NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA PHÔI HẠT BƠ (Persea americana) THÔNG QUA KỸ THUẬT NUÔI CẤY PHÔI VÀ LÁT MỎNG TẾ BÀO

Từ đó việc tìm hiểu sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự phát sinh hình thái của phôi hạt bơ và lát mỏng tế bào từ chồi bơ in vitro được thực hiện nhằm mục đích định hướng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA PHÔI HẠT BƠ

(Persea americana) THÔNG QUA KỸ THUẬT NUÔI CẤY PHÔI

VÀ LÁT MỎNG TẾ BÀO

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: Trần Hương Nhiên

Tháng 12/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA PHÔI HẠT BƠ

(Persea americana) THÔNG QUA KỸ THUẬT NUÔI CẤY PHÔI

VÀ LÁT MỎNG TẾ BÀO

Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện

ThS TRẦN THỊ THU HÀ

Tháng 12/2013

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, em đã đươc sự giúp đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ và động viên từ gia đình, từ quý Thầy Cô cùng các bạn Với sự biết ơn chân thành và sâu sắc nhất em xin gửi lời cảm ơn đến:

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, tập thể giáo viên Bộ môn Công nghệ Sinh học, quý Thầy Cô đã tạo điều kiện cũng như truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Bùi Minh Trí, Thầy là người đã trực tiếp và tận tình hướng dẫn em trong quá trình em thực hiện đề tài cũng như đã giúp em tháo gỡ những vướng mắc, khó khăn em gặp phải

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ThS Trần Thị Thu Hà là người giúp em kịp thời bổ sung những kiến thức cần thiết cho đề tài và là người đã động viên em giữ vững sự quyết tâm của mình khi em gặp khó khăn

Con xin cảm ơn Bố Mẹ đã sinh ra con, dạy dỗ và nuôi con khôn lớn, đã luôn bên cạnh con và hỗ trợ con cho đến ngày hôm nay, giúp con chăm lo cho gia đình riêng của mình

để con yên tâm học tập Cảm ơn Anh và Con đã luôn bên cạnh hỗ trợ, động viên, là nguồn động lực cho em trong mỗi bước đi của mình

Xin cảm ơn tập thể lớp LT11SH và các anh chị em đã và đang làm đề tài tại Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật, sự giúp đỡ và quan tâm của các bạn là những điều vô cùng quý giá đối với tôi trong suốt thời gian học tập và sẽ là những kỷ niệm tôi sẽ mang theo như hành trang sau này của mình

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn Chúc tất cả mọi người sức khỏe và thành công

TP Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013

Trần Hương Nhiên

TÓM TẮT

Cây bơ (Persea americana) là một loại cây ăn quả mang lại lợi ích kinh tế và dinh

dưỡng cao được đưa vào sản xuất rộng rãi trên thế giới cũng như tại Việt Nam Nguồn giống để sản xuất rất quan trọng do đó vấn đề đặt ra là làm sao để có nguồn giống ổn định, phương pháp nhân giống phải phù hợp để đảm bảo năng suất và phương pháp nuôi cấy mô được coi là có nhiều triển vọng Từ đó việc tìm hiểu sự ảnh hưởng của chất điều

hòa sinh trưởng lên sự phát sinh hình thái của phôi hạt bơ và lát mỏng tế bào từ chồi bơ in

vitro được thực hiện nhằm mục đích định hướng cho phương pháp nhân giống in vitro cây

bơ

Nội dung thực hiện gồm ba thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên hai yếu tố với ba lần lặp lại Môi trường sử dụng là môi trường MS cơ bản có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng tùy vào mục đích từng thí nghiệm Thí nghiệm 1 tiến hành khử trùng mẫu phôi hạt bơ nhằm tìm ra nồng độ Javel và thời gian khử trùng thích hợp cho quy trình khử trùng mẫu Thí nghiệm 2 đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng (BA và NAA) ở các nồng độ khác nhau lên sự phát sinh hình thái của phôi hạt bơ Thí nghiệm 3 đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng (BA và NAA) lên sự phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào chồi bơ được nuôi cấy từ hạt

Kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng Javel thương phẩm ở nồng độ 40% và thời gian khử trùng là 35 phút sẽ cho hiệu quả khử trùng cao nhất lên đến 90% số mẫu sống sót Môi trường MS bổ sung BA 3 mg/l và NAA 2 mg/l được đánh giá là tốt nhất đến sự phát sinh chồi của phôi hạt bơ với số chồi trung bình là 5 chồi và chiều cao chồi trung bình là 2,5 cm, trong thời gian là 30 ngày Nồng độ BA thích hợp để mẫu cắt lát mỏng tế bào chồi bơ cảm ứng được là 1 mg/l, thời gian cảm ứng là 23 ngày

SUMMARY

Research the morphological generation of embryos avocado (Persea americana) via

embryo culture techniques and Thin Cell Layer culture

This research is done to know how the effects of plant growth regulators on the morphology generation of avocado embryos, and sliced of avocado bud cells to orient the

in vitro propagation avocado

The research includes 3 experiments performed Experiment 1 conducted sterilized form of seed avocado embryonic in order to find out the concentration and duration appropriate for sample sterilization processes Experiment 2 evaluated the effects of plant growth regulators (BA and NAA) at the different concentrations on the morphology arising of seeds avocado embryos Experiment 3 evaluated the effects of growth regulators (BA and NAA) on the morphology arising of thin slices of avocado bud cells are cultured from seeds

The study results show that when using Javel at concentrations of 40 % and 35 minute time for effective disinfection highest form up to 90 % of survival samples Effect of BA

3 mg/l NAA and 2 mg/l is considered the best to rise to the height shoots and buds of embryonic avocado seed BA concentration appropriate to the sample thinly sliced

inducible cell is 1mg /l Therefore, tissue culture method has great potential propagated in

vitro plants to produce the large of planting material avocado to serve production

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Danh mục chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh mục hình ảnh ix

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích, yêu cầu và giới hạn của đề tài 2

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây bơ (Persea americana) 3

2.1.1 Vị trí phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc và lịch sử phát triển 3

2.1.3 Phân bố, phân loại giống bơ 4

2.1.4 Đặc điểm thực vật học và sinh lý học 5

2.1.4.1 Thân và lá bơ 5

2.1.4.2 Hoa bơ 5

2.1.4.3 Quả bơ 6

2.1.4.4 Hạt và phôi bơ 7

2.1.5 Điều kiện sinh thái của cây bơ trồng ngoài tự nhiên 7

2.2 Tổng quan về nhân giống in vitro 8

2.2.1 Định nghĩa 8

2.2.2 Quy trình nhân giống in vitro 9

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống in vitro 10

2.2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 10

2.2.3.2 Ảnh hưởng của ánh sáng 10

2.2.3.3 Môi trường nuôi cấy 11

2.2.3.4 Vai trò của chất kích thích điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy 11

2.3 Nuôi cấy lát mỏng tế bào Thin Cell Layer (TCL) 13

2.4 Các nghiên cứu liên quan đến nhân giống in vitro cây bơ 14

2.4.1 Các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây bơ trên thế giới 14

2.4.2 Nghiên cứu về nhân giống in vitro cây bơ tại Việt Nam 14

CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 16

3.2 Vật liệu 16

3.2.1 Mẫu nuôi cấy 16

3.2.2 Môi trường nuôi cấy 16

3.2.3 Hóa chất 16

3.3 Thiết bị và dụng cụ 16

3.3.1 Thiết bị 16

3.3.2 Dụng cụ 16

3.4 Phương pháp nghiên cứu 17

3.4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của Javel các nồng độ và thời gian khác nhau lên sự sống sót của phôi hạt bơ 17

3.4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự phát sinh hình thái của phôi hạt bơ 18

3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA ở các nồng độ khác nhau lên sự phát sinh hình thái từ phương pháp nuôi cấy lát mỏng chồi cây bơ in vitro 20

3.5 Phân tích số liệu 21

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Ảnh hưởng của Javel ở các nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau lên sự sống sót của mẫu cấy 22

4.2 Ảnh hưởng của BA và NAA lên sự phát sinh hình thái của phôi hạt bơ 26

4.3 Khảo sát sự cảm ứng của tế bào lát mỏng cắt từ chồi bơ nuôi cấy in vitro

từ phôi 32

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

β - indole acetic acid

β - indole butyric acid Murashige & Skoog 1962

α – napthil acetic acid Naphthoxyacetic acid Nghiệm thức

Trung bình Thin Cell Layer longitudinally Thin Cell Layer transversally Thin Cell Layer

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Các nghiệm thức thí nghiệm sự ảnh hưởng của javel ở các nồng độ và

thời gian khác nhau lên sự sống sót của mẫu cấy 17 Bảng 3.2 Các nghiệm thức thí nghiệm sự ảnh hưởng BA và NAA các nồng độ

khác nhau lên sự phát sinh hình thái của phôi hạt bơ 19 Bảng 3.3 Các nghiệm thức thí nghiệm sự ảnh hưởng của BA và NAA lên sự

phát sinh hình thái của chồi bơ bằng phương pháp nuôi cấy lát mỏng 21 Bảng 4.1 Ảnh hưởng của Javel ở các nồng độ và thời gian khác nhau lên

sự sống sót của phôi hạt bơ 23 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của BA và NAA ở các nồng độ khác nhau lên chiều cao

chồi nuôi cấy từ phôi hạt bơ 27 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của BA và NAA ở các nồng độ khác nhau lên số chồi

được tạo ra từ một phôi hạt bơ 29

Bảng 4.4 Sự cảm ứng của mô tế bào lát mỏng từ chồi bơ invitro với môi trường

có bổ sung BA và NAA ở các nồng độ khác nhau 33

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 2.1 Cây bơ được trồng ở khu vực Tây Nguyên Việt Nam 3 Hình 2.2 Hạt và phôi hạt bơ 7 Hình 4.1 Phôi hạt bơ sau khi cấy 10 ngày 24 Hình 4.2 Ảnh hưởng của BA và NAA ở các nồng độ khác nhau lên chiều cao

chồi bơ nuôi cấy từ phôi sau 30 ngày 28 Hình 4.3 Ảnh hưởng của BA và NAA lên số lượng chồi của phôi hạt bơ

sau 30 ngày nuôi cấy 30 Hình 4.4 Ảnh hưởng của dinh dưỡng môi trường lên hình thái chồi bơ

sau 60 ngày nuôi cấy 32 Hình 4.5 Sự cảm ứng của lớp mỏng tế bào chồi cây bơ dưới sự ảnh hưởng

của BA và NAA sau 23 ngày nuôi cấy 34

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bơ (Persae americana) là một trong những loại cây ăn quả chính của vùng nhiệt đới

và cận nhiệt đới, được biết đến ở hầu hết các quốc gia trên thế giới Từ nhiều năm về trước, bơ đã được đưa vào sản xuất và xuất khẩu ở các nước Mexico, Mỹ, Brazil, Colombia, Indonesia, Chile (FAO, 1991)

Cây bơ là một loại cây thân gỗ, lâu năm, thời gian trưởng thành kéo dài (khoảng 7 năm) do vậy các cây dù trồng cùng một thời gian nhưng lại không đồng đều (Pliego-Alfaro và Berg 1992) Mặc dù có nhiều công dụng về thực phẩm và mỹ phẩm đã được biết đến nhưng về mặt di truyền lại ít được quan tâm Do đó công việc chọn giống trước đây được thực hiện một cách chủ quan, hầu hết các giống bơ có giá trị được lựa chọn trong một quần thể bơ khá lớn nên có sự khác biệt với nhau trong một vườn cây là rõ rệt Tính ổn định về di truyền của các giống bơ đã được duy trì bằng nhân giống vô tính như

sử dụng phương pháp ghép gốc hoặc nuôi cấy mô (Cruz-Hernández, 1998)

Cây bơ là loài cây lưỡng tính và ngoài tự nhiên chúng sinh sản hữu tính thông qua hình thức thụ phấn chéo giữa các cây lân cận nhau hoặc thụ phấn nhờ gió, do đó chất lượng của quả hình thành khó có thể kiểm soát được, cây con có thể cho trái với chất lượng và năng suất khác so với cây mẹ do tỷ lệ phân ly cao Điều này chứng tỏ yếu tố di truyền ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng cũng như năng suất của đời sau

Trong sản xuất cây giống, vấn đề quan trọng nhất là cơ sở di truyền vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến sự ổn định của một vườn cây, yếu tố cần cho sự ổn định như kích thước cây,

độ đồng đều về năng suất, khả năng chống chịu của cây giống đối với các bệnh như thối

rễ, nấm đất, yếu tố bất lợi của đất như độ mặn, độ chua (Coffey, 1987)

Thời gian trưởng thành của cây bơ khá lâu gây khó khăn cho việc đánh giá độ đồng đều của cây giống và sự ảnh hưởng của chúng đến năng suất của các cây đời sau Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến việc nhân giống vô tính để ổn định tính di truyền cũng như chất lượng của cây được chọn lọc Các biện pháp được sử dụng như giâm cành, chiết cành, chiết rễ và ghép cây nhưng phương pháp áp dụng chủ yếu vẫn là sử dụng gốc ghép

Đối với gốc ghép hay nhân giống đơn thuần từ hạt thường gặp những khó khăn như thời gian tương đối dài, cây dễ bị nhiễm nấm từ tự nhiên và gây nên một số bệnh ảnh hưởng đến năng suất trái, mẫu ghép có thể không phù hợp với gốc được chọn, tốn kém nhân công và kinh phí

Từ những hạn chế trên phương pháp nhân giống in vitro có thể được xem có nhiều

triển vọng để tạo ra một số lượng cây giống lớn, đồng đều về mặt di truyền Để giải quyết

vấn đề trên đề tài “Nghiên cứu sự phát sinh hình thái của phôi hạt bơ (Persea americana)

thông qua kỹ thuật nuôi cấy phôi và lát mỏng tế bào” đã được thực hiện nhằm định hướng cho công việc nhân giống

1.2 Yêu cầu của đề tài

Tìm hiểu phản ứng tái sinh và phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy in vitro từ phôi hạt

và từ chồi cây bơ khi sử dụng kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt và nuôi cấy lát mỏng tế bào

1.3 Nội dung thực hiện

Xác định được nồng độ Javel và thời gian thích hợp cho qui trình khử trùng mẫu cấy Xác định được nồng độ chất điều hòa sinh trưởng và đánh giá được ảnh hưởng của chúng lên sự phát sinh hình thái của phôi hạt bơ

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây bơ (Persea americana)

Mỹ Ở nước ta, bơ cũng được nhập trồng từ đầu thế kỷ 20 Hiện nay vùng sản xuất chính

là Lâm Đồng và các tỉnh khác vùng Tây Nguyên

2.1.3 Phân bố, phân loại giống bơ

Đa số các giống bơ đều xuất xứ từ các vùng nhiệt đới Trung Mỹ như Mexico, Guatemala và quần đảo Antilles Trong những xứ này, người ta thường phát hiện những cây bơ mọc hoang dại (en.wikipedia.org)

Bơ gồm rất nhiều giống thuộc họ Lauraceae Phần lớn các giống có tính chất thương mại đều thuộc vào 3 chủng: chủng Mexico, chủng Guatemala và chủng Antilles hay West

Indian Chủng Guatemala và West Indian (Antilles) được xếp vào loài Persea americana Mill Chủng Mexico được xếp vào loài Persea drymyfolia (rauhoaquavietnam.vn)

Đặc tính của 3 chủng loại bơ quan trọng:

- Chủng Mexico: Có lá thay đổi nhiều về kích thước, lá có màu xanh lục, mặt dưới nhạt hơn mặt trên, đặc biệt khi vò lá ngửi có mùi hôi Trái thường dài dạng quả lê, dạng

đu đủ Chất lượng rất tốt do hàm lượng chất béo rất cao: 15-30% (trên thị trường gọi là bơ sáp) Vỏ trái mỏng, thường trơn tru, khi chín có màu xanh, vàng xanh, hay đỏ tím, đỏ sẫm tùy giống Hạt khá lớn, vỏ hạt mỏng, mặt ngoài hạt trơn láng, khi chín hạt nằm lỏng trong lòng quả nhưng lắc không kêu Thời gian từ khi ra hoa đến lúc trái chín thường từ 8 – 9 tháng Đây là chủng bơ có chất lượng cao nhất và có đặc tính chịu rét tốt nhất

- Chủng Guatemala: có lá màu xanh sẫm hơn chủng Mexico và chủng Antilles, khi

vò lá không có mùi hôi Ngọn non màu đỏ tối Thời gian từ lúc trổ hoa đến lúc trái chín thường từ 9 – 12 tháng Trái nhiều Cuống trái dài, vỏ hơi dày và có sớ gỗ Da thường sần sùi như da cá sấu Hạt nhỏ và nằm sát trong lòng quả Thịt quả dày cơm, có hàm lượng dầu béo 10 – 15% Mặt ngoài hạt láng hoặc trơn láng Chủng này có sức chống chịu rét khá tốt

- Chủng Antilles hoặc West Indian: có lá to, lá thường có màu sắc gần như đồng đều

ở hai mặt lá; khi vò nát lá, ngửi không có mùi vị Thời gian từ lúc trổ hoa đến lúc trái chín thường từ 6 – 9 tháng Trái thường to, có trái rất to Cuống trái ngắn Vỏ trái hơi ngắn và dai, dày trung bình 0,8 – 1,5 mm Da trái có màu xanh và khi chín thì đổi sang màu xanh hơi vàng Thịt quả có hàm lượng dầu 3 – 10% Hạt khá lớn và nằm lỏng trong lòng quả, khi chín lắc qua nghe tiếng kêu Mặt ngoài của hạt sần sùi, vỏ bao quanh hạt không dính

liền với hạt Chủng Antilles chịu rét yếu nhưng chịu nóng và chịu mặn (3% trong nước tưới)

Căn cứ vào các đặc điểm trên, có thể nghi nhận các vùng phân bố của các giống bơ chính ở Việt Nam như sau:

- Vùng Đà Lạt: hiện diện chủ yếu các giống thuộc chủng Mexico do đặc điểm chịu rét rất giỏi của nó, bên cạnh đó còn phát hiện các giống thuộc chủng Guatemala, nhưng chủng này chiếm tỷ lệ rất ít

- Vùng Đức Trọng, Đơn Dương, Bảo Lộc: trong các huyện này, chủng Antilles chiếm tỷ lệ cao nhất so với các chủng khác

- Vùng Di Linh: được xem là vùng phân bố chủng Guatemala

2.1.4 Đặc điểm thực vật học và sinh lý học

2.1.4.1 Thân và lá cây bơ

Cây bơ cao khoảng 20 mét, lá xen kẽ, mỗi lá dài 12 – 25 cm Cây to được xếp vào loại cây xanh lá quanh năm, nhưng vài giống có tính rụng lá một phần hoặc rụng hết khi cây trổ hoa, những đặc tính này chỉ có tính cách tạm thời vì sau đó chồi non lại phát sinh ngay Trên đa số giống lá già chỉ rụng dần trong một thời gian khá dài vào mùa xuân nên cây lúc nào cũng xanh lá Lá lúc còn non thường có lông mịn, màu hơi đỏ hoặc màu đồng nhưng đến khi trưởng thành, lá có màu xanh láng và dài Chiều dài lá rất thay đổi từ hình thuẩn đến hình dao Chóp lá thường bén nhọn nhưng có vài giống chóp lá hơi tròn Mùi vị

của lá thường chỉ đặc trưng cho loài Persea drymifolia, khi vò ngửi có mùi hôi

của hoa bơ mang tính tạp giao Căn cứ vào thời gian hoạt động của nhị và nhụy, các tác giả đã chia bơ ra thành 2 nhóm:

- Nhóm A: hoa nở lần 1 vào buổi sáng; nhụy chín nhưng nhị chưa tung phấn; tiếp theo đó là thời kỳ hoa cụp lại; hoa nở lần 2 vào buổi trưa ngày hôm sau; nhị chín tung phấn nhưng nhụy không còn khả năng thụ phấn nữa Khoảng cách thời gian giữa 2 lần nở hoa của một hoa kéo dài trên 24 giờ

- Nhóm B: có đặc điểm nở hoa ngược lại: hoa nở một lần vào buổi chiều; nhụy chín sẵn sàng đón phấn; tiếp theo đó là thời gian hoa cụp lại khoảng dưới 24 giờ; hoa nở lần 2 vào buổi sáng hôm sau; nhị chín và tung phấn

Như thế hai nhóm A và B có đặc tính bổ sung sự thụ phấn cho nhau để cây đậu quả tốt (nongnghiep.vn)

2.1.4.3 Quả bơ

Quả mọng lớn, nạc, dạng quả lê, hình trứng hay hình cầu, màu lục hay màu mận tía Khi chín thịt mềm, màu vàng lục giống như chất bơ, có vị ngọt nhẹ Quả của cây bơ hình như cái bầu nước, dài 7-20 cm, nặng 100g – 1kg Quả có ba phần rõ rệt: vỏ, thịt và hạt Bề dày và cấu tạo của vỏ thay đổi tùy giống Quả của những giống thuộc chủng Mexico thường có vỏ mỏng và láng, chủng Guatemala và Antilles thường có vỏ dày hơn Có giống quả vỏ sần sùi, có giống vỏ láng và đôi khi có sớ gỗ Màu sắc của vỏ quả biến động

từ màu xanh sáng, màu xanh nhạt, xanh vàng, hoặc tím đến tím sẫm khi quả chín Thịt quả có hàm lượng dầu béo rất cao so với các loại quả khác

x Thành phần hóa học trong quả bơ

Quả bơ chứa: Nước 60%; protid 2,08%, lipid 20,10%, glucid 7,40%, tro 1,26%, nghèo

về chất khoáng; các aminoaacid là: cystin, trytophan; có nhiều chất kháng sinh Còn có vitamin A, B và C (19 - 20 mg %) (smegtz.org.vn)

2.1.4.4 Hạt và phôi hạt bơ

Hạt quả bơ hình tựa quả trứng, dài 5 - 6 cm, nằm trong trung tâm, màu nâu đậm, và rất cứng Hạt được 2 lớp vỏ lụa bao bọc, gồm có hai tử diệp hình bán cầu Giữa hai tử diệp có phôi hạt nằm về phía cuống quả, và khi hạt nẩy mầm, cây mầm sẽ mọc thẳng từ dưới lên

theo trục thẳng đứng của hạt Mặt ngoài tử diệp (nội nhũ) trơn láng hoặc sần sùi tùy theo giống và hình dạng cũng biến động khá nhiều (rauhoaquavietnam.vn)

Hình 2.2: Hạt và phôi hạt bơ

(Nguồn:http://blog.growingwithscience.com)

2.1.5 Điều kiện sinh thái của cây bơ phát triển ngoài tự nhiên

Cây bơ có rất nhiều giống thuộc các chủng khác nhau nên không thể nêu nên đặc điểm sinh thái nói chung

Về nhiệt độ: Cây bơ có nguồn gốc ở các xứ nhiệt đới Trung Mỹ, phân bố ở độ cao

dưới 1.000 – 2.700 m Ở đây các giống thuộc chủng Guatemala, Mexico có thể chịu được nhiệt độ từ -200C đến -600C, các giống Antilles chỉ chịu được nhiệt độ khoảng 00C

Tại Đà Lạt, nhiệt độ tuyệt đối thấp rất hiếm khi đạt mức 00C – 10C, nên các giống Antilles kém chịu rét nhất cũng chịu được, do đó vấn đề nhiệt độ thấp đối với cây bơ không quan trọng lắm Vấn đề đặt ra là ảnh hưởng của nhiệt độ quá cao đối với sự chống chịu của giống và vấn đề phẩm chất biểu hiện ở hàm lượng dầu trong quả

Ẩm độ: Lượng mưa tối thích cho cả năm là 1000 – 1500 mm Khi bơ ra hoa, nếu gặp

trời mưa dầm, ẩm độ không khí quá cao, hoa sẽ rụng nhiều Do đó, bơ cần có một mùa khô mát để ra hoa đậu quả tốt Mưa nhiều vào mùa quả chín cũng làm giảm chất lượng quả, hàm lượng dầu không cao

Gió: Cây bơ có gỗ dòn, chống gió yếu nên vấn đề trồng cây che chắn gió có tác dụng

hạn chế đổ gãy đồng thời giảm tốc độ thoát hơi nước vào mùa ra quả (mùa khô) để cây không bị rụng trái Gió còn làm trái cọ sát lẫn nhau, cọ sát với lá, cành gây ra bệnh sinh lý làm giảm giá trị trái bơ

Đất đai: Có thể trồng bơ trên nhiều loại đất khác nhau: đất sét pha cát, đất pha sét, đất

thịt nặng Nhưng vấn đề đặc biệt cần lưu ý là đất phải thông thoáng, dễ thoát nước, giầu chất hữu cơ Lớp đất thông thoáng thoát thủy phải sâu ít nhất là 90 cm Đất có mạch nước

ngầm thấp sâu ít nhất là 2m, vì trong thời kỳ đầu sinh trưởng, rễ bơ ăn cạn, cây vẫn phát triển tốt nhưng càng về sau, bộ rễ ăn càng sâu, gặp đất úng thủy, rễ phát sinh nấm

Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa,

đế hoa, rễ

Phương pháp nuôi cấy mô được áp dụng trên thực vật nhằm nhân giống một loại cây

mong muốn dựa và đặc tính quan trọng của tế bào thực vật đó là tính toàn năng (cell

totipotency) Mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lượng

thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh

Ngày nay người ta dùng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm các mục đích:

- Tạo quần thể lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn, với diện tích thí nghiệm nhỏ, có điều kiện môi trường kiểm soát được

- Tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây mà ngoài thiên nhiên không thực hiện được

- Làm sạch virus cho cây bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

- Cải thiện giống cây trồng bằng công nghệ sinh học

2.2.2 Quy trình nhân giống in vitro

Theo Trần Thị Dung (2009), sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ đạt được

khi trải qua các giai đoạn:

Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy in

vitro

Vô trùng mẫu cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên Tuy nhiên, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vàu lần thử chắc chắn sẽ đạt được kết quả

Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách có định hướng các mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu bởi tỷ lệ của các hợp chất auxin và cytokinin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Thường mô non, chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành Người ta nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây cho kết quả khả quan trong tái sinh chồi

Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ số nhân, ta thường thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men, kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẽ sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy auxin là nhóm hormone thực vật qua trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy

Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh ra đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in

vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng của quá trình này trong thực tiến sản xuất

Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống tự

dưỡng hoàn toàn, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, ẩm

độ, giá thể… ) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ra ngoài đồng ruộng

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống in vitro

2.2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Yêu cầu về khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng phát triển của từng loại cây

in vitro cũng khác nhau Thông thường, người ta nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ phòng

từ 25 – 280C Theo các tác giả Shigenobu và Sakamoto (1981) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999) thì nhiệt độ cũng như thời gian chiếu sáng ngày đêm phải không thay đổi trong suốt thời gian nuôi cấy

2.2.3.2 Ảnh hưởng của ánh sáng

Ánh sáng (bao gồm cường độ, chu kỳ và thành phần quang phổ) có ảnh hưởng mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Read, 1990; Dooley, 1991) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999) Cường độ ánh sáng từ 2.500 – 3.500 lux thường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô Cường độ ánh sáng lớn hơn thì sự sinh trưởng của chồi chậm lại nhưng thúc đẩy quá trình tạo rễ (Murashige, 1977) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999) Thành phần quang phổ cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy Các ánh sáng đơn sắc khác nhau về bước sóng cũng ảnh hưởng khác nhau về sự tạo chồi, tạo rễ của quá trình nuôi cấy Sự thu nhận ánh sáng của chồi phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng và chất liệu bình nuôi cấy

2.2.3.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy cơ bản bao gồm năm thành phần chính:

- Các muối khoáng đa lượng

- Các muối khoáng vi lượng

- Các vitamin

- Đường làm nguồn carbon

- Các chất điều hòa sinh trưởng

Ngoài ra người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác định như acid amin, EDTA, hoặc không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men vào môi trường tùy theo nhu cầu riêng của từng đối tượng nuôi cấy

Dựa vào hàm lượng và thành phần ta có 3 loại môi trường:

- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: White, Vacin vad Went, Knop

- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: B5 Gamborg

- Môi trường giàu chất dinh dưỡng: MS ( Murashige – Skoog)

2.2.3.4 Vai trò của chất kích thích điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy

Chất điều hòa sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp, nhưng có hiệu ứng sinh học cao, được tổng hợp tại một cơ quan của cây và gây ảnh hưởng điều tiết đến các quá trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác Chất điều hòa sinh trưởng là sản phẩm trao đổi chất bình thường của cơ thể thực vật, đóng vai trò chủ đạo trong quá trình sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý, hóa sinh khác cũng như trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện môi trường (Bùi Trang Việt, 2000) Chất điều hòa sinh trưởng thực vật có 3 nhóm chính:

¾ Auxin

Auxin được khám phá ra do các thí nghiệm thực hiện trên các phản ứng làm cong bao

lá mầm

Công thức hóa học: C10H9O2N

Tên gọi: Indole β acetic acid

Có hai loại auxin là auxin tự nhiên: IAA có trong tế bào thực vật và auxin tổng hợp: NAA; IBA; 2,4 – D; NOA

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào nồng độ

và sự hỗ trợ qua lại của chúng với các chất điều hòa khác Trong trường hợp khảo sát tác đông riêng rẽ, auxin có tính chất quan trọng là tác động rõ ràng trên sự kéo dài tế bào Hiệu quả này là sự nối tiếp cho một sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập nước vào trong tế bào, sự đề kháng của tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra Auxin còn có tác dụng kích thích sự hình thành rễ, kìm hãm sự phát triển chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả Auxin kích thích sự kéo dài tế bào, tuy nhiên chỉ tác động trên

tế bào diệp tiêu và khúc cắt thân cô lập, tế bào biểu bì hay dưới biểu bì phản ứng mạnh đối với auxin khi một đoạn cắt thân cây được chẻ dọc và xử lý auxin thì hai nửa thân cong vào một cách điển hình (Bùi Trang Việt, 2000)

¾ Cytokinin

Cytokinin là các adenine được thay thế, chất này được người ta biết qua nhóm nội sinh

là Zeatin và Isopentenyladenine (IPA), cytokinin tự nhiên và các chất tổng hợp Có hai loại được sử dụng nhiều nhất là: Kinetin (6 furfuryl – aminopurine), Benzyladenine (BAP)

Tác động của cytokinin cũng thể hiện rất rõ trong sự sinh tạo cơ quan thực vật, kích thích hình thành từ mô sẹo Trái lại, chúng là chất đối kháng với sự sinh tạo rễ Kích thích

sự chuyển hóa, làm thuận lợi một phần việc tổng hợp protein và mặt khác trong lúc bảo

vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của những enzyme phân giải, ngăn chặn sự lão hóa, gia tăng sự tập trung dinh dưỡng vào các cơ quan đang lớn Một hiệu quả đối kháng của tính ưu thế chồi ngọn; các chồi được xử lý bằng Cytokinin sẽ tăng cường cạnh tranh với chồi tận cùng Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin Cytokinin có tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào Trong sự nuôi cấy các mô nghèo Cytokinin, auxin kích thích sự nhân đôi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân nhưng không có sự phân vách, sự phân vách chỉ xảy ra khi

có Cytokinin ngoại sinh (Bùi Trang Việt, 2000)

¾ Gibberellin

Gibberellin đầu tiên được tìm thấy là dạng gibberellic acid (GA) vào năm 1939 Đến nay đã có hơn 50 gibberellin khác nhau đã được tìm thấy Gibberellin có tác động làm tăng chiều dài lóng

Trong nuôi cấy in vitro, gibberellin có tác động đối với nhiều đỉnh sinh trưởng, nếu

thiếu gibberellin đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu tạo nên các mắt cây (Dương Công Kiên, 2002) Gibberellin có hiệu quả kích thích lên sự chuyển hóa, vì chúng làm thuận lợi cho sự tổng hợp các enzyme phân giải Gibberellin còn tác động đến sự đậu trái của cây cho trái không hạt

Một tác động khác phức tạp hơn nhưng kỳ diệu là khả năng đánh thức các chồi, mầm ngủ trên nhiều giống cây

Trong lĩnh vực sinh tạo cơ quan thực vật, gibberellin cho thấy các hoạt động đối kháng, chúng dường như đối nghịch với sự phân hóa tế bào (mô không có tổ chức) Trong

nuôi cấy in vitro, ta áp dụng chúng cho việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, chồi

thân

2.3 Nuôi cấy lát mỏng tế bào Thin Cell Layer (TCL)

Hệ thống nuôi cấy lát mỏng tế bào bao gồm các mẫu cấy có kích thước nhỏ được cắt

ra từ những bộ phận khác nhau của thực vật (thân, lá, rễ, phát hoa, các bộ phận của hoa, lá mầm, chồi, phôi) Nếu mẫu cấy được cấy theo chiều dọc được gọi là lTCL, nếu cắt theo chiều ngang được gọi là tTCL Các lTCL (1 mm - 10 mm) chỉ chứa một loại mô như lớp đơn tế bào biểu bì hoặc một vài lớp (3 – 6 lớp) của tế bào vỏ, ngược lại các tTCL (dày khoảng 0,2 – 0,5 mm đến vài mm) bao gồm một số tế bào thuộc các mô khác nhau (mô biểu bì, mô vỏ, tượng tầng, mô ruột hay tế bào nhu mô) ( Trần Thanh Vân và Gendy, 1996) tTCL và lTCL có đặc điểm chung là mỏng Đặc điểm này đóng vai trò qua trọng vì

các phân tử đánh dấu sự biệt hóa có thể định vị in situ ở những tế bào đích hay những tế

bào đáp ứng Quá trình định vị này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng không mong muốn (Trần Thanh Vân, 2003)

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào lát mỏng đã được phát triển hơn 30 năm qua với khả năng điều khiển biệt hóa hoa, rễ, chồi và phôi soma Kỹ thuật này được ứng dụng thành công trong nhân giống trên nhiều loài thực vật khác nhau.Nuôi cấy lớp mỏng tế bào là một

phương pháp cho nhiều ưu thế hơn so với những phương pháp nhân giống in vitro truyền

thống khác và được ứng dụng thành công trên nhiều loài cây khác nhau (Dương Tấn Nhựt

và cs, 2003) Tuy nhiên, việc ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào ở cây thân

gỗ chưa được công bố nhiều (Huỳnh Hữu Đức và cs, 2007)

2.4 Các nghiên cứu liên quan đến nhân giống in vitro cây bơ

2.4.1 Các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây bơ trên thế giới

Phương pháp thu thập và bảo tồn giống bơ trên thế giới đã được xây dựng trên cơ sở là nuôi cấy mô tế bào, đối với cây bơ bộ phận thường được sử dụng là chồi nách, mô phân

sinh đỉnh, lá Môi trường được sử dụng hầu hết ở các phương pháp là môi trường Murashige and Skoog

Mô của bơ gỗ, Persea americana, đã chứng minh phần nào khó khăn hơn để xử lý

trong điều kiện nuôi cấy mô vô trùng, mặc dù một số cải tiến kỹ thuật đã được phát triển trong nhiều năm qua Quy trình khử trùng mẫu bơ đã được công bố nhiều lần nhưng chưa được ứng dụng rộng rãi vì chưa được chứng minh là tối ưu Việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô vô trùng để kiểm tra phản ứng sinh lý của mô bơ đối với các yếu tố môi trường, ánh sáng, nhiệt độ, môi trường nuôi cấy đã có được thông tin cơ bản có thể được áp dụng cho công tác nhân giống vô tính của cây thân gỗ Phần lớn các thử nghiệm nuôi cấy mô đã

sử dụng các vỏ quả trái cây như một mô thử nghiệm Nghiên cứu đã áp dụng trên các mô

có nguồn gốc từ các phân đoạn thân hay có thể sử dụng toàn bộ hoặc từng bộ phận nụ bên trong cây giống, mô lá mầm (Schroeder, 1980)

Việc trồng các mô thực vật trên môi trường nhân tạo đã được sử dụng rộng rãi như một công cụ nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu thực vật (Black, 1957 và Morel, 1948), cũng như nhiều người khác, đã mô tả cách sử dụng của phương pháp này trong nghiên cứu bệnh lý thực vật Sự quan tâm của các nhà khoa học về phương pháp này được ứng dụng vào mô bơ trên môi trường nhân giống nhân tạo và cho rằng có thể dùng phương pháp này để phục vụ cho việc xác định các bệnh nắng đốm hay bệnh do virus gây

ra trên bơ (Desjardins, 1958)

2.4.2 Nghiên cứu về nhân giống in vitro cây bơ tại Việt Nam

Dương Tấn Nhựt và cs (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của peptone lên sự tái sinh

chồi bơ in vitro và rễ từ phần thân cây bơ trưởng thành hoặc chưa trưởng thành Trong

nghiên cứu này, đã sử dụng cả hai loại mẫu thân cây bơ trưởng thành và chưa trưởng thành để nghiên cứu ảnh hưởng của peptone trên chồi tái sinh Mẫu được cấy trên môi trường Murashige và Skoog (MS) trung bình không có hoặc có chất điều hòa sinh trưởng thực vật Trên môi trường MS bổ sung cả peptone và benzyladenine hoặc axit dichlorophenoxyacetic, mẫu sống sót nhưng bị ức chế đáng kể trong việc tái sinh chồi

Trường hợp chỉ bổ sung peptone vào môi trường với một lượng là 2,0% (w/v) kết quả cho thấy là tối ưu số chồi sinh ra Chồi cũng sinh ra ở phần nách lá từ cây trưởng thành nhưng tốc độ hồi phục vẫn ở mức thấp Tất cả các chồi cấy có nguồn gốc từ cây trưởng thành hình thành rễ trên các môi trường bổ sung peptone và acid naphthaleneacetic

CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện từ tháng 4/2013 đến tháng 11/2013 tại Phòng thí nghiện Công nghệ Sinh học Thực vật Viện nghiên cứu Sinh Học và Môi Trường, Đại học Nông lâm

Tp HCM, khu phố 6, phường Linh Trung, Thủ Đức, Tp.HCM

3.2 Vật liệu

3.2.1 Mẫu nuôi cấy

Hạt bơ được thu thập từ các vườn bơ ở thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng

3.2.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS (thành phần xem tại phụ lục)

Môi trường được điều chỉnh ở pH = 5,8 ± 0,1 trước khi hấp khử trùng ở 1210C, 1atm,

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của Javel các nồng độ và thời gian khác nhau lên

sự sống sót của phôi hạt bơ

Tiến hành khử trùng mẫu hạt bơ nhằm tạo ra nguồn mẫu sạch ban đầu cho quy trình nuôi cấy Qui trình được thực hiện như sau:

- Hạt bơ được rửa sạch với xà phòng và nước (giai đoạn này được thực hiện bên ngoài sau đó đưa vào tủ cấy vô trùng thực hiện các bước tiếp theo)

- Khử trùng về mặt với cồn 70%

- Rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 – 5 lần

- Tiếp tục khử trùng với javel 30%

- Rửa nước cất 3 – 5 lần

- Tiến hành cắt nhỏ phần nội nhũ chọn ra phần chứa phôi của hạt bơ

- Tiến hành khử trùng giai đoạn 2 với 16 nghiệm thức như bảng 3.1

Bảng 3.1 Các nghiệm thức thí nghiệm sự ảnh hưởng của javel ở các nồng độ và thời gian

khác nhau lên sự sống sót của mẫu cấy

Javel (%)

Thời gian khử trùng (phút)

Thí nghiệm gồm 16 nghiệm thức, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với hai yếu tố Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 Mỗi lần lặp lại gồm 3 chai 500 ml Mỗi chai chứa 50 ml môi trường

MS, cấy một mẫu Tổng số mẫu là 144

Điều kiện chiếu sáng: cường độ ánh sáng 50μmol m-2 s-1, nhiệt độ phòng nuôi cấy là

25 ± 20C, thời gian chiếu sáng 18 giờ/ ngày, độ ẩm 60 – 80% Đặt chai đã cấy mẫu vào kệ

có gắn bóng đèn huỳnh quang

Điều kiện tối: nhiệt độ phòng nuôi cấy: 22±20C, ẩm độ 60 – 80% Điều kiện tối được thực hiện khi tắt hết các bóng đèn

ƒ Chỉ tiêu theo dõi:

Sau 20 ngày nuôi cấy quan sát:

- Sự thay đổi màu sắc của mẫu

3.4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự phát sinh hình thái của phôi hạt bơ

Hạt bơ sẽ được khử trùng từ kết quả khử trùng tốt nhất lấy từ thí nghiệm 1 và nuôi cấy

trên môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng như bảng 3.2

Thí nghiệm gồm 16 nghiệm thức, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với hai yếu tố Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 Mỗi lần lặp lại gồm 3 chai 500 ml Mỗi chai chứa 50 ml môi trường

MS, cấy một mẫu Tổng số mẫu là 144

Điều kiện chiếu sáng: cường độ ánh sáng 50μmol m-2 s-1, nhiệt độ phòng nuôi cấy là

25 ± 20C, thời gian chiếu sáng 18 giờ/ ngày, độ ẩm 60 – 80% Đặt chai đã cấy mẫu vào kệ

có gắn bóng đèn huỳnh quang

Điều kiện tối: nhiệt độ phòng nuôi cấy: 22±20C, ẩm độ 60 – 80% Điều kiện tối được thực hiện khi tắt hết các bóng đèn