NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN MOKARA TRÊN HỆ THỐNG BIOREACTOR NGẬP CHÌM CÁCH QUÃNG VÀ HỆ THỐNG ĐÈN LED

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Bioreactor giúp tạo ra môi trường nuôi cấy thoáng khí, cây con khỏe mạnh, tỉ lệ sống sót cao, giảm chi phí nhân công, tiết kiệm, hệ số nhân được gia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN MOKARA TRÊN HỆ THỐNG

BIOREACTOR NGẬP CHÌM CÁCH QUÃNG

VÀ HỆ THỐNG ĐÈN LED

Sinh viên thưc hiện : NGUYỄN THỊ TÌNH Niên khóa : 2011 - 2013

Tháng 12/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNG PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN MOKARA TRÊN HỆ THỐNG

BIOREACTOR NGẬP CHÌM CÁCH QUÃNG

VÀ HỆ THỐNG ĐÈN LED

ThS MAI TRƯỜNG NGUYỄN THỊ TÌNH

KS.NGUYỄN ĐỨC MINH HÙNG

Tháng 12/2013

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực tập tại Viện Sinh học Nhiệt đới, được sự quan tâm, hướng dẫn tận tình của cán bộ Phòng PILOT Thực Vật với cở sở phòng thí nghiệm đầy đủ trang thiết bị, em đã có cơ hội tiếp cận môi trường làm việc chuyên nghiệp, cũng như trải nghiệm thực tế, tạo điều kiện cho chúng em có cái nhìn cụ thể, xác thực về nhiệm

vụ sau này

Qua quá trình thực tập, em được tìm hiểu cũng như học hỏi nhiều kinh nghiệm quý báu, từ đó giúp ích chúng em rất nhiều trong việc áp dụng kiến thức đã học vào thực tiễn, và xa hơn là rèn cho em kỹ năng và tác phong làm việc thực tế

Trong thời gian qua, em nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy cô cũng như sự hỗ trợ của Viện để đợt thực tập được hoàn thành tốt đẹp, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

 Quý thầy cô của trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã cho

em nền tảng kiến thức cơ sở để em lấy đó làm tiền đề cho quá trình học tập, nghiên cứu cũng như ứng dụng vào thực tế sau này

 Thạc sĩ Mai Trường và thầy Nguyễn Đức Minh Hùng đã theo sát, giải đáp thắc mắc cho em, cung cấp nhiều tài liệu cũng như sách quý và chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt quá trình thực tập tại Viện Sinh học Nhiệt đới

 Cô Lương Thanh Hồng đã nhiệt liệt truyền đạt nhiều kinh nghiệm làm việc

và tạo không khí thoải mái, thân thiết trong suốt thời gian làm việc

 Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Ba Mẹ - người luôn giúp con đứng vững sau những lần vấp ngã, luôn động viên những lần con thấy nản chí, luôn tin tưởng và tạo cơ hội cũng như mọi điều kiện tốt nhất cho con học tập và trưởng thành như hôm nay

Một lần nữa chúng em xin chân thành cảm ơn!

TP.HCM, ngày 14 tháng 01 năm 2014

TÓM TẮT

Hoa lan được ví như nữ hoàng của sắc đẹp vì sự đài các, vương giả của những nhành hoa tuyệt đẹp, màu sắc sặc sỡ và hương thơm nồng nàn, chính vì vậy hoa lan là nguồn đam mê của nhiều người Hiện nay trên thế giới đèn LED (viết tắt của Light Emiting Diode, có nghĩa là điốt phát quang) đã có rất nhiều ứng dụng trong thực tiễn Việc áp dụng đèn LED trong nông nghiệp đã rút ngắn được thời gian cần thiết để đưa một giống mới có khả năng cho năng suất cao, ổn định phẩm chất vào trồng ở quy mô lớn Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Bioreactor) giúp tạo ra môi trường nuôi cấy thoáng khí, cây con khỏe mạnh, tỉ lệ sống sót cao, giảm chi phí nhân công, tiết kiệm, hệ số nhân được gia tăng nhiều lần so với khi nhân giống trên hệ thống nuôi cấy

thông thường Những lý do nêu trên là cơ sở ra đời của nghiên cứu “Nghiên cứu nhân

giống lan Mokara trên hệ thống Bioreactor ngập chìm cách quãng và hệ thống

đèn LED” Mục đích là nguyên cứu ảnh hưởng tỷ lệ màu chiếu sáng khác nhau của

đèn LED đến sự phát triển của lan Mokara

Đề tài có 4 thí nghiệm: thí nghiệm 1 nhân giống cụm chồi lan Mokara bởi môi trường agar và so sánh trên đèn LED Thí nghiệm 2 nuôi cấy phát sinh rễ cây Mokara

bởi môi trường agar và so sánh trên đèn LED Thí nghiệm 3 nhân giống cụm chồi lan

Mokara trong bioreactor ngập cách quãng trên đèn LED Thí nghiệm 4 nuôi cấy phát

sinh rễ cây Mokara trong bioreactor ngập cách quãng trên đèn LED Qua quá trình theo dõi và quan sát ta rút ra được kết luận sau: thí nghiệm 1 cây lan Mokara ở giai đoạn phát sinh chồi và thí nghiệm 2 cây lan Mokara ở giai đoạn tạo rễ, cây nuôi trong

hộp nuôi cấy Magenta ở nghiệm thức 4 (tỷ lệ ánh sáng xanh 25% + 75% đỏ) là tốt

nhất Thí nghiệm 1 cây lan Mokara ở giai đoạn phát sinh chồi và thí nghiệm 2 cây lan

Mokara ở giai đoạn tạo rễ, cây nuôi trong hệ thống Bioreactor ngập chìm cách quãng ở

nghiệm thức 4 (tỷ lệ ánh sáng xanh 25% +75% đỏ) là tốt nhất Kết quả phân tích Chlorophyll ở nghiệm thức 4 (tỷ lệ ánh sáng xanh 25% + 75% đỏ) tốt nhất

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề, tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

1.4 Ý nghĩa đề tài nghiên cứu 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật (nhân giống in vitro) 4

2.1.1 Giới thiệu 4

2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô 4

2.1.3 Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam 5

2.1.4 Các giai đoạn trong quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

2.1.5 Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật 8

2.1.6 Môi trường nhân giống in vitro 9

2.2 Giới thiệu về hoa lan và kỹ thuật nhân giống hoa lan 13

2.2.1 Lịch sử trồng lan trên thế giới và ở Việt Nam 13

2.2.2 Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và Việt Nam 14

2.2.3 Giới thiệu về hoa lan Mokara 15

2.3 Giới thiệu về hệ thống Bioreactor trong nuôi cấy mô 18

2.3.1 Giới thiệu chung 18

2.3.2 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản của hệ thống bioreactor 19

2.3.3 Ưu điểm và khuyết điểm của hệ thống bioreactor 22

2.3.4 Một số thành tựu trong hệ thống bioreactor 24

2.3.5 Thuận lợi và khó khăn trong nuôi cấy trong hệ thống bioreactor 24

2.4 Tổng quan về đèn LED 25

2.4.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển 25

2.4.2 Cấu tạo đèn LED 26

2.4.3 Ứng dụng của đèn LED 27

2.4.4 Cơ sở của việc sử dụng đèn LED trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 27

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

3.2 Vật liệu 29

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 29

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

3.2.3 Thiết bị dụng cụ 30

3.2.4 Hóa chất 30

3.2.5 Điều kiện nuôi cấy 31

3.3 Bố trí thí nghiệm 31

3.3.1 Thí nghiệm 1: Nhân giống cụm chồi lan Mokara trong hộp nuôi cấy Magenta trên đèn Led 31

3.3.2 Thí nghiệm 2: Nuôi cấy phát sinh rễ cây Mokara trong hộp nuôi cấy Magenta trên đèn Led 31

3.3.3 Thí nghiệm 3: Nhân giống cụm chồi lan Mokara trong bioreactor ngập cách quãng trên đèn LED 32

3.3.4 Thí nghiệm 4: Nuôi cấy phát sinh rễ cây Mokara trong bioreactor ngập cách quãng trên đèn LED 32

3.3.5 Đo hàm lượng chlorophyll lá 33

3.4 Phân tích thống kê 34

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Thí nghiệm 1: Nhân giống cụm chồi lan Mokara trong hộp nuôi cấy Magenta trên đèn Led 35

4.2 Thí nghiệm 2: Nuôi cấy phát sinh rễ cây Mokara trong hộp nuôi cấy Magenta trên đèn Led 37

4.3 Thí nghiệm 3: Nhân giống cụm chồi lan Mokara trong bioreactor ngập cách

quãng trên đèn LED 39

4.4 Thí nghiệm 4: Nuôi cấy phát sinh rễ cây Mokara trong bioreactor ngập cách quãng trên đèn LED 42

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 KẾT LUẬN 46

5.2 KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 49

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOV Amino oxyacetic acid

ACC Acid 1- amino-cyclopropan-1-carboxylic

2,4D 2,4D Dichloro phenoxy acetic acid

EDTA Ethylene diaminetetraacetic acid

EDDHA Ethylene diamine-di (o-hydroxyphenyl) acetic acid

NAA α – naphthalenescetic acid

PLB Protocom –like body

TIS Temporary Immersion System

TIBA 2,3,5 – Tri – iodobenzoic acid

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các vitamin thường dùng (mg/l) 10

Bảng 4.1 Nuôi cấy sự phát sinh chồi lan Mokara 35 Bảng 4.2 Nuôi cấy lan Mokara ở giai đoạn tạo rễ sau 8 tuần 37 Bảng 4.3 Kết quả nuôi cấy sự phát sinh chồi lan Mokara trong bioreactor ngập cách

quãng trên đèn LED sau 8 tuần 40

Bảng 4.4 Kết quả nuôi cấy phát sinh rễ lan Mokara trong bioreactor ngập cách quãng

trên đèn LED 42

Bảng 4.5 Kết quả phân tích chlorophyll lá cây lan Mokara sau 8 tuần nuôi cấy dưới

đèn LED 44

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ các phương thức tạo cây hoàn chỉnh trong nhân giống in vitro 8

Hình 2.2 Sơ đồ các bộ phận dùng nuôi cấy in vitro ở cây lan 13

Hình 2.4 Hệ thống RITA® 20

Hình 2.5 Hệ thống bình sinh đôi BIT® 21

Hình 2.6 Các thành phần của hệ thống Plantima 22

Hình 2.7 Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập 22

Hình 2.8 Các loại đèn LED 26

Hình 2.9 Cấu tạo của một bóng đèn LED 26

Hình 3.1 Bản mạch dùng trong thí nghiệm 29

Hình 3.2 Tủ cấy 30

Hình 3.3 Hệ thống Bioreactor 30

Hình 4.1 Chồi lan Mokara sau 8 tuần nuôi cấy cây dưới đèn LED 36

Hình 4.2 Sơ đồ so sánh số chồi chiều cao chồi lan Mokara sau 8 tuần nuôi cây dưới đèn LED 37

Hình 4.3 Cây lan Mokara sau 8 tuần nuôi cây dưới đèn LED 38

Hình 4.4 Sơ đồ so sánh sự phát triển của lan Mokara sau 8 tuần nuôi cây dưới đèn LED 39

Hình 4.5 Chồi lan Mokara trong bioreactor ngập cách quãng trên đèn LED sau 8 tuần 41

Hình 4.6 Sơ đồ so sánh số chồi chiều cao chồi và trọng lượng tươi lan Mokara nuôi trong bioreactor ngập cách quãng trên đèn LED sau 8 tuần 42

Hình 4.7 Cây lan Mokara nuôi trong bioreactor ngập cách quãng trên đèn LED sau 8 tuần 43

Hình 4.8 Sơ đồ so sánh sự phát triển của cây lan Mokara nuôi trong bioreactor ngập cách quãng trên đèn LED 44

Hình 4.9 Sơ đồ so sánh chlorophyll tổng số lá 45

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề, tính cấp thiết của đề tài

Hoa lan được ví như nữ hoàng của sắc đẹp vì sự đài các, vương giả của những nhành hoa tuyệt đẹp, màu sắc sặc sỡ và hương thơm nồng nàn, ngọt ngào, thân cành yểu điệu, hấp dẫn, chính vì vậy hoa lan là nguồn đam mê của nhiều người

Hiện nay trên thế giới đèn LED (viết tắt của Light Emiting Diode, có nghĩa là điốt phát quang) đã có rất nhiều ứng dụng trong thực tiễn Việc áp dụng đèn LED trong nông nghiệp đã rút ngắn được thời gian cần thiết để đưa một giống mới có khả năng cho năng suất cao, ổn định phẩm chất vào trồng ở quy mô lớn Với ưu thế khai thác ở điện thế thấp và không phụ thuộc vào lưới điện, tiết kiệm tối đa năng lượng đầu vào và cho năng suất cây trồng cao Đèn LED đã trở thành thế hệ chiếu sáng nông nghiệp mới cho cả cây trồng trong nhà lẫn ngoài vườn Nhiều trong số các nghiên cứu ứng dụng đèn LED là của các nhà khoa học Việt Nam thực hiện ở trong nước cũng như nước ngoài, nhằm cải thiện chất lượng nông sản cho xuất khẩu, gia tăng năng suất cây trồng

Các loại tia sáng khác nhau có tác dụng lên quang hợp không giống nhau Bằng công trình nghiên cứu của mình Timiriazep là người đầu tiên xác định tia đỏ có hiệu suất quang hợp cao hơn các tia khác, sau tia đỏ là tia xanh Thành phần ánh sáng không chỉ ảnh hưởng đến cường độ quang hợp mà còn thay đổi sản phẩm quang hợp Với ánh sáng có bước sóng ngắn sản phẩm tạo ra trong quang hợp chứa nhiều acid amin, protein so với bước sóng dài Ngược lại ánh sáng có bước sóng dài tạo sản phẩm chứa nhiều glucid hơn so với bước sóng ngắn Tuy nhiên hiệu quả quang hợp sẽ tăng lên nếu sử dụng phối hợp hợp lý giữa các tia Theo nghiên cứu của Emerson nếu chiếu xen kẽ tia sáng có bước sóng lớn hơn 680 nm (tia đỏ) với tia sáng có bước sóng nhỏ hơn 650 nm sẽ làm nâng cao hiệu suất quang hợp rõ rệt, đó là hiệu ứng “Emerson” Thông thường người ta sử dụng hai chùm sáng màu đỏ (R) và màu xanh (B) có đỉnh cực đại ở độ dài bước sóng là 662 nm và 430 nm lúc đó quang phổ của đèn LED gần trùng với quang phổ hấp thụ của các diệp lục tố A và B, nghĩa là các loại cây trồng có thể hấp thu tối đa để chuyển năng lượng hấp thu từ đèn LED thành năng lượng tế bào,

trong khi hiệu suất sử dụng của cây đối với năng lượng áng sáng mặt trời và các nguồn ánh sáng trắng chỉ vào khoảng 35% Với tính chất này người nông dân có thể sử dụng đèn LED thay thế cho đèn huỳnh quang trong việc chiếu sáng cho vườn ươm, vì ngoài khả năng tiết kiệm điện người ta còn có thể chủ động thay đổi bước sóng ánh sáng của đèn cho phù hợp với khả năng hấp thụ của từng loại cây

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, ngành vi nhân giống thực vật đã phát triển, đặc biệt các đơn vị đã mạnh dạn đầu tư nuôi cấy nhân giống hoa lan nhằm tạo ra hàng ngàn cây giống có kích thước, chất lượng đồng đều

Hiện nay, một số cơ sở tư nhân, trường đại học, viện nghiên cứu có xu hướng phát triển nghiên cứu nhân giống lan trên những kỹ thuật mới như: fermenter, quang tự dưỡng, bioreactor, … nhưng vẫn chưa đưa ra áp dụng rộng rãi Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Bioreactor) là một hệ thống không những tận dụng được các ưu điểm của nuôi cấy lỏng và nuôi cấy trên thạch mà còn hạn chế được nhược điểm của hai hệ thống nuôi cấy trên giúp tạo ra môi trường nuôi cấy thoáng khí, cây con khỏe mạnh, tỉ lệ sống sót cao, giảm chi phí nhân công, tiết kiệm và giảm chi phí môi trường nuôi cấy do sử dụng ít môi trường trên một mẫu cấy và không sử dụng thạch, hệ số nhân được gia tăng nhiều lần so với khi nhân giống trên hệ thống nuôi cấy thông thường Phòng thí nghiệm trọng điểm - Viện Sinh học Nhiệt đới cũng đã được đầu tư thiết bị này để nhân giống thực vật trong phòng thí nghiệm

Những lý do nêu trên là cơ sở ra đời của nghiên cứu “Nghiên cứu nhân giống

lan Mokara trên hệ thống Bioreactor ngập chìm cách quãng và hệ thống đèn

LED”

1.2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ màu chiếu sáng khác nhau của đèn LED đến sự

phát triển của lan Mokara

1.3 Nội dung thực hiện

Nhân giống cụm chồi và nuôi cấy phát sinh rễ lan Mokara bởi môi trong hộp

nuôi cấy Magenta và chiếu sáng dưới đèn Led với các tỷ lệ khác nhau với đèn huỳnh quang

Nhân giống cụm chồi và nuôi cấy phát sinh rễ lan Mokara trong Bioreactor

ngập cách quãng và chiếu sáng dưới đèn Led với các tỷ lệ khác nhau với đèn huỳnh quang

1.4 Ý nghĩa đề tài nghiên cứu

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Sử dụng hệ thống phát sáng đèn LED là một nguồn sáng cho cây trồng là một ý tưởng được cân nhắc và được chú ý đặc biệt trong những năm gần đây vì ứng dụng rộng rãi của nó trong thương mại

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật (nhân giống in vitro)

2.1.1 Giới thiệu

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật

ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hay đỉnh sinh trưởng

2.1.2 Lịch sử nuôi cấy mô

Năm 1938, hai nhà sinh học người Đức Schleiden & Schwann đã đề xướng

thuyết tế bào và nêu rõ: “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các

tế bào hợp thành” Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền có trong

tế bào đầu tiên (hợp tử) và là những đơn vị độc lập, có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể (Trần Văn Minh, 2004)

Năm 1922, Kotte (người Đức) và Robbins (người Mỹ) có cùng ý tưởng là sử dụng các phân sinh mô làm mẫu cấy, thí nghiệm với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo Tuy nhiên sự sinh trưởng chỉ tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần

và ngừng lại (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Năm 1934, White đã thành công trong việc

phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua (Licopersicum

esculentum) (Bùi Thế Vinh, 2008)

Nobécourt (1939), White (1943) và Gautheret (1945) đã công bố thành công sớm nhất của phương pháp nuôi cấy mô thực vật được tiến hành trên môi trường thạch Tuy nhiên việc đánh giá kết quả khi đó còn hạn chế bởi nhiều nguyên nhân như

sự thiếu thông tin về chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Dương Tấn Nhật, 2009) Năm

1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi (Bùi Thế Vinh, 2008)

Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho

việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay Năm 1960

- 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hóa Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng thương mại hóa (Bùi Thế Vinh, 2008)

Năm 1960, những công bố về hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật vào thời điểm này làm giáo sư Gamborg đã nảy ra ý tưởng ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong fermenter (bioreactor sau này) Vào lúc đó có một số thiết bị tương đương của hệ thống nuôi cấy lên men Bằng thiết bị này các nhà khoa học có thể điều khiển và xác định được sự sinh trưởng của tế bào (Ts Dương Tấn Nhật, 2009) Năm 1994, cây cà chua Favr - savr có mặt trên thị trường Hoa Kỳ Từ năm 1994 trở về sau, các kỹ thuật mới liên quan đến chuyển nạp gen và tạo ra những giống cây chuyển nạp gen mới

2.1.3 Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được nghiên cứu trên 30 năm, nhưng áp dụng trong thực tế sản xuất trong các lĩnh vực vi nhân giống cây hoa cành, cây công nghiệp, cây lâm nghiệp và cây dược liệu trong khoảng 10 - 20 năm trở lại Bên cạnh đó, có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật cũng được xây dựng ở các trường đại học, viện nghiên cứu, sở khoa học và công nghệ của các tỉnh, thành phố Hiện nay có nhiều vấn đề được quan tâm nghiên cứu trong nuôi cấy

mô và tế bào thực vật như vi nhân giống, tạo phôi soma, tạo hạt tổng hợp (hạt nhân tạo), chuyển nạp gen, sản xuất các chất biến dưỡng thứ cấp, cấy chồi và đỉnh sinh

trưởng, ra hoa in vitro, …

Môt số trung tâm nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô: phân viện sinh học Tây Nguyên (Đà Lạt), Viện sinh học Nhiệt đới (Thủ Đức - thành phố Hồ Chí Minh), Viện cây ăn quả miền Nam (Tiền Giang), Phân viện thực phẩm thành phố, Sở khoa học và công nghệ các tỉnh, thành phố, Viện Pasteur, … (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

2.1.4 Các giai đoạn trong quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.4.1 Giai đoạn 1: Cấy khởi đầu - Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy

Mẫu cấy là mảnh mô thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy

 Lựa chọn mẫu

Hầu hết là các cơ quan hay bộ phận của cây như chồi ngọn, phiến lá, … Mẫu phải ít mầm bệnh, cây mẹ khỏe mạnh, không bị bệnh Cần lưu ý đến tuổi sinh lý của

cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu Tình trạng sinh lý của cây mẹ cũng như nguồn dùng làm mẫu cấy có thể được cải thiện bởi một số kỹ thuật, ví dụ đối với cây thân gỗ lâu năm, việc

sử dụng chồi từ các cây này làm mẫu cấy thường khó thành công trong việc tạo cây con từ các chồi này (Nguyễn Đức Minh Hùng, 2009; Bùi Thế Vinh, 2008)

 Khử trùng mẫu

Đưa mẫu từ ngoài môi trường vào phải đảm bảo yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp,

tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng

xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như: calcium hypochloride, chlorur thủy ngân, javel, …

2.1.4.2 Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống in vitro

Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống

in vitro Có 2 thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Đối với những

loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 (gibberellic acid) và các chất hữu cơ khác (Bùi Thế Vinh, 2008)

2.1.4.3 Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh Cây nhân

giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài (Bùi Thế Vinh,

2008)

Ở giai đoạn này bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô lên các môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh Những khả năng tạo cây đó là: tái sinh mô sẹo, phát triển chồi nách, tạo phôi vô tính, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng mới

Bổ sung tổ hợp hoormon sinh trưởng mới: tăng cytokinin giảm auxin, tỷ lệ auxin/cytokinin < 1: tăng cường quá trình tạo chồi, tỷ lệ auxin/cytokinin = 1: cân bằng

2 quá trình tạo chồi và tạo rễ, tỷ lệ auxin/cytokinin > 1: tăng cường quá trình tạo rễ

Bảo đảm ở chế độ nhiệt độ 20 – 27oC Tuy nhiên cần xác định số lần cấy chuyển hợp

lý, vì nếu số lần cấy chuyển quá lớn thì sẽ dẫn tới hiện tượng cây bị thoái hóa và sinh trưởng kém, có thể mất đi những đặc tính ban đầu của cây bố mẹ

2.1.4.4 Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh, tạo rễ

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một

bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro Sự ra rễ phụ thuộc nhiều

yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di

truyền Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro Nồng độ

auxin tối ưu được xác định dựa trên tỷ lệ tạo rễ, số lượng rễ và chiều dài rễ Môi

trường lúc này không cần bổ sung cytokinin

2.1.4.5 Giai đoạn 5: Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm

Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp, … Sau khoảng 2 tuần cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm

Đây là giai đoạn quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính vì cây con

thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro, bao gồm công việc huấn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện khí hậu thay đổi: nhiệt độ,

ánh sáng, độ ẩm, … và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng hoàn toàn Quá trình thích nghi của cây phải được hiểu như là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh lý, giải phẫu của bản thân cây con đó Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi

là 2 - 3 tuần Trong thời gian này cây phải được bảo vệ trước những yếu tố bất lợi như: mất nước nhanh làm cây bị héo khô, nhiễm vi khuẩn và nấm làm cho cây bị héo khô, cháy lá do nắng, cây con dễ dàng bị stress Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy

mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, độ ẩm cao Cây con thường được cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ độ ẩm, trong những ngày đầu cần phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường 7 - 10 ngày kể từ ngày cấy) Rễ được tạo trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con

thường được xử lý ra rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ

Hình 2.1 Sơ đồ các phương thức tạo cây hoàn chỉnh trong nhân giống in vitro

2.1.5 Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật

2.1.5.1 Ưu điểm

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có những ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống, đặc biệt là về tốc độ nhân giống cực kì cao trong một thời gian ngắn Có nhiều tiềm năng công nghiệp hóa cao, dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen: khả năng tạo cây đơn bội qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, từ đó tạo ra các dòng hợp tử tuyệt đối, nhờ đó rút ngắn được thời gian lai tạo Khả năng hấp thụ DNA ngoại lai vào tế bào thực vật và khả năng gây biến tính ở thực vật do DNA ngoại lai nhờ công nghệ gene Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp tái sinh cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong một thời gian dài và ở nhiệt độ thấp mà không mất tính toàn thế của tế bào, … Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây như: trục thân, lóng thân, phiến lá, chồi phát hoa, hạt phấn mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được Cây con tạo ra đồng nhất về mặt di truyền Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, … Bảo

quản nguồn cây giống in vitro với số lượng lớn nhưng lại chiếm diện tích rất nhỏ Tạo

cây có khả năng ra hoa, quả sớm Tạo dòng toàn cây cái (cây chà là) hay toàn cây đực (cây măng tây) theo mong muốn

2.1.5.2 Nhược điểm

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có những ưu điểm nổi bật nhưng

vẫn có một số nhược điểm sau: giá thành cây con được sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống còn khá cao Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm Sự đa dạng

của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo ra thường ít đồng nhất

về mặt kiều hình Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng

được bổ sung vào môi trường nuôi cấy

2.1.6 Môi trường nhân giống in vitro

Đây là nhân tố quyết định sự thành công của quá trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật Thành phần môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật thay đổi tùy theo loài

và bộ phận nuôi cấy Thông thường các chất được phân thành 2 loại thành phần: thành phần cơ bản và thành phần tự chọn (là thành phần có thể thêm hoặc không thêm vào môi trường) Thành phần cơ bản gồm có: nước, các nguyên tố khoáng (đa lượng & vi lượng), nguồn carbohydrate (đường), vitamin, chất tạo gel (agar), chất điều hòa sinh trưởng và nước dừa Thành phần tự chọn gồm có: chelates, chất thẩm thấu, than hoạt tính, amino acid, đạm hữu cơ

Nước: Nước sử dụng pha môi trường trong nuôi cấy mô thường là nước cất một

lần, cũng có thể là nước cất hai lần hay nước khử khoáng (là nước cất một hay hai lần

đi qua các cột khử khoáng hay các cột trao đổi ion)

Nguồn carbohydrate: Các carbohydrate hỗ trợ cho sự sinh trưởng của tế bào

trong nuôi cấy mô là các loại đường: sucrose, maltose, galactose, mannose, fructose,

ribose, glycerol Thường sử dụng đường sucrose 2 - 5 % Khi sử dụng đường sucrose

trong môi trường nuôi cấy, nó được thủy phân hoàn toàn hoặc một phần thành

monosaccharide: glucose và fructose

Các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng: Đối với cây trồng, các chất

khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng Ví dụ magiê là một phần của phân

tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế bào, nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino axit và protein Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzym cần thiết cho hoạt động sống của tế bào Muối khoáng là thành

phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho

sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzym Các ion của các muối hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường trong tế bào, duy trì điện thế hóa của thực vật Ví dụ: K,

Ca rất quan trọng trong điều hòa tính thấm lọc của tế bào (Trần Văn Minh, 2004)

Các vitamin: Các vitamin được sử dụng như là coenzyme và được sử dụng một

lượng rất nhỏ (mg/l) Vitamin cần được giữ trong điều kiện lạnh 5oC (hay trong ngăn

đá tủ lạnh) Các vitamin này được bổ sung vào môi trường với nồng độ rất thấp 0,1 -

10 - 50

1 - 5

1 - 5 0,1 - 1 0,1 - 1

(Trần Văn Minh, 2004)

Agar: Agar là sản phẩm tự nhiên được trích từ tảo, là một polysaccharide Agar

và đặc tính gel tùy thuộc vào thương hiệu của nhà sản xuất, trong đó cần lưu ý đến độ tinh khiết của agar, hàm lượng độ ẩm chứa trong agar, sự sinh trưởng của mẫu cấy trong môi trường có agar Nồng độ agar sử dụng sẽ ảnh hưởng đến thế năng nước trong môi trường nuôi cấy, độ cứng của môi trường, sự sinh trưởng của mẫu cấy, các vấn đề sinh lý của mẫu cấy như thừa nước, sự hoạt động của cytokinin trong môi

dichlorophenoxy acetic acid), PCPA (P-chlorophenoxy acetic aid), Dicamba (3, Dichloro-O-anisic acid) Nhóm auxin có tác dụng: kích thích phân chia và kéo dài tế bào, cần thiết cho sự hình thành rễ, kích thích ra rễ, kích thích sự lớn lên của bầu quả, kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả của cây, kìm hãm sự sinh trưởng chồi phụ, do đó tạo điều kiện cho các chồi chính phát triển (tính trội đỉnh)

6-b Cytokinin

Cytokinin thường được dùng để kích thích sự tăng trưởng chồi trong nuôi cấy

mô Cytokinin là adenin được thay thế N-6 kết hợp với auxin gây ra sự phân chia tế bào thực vật Zeatin là cytokinin tự nhiên được trích ra từ hạt bắp nảy mầm Kinetin (hay 6-furfurilaminopurin) và Benzyladenin được tổng hợp đầu tiên và đang được sử dụng rộng rãi Ngoài ra còn có TDZ (thidiazuron) ngăn cản cytokinin oxidase DPU (Diphenylurea) được chứng minh là cytokinin chính trong nước dừa Môi trường chứa auxin và 10 - 20% nước dừa giúp sự phân chia của các tế bào thân đã phân hóa (sự tạo

mô sẹo) (Bùi Trang Việt, 2000)

Sau zeatin, hơn 30 cytokinin khác nhau được cô lập Ngày nay người ta gọi cytokinin để chỉ một nhóm chất, thiên nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lý giống nước dừa hay kinetin Tương tác auxin/cytokinin: tỷ lệ auxin/cytokinin cao giúp sự tạo

rễ, tỷ lệ auxin/cytokinin thấp giúp tạo chồi, sự cân bằng giữa 2 loại này là một yếu tố kiểm soát sự phát triển

c Gibberellin (GA)

Thông thường gibberellin làm tăng hàm lượng auxin trong mô mà chúng kích thích Tuy nhiên hai chất này có hoạt động độc lập Chức năng chính của nó ở trong cây là kích thích sự sinh trưởng kéo dài ở phân sinh mô chồi Một số ảnh hưởng của

GA được biết đến như: kích thích hạt nảy mầm ở hạt cần xử lý lạnh hay ánh sáng để phát sinh nảy mầm, kích thích hình thành nhiều loại enzyme, kích thích sự hình thành

và phát triển trái, kích thích sự phân chia tế bào và mô phân sinh lóng, trong sự biểu hiện phái tính của hoa, GA kích thích sự tạo hoa đực

d Abscisic acid (ABA)

Trong nuôi cấy mô ABA được sử dụng rộng rãi trong sự tạo phôi vô tính trong thao tác phôi và biến đổi phôi thành cây con ABA cản trở sự tăng trưởng của các mô nuôi cấy (đối nghịch với auxin)

e Ethylen

Ethylene là một chất khí, là một hormone bay hơi Sinh tổng hợp ethylene có thể được điều hòa bởi các chất ngăn cản như AVG (aminoethoxyvinyl glycine) và AOA (amino oxyacetic acid) Auxin và cytokinin kích thích sự sản xuất ethylene bằng cách kích thích sự thành lập ACC (acid 1-amino-cyclopropan-1-carboxylic) (vài hiệu ứng của auxin gián tiếp qua ethylene: rụng lá, ra hoa ở cây thơm) Abscisic acid cản trở sự thành lập ACC Ethylene cho phép cây nhú ra khỏi mặt đất mà không bị hư mô phân sinh ngọn

Nước dừa (CW) và một số dịch chiết khác: Nước dừa được sử dụng rộng rãi

như là chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy phôi Nước dừa thường được bảo quản lạnh (tốt nhất nên sử dụng tươi) Nước dừa ngoài cung cấp chất béo, acid amin, acid hữu cơ, còn chứa nhiều trypton, carbohydrat như sucrose, glucose và fructose Môi trường chứa auxin và 10 - 20% nước dừa giúp sự phân chia của tế bào thân đã phân hóa (sự tạo mô sẹo) Khi cấy phôi lan, nước dừa được sử dụng để giúp phôi lan

tăng trưởng và nảy mầm (Hegarty, 1955; Niimoto và Sagawa, 1961)

Nhiều loại dịch chiết khác được sử dụng cho môi trường nuôi cấy phôi lan, như nước chiết cà chua (Meyer, 1945; Vacin và Went, 1949; Griffin và Link, 1957) Vì trong phôi lan có nhu cầu đặc biệt về nguồn đạm, do vậy có thể các thành phần trong dịch chiết có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của phôi

Than hoạt tính (activated charcoal): Than hoạt tính cho vào môi trường nhằm

mục đích làm tối môi trường nuôi cấy (môi trường tạo rễ), hấp thu các phân tử kim loại và các phân tử có cấu trúc vòng (ví dụ chất điều hòa sinh trưởng) hoặc các chất có phenol Khi bổ sung than hoạt tính ở nồng độ thích hợp vào môi trường nuôi cấy lan, các hợp chất phenol trong môi trường sẽ được loại bỏ, giúp mô sinh trưởng tốt Việc

bổ sung than hoạt tính vào môi trường có tác dụng khử độc Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng và làm đen môi trường Khả năng kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với

các chất tạo phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy

pH môi trường: pH thường được điều chỉnh trong khoảng 5,5 - 6 trước khi hấp

khử trùng pH quyết định sự hòa tan của khoáng trong môi trường và ảnh hưởng sự hấp thu khoáng trong môi trường, ảnh hưởng trên sự tạo gel của agar khi hấp khử

trùng pH thấp (pH < 4,5) môi trường có agar rất khó tạo gel

Chelate: Chelate là chất có khả năng thành lập phức chất với các cation kim

loại và giúp giữ chúng trong dung dịch Các chelate phổ biến như: EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid), EDDHA (ethylenediamine-di (o-hydroxyphenyl) acetic acid)

2.2 Giới thiệu về hoa lan và kỹ thuật nhân giống hoa lan

Hình 2.2 Sơ đồ các bộ phận dùng nuôi cấy in vitro ở cây lan

A Chồi: (1) trẻ, (2) già, (3) mới phát triển, (4) giả hành và chồi nách

B Phát hoa: (1) chồi nách, (2) hoa nở, (3) chồi trong quá trình phát triển

C Mô phân sinh đỉnh D Chồi E Chồi trên trục hoa F Lá non

G Chồi có thể được hình thành từ (1) chồi ngọn, (2) chồi, (3) chồi trục hoa

H Đỉnh chồi I Quá trình tạo cây con từ các loại chồi khác nhau

2.2.1 Lịch sử trồng lan trên thế giới và ở Việt Nam

2.2.1.1 Lịch sử trồng lan trên thế giới

Ở Châu Âu, người ta có thể tìm thấy dấu vết về sự quan tâm đến loài lan từ thời

Hy Lạp và La Mã Vào lúc đó người ta chỉ biết đến địa lan, vốn khác xa với loài lan cộng sinh nhiệt đới Người Hy Lạp sống dựa nhiều vào tài nguyên của thế giới tự nhiên và họ sử dụng phần thân chìm cùng bộ rễ của đa số loài lan Châu Âu để làm thuốc chữa bệnh, họ nghiên cứu hình dạng kỳ lạ của hoa lan và tin rằng các hình dạng khác nhau đó biểu lộ những hữu ích của cây lan Đến cuối thế kỷ 18, loài lan trở thành một biểu tượng về vị thế cho giới nhà giàu và những người nổi tiếng Năm 1856 loài

lan lai đầu tiên đã nở hoa, đó là loài Calanthe Năm 1869 loài lan lai đầu tiên được trồng là Paphiopedilum Harrisianum Khi thế chiến thứ hai ập đến, những giống lan

tốt nhất của Anh đã được chuyển đến lưu giữ ở California, Nam Phi và Úc (Thiên Kim, 2009)

2.2.1.2 Lịch sử trồng lan ở Việt Nam

Hoa lan đến với người Việt Nam qua những vị thuốc chữa bệnh lưu truyền trong dân gian Đời Trần Anh Tông nhà vua rất thích sưu tầm các loài hoa, đặc biệt đã sưu tầm được 500 loài lan quý, lập nên “Ngũ Bách Viên” - niềm kiêu hãnh của vị vua phong nhã Bên cạnh “Ngũ Bách Viên” của vua Trần Anh Tông còn có một vườn lan lớn ở Thanh Hà - Thanh Long là vườn lan của Lữ Hồng Chiêu Việc xuất khẩu hoa lan

ở Việt Nam chính thức được thực hiện vào năm 1980 do công ty Vegetexco xuất lan cắt cành ở Đà Lạt Năm 1976 trung tâm sinh học thực nghiệm thành phố Hồ Chí Minh

đã tổ chức phòng nuôi cấy mô lan và tạo ra hàng loạt cây con phong lan nuôi cấy mô

Năm 1987, Ủy ban khoa học thành phố tổ chức nghiên cứu đề tài về kinh tế kỹ thuật lan xuất khẩu Năm 1987 - 1988, hội khoa học lâm nghiệp và trường đại học tổng hợp đã mở nhiều lớp nuôi trồng lan xuất khẩu, phong trào nuôi trồng lan thành phố trong thời gian này ngày càng sôi động Hiện nay nhiều hội hoa lan, cây cảnh thành phố ra đời và thường xuyên mở những hội thảo về hoa lan, cây cảnh

2.2.2 Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và Việt Nam

2.2.2.1 Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới

Năm 2006, khối EU có sản lượng xuất khẩu hoa lan trên thế giới đạt 55 tỉ sản phẩm Trong đó Hà Lan là quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất khẩu, do trồng lan trong nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm Năm

2006, Hà Lan xuất khẩu hoa lan chiếm 95% tổng sản lượng hoa lan trong khối EU

(Nguồn: AIHP/Union Fluers: International Statistics Flowers and Plants 2007)

Hoa lan hiện nay đang là mặt hàng xuất khẩu chiến lược, mang lại nguồn lợi kinh tế cho nhiều quốc gia Châu Á Thái Lan là nước xuất khẩu chủ yếu hoa lan nhiệt

đới, đặc biệt là Dendrobium, phổ biến nhất là Dendrobium Sonia, ngoài ra còn có

Aranda, Mokara và Vanda Hiện nay, Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về hoa lan,

đặc biệt là Dendrobium, nó trở thành niềm kiêu hãnh của người trồng hoa lan ở Thái

Lan khi có khoảng 24 triệu m2 trang trại trồng hoa lan (Thiên Kim, 2009)

Đài Loan là nước đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan Hồ Điệp

bằng quy trình công nghệ cao Trên thị trường thế giới, sản phẩm chủ yếu của hoa lan

Hồ Điệp là hoa chậu, sản phẩm này có giá trị kinh tế cao gấp nhiều lần so với hoa lan

Hồ Điệp cắt cành Năm 2004, Hoa Kỳ đã cung cấp giấy phép xuất khẩu lan Phalaenopsis cho Đài Loan trên thị trường Hoa Kỳ

2.2.2.2 Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam

Nền kinh tế Việt Nam những năm qua phát triển vượt bậc đã nâng cao mức sống của người dân nhất là dân cư các thành phố lớn trong cả nước Do đó nhu cầu hoa lan cắt cành tăng cao Theo số liệu thống kê của vụ kế hoạch thuộc Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn Việt Namthì trồng lan cắt cành Dendrobium và Mokara 1 ha có

thể cho kinh doanh 500 triệu - 1 tỷ đồng/ha-năm Đặc biệt Đà Lạt là nơi sản xuất hoa lan sớm nhất cả nước với nguồn cây giống phong phú săn tìm trong rừng sâu Lâm Đồng dẫn đầu cả nước về nguồn lợi lan rừng với 101 chi và 396 loài, chiếm 55,3% về chi và 76,5% về loài lan rừng Việt Nam

Theo số liệu thống kê của Tổng cục Hải quan, kim ngạch nhập khẩu phong lan cắt cành qua đường chính ngạch của nước ta trong tháng 2/2007 là 26,515 nghìn USD, giảm 20,17% so với tháng 1/2007, nhưng vẫn tăng 21% so với tháng 12/2007 Chỉ riêng thành phố Hồ Chí Minh năm 2003 doanh thu từ kinh doanh hoa lan và cây cảnh mới chỉ đạt 200 - 300 tỷ đồng thì đến tháng 1/2008, con số này đã tăng lên 400 tỷ đồng Trên thực tế tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam còn chưa tương xứng với

tiềm năng (Nguồn: lantaynguyen.wordpress.com)

2.2.3 Giới thiệu về hoa lan Mokara

Năm 2006 và 2007, trung tâm Công nghệ sinh học đã tiến hành nhập nội và

đánh giá một số giống lan Mokara Lan Mokara là loại lan có giá trị kinh tế lớn, nhiều

màu sắc phong phú và đa dạng, là loại hoa có lượng lưu thông lớn trên thị trường thế

giới Hiện nay trên thị trường Việt Nam, các loại hoa Mokara đang được bán phổ biến

từ 10.000 - 15.000 đồng/cành (theo điều tra của thời báo kinh tế) Vốn đầu tư vào phát

triển lan Mokara sẽ đem lại cho sản xuất lợi nhuận rất cao

2.2.3.1 Phân loại lan Mokara

Lan Mokara được phân loại theo giới, ngành, lớp, bộ, họ, tên lai, tên Việt Nam Trong đó giới là Plantea, ngành là Angiospermatophyta, lớp là Monocotyliedoneae,

bộ là Orchidales, họ là Orchidaceae, tên lai là Mokara, tên Việt Nam là lan đất

2.2.3.2 Nguồn gốc và sự phân bố

Năm 1969, cây lan lai tên Mokara Wai Liang đầu tiên trên thế giới được chính thức ra đời ở Singapore, dưới bàn tay tài hoa của C.Y.Mok Lan Mokara là loài lan lai

giữa ba giống lan Arachnis, Ascocentrum và Vanda Do đó có đặc tính nổi bật từ bố

mẹ, đó là dạng hoa và màu sắc đẹp từ Vanda và tăng trưởng nhanh từ Ascocentrum x

Vanda Sau đó giống lan này lan truyền tới các nước Đông Nam Á Châu như Thái

Lan, Mã lai, Nam Dương và Việt Nam

Ở Việt Nam thuộc vùng nhiệt đới, thành phố Hồ Chí Minh cùng các tỉnh miền

Đông và Tây Nam Bộ có điều kiện khí hậu thích hợp cho loại lan Mokara phát triển

Mokara là loại lan đơn thân, dễ trồng, tăng trưởng nhanh trong điều kiện khí hậu nóng

ẩm Lan Mokara rất dễ nhân giống, hệ số nhân giống cao Hoa Mokara hình dáng hoa

rất phong phú, có nhiều màu sắc đẹp như màu hồng, đỏ, vàng chanh, vàng đồng, cam, tím, trắng, …

2.2.3.4 Hình thái lan Mokara

Lan Mokara là loài đơn thân, thân hình trụ dài tiếp tục mọc cao lên mãi, không

có giả hành, lá dài hình lòng máng hay hình trụ mọc cách hai bên thân Phát hoa mọc

từ nách lá giữa thân, phát hoa dài mang nhiều hoa thường không phân nhánh

Hoa Mokara có nhiều màu sắc phong phú từ màu vàng chanh, có màu hồng,

đỏ, tím, trên cánh hoa thường có chấm, có đốm hoặc hình caro rất đẹp Thường có 8 -

16 hoa/cành, rất thích hợp cho trồng sản xuất hoa cắt cành do siêng ra hoa Hoa cỡ trung bình đến lớn, cánh đài của hoa rất lớn Dễ trồng, dễ tách chiết, hệ số nhân cao, sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nóng ẩm

Thân Mokara luôn mọc cao về phía đỉnh, sự mọc dài của đỉnh không có giới

hạn nên cây chỉ có một cây phát triển vô hạn theo chiều thẳng đứng, sự phát triển này chỉ dừng lại khi ngọn bị tổn thương, lúc đó chồi bên xẻ rách bẹ lá đế mọc dài ra thành nhánh Các nhánh cũng phát triển vô hạn về đỉnh Rễ xẻ bẹ lá chui ra ngoài dọc theo chiều dài của cây Phát hoa chỉ xuất phát từ nách lá, ở một bên thân mà không bao giờ

ở đỉnh ngọn

2.2.3.5 Các điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng nuôi trồng lan Mokara in vitro

a Ánh sáng là một trong những điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng tới nuôi trồng

lan Mokara in vitro

Ánh sáng là yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng của lan Mokara Ánh sáng đem

năng lượng cần thiết cho phản ứng quang tổng hợp, nhờ đó cây tạo được chất dinh dưỡng Để ra hoa mỗi ngày cần chiếu sáng suốt 6 giờ liền, không được chiếu ánh sáng trực tiếp, do đó ta sử dụng lưới có độ che phủ từ 20 - 30% ánh sáng

b Nhiệt độ là điều kiện ảnh hưởng tới nuôi trồng lan Mokara in vitro

Mokara có thể trồng trong môi trường nóng từ 27 - 32oC, ban đêm từ 17 - 22oC, phát triển từ 25 - 30oC Nhiệt độ là một trong những yếu tố quyết định sự ra hoa của

Mokara Thường khi nhiệt độ tăng lên 10oC thì tốc độ quang hợp tăng lên gấp 2 lần

c Độ ẩm là điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng tới nuôi trồng lan Mokara in vitro

Độ ẩm cao xung quanh là điều kiện sống cơ bản cho các giống cây xuất xứ ở vùng nhiệt đới Sự tăng nhiệt độ có nghĩa là hạ độ ẩm, vì thế ta phải dùng các phương pháp để kiểm soát độ ẩm Độ ẩm thích hợp là 50 - 60% Khi chọn địa điểm để thiết lập

vườn lan Mokara cần lưu ý 3 loại độ ẩm: độ ẩm của vùng, độ ẩm của vườn và độ ẩm

trong chậu

d Độ thông thoáng là một trong những điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng tới

nuôi trồng lan Mokara in vitro

Lan Mokara rất cần độ thông thoáng nhiều, nhất là trường hợp trồng cây trong

chậu, vì hệ rễ của cây rất phát triển mà chất trồng (giá thể) lại bí Nên sử dụng chậu đất

có nhiều lỗ thoát, bỏ một ít (rất nhỏ) chất trồng vào chậu, hay không cần giá thể cây vẫn sinh trưởng tốt nhưng phải cung cấp thường xuyên dinh dưỡng cho cây

e Nhu cầu dinh dưỡng và nước tưới là một trong những điều kiện ngoại cảnh

ảnh hưởng tới nuôi trồng lan Mokara in vitro

Chất lượng nước yêu cầu là: nước ngọt, ít lượng muối hòa tan bên trong, nước không bị phèn, bẩn, acid, clo, pH thích hợp là 5,5 – 6,5 Đây được xem là yếu tố quan trọng để làm vườn lan

2.2.3.6 Giá trị lan Mokara

a Giá trị thẩm mỹ của lan Mokara

Từ rất lâu, người Phương Đông đã biết thưởng thức vẻ đẹp của hoa lan Đến

năm 1731, người Phương Tây mới biết đến loài hoa lan đầu tiên - Bletia purpurea -

mang từ quần đảo Bahama nằm giữa Đại Tây Dương Vào cuối thế kỷ XIX, ở các nước Âu Mỹ đã xảy ra “cơn sốt phong Lan” Bị lôi cuốn vì vẻ đẹp diệu kì của hoa lan, nhiều người săn hoa lan đã lên đường đến những khu rừng rậm ở Braxin, Tân Ghi-nê

và không ít người ra đi không trở lại Được thiên nhiên ưu đãi, Thái Lan là một trong

những nước xuất khẩu lan Mokara vào bậc nhất trên thế giới, họ không chỉ xuất hoa tươi mà còn xuất hoa khô Hoa Lan nói chung và hoa lan Mokara nói riêng được dùng

để trang trí tạo nên sự sang trọng trong nhà, văn phòng, công ty, Ở Việt Nam, lan là

một trong những sản phẩm đặc thù của ngành nông nghiệp đô thị góp phần tích cực làm cho chất lượng môi trường sống ngày càng trong lành hơn, mỹ quan hơn

b Giá trị kinh tế của lan Mokara

Hiện tại trồng lan Mokara có hiệu quả kinh tế cao và sự chăm sóc tương đối dễ hơn Chỉ riêng lan cắt cành như Mokara hằng năm phải nhập khẩu trên một triệu cành

(với giá bình quân 4000 đồng/cành) với trị giá thành phố phải chi hơn 4 tỷ đồng

Chính vì lí do nhập Mokara từ nước ngoài, nên hiện nay giá của nó tăng khá cao Cho nên vào thời điểm này, trồng lan Mokara hiệu quả kinh tế cao vì cành hoa cắt và giống

cây trồng đang có nhu cầu lớn, được giá

c Công dụng khác của lan Mokara

Nhiều dân tộc Trung và Nam Mỹ dùng các bộ phận một số loài cây hoa lan làm thức ăn, nước uống thay trà, trị bệnh sốt rét, táo bón, nhức đầu, bệnh suy dinh dưỡng của trẻ em, đan chiếu, rổ dệt thành đồ trang sức, làm kèn để thổi trong các buổi lễ đình

đám hội hè Cây hoa Mokara cũng có công dụng như vậy Công nghệ mỹ phẩm dùng tinh dầu hoa lan Mokara làm hương liệu, nhiên liệu

2.3 Giới thiệu về hệ thống Bioreactor trong nuôi cấy mô

2.3.1 Giới thiệu chung

Ngày nay, việc nghiên cứu cải thiện các quy trình nhân giống thực vật nhất là cây hoa cảnh trong ống nghiệm rất được quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên khắp thế giới Để ứng dụng của hệ thống vi nhân giống thông thường trên môi trường thạch vào quy mô công nghiệp nhằm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh, giảm chi phí giá thành, tăng hệ

số nhân giống Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp nuôi cấy trong môi trường lỏng có hay không có lắc Kỹ thuật này cho phép đạt được hệ số nhân chồi, tạo phôi soma, PLB (protocom-like body: thể giống protocom) nhiều hơn so với trên môi trường thạch

Tuy nhiên khi nuôi cấy trên môi trường lỏng, mẫu cấy bị trương nước và bị hiện tượng thủy tinh thể do ngập nước quá lâu trong môi trường, ngoài ra mẫu còn bị những tổn thương do quá trình lắc Vì vậy để kết hợp những ưu điểm của hệ thống nuôi cấy trên thạch với nuôi cấy lỏng Vào năm 1983, Harris và Mason đã thiết kế hai hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời là hệ thống nuôi cấy nghiêng và hệ thống Rocker Ít lâu sau, vào năm 1985, Tisserat và Vandercook đã thiết kế một hệ thống nuôi cấy tự động APCS, đây là hệ thống có thể thay thế được môi trường và có thể sử dụng nuôi cấy

trong một thời gian dài mà không cần cấy chuyền Ngoài ra còn có một số hệ thống ngập chìm tạm thời một phần hay toàn phần được điều khiển tự động bằng máy tính hay bán tự động Hiện nay đáng chú ý là hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA của hãng Cirad, Pháp; BIT Twin Flask của Cuba đã được khảo sát và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau

Bioreactor từng được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp vi sinh, sản xuất các hoạt chất sinh học có nguồn gốc từ động vật và thực vật Việc sử dụng bioreactor cho nhân giống thực vật được báo cáo đầu tiên vào năm 1981 với nghiên cứu của tác giả Takayama trên đối tượng là cây Begonia (Takayama và Miasawa, 1981) Về sau hệ thống này còn được ứng dụng có hiệu quả trên nhiều loài thực vật khác (Takayama, 1994)

Sử dụng một bioreactor cỡ nhỏ (từ 4 - 10 lít) trong khoảng 1 - 2 tháng có thể tạo

ra đến 4.000 - 20.000 cây con Điều này cho thấy khả năng và triển vọng to lớn của việc áp dụng hệ thống bioreactor trong vi nhân giống thương mại, đồng thời mở ra một hướng mới trong sản xuất các sản phẩm có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ thực vật (Takayama, 1994) Nuôi cấy lỏng lắc là bước đầu tiên đơn giản nhất trong nuôi cấy lỏng thoáng khí Về sau để đáp ứng với quy mô công nghiệp ngày càng lớn cũng như nhằm tạo sự điều khiển tự động trong nuôi cấy thực vật, hệ thống bioreactor đã ra đời Mục đích của nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor là tăng nhanh số lượng lớn sinh khối, nuôi cấy huyền phù tế bào nhằm chiết xuất các hoạt chất sinh học thứ cấp và đồng thời giúp giảm chi phí trong nhân giống thực vật (Nhựt và cộng sự, 2005)

Bioreactor được mô tả là một bình phản ứng có những tính chất sau: nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, nuôi cấy trong môi trường lỏng, số lượng mẫu cấy nhiều, có khả năng tự động hóa, vi tinh hóa thông qua vi điều khiển các yếu tố môi trường như mức độ khuấy trộn, thoáng khí, nhiệt độ, oxy hòa tan, pH (Peak và cộng sự, 2005)

2.3.2 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản của hệ thống bioreactor

Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi Teisson

và cộng sự năm 1999: tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy Cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ, cung cấp sự hòa trộn đầy đủ Có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động Hạn chế sự nhiễm, giá thành hạ

Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm đều phải tuân theo một nguyên tắc là phải có khả năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo chu kỳ xác định Các hệ thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với hệ thống mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển Các mẫu cấy thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa polypropylene thành một cụm, điều này giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuôi cấy thông thường

Tóm lại hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ phận chủ yếu sau: bơm hay máy nén khí tạo áp lực để hút môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại Hệ thống cài đặt thời gian dùng để điều khiển chu kỳ ngập Hệ thống ống dẫn và van điều khiển, các màng lọc Bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời, nhiều nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập khác nhau, tùy vào mục đích nuôi cấy khác nhau

Sau đây là ba biến thể khác nhau đã được phát triển và bán rộng rãi trên thị trường, đó là hệ thống RITA, thứ hai là hệ thống bình đôi BIT và hệ thống Plantima

2.3.2.1 Hệ thống RITA®

Hình 2.4 Hệ thống RITA®

Pha 1: mô không ngập trong môi trường

Pha 2: hiện tượng ngập được hoạt hóa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc

đẩy môi trường lỏng lên ngập mô cấy

Pha 3: sự trao đổi khí trong hệ thống RITA®

Pha 4: chu kỳ kết thúc, các van đóng lại và môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới

Hệ thống RITA® (hình 2.4) là công trình của Teisson và Alvard vào năm 1995 Một bình chứa 1 L gồm có hai phần, phần trên chứa mẫu cấy và phần dưới chứa môi trường Một áp suất vượt mức tác động vào môi trường lỏng chứa trong phần dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì Trong suốt thời gian ngập, không khí được sục vào trong môi trường lỏng, môi trường được chuyển động làm cho mẫu cấy xoay trở được các mặt tiếp xúc với bề mặt môi trường, áp suất vượt mức sau đó được thoát ra bên ngoài nhờ một ngõ ra phía trên đầu hệ thống

2.3.2.2 Hệ thống bình sinh đôi BIT®

Hệ thống bình sinh đôi BIT® (hình 2.5) được thiết kế bởi Escalona và cộng sự (1998) được dự định nhân giống số lượng lớn qua con đường phát sinh phôi soma Ðối với nhân giống theo con đường phát sinh cơ quan kích thước mẫu cấy đòi hỏi một hệ thống có thể tích lớn hơn và rẻ hơn Con đường dễ dàng nhất để đạt được trạng thái ngập chìm tạm thời theo chu kỳ nhất định là nối hai bình thủy tinh hay plastic có kích thước từ 250 ml - 10 L bằng một hệ thống ống dẫn và điều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình chứa mẫu và ngược lại Hệ thống BIT® được thiết kế đáp ứng với những yêu cầu trên

Hình 2.5 Hệ thống bình sinh đôi BIT®

2.3.2.3 Hệ thống Plantima®

Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA® tuy nhiên có thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi Công ty A-tech Bioscientific tại đảo Ðài Loan Cấu tạo và phương pháp vận hành cơ bản (hình 2.6 và hình 2.7):

Hình 2.6 Các thành phần của hệ thống Plantima

Hình 2.7 Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập

2.3.3 Ưu điểm và khuyết điểm của hệ thống bioreactor

2.3.3.1 Ưu điểm của hệ thống bioreactor

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System, TIS) có tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh phôi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi của cây được nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời luôn cao hơn so với những cây nuôi cấy trong hệ thống thông thường trên môi trường rắn hay trong những

hệ thống bioreactor thông thường Cây tái sinh và phôi soma thu được trong hệ thống này luôn có chất lượng tốt hơn Từ đó cây có nguồn gốc từ hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời có tỷ lệ sống sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh trong quá trình thuần hóa ngoài vườn ươm

Có thể nói hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã kết hợp thành công những

ưu điểm của hệ thống nuôi cấy rắn thoáng khí và hệ thống nuôi cấy lỏng giúp cây tránh được những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên môi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng Chu kỳ và tần số ngập chìm là những chỉ số chủ yếu ảnh hưởng đến sự phát triển của mẫu cấy cũng như toàn bộ quy trình nhân giống Khi những chỉ số này được tối ưu hóa, sản lượng sẽ được gia tăng, quá trình kiểm soát sự phát sinh hình thái tốt hơn và còn có khả năng hạn chế tối đa hiện tượng thủy tinh thể Ðây là ưu điểm lớn nhất của hệ thống TIS so với hệ thống bioreactor thông thường (Dương Tấn Nhật, 2009) Hệ thống TIS tiết kiệm được công lao động và không gian phòng nuôi cấy và giảm được chi phí sản xuất Những quá trình nhân nhanh phôi soma, tái sinh nhiều chồi, tạo củ bi có khả năng được tối ưu hóa trên nhiều đối tượng cây trồng từ đó giảm được chi phí sản xuất một cách đáng kể

2.3.3.2 Khuyết điểm của hệ thống bioreactor

Mật độ nuôi cấy là một yếu tố không kém phần quan trọng nhưng hiện nay vẫn

chưa được khảo sát một cách sâu rộng Thời gian ngập tối ưu phải được khảo sát và xác định chính xác cho từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây cũng như thời gian giữa các lần cấy chuyền đối với những hệ thống không thể bổ sung môi trường mới, cuối cùng là phải khảo sát tối ưu hóa thành phần môi trường cho từng giai đoạn nuôi cấy Hiện nay, nhiều nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời về mặt vật lý là rất cần thiết để có thể tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trong những hệ thống này Một ưu điểm khác của hệ thống này trong việc giảm được hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy của mẫu cấy vẫn chưa được đánh giá chính xác

Trong điều kiện Việt Nam hiện nay, giá thành của những hệ thống nuôi cấy TIS tương đối cao do phải nhập hệ thống này từ nước ngoài như Pháp, Cuba, Đài Loan do

đó nếu muốn ứng dụng rộng rãi thì những hệ thống này nhất thiết phải được nghiên cứu thiết kế ngay trong nước để giảm giá thành Ngoài ra, những thông số kỹ thuật của

hệ thống này cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây, có được những điều kiện như vậy thì chúng ta mới có khả năng áp dụng hệ thống TIS rộng rãi trong sản xuất cây giống

2.3.4 Một số thành tựu trong hệ thống bioreactor

Môi trường lỏng là môi trường đã sử dụng trong nuôi cấy tế bào, phôi soma hay

cơ quan thực vật kể cả trong nuôi cấy tĩnh hay các kiểu bioreactor khác nhau Mặc dù trước đây bioreactor chủ yếu được sử dụng trực tiếp cho nuôi cấy huyền phù tế bào và sản xuất sản phẩm thứ cấp, nhưng gần đây cũng có nhiều bioreactor được cải tiến để tạo phôi soma đã được công bố trên một số giống cây Việc nuôi cấy trong môi trường lỏng bằng hệ thống huyền phù tạm thời với các tần suất khác nhau của huyền phù đã được báo cáo là cải thiện chất lượng cây trồng và tốc độ nhân giống của chuối, cà phê, cao su Bioreactor cũng được sử dụng cho nuôi cấy tế bào rễ bằng hệ thống tạo rễ thứ cấp Việc sử dụng một kiểu bioreactor che kín giúp cho việc tạo rễ và phát sinh chồi cây hoa cẩm chướng đã được báo cáo là cải thiện quá trình tăng sinh khối (Chatterjee

một số giống Areceae

2.3.5 Thuận lợi và khó khăn trong nuôi cấy trong hệ thống bioreactor

2.3.5.1 Thuận lợi trong nuôi cấy trong hệ thống bioreactor

Nuôi cấy được các mẫu ngập chìm và phân bố theo không gian 3 chiều nên tiết kiệm được không gian, tăng cường được sự khoáng khí nên kích thích mẫu phát triển nhanh Khi nuôi cấy ngập chìm và được di chuyển tự do trong môi trường, hiệu ứng

ưu thế ngọn bị biến mất và các chồi phát triển tương đối đồng đều nhau Có sự tiếp xúc tốt hơn giữa sinh khối thực vật với môi trường, không có sự hạn chế về trao đổi khí, có thể điều khiển sinh khối thực vật tùy theo thể tích môi trường, tiết kiệm được thời gian

và nhân công trong việc nuôi cấy chuyền, dễ dàng cho nhân giống số lượng lớn tạo nhiều sinh khối, dễ dàng điều khiển được thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy, tốc độ sinh trưởng và phát triển tăng hơn nếu được tăng cường không khí, mẫu cần tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên tốc độ sinh trưởng và phát triển được tăng nhanh, nhờ việc liên tục di chuyển trong môi trường cấy nên ít xảy ra

hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả tạo được nhiều chồi hơn (Takayama và cộng sự, 1994)

2.3.5.2 Khó khăn trong nuôi cấy trong hệ thống bioreactor

Tùy vào đối tượng mà thiết kế một kiểu bioreactor thích hợp, khó áp dụng đồng loạt cho nhiều giống khác nhau, thường gặp hiện tượng bất thường về phát sinh hình thái như hiện tượng thủy tinh thể, hiện tượng bất thường của phôi, hiện tượng stress tế bào (Ziv, 1999) Những hiện tượng trên làm giảm hiệu suất nhân giống và sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Trong nuôi cấy môi trường lỏng rất dễ bị nhiễm vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, nấm mốc) Đây là nguyên nhân chủ yếu gây mất nguồn mẫu thực vật trong các phòng thí nghiệm thương mại Vì là môi trường lỏng nên sự lây nhiễm vi sinh vật sẽ xảy ra rất nhanh và gây hậu quả nghiêm trọng hơn so với các môi trường khác (rắn, bán rắn) Sự lây nhiễm có thể xuất phát từ các giai đoạn thao tác chuẩn bị và điều khiển thiết bị Trong một số phòng thí nghiệm để hạn chế nguy cơ bị nhiễm thì người ta thường tạo một không gian vô trùng trong phòng cấy bằng dòng không khí tạo áp lực dương (Ziv, 1999)

2.4 Tổng quan về đèn LED

2.4.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển

LED (viết tắt của Light Emitting Diode, có nghĩa là đi-ốt phát quang) là những đi-ốt có khả năng phát ra ánh sáng hay tia hồng ngoại Cũng giống như đi-ốt LED được cấu tạo từ một khối bán dẫn loại p ghép với một khối bán dẫn loại n Bắt đầu xuất hiện vào những năm đầu thiên niên kỷ, đèn LED (Light Emitting Diode) vốn là sản phẩm từ linh kiện bán dẫn phát sáng, giống như đèn neon nhưng tuổi thọ cao hơn đèn neon gấp 50-100 lần, hiệu suất phát sáng lên đến gần cả trăm lumens/watt Do tiêu hao nhiệt rất ít nên đèn LED không gây nóng môi trường xung quanh, không phát ra tia cực tím

Từ năm 1974 đến tháng 10/2009 có 2,272 sáng chế về LED Nhìn bản đồ sáng chế của LED qua các năm, có thể nhận thấy con đường phát triển của công nghệ LED chia làm 2 chặng rõ rệt Từ những năm 2000 trở về trước, sáng chế LED chỉ dừng ở con số hàng chục thì từ năm 2000 đến nay, số lượng sáng chế về LED tăng vọt, đạt đến con số hàng trăm Các công ty sở hữu các sáng chế LED chính là các công ty điện

tử có bề dày phát triển và có thế mạnh trên thị trường Dẫn đầu là tập đoàn chiếu sáng

số 1 Philips với 164 sáng chế, thứ hai là Cree Inc với 33 sáng chế, một số tập đoàn

điện tử khác cũng đã ghi tên mình trên bản đồ sáng chế là Gelcore LLC (28), Osram (27), Siemens (23), Samsung (20), LG (17), Univ (15)

Hình 2.8 Các loại đèn LED 2.4.2 Cấu tạo đèn LED

Quy trình chế tạo đèn LED trải qua hai giai đoạn chính là chế tạo tim đèn trước rồi gắn với hai điện cực tạo thành bóng đèn Hai điện cực này có độ dài khác nhau, chân dài là anode (điện cực dương), ngắn hơn là cathode (điện cực âm) Tim đèn là phần nối giữa hai điện cực, gọi là LED chip, được làm bằng vật liệu bán dẫn Dòng điện một chiều đi qua làm chuyển động khuyếch tán các điện tích âm và dương giữa hai điện cực và giải phóng năng lượng dưới dạng ánh sáng Tùy vào loại vật liệu bán dẫn dùng để chế tạo LED chip mà cho ra các đèn LED với màu sắc khác nhau Aluminum gallium arsenide (AlGaAs) tạo ra LED đỏ, aluminum gallium phosphide (AlGaP) cho ra LED xanh lá, indium gallium nitride (InGaN) cho ra LED xanh biển, GaP cho ra LED vàng, … Đèn LED trắng là sự kết hợp của đèn LED đỏ, xanh lá và xanh biển Cách thứ hai để tạo ra đèn LED trắng là phủ một lớp phosphor vàng vào đèn LED xanh biển

Hình 2.9 Cấu tạo của một bóng đèn LED

Tùy theo mức năng lượng giải phóng cao hay thấp mà bước sóng ánh sáng phát

ra khác nhau (tức màu sắc của LED sẽ khác nhau) Mức năng lượng và màu sắc của LED hoàn toàn phụ thuộc vào cấu trúc năng lượng của các nguyên tử chất bán dẫn

2.4.3 Ứng dụng của đèn LED

Các LED phát ra tia hồng ngoại được dùng trong các thiết bị điều khiển từ xa cho đồ điện tử dân dụng Đèn LED trắng nói riêng và đèn LED nói chung có nhiều ứng dụng rộng rãi mà đèn huỳnh quang không làm được như đèn xe, đèn đường, đèn hầm mỏ, đèn chiếu hậu cho màn hình của điện thoại cầm tay, đèn chiếu hậu cho màn hình tinh thể lỏng (LCD), in ấn kỹ thuật số, làm linh kiện cho các sản phẩm điện tử cầm tay, làm đèn báo hiệu trong giao thông Trong ngành quảng cáo đèn LED được ứng dụng rộng rãi để làm các bảng điện tử tại các nơi công cộng như: nhà ga, sân bay, ngân hàng, các trung tâm thương mại, siêu thị, … Một đặc điểm khác của đèn LED là

ít tiêu hao năng lượng và không nóng Bóng đèn truyền thống, đèn neon, đèn halogen, đều cần từ 110-220 V mới cháy được, trong khi đèn LED trắng chỉ cần từ 3-24 V để phát sáng Do ít tiêu hao năng lượng nên đèn LED có thể sử dụng ở vùng sâu vùng xa

mà không cần nhà máy phát điện công suất cao

2.4.4 Cơ sở của việc sử dụng đèn LED trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

LED có những đặc tính tốt hơn so với các nguồn ánh sáng khác như: đèn huỳnh quang, đèn hơi kim loại, đèn natri cao áp Bước sóng của nó phát ra rất đặc biệt, chiều rộng của vạch quang phổ ngắn, do vậy hiện nay LED được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu về quang sinh học như là: sự tổng hợp chlorophyll (Tripathy và Brown, 1995), quang hợp (Tennessen và cộng sự, 1994) Các đi ốt phát sáng LED là một nguồn năng lượng điện hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô Gần đây, Hahn và

cộng sự (2000) đã báo cáo rằng tốc độ quang hợp của cây Rehmannia glutinose nuôi cấy in vitro là rất cao dưới hệ thống đèn LED hỗn hợp (50% LED xanh và 50% LED

đỏ) hoặc dưới ánh đèn huỳnh quang Trong khi đó, cây con nuôi cấy dưới hệ thống LED xanh hoặc LED đỏ có tốc độ quang hợp rất thấp Cường độ photon cao của LED xanh, LED đỏ và độ dài bước sóng đặc trưng của chúng làm cho hệ thống đèn mới này mang lại nhiều thuận lợi

Dưới ánh sáng LED đỏ, lá của cây con được kéo dài và lượng chlorophyll giảm

đi Trước đó người ta đã biết rằng đèn LED đỏ có tác dụng kéo dài thân và mở rộng lá (Hoenecke và cộng sự, 1992) Trong nghiên cứu của họ, trọng lượng tươi và khô của

cây con dưới hệ thống LED đỏ giảm ít hơn dưới hệ thống đèn LED xanh Có sự giảm đặc biệt trọng lượng rễ dưới hệ thống đèn chỉ có LED đỏ hoặc chỉ có LED xanh Những cây con có thân được kéo dài dưới hệ thống LED đỏ có thân mảnh, lá hơi vàng,

có lượng chlorophyll, tốc độ quang hợp, trọng lượng tươi của đỉnh và rễ cũng thấp hơn

so với những cây được nuôi dưới hệ thống kết hợp đỏ và xanh

Phản ứng của cây con được nuôi cấy dưới tỷ lệ ánh sáng đỏ và xanh khác nhau tùy thuộc vào loài thực vật Công việc đóng vai trò quyết định chính là xác định được

tỷ lệ ánh sáng xanh và đỏ thích hợp Hahn và cộng sự (2000) đã nhận thấy rằng chiều dài chồi dưới điều kiện đèn LED xanh hoặc đỏ đều lớn hơn dưới điều kiện ánh sáng LED hỗn hợp hay đèn huỳnh quang, cây tăng trưởng vượt bậc nhưng yếu ớt Dưới ánh sáng LED hỗn hợp hay đèn huỳnh quang, thân cây không dài bằng nhưng khỏe mạnh Một số kết quả thu được trong các nghiên cứu này cho tỷ lệ đỏ xanh tối ưu của một số loài thực vật khi nuôi cấy dưới hệ thống đèn LED như: cây Dâu Tây tăng trưởng khỏe mạnh khi được nuôi cấy dưới nhiều tỷ lệ ánh sáng xanh đỏ khác nhau nhưng chúng tăng trưởng tốt nhất ở điều kiện 70% ánh sáng LED đỏ và 30% ánh sáng LED xanh Cây Bạch Đàn, cây Địa Lan, cây Hồ Điệp, cây Chuối và cây Lan Ý tăng trưởng tốt dưới điều kiện 80% ánh sáng LED đỏ và 20% ánh sáng LED xanh Các kết quả này cũng cho thấy sự tăng trưởng của cây con được nuôi cấy dưới hệ thống đèn LED đỏ và xanh đều chịu ảnh hưởng bởi LED xanh