ĐẶC TRƯNG KIỂU GENE S VÀGENEMCỦA PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS (PEDV) GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TRÊN HEO TRONG GIAI ĐOẠN TỪ 2011 2013

Trước những vấn đề thực tế trên, đề tài nghiên cứu: “Đặc trưng kiểu gene S vàgene M của Porcine epidemic diarrhea virus PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp trên heotrong giai đoạn 2011 - 2013” đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐẶC TRƯNG KIỂU GENE S VÀ GENE M CỦA PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS (PEDV) GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TRÊN HEO TRONG GIAI ĐOẠN

TỪ 2011 - 2013

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : THẠCH LỜI

Niên khóa : 2009 - 2013

Tháng 06/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐẶC TRƯNG KIỂU GENE S VÀ GENE M CỦA PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS (PEDV) GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TRÊN HEO TRONG GIAI ĐOẠN

TỪ 2011 - 2013

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS ĐỖ TIẾN DUY

Tháng 06/2013

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:

Nguyễn Tất Toàn, Giảng viên Khoa Chăn nuôi thú y, Trường đại học NôngLâm TP Hồ Chí Minh

Đỗ Tiến Duy, Giảng viên Khoa Chăn nuôi thú y, Trường đại học Nông Lâm

TP Hồ Chí Minh

Đã tận tình hướng dẫn, ủng hộ và giúp đỡ tôi thực hiện, hoàn thành tốt luận văntốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm

Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thứcquý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường

Thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học và Khoa Chăn nuôi thú y và các cán bộBệnh viện thú y Trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo điềukiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt luận văn tốt nghiệp

Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học khóa 2009 trường đại họcNông Lâm TP Hồ Chí Minh đã luôn luôn bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẻbuồn vui trong quá trình học và quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục connên người, để con được như ngày hôm nay

Tp, Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013

Sinh viênThạch Lời

TÓM TẮT

Trong những năm qua, ngành chăn nuôi heo đang đứng trước nhiều khó khăn

do dịch bệnh liên tiếp xảy ra, trong đó có dịch tiêu chảy cấp trên heo con gây thiệt hạinặng nếu không có biện pháp phòng ngừa và ngặn chặn kịp thời Bệnh do một loại vi-rút có tên là PED, vi-rút này rất dễ bị biến chủng và thay đổi độc lực Do đó việc xácđịnh đặc trưng và sự đa dạng kiểu gene của PEDV qua các năm xảy ra dịch bệnh tạiViệt Nam (2011 - 2013) Giải trình tự và so sánh sự khác biệt trên đoạn gene S (spikeprotein) và gene M (membrane protein) của chủng PEDV (Porcine epidemic diarrheavirus) là rất cần thiết

9 mẫu ruột non heo bị tiêu chảy cấp dương tính với PEDV được chọn để phântích đặc trưng và đa dạng di truyền Các mẫu này thu thập từ các địa phương khácnhau bao gồm 2 mẫu ở Đồng Nai (VN01S1, VN01M1; VN01S2, VN01M2), 1 mẫu ởĐăk Lăk (VN02S3, VN02M3), 1 mẫu ở Tây Ninh (VN02S4, VN02M4), 2 mẫu ở LâmĐồng (VN02S5; VN03S9, VN03M9), 1 mẫu ở Bình Dương (VN02S6, VN02M6) và 2mẫu ở Bà Rịa - Vũng Tàu (VN03S7, VN03M7; VN03S8, VN03M8)

Qua kết quả nghiên cứu, thấy có sự đa dạng di truyền giữa các chủng PEDVViệt Nam trong đợt dịch từ năm 2009 - 2013 Cả 3 phân nhánh nhỏ trong nhóm I của

2 cây sinh dòng của các chủng PEDV Việt Nam đều tương đồng cao và rất gần vớichủng JS-2004-2/DX (Trung Quốc), 07NP01 (Thái Lan) trên cả hai gene S và M

The thesis “Genetic characterization of the partial S gene and M gene ofPorcine epidemic diarrhea virus (PEDV) caused acute diarrhea in pigs in 2011 -2013” was performed during 5 months from 15/12/2012 to 15/05/2013 at VeterinaryHospital of Nong Lam University The objective of this study was to identify geneticcharacterization and genetic diversity of PEDV over the years of outbreaks in Vietnam(2011 - 2013) through sequencing and comparing the differences in the gene S gene(spike protein) and gene M (membrane protein)

There were 9 intestinal specimens from PEDV - positive pigs dealing withacute diarrhea were chosen to analyze genetic characteristics and diversity Thesamples collected from various localities including 2 samles in Dong Nai (VN01S1,VN01M1; VN01S2, VN01M2), 1 sample in Dak Lak (VN02S3, VN02M3), 1 sample

in Tay Ninh (VN02S4, VN02M4), 2 samples in Lam Dong (VN02S5; VN03S9,VN03M9), 1 sample in Binh Duong (VN02S6, VN02M6) and 2 samples in Ba Ria -Vung Tau (VN03S7, VN03M7; VN03S8, VN03M8)

There was genetic diversity among strains of PEDVs in different outbreaks inVietnam during 2009 - 2013, divided into 3 small branches in phylogenetic treefollowing sampling time-point in 2009/2010 and in 2011/2013 All 3 small branches

in Group I of phylogenetics (gene S and M) of Vietnamese PEDV strains hadnucleotide homology with each other and ranged from 99.2 to 99.9%, and they hadvery close relationship with strain JS-2004-2 / and DX (China) and strain 07NP01(Thailand)

MỤC LỤC

Trang

Tóm tắt ii

Summary iii

Danh sách chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình viii

Chương 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2.Yêu cầu của đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Dịch tiêu chảy cấp trên heo (PED) 3

2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh PED 3

2.1.2 Tác hại của bệnh PED 4

2.1.3 Căn bệnh PEDV 4

2.1.4 Dịch tễ học của PED 5

2.1.5 Triệu chứng của bệnh PED 6

2.1.6 Bệnh tích của bệnh PED 6

2.1.7 Các phương pháp chẩn đoán 7

2.1.8 Những biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh PED 8

2.2 Kỹ thuật chẩn đoán PEDV bởi RT-PCR và giải trình tự 9

2.2.1 Kỹ thuật RT-PCR 9

2.2.2 Giải trình tự 10

2.2.3 Xác định đặc trưng kiểu gene và cây sinh dòng 11

2.3 Một số công trình nghiên cứu liên quan tới PEDV 11

Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 13

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 13

3.2 Vật liệu nghiên cứu 13

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

3.2.2 Dụng cụ 13

3.2.3 Thiết bị 13

3.2.4 Hóa chất 14

3.3 Phương pháp tiến hành 15

3.3.1 Xác định mẫu dương tính với PEDV trên heo tiêu chảy cấp bằng RT-PCR 15

3.3.2 Xác định đặc trưng kiểu gene S và M ở Việt Nam năm 2011-2013 17

3.3.3 So sánh đa dạng kiểu gene PEDV phân lập với Việt Nam và Thế giới 17

Chương 4 Kết quả và thảo luận 20

4.1
Kết quả xác định mẫu dương tính với PEDV bằng kỹ thuật RT-PCR 20

4.2 Đặc trưng kiểu gene S và M của PEDV qua giải trình tự 21

4.2.1
Đặc trưng kiểu gene S và gene M của PEDV Việt Nam năm 2009-2013 21

4.2.2 Đặc trưng kiểu gene S và gene M của PEDV Việt Nam với Thế giới 23

4.3 Mối liên hệ dịch tễ phân tử của các chủng PEDV phân lập được 25

Chương 5 Kết luận và đề nghị 30

5.1 Kết luận 30

5.2 Đề nghị 30

Tài liệu tham khảo 31

Phụ lục 35

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylene diamine tetra acetate

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

Nested-RT-PCR Nested-reverse-transcriptase polymerase chain reaction

PED Porcine epidemic diarrhea (dịch tiêu chảy cấp trên heo)PEDV Porcine epidemic diarrhea virus

TGEV Transmissible gastroenteritis virus

Taq Taq polymerase

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Hóa chất tách chiết RNA 14

Bảng 3.2 Hóa chất dùng trong điện di 14

Bảng 3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR 14

Bảng 3.4 Các đoạn mồi cho phản ứng RT-PCR để chẩn đoán PEDV 14

Bảng 3 5 Mẫu PEDV phân lập ở Việt Nam 15

Bảng 3.6 Thành phần hóa chất cho phản ứng RT-PCR 16

Bảng 3.7 Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR một bước (one - step RT-PCR) 17

Bảng 3.8 Các chủng PEDV được giải trình tự trên đoạn gene S và gene M 18

Bảng 3.9 Các chủng PEDV tham khảo Việt Nam và Thế giới trên gene M 19

Bảng 3.10 Các chủng PEDV tham khảo Việt Nam và Thế giới trên gene S 19

Bảng 4.1 Tỉ lệ (%) dương tính với PEDV thu được năm 2013 20

Bảng 4.2 Sự tương đồng giữa các chủng PEDV Việt Nam 2009 - 2013 21

Bảng 4.3 Sự tương đồng và khoảng cách di truyền trên gene S 22

Bảng 4.4 Sự tương đồng giữa các chủng PEDV Việt Nam trên gene M 22

Bảng 4.5 Sự tương đồng và khoảng cách di truyền trên gene M 23

Bảng 4.6 Sự tương đồng trên gene S của các chủng PEDV 23

Bảng 4.7 Sự tương đồng và khoảng cách di truyền trên đoạn gene S 24

Bảng 4.8 Độ tương đồng trên gene M của các chủng PEDV 24

Bảng 4.9 Sự tương đồng và khoảng cách di truyền trên đoạn gene M 24

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc của Coronavirus 5

Hình 4.1 Kết quả điện di trên gene S sau khi chạy phản ứng RT-PCR 21 Hình 4.2 Cây sinh dòng trên gene S các chủng PEDV ở Việt Nam với các chủng trên

thế giới .26

Hình 4.3 Cây sinh dòng trên gene M các chủng PEDV ở Việt Nam với các chủng trên

thế giới 29

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm qua, ngành chăn nuôi heo đứng trước rất nhiều khó khăn dodịch bệnh liên tiếp xảy ra Trong đó, bệnh tiêu chảy trên heo con, do nhiều nguyênnhân khác nhau gây ra như thay đổi thức ăn từ sữa mẹ sang thức ăn tập ăn, sức đềkháng với bệnh tật yếu, điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng không đảm bảo vệ sinh đã dẫn

đến nhiễm trùng các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn (Escherichia coli, Samolnella

ssp.) hay do một số loại vi-rút như Rotavirus, Transmissible gastroenteritis virus(TGEV), Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)

Bệnh tiêu chảy cấp trên heo con gây thiệt hại nặng nếu không có biện phápngăn ngừa hữu hiệu hay khi bệnh phát triển thành dịch Bệnh này gây chết gần như100% trên heo dưới 7 ngày tuổi (Puranaveja và ctv, 2009) Bệnh đã xảy ra ở nhiềunước trên thế giới như Châu Âu, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Thái Lan,… ỞViệt Nam, dịch tiêu chảy cấp là bệnh mới nổi trong thời gian gần đây (năm 2008).Theo Quyết định số 70/2009/QĐ-UBND do Ủy ban nhân dân TP Hồ Chí Minh banhành đã đề ra nhiệm vụ tầm soát một số bệnh mới trên vật nuôi trong đó có PED (dịchtiêu chảy cấp) trên heo (Chương trình giám sát dịch tễ gia súc gia cầm trên địa bànthành phố Hồ Chí Minh từ 2010 - 2020) Một số tỉnh như Đồng Nai, Bình Dương,

Bà Rịa - Vũng Tàu, nơi có ngành chăn nuôi l ớn nhất cả nước, cũng đang nằm trongvùng hoành hành của dịch tiêu chảy cấp trên heo trong thời gian vừa qua (Trịnh ThịThanh Huyền và ctv, 2011)

Trước những vấn đề thực tế trên, đề tài nghiên cứu: “Đặc trưng kiểu gene S vàgene M của Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) gây bệnh tiêu chảy cấp trên heotrong giai đoạn 2011 - 2013” được tiến hành

1.2 Yêu cầu của đề tài

Xác định đặc trưng kiểu gene và sự đa dạng di truyền gene S và gene M củaPEDV phân lập thực địa qua các năm xảy ra ổ dịch khác nhau ở Việt Nam năm

2011 - 2013

1.3 Nội dung thực hiện

Xác định mẫu dương tính với PEDV trên heo tiêu chảy cấp bằng kỹ thuậtRT-PCR

Xác định đặc trưng kiểu gene của chủng PEDV phân lập năm 2011 - 2013 quagiải trình tự gene S và M

So sánh đa dạng kiểu gene giữa các chủng PEDV phân lập được với các chủngphân lập trước ở Việt Nam và trên thế giới

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Dịch tiêu chảy cấp trên heo (PED)

2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh PED

Năm 1971, các ổ dịch tiêu chảy cấp trên heo đã nổ ra đầu tiên ở Anh quốc vớitriệu chứng lâm sàng tương tự bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm TGE(Transmissible gastroenteritis) (Oldham và ctv, 1972) Khi đó, người ta đã chẩn đoánrằng nghi ngờ có một loại tác nhân vi-rút khác Sau đó, bệnh đã lan rộng ra nhiều nướckhác ở Châu Âu như Đức, Bỉ, Hungary,… Vào thời điểm này dịch bệnh được gọi vớicái tên “Dịch tiêu chảy do vi-rút” (Epidemic viral diarhea - EDV)

Năm 1976, một lần nữa những đợt dịch tiêu chảy cấp có triệu chứng tương tựnhư TGE xảy ra trên heo mọi lứa tuổi và lần này người ta cũng đã loại trừ khả năngnhiễm bởi TGEV và các tác nhân gây bệnh đường ruột quen thuộc khác (Wood, 1977).Các nhà khoa học đã gọi là EDV Type 2 để phân biệt với trận dịch xảy ra năm 1971

Cho đến năm 1978, Pensaert và DeBouck đã xác định được tác nhân vi-rút gây

ra các đợt dịch có triệu chứng giống TGE nói trên cũng là một loại Coronavirus Năm

1980, DeBouck và Pensaent đã tiến hành gây nhiễm chủng vi-rút phân lập được (kíhiệu CV777) trên heo con để nghiên cứu đặc tính gây bệnh đường ruột trên heo con và

heo vỗ béo Nhóm tác giả này đã phát hiện ra rằng loại Coronavirus này đã gây ra

những ổ dịch EDV type 1 và EDV type 2 những năm trước đó Sau đó, cái tên “dịchtiêu chảy trên heo” (Porcine epidemic diarrhea - PED) đã được đề xuất (Pensaent vàctv, 1982) và được sử dụng cho đến ngày nay Tiếp theo, các cuộc điều tra về huyếtthanh trên diện rộng để tầm soát sự hiện diện của PEDV và đã phát hiện huyết thanhdương tính tại nhiều quốc gia Châu Âu (Anh, Đức, Pháp, Bỉ, Hà Lan, Bungary) ỞNhật, bệnh này xuất hiện đầu tiên vào những năm 1982 - 1983 (Takahashi và ctv,1983) Còn ở Hàn Quốc dịch bệnh đã xảy ra năm 1993 (Kwon và ctv, 1993)

Puranaveja và ctv (2009) đã xác định, dịch bệnh do PEDV xảy ra trở lại vàocuối năm 2007 tại Thái Lan Dịch bệnh làm chết 100% heo con sơ sinh và ảnh hưởngtrên heo ở mọi lứa tuổi Triệu chứng ghi nhận tùy vào tuổi của heo nhiễm, đối với heođực và heo nái thường bình phục sau một tuần Tác giả đã tiến hành giải trình tự trên

33 mẫu dương tính với RT-PCR, phân tích trên ngân hàng gene và rút ra kết luận rằng

chủng PEDV nhiễm ở Thái Lan có nguồn gốc di truyền nhiễm từ chủng PEDV phânlập được ở Trung Quốc năm 2004.

2.1.2 Tác hại của bệnh PED

PED rất nguy hiểm vì tỉ lệ tử vong cao ở heo sơ sinh, không có thuốc đặc trị vàhiện tại chưa có biện pháp hữu hiệu ngăn chặn vi-rút xâm nhập vào trại chăn nuôi

Ở Châu Âu, đại dịch tiêu chảy do PEDV những năm 1970 đã gây thiệt hại kinh

tế rất lớn Heo con dưới 2 tuần tuổi chết 100% Dịch bệnh lúc đầu từ nước Anh sau đólan sang Bỉ, Đức, Tây Ban Nha, Hungary

Ở Châu Á, những năm gần đây, nhiều ổ dịch PED trầm trọng với tỉ lệ chết cao

đã được ghi nhận Cuối năm 1996, một ổ dịch PED đã nổ ra trên 108 trại heo từ sơsinh đến xuất chuồng ở Nhật Bản Cũng ở Nhật Bản, những ổ dịch xảy ra từ tháng 9năm 1993 đến tháng 6 tháng 1994 đã đư ợc ghi nhận, với 14000 con chết, tỉ lệ chết vàokhoảng 30 - 80% trên heo con theo mẹ (Sueyoshi và ctv, 1995)

Ở Hàn Quốc, PEDV cũng đã gây ra những ổ dịch tiêu chảy trên heo mọi lứatuổi Trong 71 mẫu ruột viêm được gửi đi xét nghiệm PEDV ở Viện nghiên cứu Thú y

từ tháng 1 năm 1992 đến tháng 12 năm 1993 đã xác định được 56,3% mẫu dương tínhvới PEDV Bệnh xảy ra trên toàn quốc (Hàn Quốc) và 90% những ổ dịch được pháthiện trên heo nhỏ hơn 10 ngày tuổi Một nghiên cứu khác về huyết thanh ở Hàn Quốcđược thực hiện với 469 mẫu huyết thanh được lấy từ những heo được giết mổ ở 7 tỉnhcho thấy có 45% heo có kháng thể PEDV trong tổng số heo xét nghiệm Kết quả chothấy vi-rút đã trở thành dịch địa phương ở quốc gia này (Kweon và ctv, 1993)

2.1.3 Căn bệnh PEDV

Hình thái học và cấu trúc vi-rút PED

PEDV là một vi-rút RNA chuỗi đơn, có vỏ bọc bên ngoài PEDV có hình thái

chung của họ Coronavirus Chúng có nhiều hình dạng khác nhau, nhưng nhìn chung là

có hình cầu (Hình 2.1), đường kính từ 95 - 190 nm, bề mặt có tua gai hình trụ dàikhoảng 20 nm (Siddell và ctv, 1993)

Thành phần ribonucleoprotein (RNP) nội bào của vi-rút này có thể quan sátđược ở dạng hình sợi, đường kính từ 1 - 2 nm, hay tụ lại dạng xoắn với đường kínhrất đa dạng, thông thường 10 - 20 nm Sau khi vi-rút bị phá vỡ, nucleocapsid có tỉtrọng đối với đường sucrose là 1,27 - 1,28 g/ml (Siddell và ctv, 1983)

Hình 2.1 Cấu trúc của Coronavirus

(Swiss Instute of Bioinformatics, ViralZone 2011).

Trong đó, hai protein được quan tâm là protein S có chức năng gắn với thụ thể

tế bào chủ và protein M tham gia vào quá trình “tự ráp” của vi-rút Cơ chế gây bệnhcủa PEDV bắt đầu với sự bám của protein S vi-rút lên thụ thể aminopeptidase N trên

bề mặt các tế bào nhung mao ruột dẫn đến sự phá hủy biểu mô của tế bào nhung mao.Điều này sẽ làm biến đổi quá trình tiêu hóa, vận chuyển tế bào và hấp thụ chất dinhdưỡng ở heo con, dẫn đến tình trạng heo bị tiêu chảy (Nguyễn Thị Hoàng, 2011)

Đặc tính hóa lý và sức đề kháng

PEDV nhạy cảm với ether và chloroform, PEDV ổn định ở pH = 4 - 7 ở 40C

và pH = 6,5 - 7,5 ở 370C PEDV chịu đựng được sự gia nhiệt đến 500C trong 180 phútnhưng bất hoạt khi gia nhiệt ở 60 - 800C trong 30 phút (Lee và Yeo, 2003) PEDV bịbất hoạt nhanh bởi hầu hết các chất sát trùng như cresol, NaOH 2%, formalin 1%(Siddell và ctv, 1993)

2.1.4 Dịch tễ học của PED

Heo là kí chủ chính của PEDV Chúng xâm nhập chủ yếu qua đường tiêu hóa.Lây truyền do tiếp xúc trực tiếp với những heo bị bệnh hoặc do tiếp xúc với nhữngdụng cụ bị nhiễm (giày, ủng, công nhân, vận chuyển, mua bán,…) PEDV hiện diệnnhiều trong ruột non heo nhiễm (tá - không - hồi tràng), hạch màng treo ruột vàphân Vi-rút tấn công vật chủ qua các tế bào nhung mao ruột nên gây cản trở sự hấpthu nước và khoáng chất, đồng thời kích thích tiết dịch ở nhung mao gây tiêu chảy,mất nước và chất điện giải trầm trọng (Ducatelle và ctv, 1982)

Bệnh tiêu chảy do PEDV gây ra đã diễn ra ở nhiều quốc gia, gây hậu quảnghiêm trọng lên nền kinh tế của các nước Do vậy, ngày càng có nhiều công trìnhnghiên cứu về PEDV được công bố, đã bổ sung nhiều vào kho dữ liệu về bệnh doPEDV gây ra PEDV xuất hiện đầu tiên ở các nước Châu Âu như Anh, Pháp, Tây BanNha,… và lây sang một số nước ở Châu Á như Hàn Quốc, Nhật, Trung Quốc (Song vàctv, 2007), Thái Lan (Puranaveja và ctv, 2009), Việt Nam (Đỗ Tiến Duy và ctv, 2011).

Ở Châu Âu, các chủng phân lập từ các quốc gia khác nhau đều bắt nguồn từchủng CV777 có nguồn gốc từ Anh (Egberink và ctv, 1988) Trong đó, có cả chủngBr1/87 cũng bắt nguồn từ chủng CV777 (Bridgene và ctv, 1993) Ở Hàn Quốc, theocông bố của Park và ctv (2007) dòng DR13 (phân lập năm 2006) có độ tương đồng vàquan hệ gần nhất với CV777, riêng chủng Spk1 (phân lập năm 2005) và Chinju99(phân lập năm 2003) có quan hệ gần nhất với JS-2004-2 (Trung Quốc)

2.1.5 Triệu chứng của bệnh PED

Biểu hiện lâm sàng chính của bệnh là tiêu chảy nhiều nước, phân tiêu chảy chứanhiều nước, không có máu hoặc chất nhầy, có những cụm bông phủ lên trên và có mùitanh đặc trưng Những đàn heo giống thường nhạy cảm với PEDV Triệu chứng chínhtrên heo còn bú bị nhiễm PEDV là ói mửa, tiêu chảy nhiều nước, mất cân nặng, gầysút nhanh, bỏ bú, thường nằm chồng lên nhau sau đó heo bệnh sẽ bị rối loạn chuyểnhóa acid, dẫn đến hôn mê và tỉ lệ tử vong khoảng 58 - 80% (Pensaert và ctv, 1982).Triệu chứng điển hình trên heo cai sữa, heo choai và heo nuôi vỗ béo là tiêu chảy,biếng ăn, suy nhược với tỉ lệ bệnh cao, nhưng tỉ lệ chết thấp (1 - 3%) Trên heo nuôi vỗbéo, có mối liên hệ giữa bệnh PED với stress gây tỉ lệ tử vong cao đối với những trạinhạy cảm với stress Ở những vùng bệnh trở thành bệnh địa phương, PEDV có thể gâytiêu chảy dai dẳng cho những heo con vừa mới cai sữa (Pensaert và ctv, 1982)

2.1.6 Bệnh tích của bệnh PED

Đại thể: Heo gầy còm Dạ dày trống do ói mửa hoặc có sữa đông đặc, ruột non

chứa dịch, thành ruột mỏng Những chất trong ruột thường kết thành cụm Hoại tử cơlưng cấp tính thường thấy trên heo trưởng thành hoặc xuất chuồng

Vi thể: Có nhiều không bào trong tế bào chất của tế bào biểu mô đường tiêu

hóa Nhung mao kết dưỡng lại ngắn hay biến mất Sau đó các tế bào biểu mô trở nêndẹt, mất chức năng và bị bong tróc đi vào trong xoang ruột (Ducatelle và ctv, 1982)

2.1.7 Các phương pháp chẩn đoán

Hiện nay có nhiều phương pháp dùng để chẩn đoán trực tiếp vi-rút (RT-PCR,nested RT-PCR,…) hay gián tiếp qua kháng thể Mỗi phương pháp có những ưu nhượcđiểm và tùy vào mục đích nghiên cứu mà chọn phương pháp thích hợp

Phương pháp FAT (kháng thể huỳnh quang) cho kết quả nhanh, độ nhạy và tínhđặc hiệu tương đối tốt Tuy nhiên, do yêu cầu nghiêm ngặt về tình trạng mẫu như: mẫuphải được lấy ở heo dưới 4 tuần tuổi, heo vừa bị nhiễm (trong khoảng 24 - 28 giờ),mẫu phải tươi và được bảo quản đúng cách

Đối với Coronavirus, việc nuôi cấy phân lập gặp nhiều khó khăn và mất nhiều

thời gian do chúng khó phát triển trên môi trường nuôi cấy tế bào tế bào một lớp Phânlập vi-rút trực tiếp từ ruột non heo mắc bệnh, không phân lập vi-rút trên phân cũngnhư xác thú

Kỹ thuật ELISA là kỹ thuật đơn giản, xác định nhanh tác nhân gây bệnh thôngqua việc phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên vi-rút hoặc kháng thể sinh ra khinhiễm vi-rút Một số công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp ELISA để xétnghiệm hiệu quả trên tác nhân tiêu chảy cấp đã được tiến hành bởi Carman và ctv,2001; Guscetti và ctv, 1995

Trong phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử (EM: electron microscopy),các mẫu phải trải qua các quá trình xử lý, rồi nhuộm trước khi quan sát dưới kính hiển

vi điện tử Phương pháp này được xem là phương pháp chẩn đoán PEDV bởi vì có thểxác định hình thái của PEDV trong mô ruột nhiễm bệnh Một số nghiên cứu đã sửdụng phương pháp EM để quán sát, phát hiện và nghiên cứu các tác nhân gây tiêu chảycấp trên heo

Phương pháp hóa mô miễn dịch là phương pháp được cải tiến dựa trên nguyêntắc của phương pháp miễn dịch huỳnh quang, cũng dùng để phát hiện kháng nguyênPEDV tại mô ruột nhiễm Phương pháp ISH có nhiều ưu điểm hơn so với IHC như chiphí thấp, độ nhạy cao Mục đích của phương pháp này là việc xác định đoạnnucleotide đặc trưng trên bộ gene của tác nhân gây bệnh, dựa vào sự bắt cặp của cácnucleotide của đoạn gene mục tiêu với đoạn nucleotide được đánh dấu

Kỹ thuật PCR đã được phát triển và được sử dụng từ rất lâu để chẩn đoán visinh vật Đối với vi-rút RNA, để ứng dụng kỹ thuật PCR cần phải trải qua bước tổng

hợp cDNA trước khi thực hiện phản ứng PCR cơ bản Vì quá trình phân lập vi-rút rấtkhó khăn và tốn nhiền thời gian, nên kỹ thuật RT-PCR được xem là phương pháp ưuviệt để chẩn đoán vi-rút gây bệnh tiêu chảy cấp trên heo, nhờ độ nhạy và độ đặc hiệucao Kỹ thuật RT-PCR cũng yêu c ầu vào quá trình lấy mẫu chính xác, xử lý mẫu cũngnhư thao tác thực hiện hợp lý Để tăng độ nhạy của phản ứng RT-PCR cho những mẫuchứa RNA số lượng ít người ta dùng nested-RT PCR (RT-nPCR) khuếch đại 2 lầngiúp phát hiện lượng mẫu rất nhỏ với độ đặc hiệu cao Đây là đặc điểm nổi trội củaphương pháp này và do đó phương pháp này hoàn toàn phù hợp để dùng trong cácnghiên cứu dịch tễ.

2.1.8 Những biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh PED

Để phòng sự xâm nhập của vi-rút vào đàn heo phải lưu ý heo nhiễm bệnh ở thời

kỳ nung bệnh đang thải trùng hoặc mang trùng là nguồn reo rắc mầm bệnh Nếu không

có điều kiện xét nghiệm heo mới mua về thì phải cách ly theo dõi 3 tuần lễ mới đượcđưa vào trại Ngăn cản sự lây lan vi-rút bằng con đường cơ học hoặc động vật trunggian truyền bệnh Người vào tham quan trại cần phải đi giày sạch, ủng sạch do trạicung cấp để tránh sự lây lan (Pensaert và Yeo, 2006)

Để cắt đứt vòng truyền lây bệnh phải loại bỏ những heo nhiễm bệnh, không liêntiếp nhập heo vào trại, điều chỉnh lịch sinh sản của heo nái cho phù hợp, chia nhỏ cácđàn nái đẻ hoặc nuôi con thành từng nhóm để thực hiện tốt việc cùng xuất, cùng nhập(Kweon và ctv, 1993)

Trên thực tế, phòng bệnh này bằng cách tạo miễn dịch đây là việc mà ngườichăn nuôi áp dụng Để phòng bệnh cho heo con, người ta cho heo nái mang thai ănchất chứa hay ruột non của những heo con mắc tiêu chảy cấp (hoặc băm nhuyễn cả conheo con cho heo nái ăn) Cách này tạo được miễn dịch chủ động cho heo mẹ và thôngqua sữa mẹ tạo được miễn dịch thụ động cho heo con, giảm được số heo con mẫn cảmvới bệnh Tuy nhiên, phương pháp này cũng có thể tiền nguy cơ làm heo nái trở thànhvật mang trùng và liên tục bài thải vi-rút ra ngoài môi trường (Phạm Sỹ Lăng vàNguyễn Thiện, 2004)

Hiện nay, có một vài loại vaccine sử dụng để phòng bệnh, nhưng hiệu quảmang lại chưa hoàn hảo Trong điều trị, để làm giảm tỉ lệ tử vong của heo bệnh cầnthực hiện biện pháp chống mất nước và acidosis (nhiễm acid) Đối với heo bệnh từ 2 -

5 tuần tuổi trở lên nên dùng thuốc kháng khuẩn để điều trị đồng nhiễm hoặc kế phát

độ bắt cặp của mồi xuôi và mồi ngược không được quá cách biệt (Bùi Chí Bửu vàNguyễn Thị Lang, 2008)

Nguyên tắc tiến hành thiết kế mồi: đầu tiên phải xác định trình tự khuôn, thông

số của phản ứng PCR, các quy tắc chọn mồi; sau đó chọn trình tự thiết kế; kiểm tra lạibằng BLAST trên NCBI (webside: www.ncbi.nlm.nih.gov)

Hiện nay có rất nhiều phần mềm để thiết kế mồi cho các phản ứng PCR Trong

đó có 4 phần mềm: Primer3, PrimerQuest, PDA (Primer Design Assistant) vàDNAclub là thông dụng với độ tin cậy cao và được phép sử dụng miễn phí Mồi sửdụng trong phản ứng RT-PCR cũng được thiết kế tương tự

Phương pháp RT-PCR

Phương pháp PCR là một công cụ đã trở nên phổ biến trong sinh học phân tử,đem lại một cuộc cách mạng trong công nghệ di truyền học phân tử, đánh dấu mộtbước tiến cực kỳ quan trọng cũng như các khám phá trư ớc đây về enzyme cắt giới hạn

và phương pháp Southern blot

Phương pháp này kết hợp với phản ứng phiên mã ngược (nhờ vào đặc tính củaenzyme phiên mã ngược - Reverse transcriptase) tổng hợp cDNA bổ sung từ mẫuRNA với phản ứng khuếch đại mạch DNA nhờ bổ sung polymerase Khi thực hiệnphương pháp này, người nghiên cứu nên nắm vững các yếu tố ảnh hưởng để tối ưu hóaquy trình thực hiện

Có nhiều công trình sử dụng phương pháp RT-PCR để chẩn đoán và nghiên cứuđối với các tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp Ishikawa và ctv (1997) đã sử dụng kỹthuật RT-PCR để phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh PEDV trên mẫu bệnh đã đượcthu từ heo bị nhiễm bệnh Năm 1999, Kubota và ctv đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR đểchẩn đoán tác nhân gây bệnh PED Trong thí nghiệm của mình, Kubota và ctv đã thiết

kế mồi trên đoạn gene mã hóa protein nucleocapsid (N) để khuếch đại đoạn gene cókích thước 540bp

Năm 2001, Kim và ctv đã ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định sự khác biệtgiữa tác nhân TGEV và PEDV gây bệnh trên heo nuôi Năm 2006, Song và ctv đãnghiên cứu sử dụng RT-PCR để chẩn đoán PEDV Nhóm tác giả đã sử dụng mồi thiết

kế trên đoạn gene S để khuếch đại đoạn gene có kích thước 651bp của PEDV Cùngnăm 2006, Song và ctv tiếp tục sử dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR để phát hiện cùngmột lúc ba tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp trên heo như PEDV, TGEV và porcineGAR (porcine group A rotavirus)

2.2.2 Giải trình tự

Nhờ các ưu điểm nội trội trong nghiên cứu sinh học phân tử mà kỹ thuật PCRnhanh chóng được áp dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh về vi-rút, vi khuẩn, nấm, kísinh trùng và cho kết quả chính xác Tiếp theo phản ứng PCR, sự phân tích thành phần

và trật tự nucleotide trên phân tử DNA bằng phương pháp PCR có ý nghĩa to l ớn trongcông tác phân loại các loài sinh vật cũng như d ịch tễ bệnh học Nhất là đối với cácbệnh mới phát sinh ở các vùng lãnh thổ người ta thường tiến hành giải trình tự để thiếtlập cây sinh dòng sau đó so sánh với các trình tự của các chủng khác được phân lập ởcác địa phương khác để tìm ra nguồn gốc bắt nguồn của tác nhân nghiên cứu

PEDV cũng đã đư ợc giải trình tự từ nhiều nghiên cứu ở nhiều quốc gia khácnhau trên thế giới trong nhiều năm trước để làm giàu thêm ngân hàng dữ liệu về ditruyền vi-rút này Năm 1993, Bridgene và ctv đã xác định trình tự gene tổng hợpnuclecapsid của PEDV đã phân lập được ở Châu Âu từ năm 1977 đến 1987, đoạn genenày có kích thước 1323bp Tiếp đến, năm 1994, Duarte và Laude đã giải trình tự củatoàn bộ gene S, đoạn gene này dài 4146bp

Hiện nay, người ta thường dùng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp đối với sản phẩmPCR Đây là một cải tiến quan trọng trong phân tích geneome Theo phương pháp này,

chúng ta có thể biết được đặc điểm của trình tự mà mình nghiên cứu một cách nhanhchóng, không cần phải xây dựng một thư viện “clone”, hoặc thanh lọc các “clone”(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2008).

2.2.3 Xác định đặc trưng kiểu gene và cây sinh dòng

Để tìm ra nguồn gốc bắt nguồn của tác nhân gây nhiễm người ta lập cây sinhdòng từ trình tự của tác nhân phát hiện được, sau đó so sánh với các trình tự của cácchủng khác được phân lập ở các địa phương khác Cây sinh dòng là công cụ thể hiệnmức độ tương đồng giữa các trình tự qua quá trình tiến hóa Có thể thiết lập cây sinhdòng từ kết quả so sánh các trình tự tương đồng thông qua hai phần mềm sinh họcLasergene v7.0 và MEGA v4.1

Năm 2001, Kocherhans và ctv đã công bố trình tự geneome của PEDV dòngCV777 Trình tự hoàn chỉnh của dòng vi-rút này dài 28033 nucleitide (bao gồm cả

đuôi polyA) Trên vùng bảo tồn ORF1 của họ Coronavirus dựa vào trình tự đã biết của các Coronavirus khác, tác giả thiết kế mồi để tìm những trình tự chưa biết trên ORF1 của PEDV Dựa vào phân tích sản phẩm khuếch đại gene của những Coronavirus

khác, 3 protease và 1 yếu tố tăng trưởng (growth factor) đã đư ợc tìm thấy trên ORF1a,

1 cấu trúc hình polymerase, 1 cấu hình có gắn ion kim loại, và một cấu trúc helicasetrên ORF1b So sánh trình tự amino acid của PEDV thì chúng có quan hệ gần nhất với

Coronavirus trên người (HcoV-229E0), sau đó là TGEV (Kocherhans và ctv, 2001).

2.3 Một số công trình nghiên cứu liên quan tới PEDV

Năm 1978, Pensaert và DeBouck đã quan sát mẫu ruột bằng kính hiển vi đãnhận thấy vi-rút gây tiêu chảy ở Châu Âu từ những năm trước đó là vi-rút thuộc họ

Coronaviridae và kí hiệu chủng là CV777.

Năm 1993, Bridgene và ctv đã xác định trình tự gene tổng hợp nuclecapsid củaPEDV (phân lập được ở Châu Âu năm 1977 và 1987) Nhóm tác giả nghiên cứu trênđoạn cDNA có kích thước dài 1,7 kb Kết quả xác định đoạn gene này có kích thước

1323bp và có mức độ tương đồng rất lớn với Coronavirus trên người 229E.

Năm 1994, Duarte và Laude đã giải trình tự gene S, là gene mã hóa protein gaigắn trên vỏ vi-rút (spike protein) Đoạn protein này trên PEDV dài 1382 acid aminchứa 29 vị trí glycosyl hóa liên kết nitrogene

Năm 1997, Ishikawa và ctv đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện nhanhPEDV có trong mẫu heo bị tiêu chảy Trong thí nghiệm, tác giả đã thiết kế primer trêngene mã hóa protein M của PEDV, cho phép khuếch đại một đoạn có kích thước854bp Kết quả đã phát hiện được PEDV trong 11 mẫu bệnh phẩm lấy từ các trại heo

bị dịch bệnh

Năm 1999, Kubota và ctv đã sử dụng kỹ thuật nested RT-PCR để phát hiệnPEDV trong các mẫu bệnh phẩm thu được từ các trại bị nhiễm bệnh ở Nhật Bản Đồngthời tác giả này cũng đã so sánh trình tự nucleotide của sản phẩm PCR của các dòngvi-rút ở Nhật Bản và Hàn Quốc Đoạn mồi được thiết kế đặc hiệu để khuếch đại mộtđoạn gene có kích thước 540bp nằm trên gene mã hóa protein N Kết quả đã phát hiệnđược PEDV ở 4 trong tổng số 11 mẫu bệnh phẩm Đồng thời kết quả khi so sánh trình

tự nucleotide cho thấy có sự đồng nhất về trình tự nucleotide của 1 dòng vi-rút tại HànQuốc với 2 dòng vi-rút tại Nhật Bản

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định mẫudương tính với PEDV gây tiêu chảy cấp trên heo qua 2 đoạn gene S và M Sau đó, giảitrình tự trên kết quả sản phẩm RT-PCR của gene S và gene M để xác định đặc trưngkiểu gene của các chủng phân lập năm 2011 - 2013 ở một số tỉnh miền Đông Nam Bộ

và so sánh đa dạng kiểu gene giữa các chủng PEDV phân lập được với các chủng phânlập trước ở Việt Nam và trên thế giới

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành

Đề tài được thực hiện từ 12/2012 đến ngày 06/2013

Mẫu được thu thập tại một số trại chăn nuôi xảy ra dịch tiêu chảy cấp ở một sốtrại heo nuôi theo hình thức bán công nghiệp ở các tỉnh thành Phía Nam

Kỹ thuật RT-PCR được thực hiện tại Bệnh viện Thú y, Khoa Chăn nuôi Thú y,Trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh để xác định mẫu dương tính với PEDV

và thu thập sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh sạch và gửi đi giải trình tự tại công ty Macrogene(Hàn Quốc)

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

Các chủng PEDV phân lập trên heo con theo mẹ bị tiêu chảy cấp ở một số trạichăn nuôi ở 7 tỉnh thành phía Nam (Đồng Nai, Bình Dương, Tây Ninh, Lâm Đồng, BàRịa - Vũng Tàu)

Máy luân nhiệt PCR Tủ lạnh sâu (-700C)

Tủ sấy

Hóa chất

Bảng 3.1 Hóa chất tách chiết RNA

Dung dịch đệm (Gồm:Tris-HCl, NaCl, SDS,

Dung dịch ngăn cản Dnase

Nuclease free water (Promega, Mỹ)

Bảng 3.2 Hóa chất dùng trong điện di

Nuclease free water (Promega, Mỹ)

Green master mix

AMV Reverse transcription (50
M)

Bảng 3.4 Các đoạn mồi cho phản ứng RT-PCR để chẩn đoán PEDV

sản phẩmS

PS1

forward 5’- TTCTGAGTCACGAACAGCCA -3’

651bpPS2

reverse 5’- CATATGCAGCCTGCTCTGAA -3’

M

PM1

forward 5’- CCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAAC -3’ 715bpPM2

reverse 5’- GTTTAGACTAAATGAAGCACTTTC -3’

Trong đó: Forward (mồi xuôi), reverse (mồi ngược).

Mồi được thiết kế cho sự bắt cặp đặc hiệu với PEDV qua kỹ thuật RT-PCR theonghiên cứu Park và ctv (2007), mô tả ở Bảng 3.4

Mẫu đối chứng dương là mẫu vaccine, mẫu đối chứng âm là nước (free waternuclease, Promega, Mỹ)

Bảng 3 5 Mẫu PEDV phân lập ở Việt Nam