XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ VÀO CÂY Jatropha curcas L.

Kết quả cho thấy sử dụng kết hợp hai loại kháng sinh meropenem 50 mg/l và cefotaxime 700 mg/l cho hiệu quả diệt khuẩn đạt 48 %, trong khi sử dụng riêng lẻ 2 loại kháng sinh này không có

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HÒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ VÀO

CÂY Jatropha curcas L

Sinh viên thực hiện: TRẦN NGUYỄN NHƯ THỦY

Tháng 01/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ VÀO

CÂY Jatropha curcas L

ThS VÕ THỊ THÚY HUỆ

Tháng 01/2013

LỜI CẢM ƠN

Để trưởng thành và đạt được kết quả như ngày hôm nay, trước tiên con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Ba - Mẹ, anh hai và em trai đã luôn bên cạnh, động viên, cảm

ơn cả đại Gia đình luôn quan tâm, lo lắng cho con, là điểm tựa lớn nhất của con

Xin cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tạo điều kiện cho em trong bốn năm học tập tại Trường Các Thầy - Cô đã từng dạy dỗ và Quí Thầy

- Cô thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn bổ ích

Em xin chân thành gởi lời biết đến Thầy Bùi Minh Trí đã quan tâm, tận tình chỉ bảo và cho em những định hướng đề tài, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình làm đề tài, là người chỉ đường tận tâm cho em trong một giai đoạn quan trọng của cuộc đời

Em cũng xin gửi lời biết ơn đến cô Võ Thị Thúy Huệ đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, luôn có những lời khuyên khi em cần giúp đỡ và những lời động viên nhẹ nhàng giúp em vững tâm hơn mỗi lúc em thấy thật khó khăn

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn đến một người chị, một người bạn, một người hướng dẫn đã giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian thực hiện khóa luận Là người luôn

có mặt khi em cần giúp đỡ, từ lúc em bắt đầu làm quen với phòng thí nghiệm đến khi

em hoàn thành đề tài

Em cũng xin cảm ơn thầy Phạm Thành Hổ, viện Sinh Học Nhiệt Đới – thành phố

Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em khi em gặp khó khăn trong giai đoạn quan trọng nhất để hoàn thành đề tài

Cảm ơn các anh, chị, các bạn và các em cùng làm việc với tôi trong thời gian qua tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Thực Vật - Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học

và Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM đã hỗ trợ tôi trong quá trình làm

đề tài

Cảm ơn tập thể lớp LT11SH nói chung và những người bạn cùng phòng nói riêng

đã cho mình những kỷ niệm đẹp của thời sinh viên và luôn quan tâm, động viên nhau trong lúc làm đề tài

Em rất trân trọng sự giúp đỡ của ban lãnh đạo Viện cùng các Thầy – Cô, Anh - Chị làm việc tại Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh học và Môi Trường đã tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 12 năm 2013

Trần Nguyễn Như Thủy

TÓM TẮT

và ở Việt Nam do khả năng ứng dụng của nó trong việc phát triển nhiên liệu sinh học

và nhiều mục đích khác Đề tài: “Xây dựng quy trình chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ

vào cây Jatropha cursas L.” được thực hiện với mục đích xác định một kỹ thuật phù hợp để chuyển nạp gen vào cây Jatropha

Hạt giống Jatropha trồng tại vườn thực vật, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Thực

Vật - Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM được sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho chuyển gen Mẫu phôi

Jatropha thu nhận từ hạt được tiến hành xâm nhiễm vi khuẩn A tumefaciens chủng

EHA101 mang plasmid pGII0229 Trgus cp 148 luc do Giáo sư Jacobsen (Đại học Tổng hợp Hannover, Đức) thiết kế Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen như kháng sinh diệt khuẩn, nguồn mẫu, thời gian ngâm mẫu, thời gian đồng nuôi cấy

đã được khảo sát với mục đích tìm ra được quy trình chuyển gen hiệu quả

Kết quả cho thấy sử dụng kết hợp hai loại kháng sinh meropenem 50 mg/l và cefotaxime 700 mg/l cho hiệu quả diệt khuẩn đạt 48 %, trong khi sử dụng riêng lẻ 2 loại kháng sinh này không có khả năng loại bỏ vi khuẩn một cách hữu hiệu dẫn đến tình trạng tái nhiễm

Kết quả bước đầu nhuộm GUS cho tỷ lệ dương tính đối với thuốc thử X-gluc khá cao, ở tất cả các nghiệm thức biến thiên từ 33,33 – 100% Thời gian đồng nuôi cấy 2 ngày và ngâm mẫu 30 phút cho biểu hiện GUS đạt 100% và ít ảnh hưởng đến sức sống của mẫu Mẫu phôi tiền nuôi cấy 2 ngày trên môi trường cảm ứng mô sẹo cho tỷ lệ biểu hiện GUS (66,67%) cao hơn so với mẫu phôi tiền nuôi cấy 4 ngày trên cùng môi trường (33,33%) và mẫu phôi tiền nuôi cấy 20 ngày trên môi trường cảm ứng tạo phôi

vô tính Đồng thời đây cũng là nghiệm thức ít ảnh hưởng đến sức sống của mẫu nhất Tuy nhiên ở tất cả các thí nghiệm mức độ biểu hiện GUS không cao, chỉ phát hiện biểu hiện GUS ở phần ngoài rìa của mẫu

Jatropha curcas, a multipurpose, drought tolerant, perennial plant belonging to

Euphorbiaceae family is considered as an important candidate for the production of

biodiesel The use genetic engineering to transfer genes into Jatropha in order to

improve agronomic traits is a new and promising method.Present study was aimed to

standardize some transformation conditions for Jatropha curcas L using

Agrobacterium tumefaciens strain EHA 101 harboring vector pGII0229 Trgus cp148

luc, including bacteria antibiotic, preculture coditions, infection and co – cultivation

time Embryo explants of Jatropha seeds were infected with Agrobacterium

tumefaciens

It was found that combination of meropenem and cefotaxime at the concentation

of 50mg/l and 700 mg/l, respectively, was more effetive in disinfection of

Agrobacterium (48 %) compared to using these individally which could not remove

bacteria effectively and lead to re – infection Infection for 30 min and co – cultivation

of embryo explants with Agrobacterium for two days was found optimum (100 %)

Preculture of embryo explants in callus regeneration medium for two days showed better results (66.67 %) as compared with four-day explants in the same medium (33.33 %) and after 20 days in somatic embryo regeneration medium 42.86 %)

However, the GUS expression level was not high in all treatments The expression was only found in the surface of the explants

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT iii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT viiiii

DANH SÁCH BẢNG ix

DANH SÁCH HÌNH x

Chương 1 MỞ ĐẦU i

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây Jatropha curcas L 3

2.1.1 Đặc điểm thực vật học và sinh lý cây Jatropha curcas L 4

2.1.2 Sự phân bố của Jatropha curcas L 4

2.1.3 Các ưu điểm sinh học đáp ứng tiêu chí một cây nhiên liệu sinh học tại Việt nam của Jatropha curcas L 5

2.2 Sơ lượt về phương pháp chuyển gen ở thực vật 6

2.2.1 Khái niệm chuyển gen thực vật 6

2.2.2 Thành phần của gen chuyển nạp 6

2.2.2.1 Trình tự khởi động và kết thúc phiên mã (Promoter và terminator) 6

2.2.2.2 Gen thông báo (reporter gene) 7

2.2.2.3 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker) 7

2.2.3 Một số phương pháp chuyển nạp gen vào thực vật 8

2.2.3.1 Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol) 8

2.2.3.2 Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện (electroporation) 8

2.2.3.3 Chuyển nạp gen bằng phương pháp bắn gen (biolistic) 9

2.2.3.4 Chuyển nạp gen bằng phương pháp vi tiêm 9

2.2.3.5 Phương pháp chuyển gen gián tiếp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium với sự hỗ trợ sóng siêu âm – SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium mediated transformation) 9

2.3 Phương pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium 10

2.3.1 Vi khuẩn Agrobacterium 10

2.3.1.1 Phân loại vi khuẩn Agrobacterium Error! Bookmark not defined. 2.3.1.2 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 10

2.3.1.3 Các thành phần của Ti-plamid 12

2.3.2 Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh thực vật của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 12

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium 14

2.4.1 Ảnh hưởng của vật liệu gây nhiễm 15

2.4.2 Ảnh hưởng của thành phần và điều kiện môi trường 16

2.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 16

2.4.4 Ảnh hưởng của ồng độ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và thời gian lây nhiễm 17

2.4.5 Ảnh hưởng của dòng vi khuẩn Agrobacterium 18

2.5 Các phương pháp kiểm tra cây chuyển gen dựa trên plasmid pGII0229 Trgus cp 148 luc 18

2.5.1 Phương pháp thử GUS 19

2.5.2 Phương pháp thử khả năng kháng thuốc diệt cỏ (PPT) của cây tái sinh 19

2.6 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về chuyển gen trên cây Jatropha 19

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

3.2 Vật liệu thí nghiệm 23

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

3.2.2 Chủng vi khuẩn tái tổ hợp 23

3.2.3 Hoá chất và thiết bị 23

3.2.3.1 Hoá chất 23

3.2.3.2 Thiết bị 23

3.3 Phương pháp thí nghiệm 24

3.3.1 Phương pháp chuẩn bị dịch vi khuẩn, khử trùng hạt và thu nhận mẫu phôi 25

3.3.1.1 Chuẩn bị dịch vi khuẩn 25

3.3.1.2 Khử trùng hạt 25

3.3.1.3 Thu nhận mẫu phôi 25

3.3.2 Thí nghiệm khảo sát khả năng diệt khuẩn của 2 loại kháng sinh meropenem và cefotaxime và lên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng EHA101 24

3.3.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 26

3.3.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu và thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumerfaciens 27

3.4 Xử lý số liệu 30

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Kết quả khảo sát khả năng diệt khuẩn của hai loại kháng sinh cefotaxime và meropenem 29

4.2 Kết quả phân tích ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 33

4.3 Kết quả ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu và thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumerfaciens 37

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

AS Acetosyringone

PAT phosphinothricin acetyl transferase

PEG polyethylene glycol

IBA Indolebutyric acid

BA 6-benzyl adenin

NT Nghiệm thức

Ti-plasmid Tumor-inducing plasmid

OD Mật độ quang (Optical density)

PPT DL–homoalanin–4-yl (methyl) phosphinic acid gusA β–glucuronidase

X-gluc 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide DNA Deoxiribonucleic Acid

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng diệt khuẩn của 2 loại

kháng sinh cefotaxime và meropenem lên chủng vi khuẩn 26

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy

đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 28

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu

và thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn

A Tumerfaciens 29

Bảng 4.1 Kết quả diệt khuẩn với hai loại kháng sinh cefotaxime và

meropenem ở các nồng độ khác nhau 30

Bảng 4.2 Tỉ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc và tỉ lệ dương tính

với thử nghiệm GUS của 3 loại mẫu 33

Bảng 4.3 Tỉ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc và tỉ lệ dương tính

với thử nghiệm GUS của mẫu phôi Jatropha 36

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cây Jatropha curcas L (a) với lá (b) hoa, quả và hạt (c) 3

Hình 2 2 Agrobacterium tumefaciens (a) và khối u thực vật do A tumefaciens gây ra (b) 11

Hình 2.3 Mô hình xâm nhiễm của A tumefaciens vào tế bào thực vật (Jacobsen, 2007) 13

Hình 2.4 Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 18

Hình 2.5 Sơ đồ vùng T-DNA của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 18

Hình 3.1 Mẫu phôi Jatropha tiền nuôi cấy 2 ngày (a) và 4 ngày (b) trên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo 27

Hình 3.2 Mẫu phôi Jatropha nuôi cấy 15 ngày trên môi trường cảm ứng tạo phôi vô tính 27

Hình 4.1 Mẫu phôi Jatropha sau 15 ngày diệt khuẩn theo nghiệm thức 7 32

Hình 4.2 Biểu hiện GUS của mẫu phôi tiền nuôi cấy theo NT1 34

Hình 4.3 Biểu hiện GUS của mẫu phôi tiền nuôi cấy theo NT2 34

Hình 4.4 Biểu hiện GUS của mẫu phôi tiền nuôi cấy theo NT1 34

Hình 4.5 Mẫu phôi tiền nuôi cấy theo NT1 (a) và đối chứng (d); Mẫu phôi tiền nuôi cấy theo NT2(c) và đối chứng (e) ; mẫu phôi nuôi cấy theo NT3 (b) 35

Hình 4.6 Biểu hiện GUS của mẫu phôi xâm nhiễm theo NT1 37

Hình 4.7 Biểu hiện GUS của mẫu phôi xâm nhiễm theo NT2 37

Hình 4.8 Mẫu đối chứng không có biểu hiện GUS 37

Hình 4.9 Mẫu phôi xâm nhiễm theo NT2 sau khi chọn lọc 38

Hình 4.10 Mẫu phôi xâm nhiễm theo 1 sau khi chọn lọc 38

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nhu cầu năng lượng ngày càng tăng trong bối cảnh trữ lượng dầu mỏ thế giới đang dần cạn kiệt, giá cả leo thang và những mối quan tâm đến vấn đề ô nhiễm tăng cao Điều này đã dẫn đến việc tìm kiếm các nguồn nhiên liệu tái tạo thay thế Vấn đề được quan tâm hiện nay đó là năng lượng sinh học (Biofuel), trong đó diesel sinh học

từ thực vật đang nhanh chóng nổi lên như là sự thay thế cho nhiên liệu xăng dầu

Tuy nhiên, việc trồng cây lương thực, chẳng hạn như ngô và đậu nành để thu nhiên liệu sinh học gây ra sức ép đối với nguồn thực phẩm, ảnh hưởng đến diện tích đất canh tác và giá cả của dầu thực vật khá cao Một hướng khác để giải quyết vấn đề này là sử dụng cây trồng sản xuất dầu thực vật không ăn được và có thể phát triển trên đất không thích hợp cho việc trồng cây lương thực

Cây Cọc rào (Jatropha curcas L.) tỏ ra là một ứng cử viên thích hợp để trở thành

một loại cây trồng nhiên liệu sinh học Cọc rào là một loại cây phi thực phẩm với hàm lượng dầu cao và có thể phát triển trên đất bị suy thoái hay đất thải không phù hợp cho việc trồng cây lương thực Dầu sản xuất từ cây trồng này có thể dễ dàng chuyển đổi thành dầu diesel sinh học, đáp ứng các tiêu chuẩn của Mỹ và châu Âu (Tiwari và cs, 2007)

Song, việc phổ biến và ứng dụng dầu Jatropha bị giới hạn do năng suất của hạt

giống và hàm lượng dầu trong hạt chưa cao

Vì vậy cần sử dụng các biện pháp chọn tạo giống để cải thiện các đặc tính nông học và chất lượng dầu trong hạt Các kỹ thuật chọn tạo giống truyền thống như lai tạo

và chọn lọc nhân tạo đòi hỏi nhiều thời gian và có thể phải trải qua nhiều thế hệ mới có được những tính trạng mong muốn và loại bỏ những tính trạng không mong muốn Kỹ thuật di truyền là một giải pháp đầy hứa hẹn và khả thi nhằm cải thiện đáng kể những tính trạng của thực vật Đặc biệt, kỹ thuật chuyển nạp gen nhờ vi khuẩn

Agrobacterium là kỹ thật được sử dụng phổ biến nhất và rất có hiệu quả trong chuyển

gen thực vật Tuy nhiên, ứng dụng của kỹ thuật di truyền trong tạo giống cây Jatropha

vẫn còn mới mẻ, hiệu quả chuyển gen vào mô thực vật thông qua vi khuẩn

Agrobacterium phụ thuộc vào nhiều yếu tố như quá trình tái sinh còn là một thách thức,

cây dễ sinh những biến dị bất thường và mất khả năng sinh sản (Efendi và cs, 2000)

Từ những lý do trên, việc chuyển những gen mong muốn vào cây Jatropha bằng

kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium, nhằm cải thiện các đặc tính

nông học và chất lượng dầu trong hạt, là hướng đi cần thiết Đề tài “Xây dựng quy

trình chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây Jatropha curcas L.” được thực hiện với mục đích xác định các điều kiện trong quy trình chuyển gen vào cây Jatropha cho hiệu

quả biến nạp cao, làm nền tảng cho các nghiên cứu chuyển nạp những gen khác nhau

vào cây Jatropha

1.2 Yêu cầu

- Lây nhiễm chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA101 mang plasmid vector

pIBGUS vào mẫu phôi hạt cây Jatropha

- Kiểm tra kết quả chuyển gen vào cây Jatropha bằng phương pháp nhuộm GUS

- Tuyển chọn và tái sinh mẫu giả định chuyển gen thành công

1.3 Nội dung thực hiện

- Khảo sát khả năng diệt khuẩn của hai loại kháng sinh cefotaxime và meropenem

đối với vi khuẩn A tumefaciens chủng EHA101

- Tiến hành lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens mang plasmid vectorpIBGUS vào

mẫu phôi và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp

- Nuôi cấy mẫu đã tiến hành chuyển gen trên môi trường chọn lọc, tuyển chọn và tái sinh mẫu chuyển gen

- Phân tích mẫu đã tiến hành chuyển gen bằng phương pháp nhuộm GUS

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây Jatropha curcas L

Hình 2.1 Cây Jatropha curcas L (a) và các bộ phận lá (b) hoa, quả và hạt (c)

(khcn-moit.gov.vn; chemicallygreen.com)

2.1.1 Đặc điểm thực vật học và sinh lý cây Jatropha curcas L

mọng nước hay cây bụi nhỏ, thuộc giới Plantae, ngành Magnoliophyta, lớp

Magnoliopsida, họ Euphorbiaceae, chi Jatropha, loài Jatropha curcas Linn (Wahl và

cs, 2009) Jatropha có khoảng 70 loài khác nhau đã được xác định Tên chi Jatropha

có nguồn gốc từ jatrós (bác sĩ), trophé (thức ăn) trong tiếng Hy Lạp, với hàm ý được

sử dụng như thuốc Curcas là tên gọi thông thường cho cây cọc rào ở Malabar, Ấn Độ

(Kamal và cs, 2011)

a

c

b

Jatropha curcas L có nhiều nhánh dày Cây Jatropha có thân thẳng và vỏ cây

màu xám hoặc đỏ nhạt Lá cây này được sắp xếp xen kẽ, có màu xanh, có chiều dài và

chiều rộng từ 6 - 15 cm với 5 đến 7 thùy nông Nhánh Jatropha chứa mủ màu trắng, là

nguyên nhân gây ra những vết bẩn màu nâu, rất khó loại bỏ Thông thường, cây

Jatropha có 5 rễ được hình thành từ hạt: một rễ chính (rễ cọc) và các rễ khác là rễ phụ

(rễ bên), cây trồng từ hom (đoạn thân cành được cắt đem đi trồng) thì chỉ phát triển rễ bên Cụm hoa của cây này được hình thành ở đỉnh của nhánh, hoa đực và hoa cái đơn tính trên cùng một thân Quá trình thụ phấn nhờ côn trùng Sau khi thụ phấn, trái hình elip được hình thành Vỏ quả ngoài vẫn có nhiều thịt cho đến khi trưởng thành Hạt

của trái Jatropha chín có màu đen và dài trung bình 18 mm, rộng trung bình 10 mm

Trọng lượng hạt (tính trên 1000 hạt) là khoảng 727 g.Tuổi thọ của cây Jatropha là

hơn 50 năm (Kamal và cs, 2011)

2.1.2 Sự phân bố của Jatropha curcas L

Jatropha curcas có lẽ được phân phối bởi người đi biển Bồ Đào Nha sang các nước

khác ở châu Phi và châu Á Ngày nay Jatropha là cây trồng ở hầu hết các quốc gia vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Jatropha curcas L được sử dụng làm hàng rào xung

quanh khu vườn hoặc để bảo vệ cây trồng chống lại các động vật như gia súc, dê; giảm xói mòn gây ra bởi nước, gió; làm cây thuốc chẳng hạn như hạt giống chống táo bón, sap chữa lành vết thương; lá làm trà chống bệnh sốt rét (Kamal và cs, 2011)

Jatropha sinh trưởng và phát triển tốt trên các vùng có độ cao so với mặt nước

biển từ 30 - 1.400 m, nhiệt độ bình quân năm từ 18 -28oC, lượng mưa trung bình năm

từ 480 mm - 2.380 mm Loài cây này có đặc tính chịu hạn rất khỏe, có thể mọc ở nơi khô hạn lượng mưa bình quân năm chỉ có 250 mm và cho hiệu quả kinh tế ở những vùng mà lượng mưa trên 800 mm/năm, trong điều kiện hạn hán 8-9 tháng cây vẫn

không bị chết Jatropha cũng thích hợp trên đất cát pha và có thể sinh trưởng phát

triển trên nhiều loại đất khác nhau kể cả đất sỏi đá và nhiễm mặn, trừ đất bị ngập úng

2.1.3 Các ưu điểm sinh học đáp ứng tiêu chí một cây nhiên liệu sinh học tại Việt

nam của Jatropha curcas L

Các ưu điểm sinh học vượt trội và giá trị của cây Jatropha bao gồm:

Jatropha là cây bụi lớn, có chu kỳ sống lâu tới 50 năm, cho quả, hạt sớm, hàng

năm, năng suất cao tới 10-12 tấn/ha, hàm lượng dầu trong hạt cao, trung bình 32- 35%

Đây là nguồn nguyên liệu dầu diesel sinh học rất tiềm năng để dần thay thế các tài nguyên nhiên liệu hoá thạch đang càng ngày càng bị cạn kiệt

Cây Jatropha được coi là loài cây thân thiện với môi trường bởi Jatropha có khả

năng cộng sinh với nấm rễ mycorrhiza cao, nên thích nghi sinh trưởng tốt trên những lập địa suy thoái, khô cằn cỗi, thậm chí ô nhiễm và hoang hóa, do vậy cây có tác dụng cải tạo đất, cải tạo môi trường rất tốt Đây là loài cây thường xanh, chỉ cần thu hái quả hạt hàng năm, không phải đốn hạ cây, tạo ra thảm thực vật có độ che phủ ổn định, có khả năng hấp thụ CO2 lớn, vì vậy cây Jatropha cũng rất có ý nghĩa về dịch vụ môi

trường (Lê Quốc Huy và cộng sự, 2007)

Năng suất sinh học và hàm lượng chất dinh dưỡng trong hạt cao, bã ép dầu từ cây

Jatropha là nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ cao cấp vì có chứa hàm lượng

protein cao, thành phần hoạt chất của phế liệu có khả năng sử dụng làm chế phẩm

phòng trừ sâu bệnh (Lê Quốc Huy và cộng sự, 2007) Cây Jatropha curcas L được sử

dụng như là một cây thuốc chẳng hạn như hạt giống chống táo bón, sáp chữa lành vết thương, lá dùng như trà giúp chống bệnh sốt rét (Garg và cộng sự, 2011)

Các tài liệu nghiên cứu và thử nghiệm cây Jatropha tại một số tỉnh của Việt Nam cho thấy Jatropha là cây nhiên liệu sinh học có triển vọng ở Việt Nam vì đáp ứng được một số tiêu chí sau: Cây Jatropha thích hợp với điều kiện đất đai, khí hậu nhiệt

đới ở nước ta và không cạnh tranh với đất trồng cây lương thực Cây sinh trưởng

nhanh, có thể bắt đầu cho quả khoảng sáu tháng sau khi trồng Jatropha là cây chịu

hạn, có thể trồng cả trên các vùng đất đai cằn cỗi, đất cát ven biển (như Ninh Thuận, Bình Thuận), ven đường, đất bờ kênh, ven suối và không cần chăm sóc nhiều như đối

với một số cây trồng khác Trồng cây Jatropha giúp cải tạo, bảo vệ đất rất tốt và chống

xói mòn trên đất dốc

Cây Jatropha cho năng suất dầu tương đối cao: 2.500-3.000 l dầu

biodiesel/ha/năm và trồng một lần có thể thu hoạch từ 10 năm trở lên Trồng cây

Jatropha cần vốn đầu tư thấp trên cùng đơn vị diện tích, tạo việc làm cho người nghèo

và lao động nhàn rỗi Công nghệ chế biến dầu diesel từ hạt cây Jatropha tương đối

đơn giản, có thể thực hiện với các thiết bị được chế tạo trong nước (Thái Xuân Du và Nguyễn Văn Uyển, 2006)

2.2 Sơ lược về phương pháp chuyển gen ở thực vật

2.2.1 Khái niệm chuyển gen thực vật

Trong cộng đồng công nghệ sinh học thực vật, chuyển nạp (transformation) có thể được định nghĩa chính xác là quá trình đưa DNA vào tế bào thực vật, dẫn đến sự thay đổi trong cấu tạo di truyền của tế bào mục tiêu và các dẫn xuất của nó Khả năng tái sinh toàn bộ cây từ tế bào thực vật được chuyển nạp, báo cáo đầu tiên bởi Horsch

và cs (1985), đã cách mạng hóa các ngành khoa học cây trồng, thay đổi bộ mặt của hành tinh, thông qua những thành công và ứng dụng nhanh chóng của cây trồng biến đổi gen (Finer, 2009)

Cây chuyển gen (transgenic plant) là cây mang một hoặc nhiều gen được đưa vào bằng phương thức nhân tạo thay vì thông qua lai tạo như trước đây Những gen được đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn Thực vật tạo ra được gọi là thực vật “chuyển gen” mặc dù trên thực tế tất cả thực vật đều được “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại của chúng bởi quá trình thuần hóa, chọn lọc và lai giống có kiểm soát trong một thời gian dài (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)

2.2.2 Thành phần của gen chuyển nạp

2.2.2.1 Trình tự khởi động và kết thúc phiên mã (Promoter và terminator)

Một gen lạ chuyển nạp vào cây trồng chỉ có thể biểu hiện khi có một chuỗi trình

tự khởi động phiên mã thích hợp đi kèm theo nó, đó là các promoter Mỗi promoter

khác nhau cần có các vector tương ứng Hiện nay, promoter CAMV35S của virus gây

bệnh khảm trên cải bông là một trong những promoter mạnh và được sử dụng phổ biến nhất Theo Heldt (1997) promoter này bao gồm các enhancer có khả năng phiên

nhất (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.2.2.2 Gen thông báo (reporter gene)

Dù là chuyển nạp gen bằng phương pháp nào cũng đều cần một phương pháp tin cậy để xác định tế bào nào đã nhận gen ngoại lai (Jacobsen, 2007) Với mục đích đó,

khi thiết kế plasmid, người ta đã sử dụng một hay nhiều gen thông báo Những gen thông báo đều mang chuỗi mã tổng hợp một loại protein đặc biệt nào đó rất dễ phát hiện trong cây giúp nhận biết tế bào hoặc thể chuyển gen và cho phép đo lường mức

độ biểu hiện của gen ngoại lai

Gen gusA của vi khuẩn E.coli là một trong các gen thông báo thường được sử

dụng phổ biến Gen gusA mã hóa enzyme β–glucuronidase Enzyme này xúc tác phản

ứng phân giải cơ chất glucuronidae không màu để tạo thành sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng Glucuronidae thường dùng là 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide (X-gluc) Trong tự nhiên, enzyme β–glucuronidase không tồn tại trong

thực vật nên gen gusA là gen chỉ thị rất tốt trong công nghệ gen thực vật Mặt khác,

sản phẩm màu xanh chàm nói trên rất bền và phản ứng ít bị ảnh hưởng của pH môi trường nên thuận tiện cho việc theo dõi

Ngoài ra còn có gen phát sáng gfp hoặc gen mã hóa cho chloramphenicol acetyltransferase (CAT), gen luc mã hóa cho luciferase được lấy từ đom đóm (Bùi Chí

Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.2.2.3 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker)

Sau khi chuyển gen, cần phải tiến hành chọn lọc để tách riêng và tái sinh các tế bào đã nhận gen mục tiêu Vì vậy tất cả các plasmid đều phải có ít nhất một gen chọn lọc để giúp quan sát và chọn lọc những thể chuyển gen thành công Các gen này thường mã hóa cho một enzyme có khả năng khử độc tính của chất chọn lọc như

kháng sinh (nptII, hpt…) hoặc thuốc diệt cỏ (bar hay pat) trong quá trình chuyển hóa

Khi các gen chọn lọc biểu hiện, chúng sẽ giúp tế bào tiếp tục sinh trưởng trong môi trường chọn lọc (selective media) thường chứa chất kháng sinh hay thuốc diệt cỏ Ngoài ra, chúng còn được dùng để phân tích bộ gen của cây được chyển gen nhằm xác định đoạn DNA đưa vào có hoạt động hiệu quả hay không

Một số chỉ thị chọn lọc phổ biến hiện nay như gen nptII mã hóa enzyme

neomycin phospho transferase II xúc tác quá trình phosphoryl hóa kháng sinh

kanamycin và làm bất hoạt kháng sinh này, gen hph mã hóa enzyme hygromycin phospho transferase có tác dụng làm bất hoạt kháng sinh hygromycin, gen hph tỏ ra

rất thành công trên cây bắp (Walters và ctv, 1992), cây lúa (Christou và ctv, 1991; Li

và ctv, 1993) Gen bar kháng thuốc diệt cỏ có thể được sử dụng như gen mục tiêu nhưng đồng thời cũng là một chỉ thị chọn lọc Gen bar mã hóa cho enzyme

phosphinothricin acetyl transferase (PAT) làm bất hoạt phosphinothricin (PPT), là

thành phần chính trong thuốc diệt cỏ Basta Gần đây, gen pmi mã hóa enzyme

phospho mannose isomerase đã được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc Gen này hoạt động trên cơ sở phản ứng huỳnh quang trong môi trường có đường mannose Điều này đã

mở ra một triển vọng lớn về an toàn sinh học do không cần sử dụng các gen kháng kháng sinh hay kháng hoạt chất diệt cỏ (Lê Trần Bình, 2008)

2.2.3 Một số phương pháp chuyển nạp gen vào thực vật

2.2.3.1 Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol)

Phương pháp PEG được sử dụng để chuyển nạp gen trên cả động vật lẫn thực vật Đối tượng của phương pháp này là các tế bào trần, gen chuyển nạp ở dạng plasmid DNA Phương pháp được phát triển dựa trên nguyên tắc PEG làm kích hoạt sự dung hợp tế bào trần từ đó tạo khả năng du nhập gen lạ vào tế bào Cao và ctv (1991) đã sử dụng nguồn tế bào trần từ ba giống lúa Pi 4, Taipei 309 và Nipponbare trong thí nghiệm chuyển gen bằng phương pháp PEG, kết quả là đã thu được những tế bào trần mang các gen chuyển nạp

2.2.3.2 Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện (electroporation)

Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng xung điện với thời gian cực ngắn trong một điện trường cực mạnh tạo ra các lỗ tạm thời trên màng sinh chất để làm tăng khả năng xâm nhập của DNA cần chuyển vào tế bào trần (Nagara, 1989) Phương pháp sử dụng xung điện đã được sử dụng trong chuyển nạp gen trên cả động vật, thực vật và vi sinh vật Tuy còn nhiều khó khăn chưa giải quyết được về mặt kỹ thuật nhưng người ta cũng đã ghi nhận những trường hợp chuyển gen thành công trên cây lúa (Toriyama và ctv, 1988; Zhang và ctv, 1988; Shimamoto và ctv, 1989), trên

cây bắp (Rhodes và ctv, 1988) và trên cây cải dầu (Guerche và ctv, 1987, trích dẫn

bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.2.3.3 Chuyển nạp gen bằng phương pháp bắn gen (biolistic)

Phương pháp bắn gen được phát minh bởi John Stanford ở Đại học Cornell (Klein và ctv, 1987) Ưu điểm của phương pháp này là có thể áp dụng trên tất cả các loài thực vật một lá mầm và hai lá mầm, không cần hệ vector kép (binary vector) và quy trình vận hành tương đối đơn giản

Bột vàng hoặc tungsten sẽ được phủ lớp DNA mục tiêu trên bề mặt và được gắn lên viên đạn plastic Khi bắn, viên đạn phóng xuống tấm chắn tạo ra một lực phóng

các hạt vàng (hay tungsten) túa ra trên rây lưới kim loại với một vận tốc lớn xuyên vào tế bào Mô được bắn xong sẽ được chuyển vào môi trường tái sinh có bổ sung các chất chọn lọc thích hợp (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.2.3.4 Chuyển nạp gen bằng phương pháp vi tiêm

Vi tiêm (microinjection) là phương pháp tiêm trực tiếp DNA vào nhân của tế bào phôi bằng cách sử dụng micropipette để tiêm dung dịch DNA lạ vào tế bào trần dưới

áp lực cao, tạo ra những cây chuyển gen (Neuhaus và ctv, 1987; De la Pẽna và ctv,

1987, trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị kỹ thuật đắt tiền cho việc vi thao tác dưới kính hiển vi và sự khéo léo, chính xác tiêm một lượng rất nhỏ dung dịch DNA

2.2.3.5 Phương pháp chuyển gen gián tiếp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium với

sự hỗ trợ sóng siêu âm – SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium mediated

transformation)

Phương pháp SAAT là phương pháp biến đổi gen dựa trên phương pháp chuyển

gen gián tiếp nhờ vào vi khuẩn Agrobacterium Mô đích sẽ được xử lý trong một thời

gian ngắn cùng với sự hiện diện của vi khuẩn Sóng siêu âm sẽ tạo rất nhiều vết

thương nhỏ và đồng đều trên mô cây, cho phép Agrobacterium xâm nhiễm dễ dàng và

do đó sẽ làm gia tăng hiệu quả biến nạp Đây là phương pháp khá hữu hiệu, đơn giản,

rẻ tiền làm gia tăng hiệu quả biến nạp vào mẫu mô cây có hiệu quả chuyển gen thấp

(Liu và ctv, 2005)

Theo Trick và Finer (1997), các mô xử lý SAAT cho thấy sự tăng mạnh của biểu hiện GUS so với các mô chỉ ủ khuẩn thông thường Tùy theo loại mô, thời gian đáp ứng cũng khác nhau, có thể từ vài giây đến vài trăm giây Các mô đáp ứng ở diện rộng với thời gian xử lý SAAT Vì thế, thời gian xử lý tối ưu là khi xử lý thời gian ngắn nhất và cho hiệu quả cao nhất

Từ năm 1974, Miller và ctv ứng dụng phương pháp chuyển gen SAAT trên mô

rễ cây Vicia faba; đến năm 1990 Joersbo và Brunstedt chuyển vào protoplast của

Nicotiana tabacum và Beta vulgaris, Trick và Finer thực hiện trên cây đậu nành, bắp,

lúa mì vào năm 1997, v.v Gần đây, một số nghiên cứu của Liu và ctv (2005) trên hạt

Phaseolus vulgaris L., Park và ctv (2005) trên Raphanus sativus L đã kết hợp SAAT

với phương pháp thấm hút chân không, tạo điều kiện cho A tumefaciens xâm nhiễm,

làm tăng khả năng biến nạp Sự kết hợp giữa hai phương pháp tỏ trên ra rất hữu hiệu, nhất là trên các loại cây khó chuyển nạp gen (Liu và ctv, 2005)

2.3 Phương pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium

Biến nạp gen thực vật đã cho phép nhà chọn giống biến đổi cây trồng bằng một phương pháp mới và có khả năng khắc phục các vấn đề quan trọng của nông nghiệp hiện đại Chuyển các gen vào thực vật đã được thực hiện thông qua kỹ thuật sử dụng vi

khuẩn Agrobacterium như một vector sinh học hoặc kỹ thuật chuyển gen trực tiếp

(Tsaftaris và cs, 2000)

Kỹ thuật chuyển gen dựa trên vi khuẩn Agrobacterium và kỹ thuật chuyển gen

trực tiếp phát triển song song, nhưng ngày nay phương pháp chuyển gen gián tiếp được sử dụng rộng rãi nhất do tính đơn giản và hiệu quả của nó đối với nhiều loài thực vật, mặc dù nó vẫn còn bị hạn chế về phạm vi của cây trồng chủ (Tsaftaris và cs, 2000)

2.3.1 Vi khuẩn Agrobacterium

Hình 2 2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (a) và khối u thực vật

do A tumefaciens gây ra (b)

(www.apsnet.org, www.visualphotos.com)

2.3.1.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Proteobacteria, bộ Rhizobiales, họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium, loài

A tumefaciens (Deacon và ctv, 2005)

Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn Gram âm, hình que,di động, không sinh

bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium (Deacon và ctv,

2005) Đây là vi khuẩn hiếu khí, có 5- 11 lông roi, phát triển tối ưu ở 29oC trong môi

trường có bổ sung mangan và succinate như là nguồn cacbon duy nhất (Domer, 1999)

Agrobacterium tumefaciens là nguyên nhân gây bệnh u sần trở thực vật (chủ yếu là cây

hai lá mầm) khi xâm nhiễm vào cây

Bộ nhiễm sắc thể Agrobacterium tumefaciens dạng vòng, có kích thước 2,6Mb

Ngoài ra vi khuẩn còn mang một hay nhiều plasmid lớn có kích thước 200 - 800 kb (Gelvin, 2003), một trong số đó là Ti plasmid, hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên

Ti plasmid, chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập (Deacon và ctv, 2005) Khi rễ cây xuất hiện vết thương thì tế bào vi khuẩn

sẽ di chuyển về phía vết thương theo cơ chế hóa hướng động và xâm nhập vào cây qua vết thương đó Ti plasmid mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây Những vi khuẩn không mang Ti lasmid thì được xem như là vi khuẩn không độc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây Các khối u có đường kính đến 30

cm nhưng phổ biến là 5 – 10 cm Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng

và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường Khi xâm nhiễm vào cây một phần gen trên Ti plasmid sẽ gắn vào bộ gen của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là opine Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này như nguồn cacbon

và nitơ (Gustavo và cs, 1998)

2.3.1.2 Các thành phần của Ti-plamid

Ti plasmid là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn và có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn Việc xác định Ti plasmid như một nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bước khởi động

của một giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens Điều này đã

mở ra khả năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000)

Trong quá trình xâm nhiễm, T-DNA, một đoạn của Ti plasmid, được chuyển vào nhân tế bào thực vật và cài nhập vào nhiễm sắc thể của cây (Gustavo và cs, 1998) Trong cấu trúc của Ti plasmid , hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển gen vào cây

là đoạn T- DNA, bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của T- DNA, và gen vir

(Nguyễn Đức Lượng và cs, 2002)

T-DNA có chứa hai loại gen: thứ nhất là các gen gây ung thư, mã hóa cho enzym tham gia trong quá trình tổng hợp auxin và cytokinin và chịu trách nhiệm cho sự hình thành khối u; thứ hai là các gen mã hóa cho tổng hợp opines Các hợp chất này được

tạo ra bởi phản ứng giữa axit amin và đường được tổng hợp và tiết ra bởi các tế bào khối u Hai bên đoạn T-DNA là hai trình tự lặp đi lặp lại 25 bp, hoạt động như một yếu

tố cis cho sự chuyển gen vào thực vật

Quá trình chuyển T-DNA là hết quả hoạt động hợp tác của các protein được mã

hóa bởi các gen trong khu vực độc của plasmid Ti (gọi là các gen vir) và trong các nhiễm sắc thể vi khuẩn Khu vực gen độc 30 kb (vùng gen vir) được tổ chức trong sáu operon cần thiết cho việc chuyển T-DNA (virA, virB, virD, và virG) hoặc để tăng hiệu suất chuyển gen (virC và virE) (Riva và cs, 1998)

Ngoài T-DNA, Ti plasmid còn mang các gen dị hóa giúp phân giải sản phẩm của các tế bào khối u, các gen liên quan đến quá trình tiếp hợp plasmid và các gen có vai trò trong sự ổn định và toàn vẹn plasmid (Hooykaas và Schilperoort, 1992; Zupan và Zambrysky, 1995 trích dẫn bởi Riva và cs, 1998)

2.3.2 Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh thực vật của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Hình 2.3 Mô hình xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào tế bào thực vật

(https://research.cip.cgiar.org)

Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề mặt

rễ cây, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất dinh dưỡng do mô rễ tiết ra Vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây bị tổn thương do nhiều nguyên nhân khác nhau Trong đều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thương nhờ các dấu hiệu hoá học Đều này có được là do đáp ứng giải phóng đường và các thành phần phổ biến khác trong rễ Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn mang Ti plasmid sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thương (hợp chất phenolic) như acetosyringone Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng độ thấp (10-7M) Bởi vậy, một trong những chức năng của Ti plasmid là mã hoá các thụ thể (receptor) nhận biết các chất hoá học Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho

vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thương

Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm Ở nồng độ cao (10-5 – 10-4M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên Ti plasmid (Valentine, 2003)

Sau khi được kích hoạt, các gen vir sẽ đều khiển quá trình tạo sợi đơn T-DNA Quá trình tạo sợi đơn T-DNA được thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein virD1

và virD2 thực hiện Sau đó protein virD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo thành phức hợp T- DNA Phức hợp T-DNA-virD2 cùng với protein virE2 được chuyển vào trong

tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp được mã hoá bởi các gen virB Cùng với

một số thành phần trong tế chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đưa phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào (Valentine, 2003 )

Trong nhân tế bào cây, T-DNA được kết nạp vào bộ gen của cây không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tương đồng

với DNA của cây và gắn vào Sau đó nucleotide gắn với virD2 tìm các đoạn vi tương

đồng (microhomology) trên DNA cây và gắn vào Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’ nucleophilic của DNA cây

mà bị tách ra Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây được hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn đến sự hòa hợp của T-DNA hoàn thành Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt động tổng

hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn (Valentine, 2003 )

Người ta đã lợi dụng đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium để chuyển gen mong muốn vào thực vật, trong đó plasmid Ti được biến đổi, nó chỉ còn khả năng gắn T-DNA vào bộ gen của tế bào đích và mất khả năng gây bệnh

Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với

một số loài nhưng không phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con đường này Ðặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì

và ngô là không được biến nạp dễ dàng nhờ A tumefaciens

Ðể khai thác và sử dụng như là một vector chuyển gen các nhà khoa học đã loại

bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-DNA và các

gen vir Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-DNA Nó sẽ được chuyển

vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra đối với

sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc biệt Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được biến nạp,

giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn A tumefaciens sử dụng,

môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể

biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn

Agrobacterium

Sự đa dạng của các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen có lẽ là lý do tại

sao Agrobacterium gặp khó khăn trong việc chuyển gen ở các loài thực vật một lá

mầm (Hiei và cộng sự, 1997; Ishida và cộng sự, 1996, trích dẫn bởi Carvalho và cs,

2004) Trong thực tế Agrobacterium thường chỉ gây hại ở cây hai lá mầm Vì vậy

tần suất chuyển nạp gen ở cây hai lá mầm cao hơn nhiều so với cây một lá mầm (Lê

Xuân Thao, 2012) Hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium ở thực vật phụ

thuộc vào nhiều yếu tố

2.4.1 Ảnh hưởng của vật liệu gây nhiễm

Yếu tố đầu tiên là nguồn vật liệu gây nhiễm, cụ thể là loại, giai đoạn phát triển và tình trạng của các mô thực vật xâm nhiễm (Carvalho, 2004), trong đó tiền nuôi cấy đóng một vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả chuyển đổi di truyền (Birch, 1997)

Sự chuyển hoặc/và tích hợp T-DNA phụ thuộc vào các giai đoạn của chu kỳ tế bào chủ, cụ thể đó là các T-DNA chỉ có thể tích hợp ở giai đoạn nhân bản ADN Theo

An (1985), tần số chuyển nạp gen ở cây thuốc lá là phụ thuộc vào trạng thái sinh lý

của các tế bào, tần số chuyển nạp tối đa thu được khi tế bào thực vật phát triển theo cấp số nhân, cho thấy sự tăng trưởng nhanh của các tế bào thực vật là một yếu tố cần thiết cho việc chuyển nạp hiệu quả của thực vật bậc cao Villemont cùng cs (1997) và Hào cùng cs (2000) báo cáo rằng tiền nuôi cấy trong 4-8 ngày đại diện cho giai đoạn tăng trưởng logarit của callus từ phôi cây có múi Li (2003) cũng cho rằng tiền nuôi cấy mô sẹo của phôi cây có múi trong 4 ngày trong môi trường lỏng cung cấp tối ưu điều kiện chuyển nạp hoặc tích hợp T-DNA

Làm khô mẫu: Tình trạng khô của mẫu trước hoặc ngay khi xâm nhiễm vi khuẩn

là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng biến nạp Không rõ nhân tố nào bị tác động bởi việc làm khô mẫu, có thể đó là sự co nguyên sinh chất và tình trạng tổn thương mẫu giống như xử lý thẩm thấu Mặc dù cơ chế của sự phơi mẫu đến nay chưa rõ, nhưng người ta chứng minh rằng nó có khả năng loại bỏ vi khuẩn tương đương với xử lý AgNO3

Mức độ gây tổn thương của mô thực vật đích: Agrobacterium xâm nhiễm vào tế

bào thực vật thông qua một cơ chế chuyển gen gây ra khối u ở thực vật Gen vir (gen

gây độc) được hoạt hóa trong vi khuẩn nhờ chất chuyển hóa của thực vật phóng thích

từ các điểm bị thương Khi mô bị tổn thương, vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhập và chuyển DNA vào tế bào thực vật hơn Nhưng nếu mô bị tổn thương quá nặng thì sau khi chuyển gen khả năng tái sinh của mô rất thấp (Nguyễn Thị Thu Trang, 2012)

2.4.2 Ảnh hưởng của thành phần và điều kiện môi trường

Các thành phần và điều kiện của môi trường được sử dụng để lây nhiễm, đồng nuôi cấy và nuôi cấy mô (Carvalho, 2004), đặc biệt là nồng độ acetosyringone (AS) (Lê Tấn Đức, 2007) ảnh hưởng lớn đển hiệu quả chuyển nạp

Bổ sung các AS với vi khuẩn khi đồng nuôi cấy gây ra biểu hiện gen vir và làm tăng tỷ lệ cũng như mức độ chuyển nạp gen (Henzi và cs 2000) Tuy nhiên, AS không cần thiết đối với một số loại mô bị thương, vì chúng tiết các hợp chất phenol đủ để đạt được một phản ứng VIR Việc bổ sung 100 mM AS cho các môi trường đồng nuôi cấy tăng tần số biến nạp đáng kể Có thể, AS là cần thiết đối với các mô sẹo không bị thương trong thao tác

Ngoài ra còn có các chất gây cảm ứng gen vir khác như: acid galacturonic, acid

glucuronic, acid arabonic, các chất dẫn dụ (đường, amino acid), các chất kết dính của thực vật (pectin, vitronectin, germin)