhiễm vi rút vào các giếng của một loại đĩa chuyên dụng, sau đó bổ sung kháng kháng thể đánh dấu huỳnh quang và quan sát phản ứng kháng nguyên - kháng thể xảy ra IFA có tính đặc trưng cao nhưng lại phụ thuộc rất nhiều vào yếu tố ngoại cảnh, ví dụ điều kiện phòng thí ngiệm, tay nghề kỹ thuật viên, thời gian ủ, qui trình, loại tế bào sử dụng…(Yoon và ctv, 1992)

Xét nghiệm SVN được thực hiện dựa vào nuôi cấy tế bào để biết mức độ vi rút khi ủ với dãy nồng độ huyết thanh pha loãng Sau khi ủ, huyết thanh sẽ được chuyển sang một dòng tế bào nhạy để xác định hiệu giá kháng thể Không có qui trình chuẩn cho phương pháp này, nhưng hầu hết các qui trình là giống nhau giữa các phòng thí nghiệm Phương pháp này ít nhạy hơn IFA và ELISA vì kháng thể trung hòa vi rút phát triển dần dần sau khi nhiễm vi rút (>21 ngày) và nhiều cá thể heo lại có hiệu giá kháng thể trung hòa tương đối thấp (D Cheon và C Chae, 2000)

Điểm bất lợi của phương pháp huyết thanh là có thể cho kết quả dương tính giả Các nghiên cứu trước đó cho thấy kháng thể đặc hiệu cho PRRSV từ heo mẹ có thể được phát hiện ở heo con trong 4 ngày sau khi sinh và biến mất trước 3 tuần tuổi (Albina và ctv, 1992) Ngoài ra đáp ứng vắc xin có thể ảnh hưởng đến kết quả cũng như khả năng phân biệt heo bị nhiễm PRRSV với heo được tiêm ngừa vắc xin

2.6.3 Phản ứng dây chuyền nhờ polymerase (PCR - Polymerase Chain Reaction)

PCR là kỹ thuật sử dụng enzyme in vitro cho phép khuếch đại trình tự acid

nucleic chuyên biệt thông qua các chu kì lặp lại ở nhiệt độ khác nhau RT - PCR được

ứng dụng để khuếch đại RNA PRRSV từ các mẫu như huyết thanh, mô, tinh dịch, Đây là phương pháp có độ nhạy cao và nhanh chóng, kết quả có thể được trả sau 24 đến 48 giờ Kỹ thuật này còn giúp cải thiện hạn chế của phương pháp phân lập vi rút trên tinh dịch PCR hoạt động trên nguyên tắc DNA polymerase khi hoạt động sẽ tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn với sự tham gia của những mồi (primer) chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo 3 bước: Biến tính phân tử DNA, sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn và sự tổng hợp mạch mới Ba bước này tạo thành một chu kì

và được lặp lại nhiều lần (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thùy Dương, 2005)

Kỹ thuật RT - PCR được phát triển để phát hiện RNA của vi rút PRRS trong các mẫu bệnh phẩm Kỹ thuật này không những có độ đặc hiệu và độ nhạy cao mà thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm cũng ngắn hơn so với phương pháp nuôi cấy tế bào vì thế PCR được sử dụng khá rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện vi rút Nhiều dạng khác nhau của PCR được sử dụng, hầu hết chúng được sử dụng để phát hiện các vùng ORF7, ORF6 hay ORF1b của PRRSV Thiết kế mồi là khâu quan trọng trong

kỹ thuật PCR Mồi là các trình tự oligonucleotide có khả năng bắt cặp đặc hiệu với vùng gen mục tiêu cần khuếch đại Tùy vào mục đích phát hiện hay phân loại PRRSV

mà thiết kế primer trên các ORF khác nhau, ví dụ, hai vùng gene bảo tồn cao là ORF 6

mã hoá protein màng và ORF 7 mã hoá nucleocapsid thường được dùng để thiết kế mồi cho phản ứng RT - PCR phát hiện PRRSV, còn một số vùng khác như ORF 5 mã hoá protein vỏ (envelope) được sử dụng khi cần phân biệt các chủng (chủng độc lực cao - chủng thường) (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) RNA vi rút sẽ được ly trích từ các mẫu bệnh phẩm sau đó tiến hành phản ứng phiên mã ngược (RT) để tạo cDNA và sau đó khuếch đại cDNA bằng PCR Để gia tăng độ nhạy trong chẩn đoán PRRSV, nhất là để phân biệt 2 dòng PRRSV thì Chung và ctv (2002) đã sử dụng phương pháp multiplex reverse transcription - nested PCR (RT - nPCR)

Wang (1994) đã sử dụng kỹ thuật RT - PCR trực tiếp để phát hiện sự tồn tại của PRRSV trong heo thương phẩm và trong tinh dịch con đực Tuy nhiên kết quả chẩn đoán chưa đủ làm cơ sở để kết luận bệnh mà chỉ cho phép xác định tình trạng nhiễm của đàn và kỹ thuật này đòi hỏi kỹ thuật viên phải có trình độ

kỹ thuật cao Một số yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của RT - PCR là loại mẫu, tình trạng mẫu, khối lượng mẫu, kỹ thuật xử lý, bảo quản mẫu, trình tự mồi, tối ưu hóa chu trình,… Vì vậy, như bất kỳ phản ứng PCR nào thì cũng cần khảo nghiệm độ nhạy và

độ đặc hiệu của phản ứng Các quy trình thu nhận và trữ mẫu, quy trình chiết tách và tinh sạch RNA phải được thực hiện một cách nghiêm ngặt Do đó kết quả của phản ứng PCR giữa các phòng thí nghiệm khác nhau có thể sẽ khác nhau

Nested RT - PCR là kỹ thuật PCR sử dụng 2 hoặc nhiều cặp mồi nhằm tăng độ nhạy cho phản ứng Cặp mồi thứ nhất sẽ khuếch đại trình tự có kích thước lớn hơn, sau

đó các mồi “nested” sẽ khuếch đại những đoạn nằm bên trong sản phẩm ban đầu bằng cách sử dụng sản phẩm PCR đầu tiên để làm khuôn mẫu Phương pháp này cũng có thể được thực hiện với một cặp mồi đầu tiên và một mồi đơn cho phản ứng nested-PCR sau đó, phương pháp này gọi là heminested - PCR Đơn giản hơn, nested - PCR được tiến hành với cùng 1 cặp mồi cho cả 2 lần PCR nên còn được gọi là PCR 2 bước

Áp dụng trường hợp này đối với những mẫu xuất hiện băng mờ khi điện di lần 1, PCR bước 2 sẽ làm tăng số lượng sản phẩm và do đó cải thiện độ sáng của băng sản phẩm Nested - PCR là kỹ thuật rất nhạy, có thể phát hiện PRRSV nồng độ thấp trong tinh dịch và các mẫu khác Nested RT - PCR có thể phát hiện được 10 đến 30 hạt virion/ml

và 10-2 đến 102 TCID50/ml (trích dẫn bởi Kono và ctv, 1994) Mặc dù độ nhạy và độ chuyên biệt rất cao, nhưng vẫn xảy ra tình trạng dương tính giả, nên vẫn phải chấp nhận một mức độ sai số nào đó trong xét nghiệm

Trong công trình của Kono và ctv (1994), tác giả đã chứng minh rằng nested PCR nhạy hơn gấp 100 lần so với RT - PCR và nested - PCR phát hiện được vi rút ở mức 1 TCID50/100 µl Nested - PCR có thể phát hiện DNA hoặc RNA vi rút trong mẫu xét nghiệm ở giai đoạn cấp tính hoặc mãn tính nhạy hơn so với phương pháp phân lập

-vi rút, vì vậy, phương pháp này không chỉ là phương pháp thay thế cho phân lập -vi rút

mà còn rất hữu ích trong phát hiện vi rút khi trong đàn chưa có biểu hiện lâm sàng

Real - time RT - PCR được xem là phương pháp khắc phục nhược điểm của phương pháp RT - PCR do ưu điểm nhanh, nhạy, đặc hiệu, giảm các bước sau PCR, từ

đó giảm nguy cơ nhiễm Hiện nay kĩ thuật real-time RT - PCR ngày càng được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh trên người, động vật và thực vật Nhiều công trình đã xây dựng quy trình real-time RT - PCR phát hiện PRRSV sử

dụng mẫu dò Taqman hoặc SYBR đã được công bố Ngoài ra, nhiều nước cũng đã thương mại hóa các bộ kít chẩn đoán PRRSV bằng kĩ thuật real-time RT - PCR như PRRSV Real-time RT - PCR kit (Shanghai ZJ Bio-Tech Co., Ltd), Real-Time PCR PRRSV Specific Reagents (Tetracore, Inc), ADIAVET® PRRS EU/NA (Pháp),…

2.7 Tình hình nghiên cứu, phát hiện PRRSV ở trên thế giới và Việt Nam

Khi so sánh giữa RT - PCR và VI trong công trình “Phát hiện PRRSV trong tinh dịch heo đực bằng PCR”, J Hennings và ctv (1995) đã nhận xét cả PCR và VI đều

có khả năng phát hiện được PRRSV trong tinh dịch, tuy nhiên độ ngạy của VI kém hơn PCR Với độ pha loãng 1 : 20 của mẫu, PCR vẫn phát hiện được PRRSV trong khi

VI lại không phát hiện được Và nhóm tác giả cũng đã kết luận rằng PCR là một công

cụ hữu ích trong việc chẩn đoán PRRSV, đặc biệt với các mẫu khó thực hiện bằng VI như tinh dịch, phân hoặc dịch tiết

Công trình của Cheon và Chae (2000) đã chứng minh rằng RT - PCR là phương pháp phát hiện PRRSV nhạy nhất trong nhóm các phương pháp phân lập vi rút, RT - PCR, hóa mô miễn dịch và lai tại chỗ Trong 13 mẫu bạch cầu, có 6 mẫu cho kết quả dương tính với PRRSV bằng cả 4 phương pháp, 4 mẫu (15%) dương tính với PRRSV bằng RT - PCR, lai tại chỗ và phân lập vi rút; 2 mẫu (15%) dương tính với PRRSV bằng phân lập vi rút, RT - PCR và lại tại chỗ; 1 mẫu (8%) dương tính với PRRSV bằng phân lập vi rút và RT - PCR

Trong công trình nghiên cứu của Yahara và ctv (2002), tác giả đã đánh giá khả năng phát hiện kháng thể PRRSV của kỹ thuật ELISA và IFA trên heo thương phẩm

208 mẫu huyết thanh được thu thập từ trại âm tính với PRRSV và 210 mẫu huyết thanh được thu thập từ trại dương tính với PRRSV đã được kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA và IFA Kết quả cho thấy, độ tương đồng của 2 phương pháp là 84% Trong nghiên cứu này, ELISA có thể phát hiện được kháng thể với hiệu giá kháng thể thấp trong mẫu huyết thanh, trong khi IFA thì không phát hiện được

Năm 2001, Dee và ctv tiến hành đánh giá tình trạng PRRS trên 3.842 con heo ở

5 trang trại tại Mỹ bằng qui trình “Xét nghiệm và loại bỏ” Kết quả cho thấy 77 – 100% heo được xét nghiệm có ELISA (+) : PCR (-), 1,1 – 18% heo được xét nghiệm

có ELISA (+) : PCR (+) và 0 – 4,5% heo có ELISA (-) : PCR (+) Đến năm 2003, Scott Dee tiếp tục dùng qui trình này để đánh giá tình trạng PRRS ở 30 trang trại nuôi

và do đó, chỉ riêng ELISA thì chưa đủ để đánh giá tình trạng PRRSV trong đàn

Kittawornrat và ctv (2012) đã công bố nghiên cứu về việc phát hiện kháng thể PRRSV trong dịch miệng bằng bộ kít ELISA thương mại Mục đích của nghiên cứu là đánh giá hiệu quả của bộ kít ELISA thương mại phát hiện PRRSV trong dịch miệng của heo từ đó cho thấy tình trạng đàn cũng như sự phơi nhiễm của đàn với PRRSV Kết quả nghiên cứu cho thấy kháng thể IgG (Immunoglobulin G) dễ dàng được phát hiện trên các cá thể thí nghiệm và đàn thương mại Từ đó, có thể kết luận rằng phản ứng ELISA tìm kháng thể IgG trong dịch miệng là một phương pháp hữu dụng và hiệu quả trong việc giám sát đàn heo thương mại cũng như tình trạng PRRSV trong đàn

Ở Việt Nam, các nghiên cứu bước đầu về PRRSV bắt đầu muộn và có phần hạn chế hơn so với thế giới Chỉ sau khi đợt dịch heo tai xanh bùng phát vào năm 2007 mới

có một số nghiên cứu bước đầu về sự hiện diện và tỉ lệ nhiễm của PRRSV trên heo bằng phương pháp bằng RT - PCR (Nguyễn Ngọc Hải và ctv, 2007)

Dự án “Điều tra sự lưu hành PRRS trên đàn heo một số tỉnh ở Việt Nam” của Nguyễn Văn Cảm và ctv đã được thực hiện vào năm 2008 Bằng phương pháp ELISA phát hiện kháng thể PRRSV và real-time RT - PCR phát hiện kháng nguyên PRRSV Kết quả cho thấy rằng: Trong tổng số 674 mẫu huyết thanh (gồm 601 mẫu huyết thanh

heo nái và 73 mẫu huyết thanh heo đực) và 73 mẫu tinh dịch thu thập được tiến hành kiểm tra đều không phát hiện thấy vi rút PRRS Tỷ lệ lưu hành kháng thể PRRS trong các đàn heo điều tra là cao, tỷ lệ trung bình 82,6%, trong đó tỷ lệ ở heo nái là 81,2%

và ở heo đực là 94,5% Kết quả này cho thấy nguy cơ lây lan PRRSV từ heo đực cao hơn nhiều so với heo nái, đặc biệt khi PRRSV có thể lây qua tinh dịch Sự lưu hành kháng thể PRRS trong các cơ sở chăn nuôi (trại và hộ) đạt tỷ lệ 87,6%, đặc biệt có tới 9/15 tỉnh đã phát hiện trong 100% số trại và hộ chăn nuôi đã lấy mẫu Kháng thể PRRS chủng Bắc Mỹ đã lưu hành ở tất cả 15 tỉnh được lấy mẫu kiểm tra và tỷ lệ trung bình là 75.1% Phát hiện thấy kháng thể PRRS dòng châu Âu lưu hành ở 8 trên 15 tỉnh với tỷ lệ là 7,6% Tỷ lệ trung bình số trại có lưu hành kháng thể PRRS chủng châu Âu (33,3%) thấp hơn nhiều so với tỷ lệ chủng Bắc Mỹ (78,4%) Năm 2011, Lý Thị Liên Khai và Võ Thị Cẩm Hằng đã công bố công trình “Khảo sát tình hình nhiễm ghép hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp với dịch tả heo tại các tỉnh Bạc Liêu và Sóc Trăng” Công trình được thực hiện dựa vào kỹ thuật RT - PCR được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của PRRSV và kỹ thuật ELISA gián tiếp giúp phát hiện kháng nguyên p125 của vi rút dịch tả heo Kết quả nghiên cứu đã phát hiện được PRRSV trên đàn heo có

triệu chứng lâm sàng của PRRS là 84,03% PRRSV đang lưu hành là chủng Trung

Quốc thuộc dòng Bắc Mỹ Có 6 trong số 119 mẫu xét nghiệm nhiễm PRRSV dương tính với cả dịch tả heo chiếm tỷ lệ (5,04%)

Trong công trình của Nguyễn Đức Hiền (2012), 290 mẫu huyết thanh heo chưa tiêm phòng vắc xin PRRS được xét nghiệm bằng phương pháp ELISA cho thấy tỷ lệ nhiễm PRRSV ở heo nuôi tại thành phố Cần Thơ là 16,90% Trong đó, tỷ lệ nhiễm PRRS ở heo của những trại chăn nuôi tập trung cao hơn heo nuôi ở các nông hộ (64,0

% so với 38,12%) Tỷ lệ nhiễm PRRSV cao nhất được tìm thấy trên heo nái (69,57%),

kế đến trên heo con (33,33%) và thấp nhất trên heo thịt (12,16%)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 2/2013 đến tháng 05/2013 tại Phòng xét nghiệm chẩn đoán thú y Hàn – Việt, thuộc Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông Lâm

Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Mẫu thí nghiệm và vật liệu phòng thí nghiệm

75 mẫu máu thu từ 3 trại ở Bình Dương

Dụng cụ: eppendorf thể tích 0,2 ml, 1,5 ml; đầu típ 10 μl, 100 μl, 1000 μl; micropipette 10 μl, 100 μl, 1000 μl; ống đong; bình thủy tinh 500 ml…

Thiết bị: Máy cất nước; máy li tâm thường và ly tâm lạnh 4oC; tủ mát (nhiệt độ 2-8oC), tủ lạnh -20oC và -70oC; tủ ấm; máy vortex; máy PCR, lò vi - ba; cân phân tích;

bộ nguồn và bồn điện di ; thiết bị đọc gel bằng tia UV; tủ cấy; tủ hút…

3.2.2 Hóa chất

3.2.2.1 Hóa chất dùng trong phản ứng ELISA

Phản ứng ELISA được thực hiện bằng bộ kít PRRS Ab X3 ELISA test kit (IDEXX, Mỹ) Bộ kít bao gồm các thành phần:

- Đĩa ELISA phủ kháng nguyên

Phản ứng phiên mã ngược được thực hiện bằng bộ kítAccess RT - PCR System 

- Positive Control RNA with Carrier

- Upstream Control Primer

- Downstream Control Primer

- Nuclease - Free Water

Bảo quản bộ kít ở -200C Nếu bảo quản trong thời gian dài thì Positive Control RNA

with Carrier cần bảo quản ở -700C

Phản ứng PCR sử dụng GoTaq Green Master Mix 2X (Promega, Mỹ) gồm các thành phần sau:

- GoTaq® DNA Polymerase

- 2X Green GoTaq® Reaction Buffer

- dNTP

- MgCl2 3 mM

Bảo quản bộ kít ở -200C

3.2.2.3 Hóa chất dùng trong điện di

- Agarose (Nobel Bio)

- TAE 1X (Nobel Bio)

- RNA Lysis Buffer (RLA)

- RNA Dilution Buffer (RDA)

- β - mercaptoethanol 48,7% (BME)

- DNase I

- MnCl2 0,09 M

- Yellow Core Buffer

- DNase Stop Solution (DSA)

- RNA Wash Solution (RWA)

- Nuclease - free water Giữ bộ kít ở 2 – 80C

Ly trích RNA từ mẫu bằng bộ kít RNasey Mini Kit (Quiagen, Đức) Bộ kít gồm các thành phần như sau:

- RNeasy Mini Spin Columns

Giữ bộ kít ở 2 – 80C

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Lấy mẫu máu

Sát trùng vị trí lấy máu, dùng xi lanh 5 ml và kim tiêm riêng biệt để lấy mẫu máu của từng con heo Ghi kí hiệu mẫu Từng nhóm mẫu khác nhau sẽ được chứa trong túi nhựa, cho vào thùng đá 40C, nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm

3.3.3 Phản ứng ELISA

Phản ứng ELISA được thực hiện bằng bộ kít PRRS Ab X3 ELISA test kit hay IDEXX PRRS X3 (IDEXX, Mỹ)

Nguyên tắc xét nghiệm của bộ kít IDEXX PRRS X3: IDEXX PRRS X3 dùng

để phát hiện kháng thể PRRSV trong mẫu huyết tương và huyết thanh heo Đĩa ELISA được phủ bởi kháng nguyên PRRSV tái tổ hợp Sau khi mẫu được ủ trong giếng, kháng thể đặc hiệu với PRRSV sẽ tạo phức hợp với kháng nguyên trong giếng Sau khi rửa để loại bỏ các thành phần không liên kết trong giếng, phức hợp horseradish peroxidase được thêm vào giếng, phức hợp này sẽ gắn với kháng thể PRRSV có trong giếng Những phức hợp không gắn với kháng thể PRRSV trong giếng sẽ được rửa đi

và tiếp tục bổ sung TMB substrate vào, dung dịch này sẽ làm cho giếng hiện màu Màu trong giếng tỷ lệ với số lượng liên kết đặc hiệu của kháng thể và kháng nguyên PRRSV

Chuẩn bị hóa chất: Cần xác định tổng thể tích dung dịch Wash solution cần để rửa Pha loãng Wash solution (10X) theo tỷ lệ 1 : 10 với nước cất hoặc nước khử ion (1 phần Wash Concentrate (10X) với 9 phần nước cất hoặc nước khử ion) Dung dịch Wash solution 1X sau khi pha sẽ được giữa ở 2 – 80C trong 7 ngày

Chuẩn bị mẫu và đối chứng: Mẫu huyết thanh sau khi lấy ra từ tủ lạnh (-200C) được rã đông tự nhiên sau đó mẫu được pha loãng 40 lần với Sample Diluent (1 phần mẫu : 40 phần Sample Diluent) Trộn đều dung dịch mẫu đã pha loãng trước khi cho vào giếng Chú ý, không pha loãng đối chứng

Tiến trình thực hiện: Chuẩn bị đĩa ELISA đã phủ kháng nguyên và đánh dấu mẫu Trước khi tiến hành thí nghiệm, đĩa phủ kháng nguyên phải được để ở nhiệt độ phòng 18 – 260C Sau đó, thêm 100 µl đối chứng âm vào 2 giếng riêng biệt Tiếp tục thêm thêm 100 µl đối chứng dương vào 2 giếng riêng biệt Thêm 100 µl mẫu khác nhau vào các giếng khác nhau Dùng keo dán phủ lên bề mặt đĩa Ủ giếng ở 30 phút (±

2 phút), ở 18 – 260C Sau khi ủ xong, đổ hết hỗn hợp có trong giếng và rửa giếng với

300 µl Wash Solution 3 đến 5 lần Đổ bỏ hỗn hợp trong giếng Nhanh chóng thêm 100

µl Conjugate vào mỗi giếng, tránh để giếng khô quá lâu Tiếp tục ủ 30 phút (± 2 phút),

ở 18 – 260C, sau đó đổ hết hỗn hợp có trong giếng và rửa giếng với 300 µl Wash Solution 3 đến 5 lần Thêm 100 µl TMB Substrate vào mỗi giếng, ủ 15 phút (± 2 phút),

ở 18 – 260C Để dừng phản ứng, thêm 100 µl Stop Solution vào mỗi giếng để dừng phản ứng Đọc kết quả bằng máy đọc đĩa ELISA ở bước sóng A650

NC1 A650: giá trị OD lần 1 của đối chứng âm đo ở bước sóng A650 NC2 A650: giá trị OD lần 2 của đối chứng âm đo ở bước sóng A650 Sample A650: giá trị OD của mẫu đo ở bước sóng A650

Sự hiện diện hoặc vắng mặt của kháng thể PRRSV được xác định dựa vào số liệu tính toán tỷ lệ các mẫu dương tính S/P Để kết quả đạt độ tin cậy thì giá trị (PCxˉ - NCxˉ) phải lớn hơn hoặc bằng 0,150 và giá trị NCxˉ phải nhỏ hơn hoặc bằng 0,150 Khi đó:

- Nếu tỷ lệ S/P < 0,40, kết luận mẫu âm tính với kháng thể PRRSV

- Nếu tỷ lệ S/P ≥ 0,40, kết luận mẫu dương tính với kháng thể PRRSV

3.3.4 Ly trích RNA từ mẫu máu

3.3.4.1 Ly trích RNA bằng SV Total RNA Isolation System

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên khả năng gắn kết của RNA lên màng silica Đầu tiên, mẫu được ly giải dưới điều kiện biến tính cao nhằm kết tủa protein, bất hoạt RNase có trong dịch ly giải tế bào và đảm bảo ly trích được nguyên vẹn RNA

vi rút Sau khi ly tâm loại tủa và mảnh vỡ tế bào, RNA sẽ kết tủa chọn lọc với ethanol

và liên kết với silica bề mặt của sợi thủy tinh có trong Spin lọc Rnase - free DNase I được bổ sung vào màng của Spin lọc để loại bỏ DNA còn trong dung dịch RNA được tinh sạch và chứa trong màng sau đó sẽ được thu nhận bằng cách bổ sung Nuclease -free Water vào cột lọc và được thu nhận trong dung dịch

Tiến hành ly trích RNA bằng bộ kít SV Total RNA Isolation System (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các bước tiến hành như sau:

Bước 1: Cho 75 µl RNA Lysis Buffer (+BME) vào tube,

Bước 2: Thêm 100 µl mẫu vào

Bước 3: Thêm 350 µl RNA Dilution Buffer vào Trộn 3 – 4 lần Ủ 700C, 3 phút,

Bước 4: Ly tâm 10 phút, 26.000 vòng/phút Hút dịch nổi sang tube mới,

Bước 5: Thêm 200 µl Ethanol 95% vào

Bước 6: Chuyển dung dịch ở bước 5 sang cột lọc, ly tâm 1 phút, 13.000 xg,

Bước 7: Thêm 600 µl RNA Wash Solution (RWA) (+ ethanol) Ly tâm 1 phút, 26.000 vòng/phút Đổ bỏ dịch lọc,

Bước 8: Chuẩn bị DNase incubation mix Trộn đều bằng pipette, không vortex,

Bước 9: Thêm 50 µl DNase incubation mix vào cột lọc Ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút,