CHỌN LỌC MÔI TRƢỜNG NHÂN SINH KHỐI NẤM Beauveria bassiana TẠO CHẾ PHẨM DẠNG BÀO TỬ VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA CHẾ PHẨM LÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI

HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CHỌN LỌC MÔI TRƯỜNG NHÂN SINH KHỐI NẤM Beauveria bassiana TẠO CHẾ PHẨM DẠNG BÀO TỬ VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA CHẾ PHẨM LÊN C

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHỌN LỌC MÔI TRƯỜNG NHÂN SINH KHỐI NẤM

Beauveria bassiana TẠO CHẾ PHẨM DẠNG BÀO TỬ

VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA CHẾ PHẨM

LÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI

Sinh viên thực hiện : PHAN CÔNG NHẬT

Tháng 01/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHỌN LỌC MÔI TRƯỜNG NHÂN SINH KHỐI NẤM

Beauveria bassiana TẠO CHẾ PHẨM DẠNG BÀO TỬ

VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰCCỦA CHẾ PHẨM

LÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI

ThS TRẦN THỊ VÂN PHAN CÔNG NHẬT

Niên khóa: 2011 – 2013

Tháng 01/2014

LỜI CẢM ƠN

Chân thành cảm ơn:

 Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ

nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường

 Xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến cô Th.s Trần Thị Vân đã hết lòng hướng dẫn em

trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

 Thành kính ghi ơn cha mẹ đã nuôi dưỡng, thương yêu và dạy dỗ con nên người

 Sau cùng, xin cảm ơn bạn Ưng Thị Mỹ Tiên và toàn thể các bạn trong lớp đã

động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2014

Phan Công Nhật

TÓM TẮT

Nấm côn trùng Beauveria bassiana có hiệu lực cao tiêu diệt nhiều loài côn

trùng và sâu bệnh hại cây trồng, chiếm vị trí quan trọng trong các chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh từ vi nấm góp phần giảm tỷ lệ kháng thuốc cũng như thiệt hại do ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái và đặc biệt là ảnh hưởng đến con người do các thuốc trừ sâu hóa học gây ra Để nâng cao hiệu quả ứng dụng của chế phẩm nấm cần đẩy mạnh thực hiện nhiềuthí nghiệm khảo sát và nghiên cứu trong việc sản suất chế phẩm để phòng trừ sâu hại cây trồng,đề tài“Chọn lọc môi trường nhân sinh khối nấm

Beauveria bassiana tạo chế phẩm dạng bào tử và đánh giá hiệu lực của chế phẩm lên

côn trùng gây hại”được thực hiện

Nội dung: chọn lọc môi trường bán rắn thích hợp cho nấm phát triển, theo dõi các điều kiện phát triển như: ẩm độ, nhiệt độ, thời gian phát triển cao nhất của bào tử

và thời gian sấy ảnh hướng đến chế phẩm Thử nghiệm hoạt lực gây chết lên sâu xanh bướm trắng và châu chấu trong nhà lưới

Kết quả: Đã chọn lọc ra được môi trường bán rắn nhân sinh khối thích hợpcho

nấm B bassiana là gạo (tấm) có bổ sung khoáng chất, nấm phát triển tốt ở ẩm độ 20%

và nhiệt độ là 27ºC, cũng như thời gian phát triển đạt hàm lượng bào tử cao sau 10 ngày cấy lên môi trường và nhiệt độ sấy ở 37ºC trong 48 giờ là đạt mật số bào tử tốt và thích hợp cho việc bảo quản

Hiệu lực gây chết của chế phẩm B bassiana lên sâu xanh bướm trắng là 70%

sau 15 ngày phun và đối với châu chấu là 65% sau 15 ngày phun với tỷ lệ mọc lại nấm 38,46% và 43% đối với sâu xanh bướm trắng

SUMMARY

Beauveria bassiana, a high effective insect fungus have killed many insects and

pests of crops, occupy an important position in the microorganisms pesticide preparations from fungal contribute to reduce the rate of drug resistance as well as damage due to environmental pollution, ecological imbalance and particularly affects people by chemical pesticides cause

To improve the efficiency application of fungal preparations should do promotion many experiments in the research and surveys about production preparations to prevent insects and crop pests,the thesis"Selective increase medium

Beauveria bassiana fungus biomass make spores produce and evaluate the

effectiveness of the products on harmful insects"is performed

Contents: Selective suitable semi-solid medium for fungal development and monitoring of development conditions such as humidity, temperature, the highest time

development of cell and drying timeaffects products Lethal potency testing to Pieris

rapaeand Caeliferain a greenhouse

Results: Selectedsemi-solid mediumincrease biomasssuitablyfor Beauveria

bassiana fungus is rice (broken grains of rice) supplemented with minerals, fungi grow

well in humidity 20% and temperature of 27ºC,as well as development time reachedhigh levels of spores after 10 days culture on the medium and the drying temperature at 37ºC in 48 hours to reach the density of spores is good and suitable for storage

Lethal effective of productB bassiana onPieris rapae was 70% after 15 spray days and Caelifera is 65% after 15spray days with the rate of fungus regrowth nearly 38.46 % and nearly 43% on Pieris rapae

Key words: Beauveria bassiana

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana 3

2.2 Đặc điểm hình thái 3

2.3 Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng 3

2.3.1 Độc tố 3

2.3.2 Cơ chế tác động 4

2.4 Triệu chứng của sâu nhiễm bệnh 4

2.5 Các yếu tố cơ bản ảnh hướng đến sự sinh trưởng và phát triến của B.bassiana 5

2.5.1 Ảnh hưởng của môi trường và phương pháp nuôi cấy 5

2.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ,ánh sáng độ thoáng khí và độ pH 6

3 Khái niệm các loài côn trùng dùng trong thí nghiệm 6

3.1 Sâu xanh bướm trắng (Pieri rapae) 6

3.2 Châu chấu (Caelifere) 7

4 Các nghiên cứu về nấm Beauveria bassiana 8

4.1 Các nghiên cứu ngoài nước 8

4.2 Các nghiên cứu trong nước 9

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 11

3.2 Vật liệu nghiên cứu 11

3.2.1 Chủng vi sinh vật 11

3.2.2 Môi trường nuôi cấy 11

3.3 Dụng cụ và thiết bị 11

3.3.1 Dụng cụ 11

3.3.2 Thiết bị 11

3.4 Phương pháp nghiên cứu 12

3.4.1 Khảo sát và chọn lọc môi trường bán rắn để nhân sinh khối nấm Beauveria bassiana 12

3.4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởngđến sự phát triển củaB Bassiana trên môi trường nhân sinh khối tốt nhất 13

3.5 Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana để phòng trừ côn trùng hại cây trồng 15

3.5.1 Đối với sâu xanh bướm trắng 15

3.5.2 Đối với châu chấu 16

3.6 Phương pháp pha loãng và đếm số lượng bào tử 16

3.6.1 Phương pháp pha loãng 16

3.6.2 Phương pháp đếm số lượng bào tử 17

3.6.3 Phương pháp tính toán 17

Chương 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19

4.1 Tuyển chọn nấm Beauveria bassiana được nuôi cấy 19

4.2 Khảo sát và chọn lọc môi trường bán rắn để nhân sinh khối nấm 19

4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm B bassiana trên môi trường nhân sinh khối tốt nhất 21

4.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm và nhiệt độ đến sự phát triển của B.bassiana 21

4.3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm đến sự phát triển của nấm B.bassiana 21

4.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển củaB bassiana 24

4.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của nấm B bassiana 26

4.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian sấy tới năng suất và chất lượng

của chế phẩm B bassiana 27

4.4 Các bước sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana 28

4.5 Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana để phòng trừ côn trùng hại cây trồng 29

4.5.1 Đánh giá hiệu lực trừ sâu xanh bướm trắng của chế phẩm 29

4.5.2 Đánh giá hiệu lực trừ châu chấu của chế phẩm 31

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Đề nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B.bassiana : Beauveria bassiana

CMA : Corn meal agar

PGA : Potato glucoza agar

SDA : Sabouraud’s dextrose agar

YPDA : Yeast extract potato dextrose agar PDA : Potato dextrose agar

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Nấm Beauveria bassiana ký sinh côn trùng 3

Hình 4.1 Đĩa nấm Beauveria bassiana sau 7 ngày nuôi bằng phương pháp cấy điểm và cấy trải 19

Hình 4.2 Sơ đồ biểu diễn sự khác biệt giữa các nghiệm thức 10 ngày sau cấy 21

Hình 4.3 Nấm Beauveria bassianaphát triển trên môi trường

bán rắn của các nghiệm thức sau 10 ngày nuôi cấy ở 27ºC theo loại nút bông 22

Hình 4.4 Nấm Beauveria bassianaphát triển trên môi trường bán rắn của các nghiệm thức sau 10 ngày nuôi cấy ở 27ºC theo loại nút bấm kim 22

Hình 4.5 Nấm Beauveria bassiana phát triển trên môi trường bán rắn với các lượng nước bổ sung khác nhau sau 14 ngày, ở nhiệt độ 27ºC 24

Hình 4.6 Nấm Beauveria bassiana phát triển trên môi trường bán rắn với các mức nhiệt độ khác nhau sau 14 ngày 26

Hình 4.7 Sơ đồ các bước sản xuất chế phẩm nấmB bassiana 28

Hình 4.8 Chế phẩm nấm B bassianadạng bột bào tử 29

Hình 4.9 Sâu xanh bướm trắng chết do chế phẩm nấm B.bassiana 31

Hình 4.10 Châu chấu chết do chế phẩm nấm B bassianasau 15 ngày 32

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là một nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm nên rất thuận tiện cho cây trồng phát triển Đồng thời với cây trồng phát triển là sâu bệnh hại cũng phát sinh, gây hại đáng kể đến năng suất Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật (BVTV), hàng năm các loại dịch hại, bệnh hại, đã làm giảm 35 – 40% tổng sản lượng, mặt khác làm giảm phẩm chất của nông sản Để bảo vệ cây trồng, mức chi phí cho công tác bảo vệ thực vật, phòng trừ dịch hại đã không ngừng tăng lên trong phạm vi toàn quốc Trong quá trình làm giảm thiệt hại do sâu, bệnh hại gây ra, người nông dân

đã sử dụng nhiều biện pháp phòng trừnhưcanh tác thủ công, luân canh, chuyên canh, chọn tạo giống mới, dùng thuốc hóa học Trong đó biện pháp sử dụng thuốc hóa học được xem là phổ biến vì dễ áp dụng, có hiệu quả ngay, kịp thời và hiệu quả cao mà giá thành lại rẻ Nhưng việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học gây ô nhiễm môi trường trầm trọng, để lại dư lượng chất hóa học trong nông sản, giảm số lượng sinh vật có ích, làm mất cân bằng sinh thái trong tự nhiên, làm tăng tính kháng thuốc của sâu

bệnh Do vậy, sử dụng thuốc hóa học chỉ là biện pháp tình thế

Hiện nay đời sống xã hội Việt Nam ngày càng phát triển, ý thức của người nông dân cũng được nâng cao, họ hiểu được các tác hại của thuốc hóa học và muốn có một loại thuốc mới diệt trừ sâu đạt hiệu quả cao mà không gây ra hậu quả xấu như thuốc hóa học Điều đó đòi hỏi các nhà khoa học cần phải nghiên cứu để thay thế thuốc hóa học bằng các loại thuốc khác theo hướng công nghệ sinh học Qua nghiên cứu, các nhà khoa học đã phát triển các loại vi nấm, vi khuẩn, vi rút có khả năng ký sinh gây bệnh trên nhiều loại sâu hại cây trồng đạt hiệu quả cao

Nhiều cơ quan khoa học đã và đang tiến hành nghiên cứu sản xuất các chế phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật (vi khuẩn, vi rút và vi nấm) Trong số các chế phẩm

đó, vi nấm được Viện Bảo vệ thực vật nghiên cứu từ những năm 1990 thế kỷ XX, đến nay mang lại kết quả cao trong việc bảo vệ cây trồng Chế phẩm thuốc trừ sâu vi nấm

có những ưu điểm là không độc hại với người và vật nuôi, không gây ô nhiễm môi trường, không làm mất đi nguồn sinh vật có ích trong tự nhiên Nấm ký sinh côn trùng chưa tạo ra tính kháng thuốc và có khả năng lây nhiễm trên nhiều loại sâu khác nhau,

ngoài ra nấm ký sinh côn trùng không chỉ tiêu diệt trực tiếp sâu hại vào thời kỳ phá hoại mà còn tích lũy trên đồng ruộng và lan truyền cho thế hệ sâu tiếp theo

NấmBeauveria bassiana (B.bassiana) được nghiên cứu phổ biến hiện nay vì lợi

ích lâu dài của nó Có nhiều công trình nghiên cứu đã lựa chọn được những chủng

giống mới, môi trường nuôi cấy thích hợp, cho sự phát triển của nấm B.bassiana

Để góp phần vào việc nhân nuôi tạo chế phẩm nấm Beauveria bassianadạng

bột, hướng tới thương mại hóa chế phẩm, đề tài“Chọn lọc môi trường nhân sinh

khối nấm Beauveria bassianatạo chế phẩm dạng bào tử và đánh giá hiệu lực của

chế phẩm lên côn trùng gây hại”được thực hiện

1.2 Yêu cầu

Tạo chế phẩm nấm Beauveria bassiana dạng bào tử dựa trên các cơ sở

nghiên cứu và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm B bassiana

Chọn lọc môi trường tốt nhất để nhân sinh khối nấm Beauveria bassiana

1.3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát và chọn lọc môi trường bán rắn để nhân sinh khối nấm

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana

trên môi nhân sinh khối tốt nhất

- Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của ẩm độ, nhiệt độ đến sự phát triển của nấm

- Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của nấm

- Thí nghiệm 3: Khảo sátảnh hưởng củathời gian sấy tới năng suất và chất lượng

của chế phẩm Beauveria bassiana

Đánh giá hiệu lực của chế phẩm lên côn trùng gây hại

Chương 2 TỒNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana

Lớp: Deuteromycetes

Bộ: Moniliales

Họ: Moniliaceae

Chi: Beauveria

Hình 2.1Nấm Beauveria bassiana ký sinh côn trùng

Giống Beauveria thường được chia thành 3 loài:Beauveria bassiana,Beauveria

erongniarti, Beauveria alba, trong đó 2 loài đầu là tác nhân gây bệnh côn trùng

(Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

2.2 Đặc điểm hình thái

Theo Phạm Thị Thùy (2004)Beauveria bassiana có màu trắng nên người Trung

Quốc và người Việt Nam gọi là nấm trắng hay nấm bạch cương Trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng, nấm bạch cương có sợi màu trắng đến màu kem có pha một ít màu đỏ, da cam, đôi khi pha một ít màu lục, có thể tiết vào môi trường sắc tố màu vàng, màu đỏ nhạt hoặc màu xanh da trời Sợi nấm phân nhánh có vách ngăn, sợi nấm dài khoảng 3-5µm phát triển dày đặc trên môi trường, về sau xuất hiện chi chít các cuống sinh bào tử Trên cơ thể tằm và các côn trùng khác, sợi nấm mọc nhanh và chẳng mấy chốc đã phủ kín trên bề mặt cơ thể, sợi nấm có dạng phấn trắng khi khô

chuyển thành màu vàng sữa Nấm Beauveria bassiana sinh ra những bào tử trần đơn

bào không màu, trong suốt không ngăn vách từ hình cầu (đường kính 1-4 µm) đến hình trứng (kích thước 1,5-5,5 µm) Tế bào sinh bào tử trần đơn hoặc trong vòng xoắn, phát sinh từ sợi sinh dưỡng mọc thành từng đám, có cuống phình ra Tế bào sinh bào tử trần có hình zíc zắc nhưng là mấu dạng răng nhỏ phát sinh bởi sự kéo dài của gốc ghép Phần gốc của tế bào sinh bào tử trần hình cầu hoặc hình chai (kích thước 2,5-3,5 x 3,0-6,0 µm), khi thời gian nuôi cấy kéo dài, trong môi trường những bào tử trần sinh ra sẽ mảnh và kết chặt hơn với nhau

2.3 Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng

2.3.1 Độc tố

Hamill và cs (1996) đã xác định được độc tố diệt côn trùng của nấm bạch

cương Beauveria bassiana và đặt tên cho độc tố này là Beauvericin Ovehinnokov và

cs (1971) đã tổng hợp lại độc tố này, tác giả Jame và cs (1971) đã xác định bản chất của độc tố sinh ra trong quá trình trao đổi chất đó là vòng peptid có các sắc tố màu vàng tenelin và basianin, những sắc tố này có thể do hydroxylat progesteron và những phần nhỏ tách ra từ testosteron (C19H28O2) sinh ra Về mặt hóa học, độc tố Beauvericin

có danh pháp là xyclo (N – metyl – L – phenylalanin – D –α- hydroxyizovaleryl)3 Đây

là một loại depxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng 93-94oC Từ một lít môi trường nuôi

cấy nấm Beauveria bassiana, các nhà khoa học Trung Quốc ở trường Đại học Tổng hợp Nam Khai (Thiên Tân) đã tách được 1,5g độc tố Beauvericin và từ 1 kg môi

trường đặc các tác giả đã tách ra được 3,8 g Beauvericin (Phạm Thị Thùy,2004)

2.3.2 Cơ chế tác động

Trong tự nhiên, khi bào tử nấm rơi vào cơ thể côn trùng gặp điều kiện thuận lợi, chỉ sau 12 – 24 giờ bào tử nấm nẩy mầm Chúng hình thành sợi nấm đâm xuyên qua lớp vỏ kitin và sau đó phát triển bên trong cơ thể côn trùng gây hại Côn trùng gây hại phải huy động hết các tế bào bạch huyết để chống lại nhưng nấm đã tiết ra độc tố

Beauvericin và các chất khác làm phá hủy tế bào bạch huyết Sợi nấm mọc rất nhiều

bên trong cơ thể làm cho cơ thể cứng lại, sau đó một thời gian nấm mọc ra ngoài, lớp bào tử phủ lên côn trùng gây hại.Khi lớp bào tử nấm bao phủ này được gió phân tán bay đến bám dính vào cơ thể côn trùng khác,lúc này cũng thực hiện cơ chế tác động

như trên (Phạm Thị Thùy,2004)

2.4 Triệu chứng của sâu nhiễm bệnh

Triệu chứng đặc trưng nhất là sự thay đổi về khả năng di động của côn trùng,

sự di động này tùy theo mức độ phát triển của bệnh Khi bị bệnh các mô dần dần bị phá hủy từng phần, lúc đầu côn trùng di động yếu sau đó ngừng hẳn nằm im một chỗ cho đến khi chết Khi bị bệnh nấm, vận động của côn trùng ngừng từ 2-3 ngày thậm chí một tuần trước khi nấm phát triển đầy bên trong thân côn trùng Chỉ những côn trùng bị thương hay bị bệnh nấm, màu sắc toàn thân mới thay đổi và xuất hiện những

vết đen Khi sâu hại bị bệnh do nấm Beauveria bassiana ở chỗ bào tử bám vào, nấm

phát triển vào bên trong thân sâu hại tạo nên một vệt đen không có hình thù nhất định Côn trùng chết do nấm thường có màu hồng, vàng nhạt, trắng và toàn thân cứng lại Khi bị bệnh nấm, thân côn trùng bị ngắn lại hoặc khô là do hệ thống tiêu hóa bị tổn

thương hoặc do thiếu thức ăn Vi sinh vật gây bệnh trên côn trùng thường tác động

đến những mô nhất định, côn trùng bị nấm Beauveria bassiana ký sinh thì tuyến mỡ

và các mô khác bị hòa tan do enzym lipaza và proteaza của nấm tiết ra, cũng chính nhờ đặc điểm đó mà người ta có thể xác định được côn trùng bị bệnh là do động vật

nguyên sinh hay là do nấm bậc thấp(Coelomycidium, Entomophthora) gây ra.Hiện

tượng chết hoặc gắn liền với hiện tượng tiêu hủy mô là đặc trưng của bệnh nấm, quá

trình này tiến triển qua hai giai đoạn(Phạm Thị Thùy,2004)

Giai đoạn chấn thương: Các mô tổn thương bị phá hoại là do nấm từ bên ngoài gây ra, trong trường hợp này các lympho máu đọng lại và mô tái sinh được tạo nên trên bề mặt phần thân côn trùng bị chấn thương

Giai đoạn nhiễm trùng máu:Côn trùng khi bị bệnh nấm là do lympho máu chứa đầy sợi nấm

2.5 Các yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của B bassiana

Điều kiện cần thiết cho quá trình hình thành bào tử cũng như hệ sợi nấm

Beauveria bassiana nói riêng và nấm côn trùng nói chung là nhiệt độ, ẩm độ, độ pH

trong môi trường, cũng như phương pháp nuôi cấy

2.5.1 Ảnh hưởng của môi trường và phương pháp nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển,nếu môi trường không tốt,nấm mọc yếu hoặc không mọc Trong quá trình nẩy

mầm để hình thành bào tử nấmBeauveria bassiana cần các nguồn Cacbon, Nitơ Sự

phát triển của nấm phụ thuộc vào các chất ức chế khác nhau

Môi trường thích hợp nhất cho nấm phát triển là môi trường có chứa kitin làm nguồn cacbon, nếu bổ sung thêm chất kitin và glucoza thì trong quá trình nuôi cấy,

nấm Beauveria bassiana sẽ thu được số lượng bào tử cao, bởi vì thành phần kitin

trong môitrường nuôi cấy là rất cần thiết đối với các loại nấm, nó giúp cho sự phát

triển và hình thành bào tử đính (Conidiospore) và bào tử trần (Blastospore) Tuy

nhiên không phải nguồn thức ăn chứa Cacbon và Nitơ nào cũng đều có lợi cho sự sinh

trưởng và phát triển cũng như sự nẩy mầm và hình thành bào tử của nấm B bassiana,

vì ngoài nguồn nitơ vô cơ ra nấm B bassiana còn sử dụng tốt nguồn hữu cơ như

protein, pepton, các axitamin trong đó có axit glutamic là axit thích hợp cho nấm phát triển Các nguyên tố vi lượng như C++

, Zn++ có tác dụng kích thích cho sự phát triển

của nấm.Tùy vào điều kiện nuôi cấy nấmB bassianamà chúng ta nghiên cứu để lựa

chọn môi trường thích hợp sao cho nấm phát triển tốt nhất (Phạm Thị Thùy, 2004)

2.5.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng, độ thoáng khí và độ pH

Nhiệt độ và ánh sáng là 2 yếu tố quan trọng quyết định đến sự phát triển của nấm Nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển trong phạm vi 25- 30oC

Nấm Beauveria bassiana phát triển tốt nhất trong điều kiện ánh sáng yếu, chỉ

cần một lượng ánh sáng nhỏ trong thời gian 6- 8 giờ cũng đủ cho nấm côn trùng phát triển

Hầu hết các loại nấm côn trùng thuộc loại hiếu khí, khi nấm phát triển chúng cần có hàm lượng oxi thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi cũng như trong cả biên độ rộng của không gian nuôi cấy, nếu phù hợp thì nấm sẽ phát triển tốt

Nấm côn trùng đòi hỏi hàm lượng nước thích hợp, nếu quá khô hoặc quá ướt thì nấm phát triển không tốt, tỷ lệ thích hợp là 30- 50% tùy theo điều kiện ẩm độ của không khí môi trường

Phạm vi nấm côn trùng sống ở độ pH từ 3,5- 8,0, song nấm côn trùng ưa môi trường axit và nấm phát triển thích hợp nhất ở độ pH từ 5,5– 6 (Phạm Thị Thùy, 1996)

3 Khái niệm về các loài côn trùng dùng trong thí nghiệm

3.1 Sâu xanh bướm trắng (Pieri rapae)

Sâu xanh bướm trắng là loài sâu hại chủ yếu trên các loại rau cải, xu hào,

sau xanh bướm trắng thuộc bộ cánh phấn Lepidoptera.Theo tác giả Phạm Thị

Nhất(1995), sâu xanh bướm trắng có một số đặc điểm sau

Vòng đời: ở nhiệt độ 17,4ºC và độ ẩm 78,5% vòng đời sâu kéo dài khoảng 30 ngày, còn ở nhiệt độ 29,3ºC và độ ẩm 79,1% thì vòng đời sâu xanh bướm trắng chỉ kéo dài 19,5 ngày

Đặc điểm hình thái: Bướm có thân dài từ 15- 20mm, cánh trước màu trắng xòe rộng từ 40- 50mm, trứng hình vỏ phích có nhiều khía dọc Sâu non có nhiều chấm đen, sâu đẫy sức dài 28- 35mm Nhộng màu xanh nhạt hơi vàng dài từ 18– 20mm, dính một đầu trên lá rau, hai bên sườn có những chấm đen thưa, giữa lưng nổi hẳn lên một đường như hình xương sống

Đặc điểm đời sống: Hằng năm sâu thường xuất hiện nhiều vào tháng 2 đến tháng 5, chúng gây hại chủ yếu trên nhóm rau họ thập tự (rau cải, su hào, cải

bắp) Bướm cái đẻ trứng rải rác từng quả trên lá rau, một bướm cái có thể đẻ 150 trứng Sau khi nở sâu non bắt đầu gặm nhấm lá xanh và chừa lại màng lá, từ tuổi

2 trở đi sâu cắn thủng lá làm lá bị khuyết

3.2 Châu chấu (Caelifera)

Phân bộ châu chấu là một phân bộ chứa các côn trùng ăn lá, với danh pháp

khoa học là Caelifera thuộc bộ cánh thẳng (Orthoptera) Trong tiếng Việt, thông

thường người ta phân biệt các loài bằng hai tên gọi phổ biến là châu chấu hay cào cào Tùy theo hình dáng bên ngoài của phần đầu tà bằng hay nhọn, nhưng đó không phải là một đặc điểm để phân loại trong khoa học và vì thế trong một đơn vị phân loại

cụ thể nào đó có thể có cả châu chấu lẫn cào cào

Đặc điểm:Châu chấu có các râu gần như luôn luôn ngắn hơn phần thân (đôi khi có nhiều sợi nhỏ), cũng như cơ quan đẻ trứng ngắn Nhiều loài phát tiếng kêu bằng cách cọ xát các xương đùi sau vào các cánh trước hay bụng, hoặc bằng cách bật tanh tách các cánh khi bay Các màng thính giác(nếu có) nằm ở các bên của đoạn bụng thứ nhất Các xương đùi sau thông thường dài và to khỏe, thích hợp để nhảy Nói chung, châu chấu có cánh, nhưng các cánh sau giống như màng, trong khi các cánh trước thì dài và không phù hợp để bay Châu chấu cái thường to hơn châu chấu đực, với cơ quan đẻ trứng ngắn

Đặc tính sinh sản: Hệ thống sinh sản của châu chấu bao gồm các tuyến sinh học, là các ống đưa các sản phẩm sinh dục ra bên ngoài, cùng các tuyến phụ trợ

Ở con đực, tinh hoàn bao gồm một số nang giữ khoang chứa tinh trùng khi chúng trưởng thành và tạo ra các tinh trùng thuôn dài Sau khi chúng được giải phóng

thành chùm thì các tinh trùng này tích lũy trong bọng (Vesicula semainalis).Ở con

cái, mỗi buồng trứng bao gồm vài ống trứng Các ống trứng này tụ lại trong hai vòi trứng nhỏ, chúng hợp lại thành một vòi trứng chung để chuyên chở các trứng

đã chín Mỗi ống trứng bao gồm một germanium (một khối các tế bào tạo ra noãn bào, tế bào nuôi dưỡng và các tế bào nang), cùng một loạt các nang Các tế bào nuôi dưỡng noãn bào trong các giai đoạn đầu của sự phát triển, còn các tế bào nang cung cấp vật liệu cho noãn hoàn và làm vỏ trứng (màng đệm)(Flook, 1997)

4 Các nghiên cứu về nấm Beauveria bassiana

4.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Cuối thế kỷ 19 ở Hoa Kỳ đã dùng nấm Beauveria bassiana để trừ một loại bọ xít cánh trắng Nấm Beauveria bassiana có trong đất ít hơn Metarhizium anisopliae trong 100 mẫu đất chỉ có 22 mẫu nấm Beauveria bassiana

Kumar và cs (1999) đã nghiên cứu sự nẩy mầm và xâm nhiễm của Beauveria

bassiana trên tằm Bombyx mori chủng NB18, nuôi ở 26± 1ºC, độ ẩm tương đối 80 ±

5% và chiếu sáng 16 giờ Tiến hành lây nhiễm ở giai đoạn tằm lột xác sang tuổi 5, liều lây nhiễm 1 x 106 bào tử nấm/ml Độc tính Beauveria bassiana chỉ 50 bào tử/ấu trùng,

đã đủ mạnh để gây chết 100% ấu trùng Bào tử nẩy mầm khoảng 8 giờ sau khi lây nhiễm, tạo thành một giác bám trong vòng 24 giờ và các sợi nấm xuyên vào lớp biểu

bì nhờ nấm có thể sản xuất enzym teolytic và lipolytic exocellula giúp cho việc giải thể lớp da của ấu trùng Các sợi nấm xâm nhập và trong vòng 48 giờ nấm tăng trưởng mạnh tạo thành một phức hợp sợi nấm, gây ra cái chết của ấu trùng trong khoảng 5 - 6 ngày Sợi nấm phát triển tạo một tấm thảm màu trắng nấm trên toàn bộ cơ thể ấu trùng trong 6- 7 ngày Sau khi vật chủ chết các sợi nấm di chuyển ra ngoài để bắt đầu giai đoạn bào tử Do đó, nấm hoàn thành vòng đời của nó trên ấu trùng tằm trong 7 - 8 ngày Nhiều lớp tinh thể khác nhau về hình dạng và kích thước đã được quan sát trên

da và xung quanh viền lỗ thở của ấu trùng Các tinh thể có thể là oxalat của amon và magie đã được tạo ra khi nấm nhiễm vào

Đối với nấm Nomuraea rileyi (Farlow), theo nghiên cứu của Kumarvà cs

(1997) các bào tử trưởng thành sẽ nẩy mầm trên da ấu trùng tằm sau 24 giờ và xâm nhập vào lớp biểu bì trong vòng 36 giờ sau khi lây nhiễm ở nhiệt độ 24 ± 1ºC và ẩm

độ 80 ± 5% Các sợi nấm nhân lên bắt đầu sinh sôi và hình thành vách ngăn trong khoang máu, ấu trùng không thể chống cự lại tác động sau 6- 7 ngày Các sợi nấm mọc dài ra và đan xen với nhau trong mô biểu bì 7- 8 ngày Nhiều đính bào tử xuất hiện tạo thành một lớp bột phấn trắng trên bề mặt ấu trùng 9- 10 ngày Bào tử nấm màu xanh nhạt phát triển, làm cho bề mặt ấu trùng có màu xanh nhạt Vòng đời của

nấm trên tằm dâu Bombyx mori được hoàn thành trong 10- 11 ngày

Kamp và Bidochka (2002) tiến hành đánh giá sự sản xuất bào tử của 3 loại nấm

ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Verticillium lecanii

được đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2 mm, 3 mm, 4 mm tương ứng với 10 ml, 15

ml, 20 ml) và các loại môi trường khác nhau (SDA, MEA, NA, CMA, YPDA, PDA)

cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria

bassiana là tốt nhất trên môi trường PDA ở độ sâu 2 mm, trong khi Verticillium lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên môi trường YPDA và độ sâu của môi trường thì

không đáng kể

Santa và cs (2005), tiến hành nghiên cứu “sản xuất bào tử Beauveria bassiana

từ chế phẩm công nông nghiệp” trong nồi lên men với điều kiện nuôi cấy được tối ứu hóa ở nhiệt độ nuôi cấy 26ºC, pH 6,0, mật độ 107

bào tử/gram và độ ẩm ban đầu 75% Trong điều kiện tối ưu có sục khí, bào tử tạo ra lớn nhất (1,07 x 1010 bào tử/gram) sau

10 ngày nuôi cấy

4.2 Các nghiên cứu trong nước

Từ giữa thập niên 1970, Trường Đại học Lâm Nghiệp Hà Hội bắt đầu nghiên

cứu nấmBeauveria bassianađể trừ sâu róm thông D punctatus, nhưng chưa đưa được

chế phẩm nào vào ứng dụng trong sản xuất

Phạm Thị Thùy và cs (1991- 1995) cho rằngnguồn nấm Beauveria ở nước ta khá phong phú Chế phẩm nấm Beauveria bassiana được sản xuất bằng phương pháp

lên men xốp, sinh khối nấm đạt 5 x108 bào tử/gram, thời gian thu hoạch nấm tốt nhất theo phương pháp này là 10 ngày, chế phẩm được làm khô ở nhiệt độ 45ºC trong 8 giờ

và có thể được bảo quản trong 6 tháng Khi thí nghiệm phương pháp lên men chìm có sục khí trong nồi lên men 5 lít chứa môi trường có pepton, cao nấm men và muối khoáng thì sau 48 giờ ở 30ºC bào tử nấm đạt 8,5 x109

bào tử/gram Hiệu quả sử dụng tốt nhất của chế phẩm là trên rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đậu, châu chấu sống lưng vàng với nồng độ sử dụng là 5- 6 x108 bào tử/ml Hiệu lực của thuốc nấm phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ và ẩm độ

Phạm Thị Thùy và cs (1996), tiến hành thí nghiệm trong nhà lưới với hai chế

phẩm Beauveria và Metarhizium Với nồng độ dưới 200 triệu bào tử/ml cho hiệu quả

thấp đối với rầy non tuổi 3 của rầy nâu Ở nồng độ 500 triệu bào tử/ml các nấm thí nghiệm cho hiệu quả đối với rầy non tuổi 3 của rầy nâu đạt 72 – 75% Nồng độ cao hơn 600 – 650 triệu bào tử/ml, hiệu lực của hai loại nấm đều đạt từ 65- 80% Trên cơ

sở kết quả thí nghiệm trong nhà lưới, đã tiến hành ở viện BVTV, tỉnh Tiền Giang, Hà Nam, Bà Rịa- Vũng Tàu Diện tích thí nghiệm thay đổi từ 100 m2 đến 5000 m2 Kết quả cho thấy sau 10 ngày phun chế phẩm, ở các thí nghiệm, hiệu lực đối với rầy nâu

của nấm Beauveria, Metarhizium đạt 47,5 – 69,9 và 20,6 – 79,5% Hiệu lực này kéo

dài đến ngày thứ 15 sau phun nấm

Nguyễn Thị Lộc (2000), sản xuất chế phẩm trừ sâu sinh học từ nấm trắng

Beauveria basiana ở dạng bột thấm nước cho chất lượng tốt, số lượng bào tử cao (1,5

– 2,0 x1010

bào tử/gram) Nấm có hiệu lực ổn định với sâu hại sau 8 tháng bảo quản ở nhiệt độ và ẩm độ thường, có hiệu lực bền lâu và kéo dài 3- 4 tuần sau khi phun Các thí nghiệm trong nhiều vụ ở nhà lưới và thực nghiệm trên diện rộng cho kết quả diệt trừ rầy đạt từ 65- 87% sau khi phun từ 5 - 7 ngày, diệt trừ bọ xít hại cây trồng là 69- 87% sau khi phun 5- 7ngày

Theo Viện sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, các loài nấm có hiệu lực diệt sâu cao có thể mất dần tính độc trong quá trình nuôi cấy Sử dụng phương pháp tách tế bào đơn từ sâu nhiễm nấm đã chọn được các chủng nấm diệt sâu có độc tính cao Từ các mẫu sâu chết ngoài đồng ruộng đã phân lập được 9 chủng nấm

Beauveria bassiana từ sâu xanh da láng, châu chấu và bọ hại khoai lang tại Đà Lạt,

Hóc Môn và Indonesia Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy 9 chủng đều có hiệu lực diệt trùng ấu trùng tằm, ấu trùng bọ hà, bọ hà trưởng thành và sâu xanh da

láng nhưng ở các mức độ khác nhau Thử nghiệm kết hợp nấm Beauveria bassianavới

pheromon trên ruộng khoai lang ở Thủ Đức làm giảm 10% số củ khoai lang bị hà (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Sử dụng chủng nấm Beauveria bassiana tồn trữ tại phòng thí nghiệm vi

sinh – Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường

Một số côn trùng sử dụng trong thí nghiệm

3.3.2 Thiết bị

Bếp điện, nồi hấp khử trùng (Autoclave), tủ cấy vô trùng, tủ sấy, tủ đông, tủ

mát, kính hiển vi, cân phân tích

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Khảo sátvà chọn lọc môi trường bán rắn để nhân sinh khối B bassiana

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại (LLL) với một lần LLL là một bịch môi trường Trong đó nghiệm thức 1: gạo (tấm)+ nước (10%); nghiệm thức 2: bột ngô+ nước (10%); nghiệm thức 3: gạo (tấm) + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3 (0,005g; 0,005g; 0,03g) + nước (10%) và cuối cùng nghiệm thức 4: bột ngô + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3 (0,005g; 0,005g; 0,03g) + nước (10%)

Tiến hành thí nghiệm:

Các nghiệm thức được phân ra làm 2 loại gạo và bột ngô:mỗi lần lặp lại là một bịch, cân 100g (gạo hay bột ngô) cho vào bịch, với hai nghiệm thức 3 và 4 bổ sung thêm khoáng chất đúng theo tỷ lệ phù hợp đã phân ra từ trước (từng loại chất khoáng được pha với nước cất, sau đó hút 10 ml cho vào mỗi bịch môi trường), với nghiệm thức 1 và 2 chỉ cho 10 ml nước cất không bổ sung thêm chất khoáng

Các nghiệm thức trên được nhân nuôi khảo sát trên 2 loại nút: nút bông và nút bấm kim với mục đích khảo sát độ thoáng khí trong bịch sử dụng để nuôi cấy

Sau khi đã chuẩn bị xong môi trường các nghiệm thức khảo sát nhân nuôi theo từng tỷ cácloại nút đã phân ra, tất cả các bịch môi trường được hấp khử trùng bằng nồi hấp khử trùng (Autoclave) ở 121ºC thời gian 20 phút ở 1atm, sau đó để nguội

Sử dụng đĩa petri chứa nấm Beauveria bassiana đã được nuôi cấy trong

vòng10 ngày Dùng nước cất đã được hấp khử trùng với một lượng nhất định là 10 ml cho vào đĩa petri, sau đó dùng que cấy trang cào nhẹ trên bề mặt lớp thạch agar có nấm mọc, tiếp đó hút ra (lượng nước hút ra sau khi lấy bào tử 8 ml tương đương với 3 x105 bt/ ml)cấy lên môi trường nuôi cấy và đặt ở nhiệt độ 27ºC cho nấm phát triển

Chỉ tiêu theo dõi:

Đếm mật độ số bào tử của nấm Beauveria bassiana

Kiểm tra sự tạp nhiễm của môi trường sau nuôi cấy

Hàm lượng của độ ẩm trên môi trường sau khi nuôi cấy

3.4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của B bassiana trên

môi trường nhân sinh khối tốt nhất

Sau khi kết thúc nội dung 1, chọn lọc ra được môi trường nấm phát triển tốt nhất làm vật liệu cho nội dung 2

Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ nước và nhiệt độ đến sự phát triển của

nấm

 Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ nước theo 3 công thức

+ Công thức 1: Gạo (tấm) + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3(0,005g; 0,005g; 0,03g) + nước (10%)

+ Công thức 2: Gạo (tấm) + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3(0,005g; 0,005g; 0,003g) + nước (20%)

+ Công thức3: Gạo (tấm) + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3 (0,005g; 0,005g; 0,03g) + nước (30%)

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi nghiệm thức

3 lần lặp lại (LLL) với một lần LLL là một bịch môi trường

Tiến hành thí nghiệm:

Các nghiệm thức được cân 100g (gạo) cho vào bịch, sau đó bổ sung thêm khoáng chất theo tỷ lệ tương ứng, mỗi nghiệm thức 10ml (các loại chất khoáng được pha với nước cất, sau đó hút tương ứng 10ml cho vào mỗi bịch môi trường).Ở các công thức 2 và 3 sau khibổ sung 10 ml khoáng chất thêm 10 và 20 ml nước cất cho đúng theo tỷ lệ tương ứng trên mỗi bịch môi trường Sau khi đã chuẩn bị xong môi trường các nghiệm thức khảo sát ẩm độ theo từng tỷ lệ, tất cả các bịch môi trường được hấp khử trùng bằng nồi hấp khử trùng (Autoclave) ở 121ºC thời gian 20 phút ở 1atm, sau đó để nguội

Sử dụng đĩa petri chứa nấm Beauveria bassiana đã được nuôi cấy trong vòng

10 ngày Dùng nước cất đã được hấp khử trùng với một lượng nhất định là 10 ml cho vào đĩa petri, sau đó dùng que cấy trang cào nhẹ trên bề mặt lớp thạch agar nấm mọc, sau đó hút ra (lượng nước hút ra sau khi lấy bào tử 8 ml tương đương với 3 x105 bt/ml) cấy lên môi trường nhân nuôi và đặt ở nhiệt độ 27ºC cho nấm phát triển

Chỉ tiêu theo dõi:

Đếm mật số bào tử nấm để xác định công thức nào là tối ưu nhất

 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm:dựa theo kết quả thí nghiệm chọn lọc ẩm độ tốt nhất để làm tiền đề cho thí nghiệm khảo sát nhiệt độ theo 3 công thức sau:

+ Công thức 1: Gạo (tấm) + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3 (0,005g; 0,005g; 0,003g) + nước (20%) và đặt ở 25ºC

+ Công thức 2: Gạo (tấm) + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3 (0,005g; 0,005g; 0,003g) + nước (20%) và đặt ở 27ºC

+ Công thức 3: Gạo (tấm) + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3 (0,005g; 0,005g; 0,003g) + nước (20%) và đặt > 32ºC

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi nghiệm thức

3 lần lặp lại (LLL) với một lần LLL là một bịch môi trường

Tiến hành thí nghiệm:

Các nghiệm thức được cân 100g (gạo) cho vào bịch, với các nghiệm thức bổ sung thêm khoáng chất theo tỷ lệ quy định từ trước 10 ml (các loại chất khoáng được pha với nước cất, sau đó hút tương ứng 10 ml cho vào mỗi bịch môi trường) Ở các nghiệm thức của thí nghiệm này khi được bổ sung 10 ml khoáng chất sau đó được thêm 10 ml nước cất cho đúng theo tỷ lệ tương ứng trên mỗi bịch môi trường để đạt được ẩm độ 20%

Sử dụng đĩa petri chứa nấm Beauveria bassiana đã được nuôi cấy trong vòng

10 ngày Dùng nước cất đã được hấp khử trùng với một lượng nhất định là 10 ml cho vào đĩa petri, sau đó dùng que cấy trang cào nhẹ trên bề mặt lớp thạch agar nấm mọc, sau đó hút ra (lượng nước hút ra sau khi lấy bào tử 8ml tương đương với 3 x105

bt/

ml) cấy lên môi trường nuôi và đặt ở nhiệt độ 25, 27 và >32ºC cho nấm phát triển

Chỉ tiêu theo dõi:

Đếm mật số bào tử nấm để xác định công thức nào là tối ưu nhất

Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến sự phát triển của nấm

Sau khi tiến hành các bước khảo sát ở các thí nghiệm trước và kết quả thu được

sử dụng để làm tiền đề tiến hành thí nghiệm 2 Khảo sát thời gian phát triển của nấm ở các mốc 5, 7, 10, 14 ngày

Tiến hành thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi nghiệm thức

3 lần lặp lại (LLL) với một lần LLL là một bịch môi trường

Các nghiệm thức được cân 100g (gạo) cho vào bịch, với các nghiệm thức bổ sung thêm khoáng chất theo tỷ lệ quy định từ trước 10 ml (các loại chất khoáng được pha với nước cất, sau đó hút tương ứng 10 ml cho vào mỗi bịch môi trường) Ở các nghiệm thức của thí nghiệm này sau khi được bổ sung 10 ml khoáng chất sau đó được

thêm 10 ml nước cất cho đúng theo tỷ lệ tương ứng trên mỗi bịch môi trường để đạt được ẩm độ 20%

Sử dụng đĩa petri chứa nấm Beauveria bassiana đã được nuôi cấy trong vòng

10 ngày Dùng nước cất đã được hấp khử trùng với một lượng nhất định là 10 ml cho vào đĩa petri, sau đó dùng que cấy trang cào nhẹ trên bề mặt lớp thạch agar nấm mọc, sau đó hút ra (lượng nước hút ra sau khi lấy bào tử 8 ml tương đương với 3 x105

bt/ ml) cấy lên môi trường nuôi và đặt ở nhiệt độ 27ºC cho nấm phát triển Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến sự phát triển của nấm ở ẩm độ 20% và nhiệt độ 27ºC

Chỉ tiêu theo dõi:

Đếm mật số bào tửnấm sau khi cấy 5, 7, 10 và 14 ngày sau khi cấy

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian sấy tới năng suất và chất lượng của

chế phẩm Beauveria bassiana

Theo Phạm Thị Thùy và cs (1991 - 1995), thời gian làm khô tối ưu của nấm ở nhiệt độ 45ºC sau 8 giờ Dựa theo kết quả trên tiến hành khảo sát nhiệt độ sấy cho phù hợp với điều kiện khí hậu phía Nam

Sấy các nghiệm thức ở các mức nhiệt độ:30ºC, 37ºC, 40ºC

Phương pháp sấy khô: sấy để đạt đến mức ẩm độ< 70%

 Chỉ tiêu theo dõi:

Mật số bào tử trong các nghiệm thức ở các mức nhiệt độ khác nhau

Ẩm độ ở các nghiệm thức sau khi sấy từ 24=> 96giờ

So sánh và đánh giá kết quả số lượng bào tử trong mỗi thí nghiệm để rút ra được thời gian sấy thích hợp nhất để bảo quản chế phẩm tốt nhất mà không ảnh

hưởng đến năng suất và chất lượng của chế phẩm nấm Beauveria bassiana

3.5 Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassianađể phòng trừ côn

trùnghại cây trồng

3.5.1 Đối với sâu xanh bướm trắng: Bố trí công thức thí nghiệm

+ Công thức 1: Đối chứng (không phun thuốc)

+ Công thức 2: Phun dịch bào tử nấm B.bassiana ở nồng độ 1000g/1ha

3.5.2 Đối với châu chấu:Bố trí công thức thí nghiệm

+ Công thức 1: Đối chứng (không phun thuốc)

+ Công thức 2: Phun dịch bào tử nấm B.bassiana ở nồng độ 1000g/1ha

 Tiến hành thí nghiệm

Phương pháp thí nghiệm chung cho cả 2 loại: sâuxanh bướm trắng và châu chấu

- Bố trí công thức thí nghiệm,mỗi công thức thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là20con sâu (hoặc châu chấu) cho 1 công thức Chúng được thả vào trong vườn cải được trồng 2 tuần tuổi, với diện tích thử nghiệm 2m2 cho mỗi lần lặp lại

- Đối với diện tích nuôi châu chấu sử dụng lưới nhỏ kích thước 1 x 1 cm bao che xung quanh khu vực trồng cải thử nghiệm để tránh chấu chấu bay đi

- Phương pháp pha và phun chế phẩm: Cân chế phẩm khô, nghiền nhỏ, pha với nước theo nồng độ trên, lắc đều để giải phóng dịch bào tử, lọc lấy dịch bào tử sau đó cho 5 giọt chất bám dính (dầu đậu nành) lắc đều và phun lên lá cây cải, sau đó thả côn trùng (sâu và chấu chấu) vào theo từng lần nhắc lại của mỗi công thức

 Chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ số côn trùng chết trên từng công thức

Xác định số con chết mọc lại nấm

Hoạt lực của chế phẩm (theo công thức Abbott ở mục 3.6.3)

3.6.Phương pháp pha loãng và đếm số lượng bào tử

3.6.1.Phương pháp pha loãng

Cân 1 gram chế phẩm, nghiền nhỏ trong cối sau đó cho thêm 9ml nước cất vào

và tiếp tục nghiền, được dịch bào tử có độ pha loãng 10-1

cho vào ống nghiệm và thêm 9ml nước cất lắc đều ta được dịch bào tử có độ pha loãng 10-2 Làm như vậy đến khi thu được dịch bào tử có độ pha loãng đếm được (10-n)

Cách thức pha loãng bào tử được minh họa như sau:

1 gram 1 ml 1 ml 1 ml đem đếm

…

10-1 10-2 10-3 10-n

9 ml nước cất

9 ml nước cất

9 ml nước cất

9 ml nước cất

3.6.2.Phương pháp đếm số lượng bào tử

Sau khi có dịch bào tử ở độ pha loãng đếm được, dùng pipet hút dịch bào tử và

nhỏ 1 giọt xuống khoảng giữa lưới đếm của buồng đếm hồng cầu Đậy lamen lên trên đưa buồng đếm đến kính hiển vi, lấy tiêu cự để đếm

Số lượng bào tử được tính theo công thức

a x 10n x 4000

A =

b x 10-3 Trong đó:

Ca Trong đó:

- M %: Tỷ lệ chết của sâu

- Ca: Số sâu sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm

- Ta: Số sâu sống ở công thức thí nghiệm sau thí nghiệm

 Tỷ lệ mọc lại nấm:

Số sâu chết mọc lại nấm (%) Số sâu mọc lại nấm = x 100

Tổng số sâu chết

Chương 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1.Tuyển chọn nấm Beauveria bassiana (B.bassiana)được nuôi cấy

Chủng nấm được sử dụng là phần quan trọng nhất trong quá trình sản xuất vì có chủng nấm tốt chế phẩm mới đạt chất lượng cao.Hiện nay các nhà khoa học thường sử

dụng chủng nấm Beauveria bassianađược phân lập hoặc được thu thập trên các vùng

trong cả nước có mức độ tương đồng cao

Nguồn nấm Beauveria bassianađược sử dụng trong nghiên cứu khảo sát này

được tồn trữ tại Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường của Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và kế thừa kết quả nghiên cứu của Trần Thị Tú Ngân (2013) phân lập từ sâu thu thập ở Hoóc Môn (TP.HCM)có độ tương đồng 100%

với chủngB bassianađược công bố trên trên giới

Dưới đây là hình ảnh các đĩa Beauveria bassianađược nuôi cấy sau 7 ngày trên

môi trường PGA

Hình 4.1 Đĩa nấm Beauveria bassiana sau 7 ngày nuôi bằng phương pháp cấy điểm và

cấy trải (1) đĩa nấm sau 7 ngày nuôi cấy điểm; (2) đĩa nấm sau 7 ngày nuôi cấy trải

4.2 Khảo sát và chọn lọc môi trường bán rắn để nhân sinh khối nấm

Theo tài liệu của Phạm Thị Thùy (1996), nấm B.bassiana đòi hỏi môi trường có

nguồn dinh dưỡng phù hợp để phát triển như hàm lượng Nitơ, Cacbon, Kali, Photpho, Vitamin Đồng thời môi trường phải có đủ độ thoáng khí thích hợp nhất định Theo phương pháp và cách thức đã trình bày ở trên tiến hành khảo sát môi trường bán rắn để

nhân sinh khối nấm B.bassiana và chọn lọc môi trường nhân sinh khối tốt nhất Kết

quả được trình bày ở bảng 4.1