PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH TÊN LOÀI NẤM Beauveria sp. KÍ SINH CÔN TRÙNG BẰNG HÌNH THÁI VÀ PHÂNTỬ

Kết quả của nghiên cứu đã phân lập được 10 mẫu nấm khác nhau kí sinh trên côn trùng tại Củ Chi, Hóc Môn, Tây Ninh, An Giang, Lâm Đồng; bằng định danh hình tháiđã định danh được 2 mẫu nấm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH TÊN LOÀI NẤM

Beauveria sp KÍ SINH CÔN TRÙNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH TÊN LOÀI NẤM

Beauveria sp KÍ SINH CÔN TRÙNG

BẰNG HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ

Tháng 06/2013

Tiếp theo tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh cùng tất cả các thấy cô đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian theo học ở trường Đặc biệt, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến:

Th.S Trần Thị Vân đã hướng dẫn tận tình, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này

PGS TS Lê Đình Đôn luôn hết lòng vì sinh viên, đã cố gắng tạo mọi điều kiện tốt nhất cho sinh viên học tập và rèn luyện Thầy luôn vui vẻ và yêu thương chúng tôi như là con của mình

TS Lê Thị Diệu Trang đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình tìm đề tài tốt nghiệp, cho tôi những góp ý chân tình về đề tài

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn đến toàn thể quý thầy cô, anh chị và các bạn đang làm đề tài ở Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường trường Đại học Nông lâm Tp Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm đề tài Cảm ơn hai bạn cùng phòng trọ đã động viên tinh thần, cho tôi những lời khuyên chân thành nhất, luôn bên tôi trong những lúc chán nản, khó khăn

Người viết Trần Thị Tú Ngân

TÓM TẮT

Theo thống kê của Cục Bảo vệ Thực vật, hàng năm các loài dịch hại, bệnh hại,

đã làm giảm 35 – 40% tổng sản lượng, mặt khác làm giảm chất lượng của nông sản

Để giảm thiệt hại do sâu, bệnh hại, người nông dân đã sử dụng nhiều phương pháp, trong đó sử dụng thuốc hóa học rất phổ biến vì dễ áp dụng, có hiệu quả kịp thời mà giá thành lại rẻ.Nhưng việc sử dụng thuốc hóa họcgây ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và làm tăng tính kháng thuốc của sâu

bệnh Do đó,đề tài “ Phân lập, định danh tên loài nấm Beauveria sp kí sinh trên côn

trùngbằng hình thái và phân tử” được tiến hành nhằm tạo bộ mẫu nguồn và chọn lọc

loài Beauveria có khả năng sử dụng trong đấu tranh sinh học

Nội dung của nghiên cứu bao gồm: Phân lập và làm thuần các chủng nấm từ các mẫu côn trùng bị bệnh thu thập tại các tỉnh, định danh các chủng nấm bằngcác đặc

điểm hình thái, định danh các chủng nấm có đặc điểm hình thái giống Beauveria sp

dựa trên trình tự DNA của vùng rDNA – ITS

Kết quả của nghiên cứu đã phân lập được 10 mẫu nấm khác nhau kí sinh trên côn trùng tại Củ Chi, Hóc Môn, Tây Ninh, An Giang, Lâm Đồng; bằng định danh hình

tháiđã định danh được 2 mẫu nấm BPH – HM2, BW – CC thuộc giống Verticillium sp., 2 mẫu nấmBC – LĐ1, BC – LĐ2 là Nomuraea rileyi, 5 mẫu nấm BPH – HM1,BPH – TN, BPH – HM3, BW – HM, BSW – AGlà Beauveria bassiana; bằng

phương pháp định danh phân tử đã xác định được 2 mẫu nấm BW – HM, BSW –

AGlàBeauveria bassiana,mẫunấmBC – LĐ1 Cordyceps takaomontana và mẫu BC – LĐ2 là Cordyceps cicadae

SUMMARY

The thesis title: Isolation and identification fungi Beauveria sp parasitic on

insects by morphology and molecules

According to the Department of Plant Protection, pests, diseases reduced 35 to 40% of total production, on the other toreduces the quality of agricultural products To reduce losses due to pests and diseases, farmers use a variety of methods, which using chemicals are very popular because it is easy apply, effective timely, and cheap cost However, the use of chemicals causing environmental pollution, ecological imbalance, affecting human health and increase resistance of pests.Therefore, the thesis "Isolation

and identification fungi Beauveriasp.parasitic on insects by morphology and molecules" which aims to create Beauveria sp samples capable used in biocontrol

The thesis includes isolation and purifing fungi strains from disease insect samples collected at the local, strains were identified by morphological observation Identification of fungi strains have morphological characteristics similar with

Beauveria sp based on the DNA sequences of rDNA – ITS

Isolationresults show that10 fungi samples parasitic on insects in Cu Chi, Hoc Mon, Tay Ninh, An Giang, Lam Đong; there were two fungi samples BPH – HM2,

BW – CC belong strains Verticillium sp., two fungi samples BC – LĐ1, BC – LĐ2were Nomureae rileyi, five samples BPH – HM1, BPH – TN, BPH – HM3, BW – HM,BSW – AGwere Beauveria bassiana By molecular biology indentification, there were 2 samples BW – HM, BSW – AG belong Beauveria bassianafungi,samples BC – LĐ1 were Cordyceps takaomontana, samples BC – LĐ2wereCordyceps cicadae

Key words: Beauveria bassiana

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ tóm tắt v

Danh sách các bảng vi

Danh sách các hình vii

Chương 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 3

1.3 Nội dung thực hiện 3

Chương 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Lịch sử nghiên cứu nấm gây bệnh côn trùng 4

2.2 Sơ lược về nấm kí sinh côn trùng 5

2.3 Triệu chứng côn trùng bị bệnh do vi nấm 5

2.4 Điều kiện để nấm có thể tấn công côn trùng 6

2.5 Sơ lược về nấm Beauveria bassiana 6

2.5.1 Vị trí phân loại 6

2.5.2 Đặc điểm nhận biết nấm Beauveria bassiana 6

2.5.3 Đặc điểm nuôi cấy nấm Beauveria bassiana 7

2.5.4 Hoạt tính sinh học của nấm Beauveria bassiana 7

2.6 Sự xâm nhiễm và phát triển của nấm kí sinh côn trùng 8

2.7 Cơ chế xâm nhiễm của nấm gây bệnh côn trùng 9

2.8 Tính an toàn của nấm đối với động vật máu nóng 10

2.9 Phương pháp định danh nấm 10

2.9.1 Định danh bằng hình thái các mẫu nấm 10

2.9.2 Định danh sinh học phân tử nấm 11

2.9.2.1 Khái niệm PCR 11

2.9.2.2 Nguyên tắc phản ứng PCR 11

2.9.2.3 Giới thiệu về rDNA và vùng ITS 12

2.10 Các nghiên cứu về nấm Beauveria 13

2.10.1 Nghiên cứu trong nước 13

2.10.2 Nghiên cứu ngoài nước 14

Chương 3 Vật liệu và phương pháp 17

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 17

3.2 Vật liệu nghiên cứu 17

3.2.1 Mẫu thí nghiệm 17

3.2.2 Hóa chất 17

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ 18

3.3 Phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1.Phân lập nấm từ côn trùng 18

3.3.1.1.Chuẩn bị môi trường 18

3.3.1.2 Phân lập nấm từ côn trùng trên môi trường PGA 18

3.3.2 Định danh bằng hình thái các mẫu nấm đã phân lập 18

3.3.3 Định danh bằng PCR 18

3.3.3.1 Ly trích DNA 18

3.3.3.2 Quy trình điện di kiểm tra DNA tổng số nấm 19

3.3.3.3 Khuếch đại trình tự ITS của nấm bằng phản ứng PCR 19

3.3.3.4 Điện di và đọc kết quả PCR trên gel agarose 20

3.3.3.5 Kỹ thuật xử lý trình tự 21

Chương 4 Kết quả và thảo luận 22

4.1 Kết quả 22

4.1.1 Một số hình ảnh khuẩn lạc nấm thu được sau khi phân lập và làm thuần 22

4.1.2 Khảo sát hình thái nấm 23

4.1.2.1 Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy 23

4.1.2.2 Một số đặc điểm khác của các mẫu nấm quan sát dưới kính hiển vi 24

4.1.3 Kết quả định danh Beauveria sp bằng phương pháp PCR 33

4.1.3.1 Kết quả nhân sinh khối nấm trong môi trường PG 33

4.1.3.2 Kết quả ly trích DNA 33

4.1.3.3 Kết quả khuếch đại trình tự ITS của các mẫu nấm 34

4.1.3.4 Kết quả giải trình tự và xử lý mẫu 35

4.2 Thảo luận 41

Chương 5 Kết luận và đề nghị 43

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 43

Tài liệu tham khảo 44

Phụ lục 48

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

BVTV: Bảo vệ thực vật

CMA:Cornmeal Agar

Ctv: cộng tác viên

DOR: Directororate of Oilseeds Research

DNA: Deoxyribonucleic acids

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate 

EDTA: Ethylendiamin Tetraacetic Acid

MEA:Malt Extract Agar

NA:Nutrient agar

PDA: Potato dextrose agar

PDBC : Project Directororate of Biological control

PG: Potato glucose

PGA: Potato glucose agar

RNA: Ribonucleic acid

SDA: Sabouraud’s dextrose agar

SDS: Sodium dodecyl sulfate

YPDA: Yeast extract potato dextrose agar

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu và địa điểmthu thập 17

Bảng 3.2 Primer sử dụng khuếch đại trình tự ITS của nấm 20

Bảng 3.3Các thành phần để thực hiện một phản ứng PCR 20

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 20

Bảng 4.1Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy 24

Bảng 4.2Đặc điểm của 10 mẫu nấm quan sát dưới kính hiển vi 25

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1 Một số khuẩn lạc nấm thu được sau khi phân lập 23

Hình 4.2Đặc điểm hình thái mẫu BPH – CC quan sát dưới kính hiển vi 26

Hình 4.3 Đặc điểm hình thái mẫu BW – CC quan sát dưới kính hiển vi 26

Hình 4.4 Đặc điểm hình thái mẫu BPH – HM2 quan sát dưới kính hiển vi 27

Hình 4.5Đặc điểm hình thái mẫu BPH – TN quan sát dưới kính hiển vi 27

Hình 4.6Đặc điểm hình thái mẫu BC – LĐ1 quan sát dưới kính hiển vi 28 

Hình 4.7Đặc điểm hình thái mẫu BPH – HM3 quan sát dưới kính hiển vi 28

Hình 4.8Đặc điểm hình thái mẫu BW – HM quan sát dưới kính hiển vi 29

Hình 4.9 Đặc điểm hình thái mẫu BSW – AG quan sát dưới kính hiển vi 30

Hình 4.10 Đặc điểm hình thái mẫu BC –LĐ2 quan sát dưới kính hiển vi 31

Hình 4.11 Đặc điểm hình thái mẫu BPH – HM1 quan sát dưới kính hiển vi 32

Hình 4.12 Kết quả kiểm tra DNA tổng số các mẫu nấm 33

Hình 4.13Sản phẩm PCR 34

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là một nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm nên rất thuận tiện cho cây trồng phát triển Đồng thời với cây trồng phát triển, sâu bệnh hại cũng phát sinh, chúng gây hại đáng kể đến năng suất Theo ước tính của Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long (2004), mức độ tổn thất do sâu hại nếu không sử dụng thuốc trừ sâu là 83% ở lúa gạo và 84% ở bông vải Để bảo vệ cây trồng, mức chi phí cho công tác bảo

vệ thực vật, phòng trừ dịch hại đã không ngừng tăng lên trong phạm vi toàn quốc

Để làm giảm thiệt hại do sâu, bệnh hại gây ra, người nông dân đã sử dụng nhiều biện pháp phòng trừ như canh tác thủ công, luân canh, chuyên canh, chọn tạo giống mới, dùng thuốc hóa học Trong đó biện pháp sử dụng thuốc hóa học được xem là phổ biến vì dễ áp dụng, có hiệu quả ngay, kịp thời và hiệu quả cao mà giá thành lại rẻ Nhưng việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học gây ô nhiễm môi trường trầm trọng, để lại

dư chất hóa học trong nông sản, giảm số lượng sinh vật có ích, làm mất cân bằng sinh thái trong tự nhiên, làm tăng tính kháng thuốc của sâu bệnh Do vậy, sử dụng thuốc hóa học chỉ là biện pháp tình thế

Hiện nay đời sống xã hội Việt Nam ngày càng phát triển, ý thức của người nông dân cũng được nâng cao, người nông dân hiểu được tác hại của thuốc hóa học và mong muốn có một loại thuốc mới diệt trừ sâu đạt hiệu quả cao mà không gây ra hậu quả xấu như thuốc hóa học Điều đó đòi hỏi các nhà khoa học cần phải nghiên cứu để thay thế thuốc hóa học bằng các loại thuốc khác theo hướng công nghệ sinh học Phòng trừ bằng vi sinh vật là phương pháp được chú ý hơn cả Với phương pháp này người ta nhấn mạnh đến khả năng khống chế tự nhiên bởi các thiên địch như côn trùng kí sinh, côn trùng ăn thịt, vi sinh vật gây bệnh (nấm, vi khuẩn, virus, nguyên sinh…)

Nấm là một loài vi sinh vật gây bệnh có thể làm chết côn trùng, thuộc các chi trong bộ nấm mốc gây hại trên sâu, ngành phụ nấm tiếp hợp và các chi trong các bộ

của ngành phụ nấm bất toàn.Trong đó nhiều loài thuộc các chi Beauveria, Metarhizium, Entomopthora, Coelomyces có thể gây dịch bệnh cho sâu hại và có tác

dụng khống chế tác dụng của chúng trong tự nhiên

Những năm cuối thế kỷ 19, nhiều nhà khoa học Châu Âu đã sử dụng nấm

Beauveria spp để phòng trừ các loài sâu như ngài độc Portheria monocha, ong ăn lá Diprion hercyniac…

Theo thống kê nấm Beauveria bào tử cầu có phạm vi kí sinh rất rộng, có thể

gây bệnh cho hơn 700 loài thuộc 149 họ của 15 bộ côn trùng sâu hại, hơn 10 loài nhện

Tại Việt Nam việc sử dụng chế phẩm nấm Beauveria bassiana đã được tiến hành từ

năm 1979, đến nay vẫn tỏ ra có tác dụng đối với sâu róm thông và một số loài sâu hại cây nông nghiệp (Nguyễn Xuân Thành, 1996)

NấmBeauveria (nấm bạch cương) hay còn gọi là nấm cứng trắng, nấm tằm

vôi, là loại thườnggặp trên nhiều loài sâu hại Riêng chúng có mặt trên 120 loài thuộc

45 họ 7 bộ côn trùng rừng Nếu tính cả sâu hại nông nghiệp chúng có thể kí sinh trên

gần 200 loài Loài Beauveria thường được tìm thấy trong đất, các mảnh vụn thực vật

và ở côn trùng bị nhiễm bệnh, gây ra bệnh muscardinetrắng Loài nổi tiếng nhất là B bassiana, một loài đáng chú ý về gây bệnh và tử vong ở côn trùng

Beauveria là một chi nấm trong ascomycete hoặc “nấm túi”.Tốc độ tăng trưởng củaBeauveria khá nhanh Các khuẩn lạc đạt đến đường kính 1 đến 3 cm sau ủ ở 25oC trong 7 ngày trên môi trường thạch glucose khoai tây Đặc điểm cơ bản của loại nấm này là thể sợi màu trắng, dạng lông, sợi nấm mảnh đường kính 1,5 - 2 µm, cuống bào tử mọc đơn hoặc phân nhánh Bề mặt có màu trắng nhạt, màu trắng vàng hoặc màu hồng nhạt Tế bào sinh bào tử hình bình, hình ống hoặc hình cầu, thẳng hoặc hơi uốn cong Trục sợi uốn hình chữ “Z” bào tử mọc trên đầu góc chữ Z cùng với cuống rất nhỏ

Năm 1954, Macleod phân nấm bạch cương ra 2 loài chính là Beauveria bassianacó bào tử hình cầu (hoặc trên 50% bào tử hình cầu) nằm trên cuống nhỏ gắn

về nhiều hướng và B brongniartii (B tenella) có bào tử hình trứng (2% bào tử hình cầu) Trong hai loài này, loài B bassiana phân bố rộng nhất, xâm nhiễm nhiều loài côn trùng nhất được dùng để phòng trừ sâu thuộc bộ cánh vẩy và cánh nửa Nấm B tenella

thường phân bố trong đất và dùng để phòng trừ sâu non bọ hung

Năm 1975, Hook lại công bố 2 loài nấm bạch cương không có tác dụng phòng

trừ sâu là B alba và B vermiconia Sau đó Carmichae (1980) và Samson (1982) lại công bố thêm 3 loài mớiB felina, B velata, B amorpha Như vậy nấm bạch cương đã

có đến 7 loài Về sau năm 1984 ở Nhật Bản đã phân lập được rất nhiều loài có bào tử

hình ống và hình que ở giữa thắt lại và hơi uốn cong, tế bào sinh bào tử hình bình, đuôi hình chữ Z, kích thước bào tử 3,4 – 4,7 µm x 1,2 – 1,8 µm

1.1 Yêu cầu

Phân lập và định danh giống Beauveria sp gây bệnh trên côn trùng nhằm tạo bộ mẫu nguồn và chọn lọc loài Beauveria có khả năng sử dụng trong đấu tranh sinh học

1.2 Nội dung thực hiện

Lấy mẫu và phân lập nấm Beauveria sp từ các loại côn trùng

Định danh bằng hình thái các mẫu nấm

Định danh bằng phân tử các mẫu nấm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.Lịch sử nghiên cứu nấm gây bệnh côn trùng

Từ năm 2700 trước công nguyên, nhà triết học Hy Lạp Aristotle đã tìm hiểu về hiện tượng ong bị bệnh chết hàng loạt, 200 năm sau các nhà khoa học đã chứng minh được côn trùng và một số động vật không xương sống khác bị chết là do nhiễm một số loại vi nấm Năm 1709, Balisneri là người đầu tiên mô tả về nấm gây bệnh trên côn trùng

Đến thế kỷ 18, các nhà khoa học đã chứng minh nấm gây bệnh côn trùng là những loài sinh vật có khả năng lan truyền bệnh từ vật chủ này sang vật chủ khác Agostino được coi là người đi đầu trong lĩnh vực bệnh lý học côn trùng, đã bỏ hơn 30

năm nghiên cứu nấm trắng muscardine gây bệnh trên tằm dâu (Bombyx mori L.) Năm

1815, Agrostino đã mô tả khá tỉ mỉ về bệnh nấm trắng muscardin là nguyên nhân

chính gây bệnh cho tằm dâu Năm 1835, ông tìm ra nấm Beauveria bassiana là nguyên

nhân gây bệnh.Khám phá của ông không chỉ đặt nền móng cho nghiên cứu về vi sinh vật gây hại mà còn ảnh hưởng đáng kể đến nghiên cứu củaPasteur,Koch và nhiều người đi đầu trong lĩnh vực vi sinh vật gây bệnh để trừ côn trùng hại Từ năm 1885

đến 1890,Paster đã định danh được nấm trắng gây bệnh trên tằm là Beauveria bassiana và những thí nghiệm của ông làm nền tảng cho việc nghiên cứu sử dụng nấm

trừ côn trùng gây hại cho cây trồng Chính Pasteur (1874) đã đề xuất tìm kiếm nấm

côn trùng thích hợp để trừ rệp hại nho Phylloxera (Nguyễn Lân Dũng, 1981)

Năm 1944, Steinhaus là nhà khoa học đầu tiên thành lập phòng thí nghiệm chuyên nghiên cứu bệnh lý côn trùng, mở đường cho hướng nghiên cứu thực nghiệm

về khả năng lây nhiễm bệnh và ứng dụng để phòng trừ sâu hại ngoài đồng ruộng Theo Steinhaus (1956), minh họa đầu tiên về nấm gây bệnh côn trùng được Reaumur công

bố năm 1726 với một loài nấm thuộc giống Cordyceps gây bệnh cho sâu non họ Noctuidae.Và theo ôngý tưởng sử dụng vi sinh vật trừ côn trùng hại bắt nguồn từ các nghiên cứu bệnh tằm Năm 1824, Cist nghiên cứu về bệnh của sùng Melolonthado nấm Cordyceps gây ra Torrubia (1974) đã ghi nhận một loài cánh màng (có thể là Polistes) bị chết do nấm Cordyceps sphecocephala Năm 1837, Oduen cũng cho rằng

nấm bạch cương không chỉ gây bệnh cho tằm, đồng thời có thể dùng nấm này để trừ

các côn trùng khác Năm 1892Tangi đã nuôi cấy nhân tạo thành công nấm bạch cương

Beauveria bassiana rồi dùng bào tử của chúng tiêu diệt sâu róm (Porthetriadisper)

(Nguyễn Lân Dũng, 1981)

2.2 Sơ lược về nấm kí sinh côn trùng

Theo Steinhaus (1949), nấm gây bệnh côn trùng có ý nghĩa rất lớn vì có thể gây chết thường xuyên nhiều loại côn trùng có hại với tỷ lệ chết rất cao và là một trong những tác nhân điều hòa quần thể vi sinh vật trong tự nhiên rất hiệu quả Cũng như vi khuẩn, nhiều nấm liên quan với côn trùng như vi sinh vật cộng sinh, hoại sinhhoặc kí sinh Chỉ có nấm kí sinh côn trùng mới gây hiện tượng bệnh lý, làm chết côn trùng, do

đó chúng có ý nghĩa rất lớn trong bảo vệ thực vật

Nấm gây bệnh côn trùng thuộc nhiều nhóm khác nhau từ nhóm nấm nguyên thủy sống dưới nước đến nhóm nấm bậc cao sống trên cạn Đa số nấm diệt côn trùng

có số lượng lớn nhất thuộc bộ Entomophthoralesct (Mastigomycotina) và Moniliales (Deuteromycotina)

Theo Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006), nấm bất toàn kí sinh trên côn trùng có rất nhiều loài, phân bố rộng Người ta có thể sử dụng nhiều loại dinh dưỡng để nuôi cấy và sản xuất chế phẩm, nên nấm này đã được ứng dụng rộng rãi trong thực tế sản xuất.Hầu hết các nấm này thường kí sinh trên sâu non làm cho thân sâu cứng lại, trên thân mọc đầy các sợi nấm và bào tử phân sinh tạo nên các màu

Nấm bất toàn có thể sợi phân nhánh và có vách ngăn Trong ngành phụ nấm bất toàn có các lớp bào mầm, lớp bào tử sợi và lớp bào tử xoang Hầu hết các loài nấm gây bệnh côn trùng thuộc lớp bào tử sợi Chúng không có cơ quan bao bọc, chỉ có cuống bào tử và bào tử trần Phần lớn chúng thuộc các họ cuống chùm Một số loài thuộc bộ

vỏ cầu và bộ vỏ đỏ đệm Cụ thể là: nấm bào tử hình thoi và nấm bạch cương

2.3 Triệu chứng côn trùng bị bệnh do vi nấm

Khi bị bệnh nấm, côn trùng ngưng vận động 2 – 3 ngày, màu sắc cơ thể thay đổi ngay tại vị trí nấm phát bệnh, bên trong thân của sâu non xuất hiện những vệt đen, không có hình thù nhất định Cơ thể có màu vàng nhạt, trắng và hồng, thân hơi cứng, màu sắc thay đổi tùy thuộc vào màu sắc của bào tử nấm gây bệnh Kích thước cơ thể ngắn lại hoặc bị khô do hệ thống tiêu hóa bị tổn thương hoặc do thiếu thức ăn và chết Kèm theo đó là hiện tượng tiêu hủy mô đặc trưng của bệnh nấm và trải qua hai giai đoạn:

- Hiện tượng chấn thương: các mô bị tổn thương do nấm gây ra, các lympho máu đọng lại và mô tái sinh được tạo thành bên trên bề mặt phần thân côn trùng bị tổn thương

- Hiện tượng nhiễm trùng máu: xảy ra hiện tượng thực bào do lympho chứa đầy sợi nấm, các tế bào bao vây nuốt một phần tiểu thể nhất định tạo thành những hợp bào

và các tế bào khổng lồ làm cho côn trùng chết

2.4 Điều kiện để nấm có thể tấn công côn trùng

Theo Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), để bệnh dịch nấm phát triển được thì ngoài điều kiện thời tiết thuận lợi còn cần yếu tố mật độ côn trùng cao và tình trạng sinh lý của chúng Bệnh dịch nấm lan truyền được khi độ ẩm không khí đạt 90% - 100% Ngoài cấu trúc vỏ côn trùng giữ vai trò quan trọng trong

sự xâm nhập phá hủy vỏ của nấmdiệt sâu thì các vấn đề như trạng thái sinh lý của côn trùng (Rudens, 1996), độ bền vững của chitin (PyPat, 1940), sự có mặt của nấm ức chế (Sussman, 1951), hay chất kích thích (Natini, 1944) và thành phần của tấm cutin ngoài của một số loại côn trùng cũng có ý nghĩa quan trọng

2.5 Sơ lược về nấm Beauveria bassiana

2.5.2 Đặc điểm nhận biết nấm Beauveria bassiana

Theo Kirk và ctv (2001), về mặt hình thái Beauveria được phân biệt dựa vào hình dạng của tế bào sinh bào tử Trong quá trình nuôi cấy, nấm Beauveria sinh ra các

sợi nấm trắng và bào tử đính,khi bào tử già có các giọt màu vàng xuất hiện ở giữa đối

với loài B amorpha và B velata Một số loài khác xuất hiện các giọt dịch màu đỏ trên

bề mặt khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng.Trước đây, các loài trong

chiBeauveria được nhận biết dựa vào kích thước bào tử, tuy nhiên phương pháp định danh này thường gặp nhiều khó khăn bởi vì các loài nấm Beauveria không khác biệt

nhiều về kích thước Dựa vào đặc điểm hình thái, De Hoog (1972) đã mô tả rất chi tiết

hình dạng của 8 loài trong chi Beauveria và cho biết chỉ có thể nhận biết chắc chắn được hai loài là B bassiana và B.densodựa vào hình dạng của bào tử đính Theo Glare

và cs (1998), sự khác biệt về hình thái giữa các loài trong chi Beauveria chịu ảnh

hưởng bởi các điều kiện nuôi cấy và thành phần các chất có trong môi trường dinh dưỡng vì vậy rất khó nhận biết đến loài nếu chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái Tương

tự, Samson (1981) khi xác định 16 mẫu Beauveria cũng chỉ phân biệt được hai loài là bassiana và B denso hoặc B tenella Về sau B denso được đổi tên là B brongniartii

và đã phát hiện thêm một loài mới nữa là B album

2.5.3 Đặc điểm nuôi cấynấm Beauveria bassiana

Nấm Beauveria bassiana nảy mầm tốt trong môi trường có đường mía và

pepton Trong các loại đường nói chung,glucoza luôn luôn là nguồn carbon rất tốt cho các loài nấm kí sinh côn trùng nấm cũng cần nito hữu cơ và vô cơ, trong nito vô cơ thích hợp với NO3- hơn NH4+ Phốt pho (P) là nhân tố quan trọng làm tăng số lượng nấm, trong giai đoạn sinh trưởng nhu cầu carbon (C), nito (N) của nấm rất rõ rệt nhưng đến khi sợi nấm đứt ra hình thành bào tử đốt nhu cầu C, N giảm dần còn P lại tăng lên (trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2008)

Theo Trần Văn Mão (2008) phạm vi nhiệt độ của nấm khoảng 5 – 35oC, thích hợp nhất cho sự nảy mầm,phát triển và tạo bào tử của nấm là 20 – 30oC, nếu nhiệt độ thấp nấm sinh trưởng chậm, nhiệt độ cao sinh trưởng nhanh nấm mau già yếu Nhiệt

độ cũng ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử Brunno (1964), cho biết sự nảy mầm và

phát triển sợi nấm của Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana đã bị ức chế

mạnh ở nhiệt độ dưới 1oC Khi tăng nhiệt độ tốc độ phát triển của nấm tăng và nhiệt độ thích hợp là 22 – 26oC

Độ ẩm cao có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, nhưng nhiệt

độ thấp lại có lợi cho duy trì sự sống của nấm Theo Phạm Thị Thùy (2004), ẩm độ thích hợp trong phạm vi 80 – 90%, nếu trên hoặc dưới ngưỡng thì nấm phát triển yếu

Nấm Beauveria có tính thích nghi rộng, phạm vi nảy mầm là pH 3,0 – 9,4 Ở

pH 4,4 thì nảy mầm nhiều nhất, tốc độ nảy mầm cũng nhanh nhất.Sợi nấm sinh trưởng

ở pH 4,5 – 5,0, hình thành bào tử tốt nhất ở pH 6 (Trần Văn Mão, 2008)

2.5.4 Hoạt tính sinh học của nấm Beauveria bassiana

Nấm Beauveria bassiana có khả năng tổng hợp một lượng lớn các enzyme,

trong đóchitinaza, proteinaza, lipaza, ureaza, aspatainaza và amylaza có ý nghĩa lớn nhất cho khả năng gây bệnh trên côn trùng Enzyme amylaza có mức độ hoạt tính gấp

3 lần hoạt tính enzyme khác

Năm 1969, các nhà khoa học đã xác định được độc tố diệt côn trùng của nấm

bạch cương Beauveria bassianavà đặt tên cho độc tố này là beauvericin Chất này

được chúng tiết ra khi bào tử nảy mầm.Về mặt hóa học, beauvericin có danh pháp là xyclo (N - metyl - L - phenylalanin - D - α - hydroxylzovalery) Đó là một loại depxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng 93 – 94oC Từ một lít dung dịch môi trường

nuôi cấy nấm Beauveria bassiana các nhà khoa học Trường Đại học Tổng hợp Nam

Khai (Trung Quốc) đã tách ra được 1,5 g độc tố beauvericin và từ 1 kg môi trường đặc các tác giả đã tách ra được 3,8 g beauvericin

Theo nghiên cứu của các nhà khoa học đến từ Đại học Kitasoto – Nhật Bản

nhóm chất beauveriolide trong nấm Beauveria có khả năng ngăn chặn đại thực bào hấp

thu cholesterol các axít béo cấu thành giọt nhỏ - hìnhthái cho phép các đại thực bào dễ dàng hấp thu, hai là khống chế hoạt động của một loại enzyme có mặt trong đại thực bào chịu trách nhiệm thu giữ những giọt chất trên.Thử nghiệm beauveriolide trên những con chuột mắc chứng xơ vữa động mạch cho thấy sự tích tụ cholesterol và các chất béo giảm tới 50% so với những con khác Nhóm nghiên cứu khẳng định liệu pháp này không gây phản ứng phụ như tiêu chảy hay làm tổn thương tuyến thượng thận điều

mà các thuốc kiềm chế enzyme không thể làm được

2.6 Sự xâm nhiễm và phát triển của nấm kí sinh côn trùng

Sự xâm nhiễm và phát triển của nấm bên trong cơ thể côn trùng là một quá trình phức tạp gồm ba giai đoạn chính:

- Giai đoạn xâm nhập: từ lúc bào tử nấm mọc đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào cơ thể côn trùng

- Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng đến khi côn trùng chết: lúc này nấm tạo ra rất nhiều sợi nấm ngắn phân tán khắp cơ thể theo dịch máu Về phía côn trùng chỉ có phản ứng tự vệ kéo dài trong một thời gian ngắn để kìm hãm sự xâm nhập của nấm vào các nội quan Khi các sợi nấm xâm nhập vào tất cả các bộ phận chúng đồng thời gây chết vật chủ

- Giai đoạn sinh trưởng phát triển của nấm sau khi vật chủ chết: đây là giai đoạn hoại sinh của nấm kí sinh côn trùng, nấm sẽ hình thành các bào tửhoặc nấm mọc thành sợi ra ngoài cơ thể vật chủ Cuối cùng các bào tửđược tạo thành trên lớp sợi nấm ở ngoài bề mặt cơ thể côn trùng

2.7 Cơ chế xâm nhiễm của nấm gây bệnh côn trùng

Độc tố của nấm trắng là Boverixin và men kitinaza phân giải kitin (Nguyễn Xuân Thành, 1996)

Bào tử nấm rơi trên cơ thể côn trùng, sau đó trương lên, nảy mầm và phát triển khi gặp các điều kiện thích hợp, nhất là khi độ ẩm cao Nấm phát triển sợi và phân nhánh Cuống bào tử hình thành bào tử đính, bào tử phát triển rụng ra ngoài gặp gió phát tán (Nguyễn Xuân Thành, 1996)

Năm 2003, Nguyễn Xuân Thành và ctv đã đưa ra cơ chế rõ hơn về sự xâm nhiễm của nấm trắng vào côn trùng Nấm xâm nhập vào cơ thể côn trùng chủ yếu qua lớp vỏ cutin (ngoài ra còn có thể qua đường tiêu hóa, hô hấp và qua lỗ của thân) tức là

có sự tiếp xúc của bào tử nấm với cơ thể vật chủ bắt đầu sau khi vật chủ bị nhiễm bào

tử nấm sau khoảng 10 giờ và có thể kéo dài vài ngày sau, sau đó bắt đầu sinh trưởng

và phát triển Trong quá trình xâm nhiễm, nấm bị các tế bào bạch huyết tấn công do đó nấm sẽ tiêu diệt các tế bào bạch huyết Sau khi diệt hết các tế bào bạch huyết thì côn trùng chết và nấm tiếp tục sinh trưởng, phát triển Lượng sợi nấm bên trong côn trùng ngày càng tăng và xác côn trùng trở nên rắn lại, khi gặp đủ ẩm, các sợi nấm mọc ra ngoài bề mặt cơ thể côn trùng và hình thành bào tử mới

Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử nấm phình lên, nảy mầm thành ống mầm, ống mầm tiếp xúc với da côn trùng hình thành vòi bám Vòi bám là một tế bào có kích thước gấp 2 - 3 lần bào tử, có dịch nhầy để dính vào da Vòi bám hình thành sợi nhỏ chọc thủng da Sau khi xuyên qua da sợi nấm phình to thành dạng bàn, mép bàn mọc sợi nấm rồi hình thành các sợi ngắn Sợi ngắn nhờ áp lực đẩy vào lớp trong cuối cùng đạt đến da thật Nếu côn trùng lột xác, chúng lại hình thành vòi bám mới để tiến hành tái xâm nhiễm Nấm thông qua áp lực cơ giới để xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng

và nhờ tác dụng của enzyme phân giải mà chọc thủng biểu bì Những enzyme phân giải là proteaza, lipoaza và kitinaza Muốn da phân giải trước hết là nhờ proteaza, rồi lipoaza, cuối cùng mới có tác dụng của kitinaza.Mỗi loài nấm khác nhau sẽ hình thành các enzyme khác nhau nhưng chúng đều có thể tự tạo ra enzyme kitinaza (Trần Văn Mão, 2008)

Khi xâm nhập vào bên trong cơ thể qua đường tiêu hóa, bào tử từ miệng đi tới ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các tế bào nội quan để gây bệnh.Xâm nhiễm kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm sống ở nước Dưới tác động của độc tố do

nấm tiết ra có thể dẫn đến hiện tượng ngừng nhu động ruột của vật chủ Bào tử còn có thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào bên trong cơ thể côn trùng nhưng rất ít

2.8 Tính an toàn của nấm đối với động vật máu nóng

Nói chung nấm thường phát triển trong điều kiện nhiệt độ thấp và không ảnh hưởng đến động vật máu nóng Pian đã nêu rõ, nấm bạch cương trong cơ thể sống ở nhiệt độ 35oC, dù ở điều kiện ẩm độ nào đều ngưng phát triển và sau 28 ngày là mất khả năng sống, cho nên chúng rất an toàn đối với con người (Trần Văn Mão, 2008)

Schaerffenberg (1968) đã làm thí nghiệm để thử tính độc của nấm trên chuột bạch Ông dùng 0,5 ml dịch chứa 25 bào tử nấm tiêm vào tĩnh mạch chuột sau đó quan sát thấy những con chuột này không có biểu hiện gì khác thường, sau đó thí nghiệm khác được lặp lại bằng cách dùng bột bào tử rắc vào hộp 4 mg/m2 cho chúng hít vào sau 2 tháng quan sát vẫn không thấy chuột có hiện tượng trúng độc

Các nhà khoa học đã thử nghiệm tiêm dung dịch bào tử nấm Beauveria bassiana lên chuột, lợn và cho chúng ăn, theo dõi sau 2 tháng vẫn không thấy chúng

có phản ứng Điều này chứng tỏ nấm không có ảnh hưởng xấu đối với con người và động vật máu nóng Thí nghiệm độc lý cho thấy chúng có độ độc rất thấp LD50 > 2500 mg/kg Nhiều thí nghiệm đều chứng tỏ nấm bạch cương là loại nấm an toàn

2.9 Phương pháp định danh nấm

2.9.1 Định danh bằng hình tháicác mẫu nấm

Quan sát đặt điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch: hình dáng, kích thước, dạng mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, lồi lõm, có khía cạnh hay không,…) Màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới, dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo…), giọt tiết nếu có (nhiều, ít, màu sắc),…

Quan sát các đặc điểm vi học: sợi nấm (có vách ngăn, không có vách ngăn, có mấu); bào tử trần (kiểu phát sinh bào tử trần, hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt…); kiểu sinh bào tử trần (thể bình, dạng có khuyên ở đính, dạng sinh bào tử trần đồng thời, dạng sinh bào tử trần không đồng thời, bào tử đính kiểu nảy chồi, hình dạng, kích thước, màu sắc, cách sắp xếp, vị trí…

Tiến hành định loại: căn cứ vào kết quả quan sát đầy đủ, chính xác đặc điểm khuẩn lạc và các đặc điểm vi học tiến hành xác định tên loài:

Dùng khóa phân loại của các nhóm phân loại bậc cao (ngành, ngành phụ, lớp,

bộ, họ, chi) để xác định lần lượt xem thuộc chi nào Tiếp theo dùng khóa phân loại của chi đó để xác định đến loài bằng cách so sánh tất cả các đặc điểm đã quan sát được của chủng nấm đó với các đặc điểm tương ứng của loài nào đó trong khóa phân loại Nếu các đặc điểm so sánh phù hợp với đặc điểm của loài mô tả, ta xác định được tên loài nấm cần định danh

2.9.2 Định danh sinh học phân tử nấm

2.9.2.1 Khái niệm PCR

Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật nhân đoạn DNA dựa vào các base trình tự Kỹ thuật này thường dùng để xác định mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài và là kỹ thuật ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học (Amheim

và cộng sự, 1990; White và cộng sự, 1990)

Kỹ thuật PCR được Karry Mullis phát minh năm 1985 và được tiếp thu hoàn thiện thông qua việc phát hiện và sản xuất được enzyme DNApolymerase chịu nhiệt từ

vi khuẩn Themophilus aquaticusvà một số vi khuẩn khác.Máy PCR ngày càng hoàn

thiện cho phép thay đổi nhanh chóng, chính xác nhiệt độ từng giai đoạn nhân bản DNA Cho đến nay, kỹ thuật PCR được coi là phương pháp nền quan trọng của công nghệ di truyền

PCR bao gồm enzyme khuếch đại một trình tự DNA đặc hiệu Vùng thường được sử dụng để khuếch đại là vùng lặp lại không mã hóa ITS (Internal Transcribeb Spacer) trong RNA ribosome, vùng này có giá trị thay đổi giữa các loài nấm và do đó

có thể xác định mối quan hệ giữa các loài (Bruns và cộng sự, 1992) Kỹ thuật này rất

có giá trị bởi tính tiến hóa ở mức độ cao của các loài và các chủng có thể được so sánh PCR rất có giá trị trong việc xác định ở mức độ loài và chủng Nó phù hợp để xác định các nhóm, các chủng đặc biệt

2.9.2.2 Nguyên tắc phản ứng PCR

Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể như: đoạn DNA cần nhân bản mở xoắn thành hai mạch đơn, cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu và điều kiện môi trường thích hợp và enzyme DNA polymerase Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung

với một đầu của mạch khuôn và DNA sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phương phápPCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase (HồHuỳnh Thùy Dương, 2008) Theo tác giả nếu cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp

bổ sung với hai đầu của một trình tự DNAchỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo ra các mồi chuyên biệt

2.9.2.3 Giới thiệu về rDNA và vùng ITS

rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa Hơn nữa, ribosom hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánhcácsinh vật khác nhau.Cácprimerthiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật.Các rDNA 5,8 S, 18 S, và 25 S phiên mã thành các tiền rRNA riêng lẻ, nằm xen kẽ với cácvùng phiên mã bên trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS) Giữa cácnhóm gen gồm nhiều bản saolặp lại làvùng không phiên mã Có một rDNA 5 S thường không có vị trí cốđịnh và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại, rDNA 5

S thường chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm Kích thước của mỗi vùng lặp lại nằm trong khoảng 7,7 – 24 kbp (Guarro và cs, 1999)

rDNA 18 S thường được quan tâm nghiên cứu; rDNA 5,8 S có kích thước rất nhỏ và ítcó sự biến đổi song rRNA 5,8 S là thành phần không thể thiếucủa

nu – LSU – rRNA, có vai trò ổn định cấu trúc ribosom và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein; rDNA 25 S mặc dù ít có sự biến đổi song lại rất có ý nghĩa trong phân loại (Guarro và cs, 1999)

Vùng ITS là vùng có rất nhiều sự biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của vi sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng nàychỉ sửdụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong cùng loài (Guarro và cs, 1999)

2.10 Các nghiên cứu về nấm Beauveria

2.10.1 Nghiên cứu trong nước

Ở nước ta kể từ năm 1990 đến nay, các nghiên cứu về nấm Beauveria bassiana

chủ yếu là các nghiên cứu về công nghệ sản xuất các chế phẩm từ nấm và hiệu quả phòng trừ côn trùng của chúng

Từ giữa thập niên 1970, trường Đại học Lâm nghiệp bắt đầu nghiên cứu nấm

Beauveria bassiana để trừ sâu róm thông(Dendrolimus punctatus)nhưng chưa chế

phẩm nào được ứng dụng trong sản xuất

Chế phẩm nấm Beauveria bassiana được sản xuất bằng phương pháp lên men

xốp, sinh khối nấm đạt 5 x 108 bào tử/gram, đồng thời thu hoạch nấm tốt nhất theo phương pháp này là 10 ngày Chế phẩm này được làm khô ở nhiệt độ 45oC trong vòng

8 giờ và có thể bảo quản được trong 6 tháng Khi thực hiện phương pháp lên men chìm

có sục khí trong nồi lên men 5 lít chứa môi trường có pepton, cao nấm men và muối khoáng, sau 48 giờ ở 30oC bào tử nấm đạt 8,5 x 109 bào tử/gram Hiệu quả sử dụng tốt nhất của chế phẩm là trên rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đậu, châu chấu sống lưng vàng với nồng độ sử dụng là 5 – 6 x 108 bào tử/ml Hiệu lực của thuốc nấm phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ và độ ẩm(Phạm Thị Thùy và ctv, 1991 – 1995)

Phạm Thị Thùy và ctv (1996), tiến hành thí nghiệm trong nhà lưới với hai chế

phẩm nấm Beauveria và Metarhizium Với nồng độ dưới 200 triệu bào tử/ml cho hiệu

quả thấp đối với rầy non tuổi 3 của rầy nâu Ở nồng độ 500 triệu bào tử/ml cho hiệu quả đối với rầy non 3 tuổi là 72 – 75% Nồng độ cao hơn 600 – 650 triệu bào tử/ml, hiệu lực của hai loại nấm đều đạt từ 65 – 80% Dựa trên cơ sở đó, đã tiến hành thí nghiệm ngoài đồng ruộng với diện tích 5000 m2 dùng nấm để trừ rầy nâu ở viện BVTV, Tiền Giang, Hà Nam, Bà Rịa – Vũng Tàu Sau 10 ngày phun chế phẩm, hiệu

lực đối với rầy nâu của nấm Beauveria, Metarhizium đạt tương ứng là 47,5 – 69,9% và

20,6 – 79,5% Hiệu lực này kéo dài đến ngày thứ 15 sau khi phun nấm

Theo Viện sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, các giống nấm có hiệu lực diệt sâu cao có thể mất dần tính độc trong quá trình nuôi cấy Sử dụng phương pháp tách tế bào đơn từ sâu nhiễm đã chọn được các chủng nấm diệt sâu có độc tính

cao Từ các mẫu sâu chết đã phân lập được 9 chủng nấm Beauveria bassiana trên sâu

xanh da láng, châu chấu và bọ hà khoai lang tại Đà Lạt, Hóc Môn và Indonesia

Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy 9chủng đều có hiệu lực diệt ấu trùng tằm, ấu trùng bọ hà, bọ hà trưởng thành và sâu xanh da láng nhưng ở các mức độ

khác nhau.Thử nghiệm kết hợp nấm Beauveria bassiana với pheromon trên ruộng

khoai lang ở Thủ Đức làm giảm 10 % số củ khoai lang bị hà (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Nguyễn Thị Lộc (2000), đã sản xuất chế phẩm trừ sâu sinh học từ nấm trắng

Beauveria bassiana ở dạng bột thấm nước cho chất lượng tốt, số lượng bào tử cao

(1,5 – 2,0 x 1010 bào tử/gram) Sau 8 tháng bảo quản ở nhiệt độ và độ ẩm bình thường, chế phẩm vẫn còn hiệu lực ổn định và kéo dài 3 – 4 tuần sau khi phun Các thí nghiệm trong nhà lưới và trên đồng ruộng cho kết quả diệt rầy đạt 65 – 87%, diệt trừ

bọ xít hại cây trồng là 69 – 87% sau phun 5 – 7 ngày

Nguyễn Xuân Niệm (2003) khi nghiên cứu hiệu lực trừ sâu hại của chế phẩm

Bemetent (được phối từ 3 loại nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Entomopthorales) của Công ty Hợp danh Sinh Thành trong phòng trừ bọ cánh cứng

hại dừa tại Kiên Giang đã kết luận rằng Bemetent có hiệu lực phòng trừ cả thành trùng

và ấu trùng của bọ cánh cứng hại dừa

Theo Trần Văn Mão (2004), ở nước ta có nhiều chế phẩm Boverin đã được thực hiện ở nhiều tỉnh như Nghệ An, Thanh Hóa, Viện BảoVệ Thực Vật, đã áp dụng phương pháp phòng trừ sâu róm thông cho hàng ngàn hecta bằng nổ pháo, nổ mìn, treo lên cây, phun mù, phun bột tại các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Ninh, Ninh Bình, Bắc Giang từ năm 1980, hiệu quả diệt sâu đều đạt 80% Ngày nay chế phẩm này vẫn còn được sản xuất và có tác dụng phòng trừ rõ rệt Một số vùng sử dụng chế phẩm Boverin phòng trừ sâu đục quả đậu bằng cách phun vào đất làm cho sâu non khi chui vào đất bị bào tử nấm xâm nhiễm, tỷ lệ sâu chết tới 50 – 70% Ngài đục táo, mọt cà phêsau khi

phun chế phẩm nấm B bassiana thì tỷ lệ trứng của con cái giảm xuống 45– 60%

Kết quả nghiên cứu của Viện Bảo Vệ Thực Vật đã ứng dụng các chế phẩm nấm

gây hại côn trùng như nấm trắng B bassiana, nấm xanh M anisopliae, M flavoviridae

trừ sâu róm thông, rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đay, châu chấu hại ngô, mía, kiến vương hại dừa

2.10.2 Các nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, việc sử dụng thiên địch trong đấu tranh sinh học chống sâu hại có lịch sử khá lâu đời

Nhiều nước như Úc, Mỹ, Braxin, Đức, Ấn Độ, Tây Ban Nha, Pháp, Colombia,

Venezuela… đã sản xuất thành công các chế phẩm sinh học từ B bassiana để trừ dịch

hạicâytrồng như Conidia, Ostrinil,CornGuard,Mycotrol GH,Mycotrol WP, BotaniGard, Naturlis – L, Boverin, AgoBio.Bassiana 50, Bb Plus

Rombach và ctv (1988) đã sản xuất chế phẩm từ nấm B bassiana trên các môi

trường khác nhau như: 1 Saccharose 3,5%, maltose 2%, YE 3,5%; 2 Maltose 2%,YE 0,75% Nuôi cấy chìm trong 72 giờ ở nhiệt độ 72oC và nuôi cấy bề mặt 8 ngày Dùng chế phẩm 2,5 – 5 x 1012bào tử phun cho 1 hecta ruộng lúa để diệt sâu hại lúa

Theo Kaaya và ctv (1996), cả hai loại nấm B bassiana và M anisopliae đều gây

tỷ lệ chết khoảng 30% đối với Rhipicephalus appendiculatus trưởng thành trên thỏ, trong khi M anisopliae gây ra tỷ lệ chết 37% đối với Amblyomma variegatum trưởng thành.M anisopliae vàB bassiana đều gây ra sự giảm sút về trọng lượng, sự mắn đẻ và

sự nở trứng củaA variegatum trưởng thành M anisopliae làm giảm sự mắn đẻ củaA variegatum khoảng 94%, B.bassiana làm giảm sự nở trứng của A variegatum xuống tới

0% và làm cho 10% số con cái bị bệnh không có khả năng đẻ trứng

Năm 1999, Vineet Kumar và ctv đã nghiên cứu về sự nảy mầm và xâm nhiễm

của Beauveria bassianatrên tằm Bombyx mori chủng NB18, nuôi cấy ở nhiệt độ 26 ±

1oC, độ ẩm tương đối 80 + 5% và chiếu sáng 16 giờ Chỉ cần 50 bào tử/ấu trùng, độc

tính của Beauveria bassiana đã đủ mạnh để giết chết ấu trùng tằm ở giai đoạn lột xác

sang tuổi 5 với liều lây nhiễm là 1 x 106 bào tử/ml Bào tử nảy mầm sau khi lây nhiễm khoảng 8 giờ, tạo thành một giác bám trong vòng 24 giờ, các sợi nấm vào lớp biểu bì nhờ tiết ra enzyme teolytic và lipolytic exocellula giúp cho việc giải thể lớp da của ấu trùng Trong vòng 24 giờ, nấm tăng trưởng mạnh tạo thành một phức hợp sợi nấm, làm

ấu trùng chết trong khoảng 5 – 6 ngày Trong 6 – 7 ngày, sợi nấm phát triển tạo thành một tấm thảm nấm màu trắng trên toàn bộ cơ thể ấu trùng Sau khi vật chủ chết các sợi nấm chuyển ra ngoài để sang giai đoạn bào tử Do đó, nấm hoàn thành vòng đời của mình trên ấu trùng tằm trong 7 – 8 ngày Nhiều lớp tinh thể khác nhau về hình dạng và kích thước đã được quan sát trên da và xung quanh viền lỗ thở của ấutrùng Các tinh thể

có thể là oxalat của amon và magie đã được tạo ra khi nấm nhiễm vào

Theo Kaay và Hassan (2000),dung dịch bào tử nấm (M.anisopliae,B bassiana)

có pha thêm dầu (ở nồng độ 109bt.ml-1) khi xử lý lên các loài ve (kí sinh trên thú nuôi)

thì xảy ra tỷ lệ chết đối với ấu trùng của Rhipicephalus appendiculatus

vàAmblypmmavariegatum là 100%, đối với nhộng là 80 – 100%, đối với trưởng thành là

80 – 90% Ngược lại, dung dịch bào tử của các nấm trên khi pha với nước cũng ở nồng

độ 109 bt.ml-1chỉ gây ra tỷ lệ chết 40 – 50% và làm giảm sự nở trứng 68% (B bassiana)

và 48%(M anisopliae) khi phun lên Boophilus decoloratus trên thú nuôi Các dòng của

B bassiana và M anisopliaethu được từ những con ve bị bệnh trong tự nhiên cũng gây

ra tỷ lệ chết cao đối với R.appendiculatus và A variegatum được giữ trong lồng nilon

đặt trên những chậu cỏ, cả hai thành phần nước và dầu trong dung dịch bào tử nấm đều mang lại hiệu quả

Kamp và Bidochka (2002) tiến hành đánh giá sự sản xuất bào tử của 3 loại nấm

kí sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Verticillium lecanii

được đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2 mm, 3 mm, 4 mm tương ứng với 10 ml, 15 ml,

20 ml) và với các loại môi trường khác nhau (SDA, MEA, NA, CMA, YPDA, PDA)

cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm nảy mầm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana là tốt nhất trên môi trường PDA ở độ sâu 2 mm, trong khi Verticillium lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên môi trường YPDA và độ sâu của môi

trường thì không đáng kể

Santa và ctv (2005), tiến hành nghiên cứu sản xuất bào tử Beauveria bassiana từ

chế phẩm công nông nghiệp trong nồi lên men với điều kiện nuôi cấy được tối ưu hóa:nhiệt độ nuôi cấy 26oC, pH 6,0, mật độ 107 bào tử/gram và độ ẩm ban đầu 75% Trong điều kiện tối ưu có sục khí, bào tử tạo ra lớn nhất (1,07 x 1010 bào tử/gram) sau 10 ngày nuôi cấy

Sonai Rajan và Muthukrishnan (2010), khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường Potato boost agar, Potato horlicks agar, Potato maltoza agar, Potato viva agar, Potato complan agar, Potato bournvita agar đến khả năng phát triển và hình thành bào tử

của chủng nấm Nomuraea rileyi (Farlow) Samson (trước đây còn gọi Beauveria rileyi (Farl.) Gosswald): PDBC, DOR, LOCAL Theo đó môi trường thạch cho đường kính

khuẩn lạc và mật số bào tử cao nhất sau 15 ngày theo dõi là Potato maltoza agar, tương ứng như sau: chủng nấmPDBC(44,50 mm và 2,571 x 107 bào tử/ml); DOR (43,16 mm

và 2,688 x 107 bào tử/ml); LOCAL (44,00 mm và 2,7396 x 107 bào tử/ml); và thấp nhất

là Potato bournvita agar:PDBC (35,15 mm và 1,374 x 107bào tử/ml); DOR (36,15 mm

và 1,338 x 107 bào tử/ml); LOCAL (35,50 mm và 1,373 x 107 bào tử/ml)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2012 cho đến tháng 06/2013 tại Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường_Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Mẫu thí nghiệm

Thu thập côn trùng (rầy nâu, sâu, bọ cánh cứng, ve sầu, ) bị nấmBeauveria sp

ký sinh ở các đồng lúa, vườn cam quýt, vườn rau ở Củ Chi, Hóc Môn và các địa điểm khác phục vụ cho phân lập

Bảng 3.1Kí hiệu mẫu và địa điểm thuthập

3.2.2 Hóa chất

Hóa chất phân lập: Môi trường phân lậpPGA, ethanol 96o, ethanol 70o

Ly trích DNA: nitơ lỏng, Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1),lysis buffer (50mM Tris HCl/pH8, 25mM EDTA,300 mM NaCl, 0,5% SDS), NaAc 3M, TE 1X, Isopropanol, nước cất 2 lần vô trùng, ethanol 70o

Kỹ thuật điện di: Agarose 1,5%, TBE0,5X, loading dye 6X

Kỹ thuật PCR: master mix, free water,Primer : ITS1, ITS4

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ

Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp, lò viba, tủ sấy, tủ mát, máy vortex, máy ủ nhiệt độ, máy ly tâm, bếp điện, tủ đông, cân phân tích, kính hiển vi

Dụng cụ: Bộ dụng cụ phân lập vi sinh, ống nghiệm, đĩa petri, eppendorf 0,5ml

và 1,5 ml, Pipetman và đầu tip các loại, bình tam giác, chày và cối

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập nấm từ côn trùng

3.3.1.1 Chuẩn bị môi trường

Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, đem đi cân đủ lượng cần pha môi trường, sau đó cắt nhỏ cho vào nồi nấu với nước cất khoảng 30 – 45 phút rồi lọc lấy nước, cho agar và glucose vào dịch chiết khoai tây, thêm nước cất vào cho đủ 1 lít

Môi trường PGA pha xong được cho vào bình tam giác để hấp tiệt trùng ở

121oC/ 1 atm/ 20 phút, được đổ ra đĩa petri

3.3.1.2 Phân lập nấm từ côn trùng trên môi trường PGA

Thu thập các mẫu côn trùng bị nấm Beauveria sp ký sinh và cất giữ trong

eppendorf, ghi địa chỉ, ngày lấy mẫu, sau đó mang về phòng thí nghiệm phân lập

Phân lập các mẫu nấm trên môi trường PGA:dùng que cấy móc, lấy nấm mọc trên côn trùng cho vào đĩa petri chứa môi trường PGA, các đĩa môi trường này được ủ

ở nhiệt độ 25oC sau đó làm thuần và trữ trong ống nghiệm chứa môi trường PGA để sử dụng cho các thí nghiệm sau

3.3.2 Định danh bằng hình thái các mẫu nấm đã phân lập

Sau khi phân lập và làm thuần được 10 mẫu nấm kí sinh trên các mẫu côn trùng thu thập ở Củ Chi, Hóc Môn, Tây Ninh, An Giang, Lâm Đồng, tiến hành quan sát đặc điểm khuẩn lạc,đặc điểm hình tháisợi nấm, bào tửvà đo kích thước bào tử (n = 30 bào tử/mẫu), kích thước thể bình (theo khóa phân loại của De Hoog (1972), Nguyễn Ngọc

Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), ở vật kính 100X, ghi lại hình ảnh

3.3.3 Định danh bằng PCR

3.3.3.1 Ly trích DNA

DNAtừ các nguồn nấm đã nhân sinh khối được ly trích theo quy trình của Hegedus, 1996