NGHIÊN CỨU SỰ TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ VÀ KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH CHỒI CỦA CÂY CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SỰ TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ VÀ KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH CHỒI CỦ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ

VÀ KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH CHỒI CỦA CÂY CỎ NGỌT

(Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ NHẬT LỆ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU LÁ

VÀ KHẢO SÁT SỰ PHÁT SINH CHỒI CỦA CÂY CỎ NGỌT

(Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro

KS TÔ THỊ NHÃ TRẦM

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập

Các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố

Hồ Chí Minh đã giảng dạy và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này

Cô Tôn Trang Ánh và cô Tô Thị Nhã Trầm đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ rất nhiều và động viên, nhắc nhở tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Các bạn Lê Thị Ngân Hà, Huỳnh Phước và toàn thể lớp DH09SH đã động viên và giúp đỡ lúc tôi khó khăn nhất

Cuối cùng xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, người đã luôn bên con, cho con niềm tin và nghị lực để vượt qua mọi khó khăn

Nguyễn Thị Nhật Lệ

TÓM TẮT

Cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) (chất làm ngọt tự nhiên) thuộc họ

Cúc và có thể được sử dụng để thay thế các chất làm ngọt nhân tạo cho bệnh nhân tiểu đường Thông thường, nó được trồng bằng hạt hoặc cắt cành, nhưng tỷ lệ khả năng phát triển hạt giống là rất thấp Nghiên cứu sự phát sinh mô sẹo từ mẫu lá cây cỏ ngọt làm nguyên liệu và tiền đề cho các nghiên cứu nhằm ứng dụng vào sản xuất sinh khối thu nhận các hợp chất thứ cấp quý có trong cây Do đó, đề tài

“Nghiên cứu sự tạo mô sẹo từ mẫu lá và khảo sát sự phát sinh chồi của cây cỏ ngọt

(Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro” được tiến hành

Các đoạn thân và mẫu lá được khử trùng bề mặt bằng HgCl2 0,1% trong 2 phút sau đó rửa lại 5 lần với nước cất Bề mặt mẫu lá đã được khử trùng được nuôi cấy trên môi trường Murashige và Skoog (MS) với nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau như 2,4 - D và kinetin kết hợp với 2,4 - D Mô sẹo được phát sinh hiệu quả khi các mảnh lá được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 - D kết hợp với 1 mg/l kinetin sau 4 tuần nuôi cấy Mô sẹo trên được cấy truyền trên môi trường MS có bổ sung 3 mg/l BA kết hợp với 1 mg/l NAA cho khả năng nhân chồi cao nhất

Cảm ứng hình thành chồi từ đoạn thân cao nhất trong môi trường MS bổ sung BA Giảm nồng độ BA thúc đẩy quá trình nhân chồi Số lượng chồi tối đa tăng lên nhanh chóng đã thu được trên môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l BA sau 3 tuần nuôi cấy

SUMMARY

Stevia rebaudiana Bertoni (natural sweetener) belongs to Asteraceae family and

can be used as substitute of artificial sweeteners for diabetic patients Conventionally, it is cultivated by seeds or stem cutting, but seed viability rate is

poor Study the callus incurred from leaf samples of the Stevia rebaudiana Bertoni,

as materials and the premise for the research to apply in biomass production receive for secondary compounds in plants Therefore, the thesis “Research callus

formation from leaf samples and shoots generation of Stevia rebaudiana Bertoni in

vitro” were achieved

Nodal segments and leaf explants were surface sterilized with 0.1% HgCl2 for 2 minutes followed by rinsing them five times with double distilled water Surface sterilized leaf explants were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium with different concentrations of plant hormone like 2,4 - D and kinetin in combination with 2.4 - D Leaf - derived callus was efficiently induced when leaf segments were cultured on MS medium supplemented with 0.5 mg/l 2.4 - D and 1 mg/l kinetin after 4 weeks The above callus was sub - cultured on MS medium with 3 mg/l BA and 1 mg/l NAA for the highest shoot multiplication

The induction of multiple shoots from nodal segments was the highest in MS medium supplemented with BA Decreasing BA concentration promoted shoot multiplication The maximum number of proliferated shoots was obtained on MS medium supplement with 0.1 mg/l BA after 3 weeks

Key words: Stevia rebaudiana Bertoni, callus formation, shoots

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG x

DANH SÁCH CÁC HÌNH xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây cỏ ngọt (Stevia rebaudianna Bertoni) 3

2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

2.2.1 Khái niệm 5

2.2.2 Các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

2.2.2.1 Nuôi cấy phôi 6

2.2.2.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời 6

2.2.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh 6

2.2.2.4 Nuôi cấy bao phấn 7

2.2.2.5 Nuôi cấy tế bào đơn 7

2.2.2.6 Nuôi cấy các protoplast 7

2.2.3 Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật 8

2.2.4 Một số thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thực vật 8

2.3 Nhân giống vô tính in vitro 9

2.3.1 Sinh sản vô tính và hữu tính 9

2.3.2.1 Ưu điểm của vi nhân giống 9

2.3.2.2 Hạn chế của vi nhân giống 10

2.3.3 Các bước trong nhân giống vô tính in vitro 11

2.3.4 Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro 12

2.3.4.1 Đặc tính của auxin 12

2.3.4.2 Đặc tính của cytokinin 12

2.3.5 Hệ thống hình thành chồi 13

2.3.5.1 Nhân giống thông qua giai đoạn callus 13

2.3.5.2 Tạo chồi bất định 14

2.3.6 Các nhân tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 14

2.3.6.1 Mẫu nuôi cấy 14

2.3.6.2 Môi trường nuôi cấy 15

2.3.6.3 Tính bất định về mặt di truyền 16

2.3.6.4 Mẫu đưa vào nuôi cấy 16

2.3.6.5 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cây 16

2.3.6.6 Hiện tượng thủy tinh thể 17

2.4 Nhân giống 18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19

3.2 Vật liệu 19

3.3 Phương pháp nghiên cứu 20

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% và NaOCl 25% tới khử trùng mẫu lá cây cỏ ngọt 20

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự hình thành mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy 21

3.3.4 Khảo sát sự tạo chồi từ mô sẹo 23

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi từ đốt thân 24

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Thời gian và chất khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy lá cây cỏ ngọt 25

4.2 Ảnh hưởng của 2,4 - D đến sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá sau 3 tuần nuôi cấy 27

4.4 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng tạo chồi của mô sẹo lá 30

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34

5.1 Kết luận 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

6-benzylaminopurine Thủy ngân clorua 3-indol-acetic acid Indol-3-butyric acid N-(2-furanylmethyl)-1H-purine-6-amine Môi trường Murashige và Skoog (1962) Naphthalene acetic acid

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của HgCl2 và NaOCl đến khử trùng mẫu lá cây cỏ ngọt 20

Bảng 3.2 Nồng độ 2,4 - D được bổ sung vào môi trường phát sinh sẹo lá 21 Bảng 3.4 Sự kết hợp giữa BA và NAA trong môi trường tạo chồi từ mô sẹo lá 23 Bảng 3.5 Nồng độ BA được bổ sung vào môi trường tạo chồi từ đốt thân 24 Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thời gian và chất khử trùng đến mẫu lá cây cỏ ngọt 25 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của 2,4 - D đến sự hình thành mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy 27 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của 2,4 - D và kinetin đến sự hình thành mô sẹo và trọng

lượng tươi của mẫu cấy 28

Bảng 4.4 Cảm ứng phát sinh chồi từ mô sẹo lá 30 Bảng 4.5 Số lượng chồi được tạo thành từ đốt thân trên các loại môi trường 32 

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây cỏ ngọt (2004) 3

Hình 3.1 Mẫu lá và đốt thân cây cỏ ngọt 22

Hình 4.1 Mẫ lá cây cỏ ngọt được khử trùng bằng HgCl2 và NaOCl 26

Hình 4.2 Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4 - D 27

Hình 4.3 Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4 – D và kinetin 29

Hình 4.4 Sự hình thành chồi từ mô sẹo lá cây cỏ ngọt 31

Hình 4.5 Chồi mới được tạo thành từ đốt thân cây cỏ ngọt sau 28 ngày 32 

1997 lên 6,5% năm 2003 và tiếp tục tăng rất nhanh Tại Việt Nam, trong 4 thành phố lớn Hà Nội, Huế, Thành phố Hồ Chí Minh, Hải Phòng tỷ lệ bệnh tiểu đường là 4% Ước tính đến năm 2025 sẽ lên tới 330 triệu người (gần 6% dân số toàn cầu) Tỷ lệ bệnh tăng lên ở các nước phát triển là 42%, nhưng ở các nước đang phát triển (Việt Nam) sẽ là 170%

Loại cây này chứa rất nhiều chất có vị ngọt trong đó có stevioside – chất có vị ngọt gấp 300 lần đường sucrose đóng vai trò là thành phần chủ đạo, không gây độc hại cho con người, được sử dụng trong y học để dùng cho người bị bệnh đái đường, phòng chống xơ cứng động mạch ở người già, chống béo phì ở phụ nữ, chống sâu răng, chống ung thư vòm họng Trong công nghiệp thực phẩm stevioside là chất phụ gia để sản xuất bánh kẹo, rượu màu và nước giải khát Cây có rất nhiều ưu điểm như dễ trồng, thích nghi rộng rãi với nhiều vùng sinh thái khác nhau, khả năng chống chịu khá tốt Trồng cây trên quy mô lớn là một việc làm cần thiết để đảm bảo cung cấp đủ nguồn nguyên liệu ban đầu cho y học, công nghệ thực phẩm Hiện nay việc nhân giống cây bằng cách giâm cành, gieo hạt đang rất phổ biến nhưng có nhiều nhược điểm như chất lượng không đồng đều, thoái hóa giống, nếu nhân giống bằng giâm cành với số lượng lớn đòi hỏi phải có đầy đủ trang thiết bị và kỹ thuật cao; việc nhân giống bằng hạt gặp nhiều khó khăn thường không giữ được đặc tính của giống, thời gian nhân

giống lâu, cây giống không đồng đều Việc nghiên cứu nuôi cấy mô in vitro thành

công có thể nhân giống vô tính với tốc độ nhanh, tạo cây trồng sạch bệnh và kháng

đều cao Hiện nay việc nuôi cấy mô tế bào thực vật là công cụ rất tốt cho việc nhân giống nhanh và nghiên cứu tạo giống mới, có thể khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống truyền thống Do đó đề tài “ Nghiên cứu sự tạo mô sẹo từ

mẫu lá và khảo sát sự phát sinh chồi của cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) in

vitro” được thực hiện

1.2 Yêu cầu

Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy, nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến sự phát sinh mô sẹo từ mẫu lá và quá trình hình thành chồi từ mô sẹo lá,

số lượng chồi được tạo ra từ các đốt thân cây cỏ ngọt

1.3 Nội dung thực hiện

Khảo sát chất khử trùng và thời gian khử trùng mẫu cấy lá và thân cây cỏ ngọt nhằm cung cấp nguồn mẫu sạch cho các thí nghiệm sau

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích sinh trưởng lên khả năng phát sinh

mô sẹo từ nuôi cấy mẫu lá sau 3 tuần nuôi cấy

Khảo sát khả năng phát sinh chồi từ mô sẹo lá và khả năng tạo chồi từ các đốt thân cây cỏ ngọt

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây cỏ ngọt (Stevia rebaudianna Bertoni)

dã ở miền Nam nước Mỹ, ngoài ra còn có thể tìm thấy ở trong các môi trường bán khô hạn khác nhau, từ đồng cỏ đến địa hình rừng núi

Cây cỏ ngọt là loại cỏ sống lâu năm, 6 tháng sau khi trồng gốc bắt đầu hoá gỗ, mỗi gốc có nhiều cành (nếu để mọc tự nhiên cây có thể cao đến 100 cm) Cành non và lá đều phủ lông trắng mịn, lá mọc đối, hình mũi mác, dài 30 - 60 mm, rộng 15 - 30 mm,

có 3 gân chính xuất phát từ cuống lá Mép lá có răng cưa ở nửa phần trên Cụm hoa hình đầu, mỗi tổng bao có chứa 5 hoa nhỏ, tràng hình ống, màu trắng ngà, có 5 cánh nhỏ Có hai vòi nhụy dài đưa ra ngoài, hoa có mùi thơm nhẹ (hình dáng giống hoa cỏ Lào nhưng nhỏ hơn nhiều), mùa hoa từ tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau Toàn thân có vị ngọt, nhiều nhất ở lá, lá già chết khô ở dưới nhưng cuống rất dai nên không

rụng (vẫn còn vị ngọt) Cỏ ngọt sinh sản hữu tính (gieo hạt) và vô tính (giâm cành) là cây ưa ẩm, ưa sáng nhưng sợ úng và chết khi ngập nước

Stevia là loại cây có xu hướng phát triển tốt trên nhiều loại đất khác nhau từ đất cát đến đất sét pha bùn nhưng sẽ không phát triển trong đất mặn Trong mùa sinh trưởng, chúng phát triển mạnh trong phạm vi nhiệt độ từ 15 – 30oC, đòi hỏi các kỹ thuật canh tác tương tự các cây trồng khác Các bộ phận được dùng là cành mang lá phơi hoặc sấy khô (khi đoạn cành dài khoảng 20 - 25 cm là thời điểm cắt cành, trung bình mỗi tháng có thể được một lần thu hoạch)

Các hoạt chất chính trong cây: Lá Stevia được sử dụng lâu đời như một chất làm ngọt do có sự hiện diện của tinh thể ngọt glucoside Stevioside (là một glucoside) có vị ngọt gấp 250 - 300 lần đường kính (saccharoza), nhưng stevioside không sinh năng lượng, không lên men, nhiệt độ nóng chảy 95oC, có một tuổi thọ dài (Swiss, 1899) Sản phẩm của nó có thể được thêm vào đồ nấu nướng, chế biến thực phẩm hoặc đồ uống không gây độc hại cho người, không đòi hỏi kỹ thuật sản xuất phức tạp, năng suất cao, công nghệ thu hái chế biến đơn giản Các công bố khoa học cho thấy cỏ ngọt

có thành phần chống ung thư vòm họng, phòng và chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp, chống béo phì Trong cỏ ngọt khô (cả cành lá) chứa khoảng 1,5% chất ngọt stevioside (trong lá chứa khoảng 6 - 7% stevioside) Như vậy 100 g cỏ ngọt khô có lượng chất ngọt tương đương 400 - 450 g đường kính

Ngày 4 tháng 7 năm 2008 Tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) phê chuẩn và Cục quản lí dược và thực phẩm Mỹ (FDA) cho phép vào ngày 17 tháng 12 năm 2008 về việc sử dụng cây cỏ ngọt để chế xuất chất làm ngọt Đường chiết xuất từ cây cỏ ngọt (Stevia) đang trở thành mặt hàng thiết yếu và an toàn, cụ thể

là các hãng thực phẩm lớn trên thế giới như Coca, Pepsi, Cargill đang sử dụng đường

cỏ ngọt thay đường mía

Cây cỏ ngọt được nhập vào Việt Nam tháng 8 năm 1988 Ngày nay cỏ ngọt đã được phát triển trên nhiều vùng ở trong nước, từ các tỉnh miền núi phía Bắc như: Hà Giang, Cao Bằng, Sơn La, Bắc Thái, Vĩnh Phú, Hoà Bình, Hà Tây, Hải Hưng, Hà Nội cho đến các tỉnh phía Nam như Bình Dương, Bình Phước, Lâm Đồng (Đà Lạt), Đắk Lắk

2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Khái niệm

Sự thành công của công nghệ sinh học dựa trên nền tảng cơ bản là kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Sự hiểu biết những đặc điểm sinh học của các loại cây là một điều kiện tiên quyết cho việc sử dụng hợp lí các hệ thống và bộ phận của chúng Nuôi cấy mô tế bào thực vật giúp cung cấp sự hiểu biết cơ bản về những yêu cầu vật lí, hóa học của sự nuôi cấy tế bào, mô, cơ quan, sự sinh trưởng và phát triển của chúng Quá

trình nuôi cấy tế bào, mô, cơ quan và việc nhân giống cây trồng dưới điều kiện in vitro

đã mở ra con đường mới cho lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật

Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberland nêu ra năm 1902 Theo quan niệm của công nghệ sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Quá trình phát sinh hình thái của nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật, mô và các cơ quan trên môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng và những điều kiện điều khiển của ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm Sự phát triển của nuôi cây mô tế bào thực vật như một nền khoa học cơ bản là mối liên kết chặt chẽ với sự khám phá và điều khiển các đặc tính của cây, đã tạo cho chúng ta sự hiểu biết về sự tăng trưởng và phát triển của thực vật Hơn thế nữa, khả năng phát triển của tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy còn được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp, công nghiệp, và là điều kiện tiên quyết cho

kỹ thuật di truyền gen thực vật (Evans và cộng sự, 2003)

2.2.2 Các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm dùng chung cho tất cả các loại nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo, ở điều kiện vô trùng Bao gồm các kỹ thuật như nuôi cấy phôi, nuôi cấy mô và các cơ quan tách rời, nuôi cấy mô phân sinh, nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy tế bào đơn và nuôi cấy các protoplast

2.2.2.1 Nuôi cấy phôi

Sự ghi nhận đầu tiên về nuôi cấy phôi là sự tách phôi Phascolus và Fagopyrum

trong đất (Charles bonnet, thế kỷ 18) nhưng nhận được cây là cây lùn Từ đầu thế kỉ 20 các công trình nuôi cấy mô được hoàn thiện hơn Năm 1922, Knudson đã nuôi cấy thành công phôi cây lan trong môi trường chứa đường và ông khám phá ra nếu thiếu đường thì phôi không thể phát triển thành protocom

Năm 1976, Raghavan đã công bố rằng phôi phát triển qua 2 giai đoạn dị dưỡng và

tự dưỡng, ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phôi) cần có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi không cần chất điều hòa sinh trưởng

Đối với nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò rất quan trọng Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, nước chiết malt là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi Các chất điều hòa sinh trưởng như GA3, auxin, cytokinin thường được dùng nhiều trong môi trường nuôi cấy

2.2.2.2 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

Các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi (Wetmore, 1946) Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận của các cây là khác nhau nhưng

có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn carbon dưới dạng đường và các muối của nguyên tố đa lượng (nito, phospho, kali, canxi) và vi lượng (Mg, Fe, Co, Zn) Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng

Đối với nuôi cấy mô sẹo thì môi trường giàu auxin mô sẹo sẽ được hình thành Mô sẹo là những tế bào không phân hóa, thường được tạo ra do quá trình tạo cơ quan nhất

là trong sự tạo rễ Sự tạo mô sẹo nhờ auxin gồm 3 quá trình: sự phản phân hóa của tế bào nhu mô hoặc sự phân chia của tế bào tượng tầng hoặc sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi Khối mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo Cây tái sinh từ mô sẹo có nhiều chồi hơn

so với cây tái sinh từ đỉnh sinh trưởng tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao

2.2.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh

Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi sinh trưởng và cành, có kích thước

Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân giống

in vitro, ngoài ra còn được sử dụng để nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo

cây đa bội

2.2.2.4 Nuôi cấy bao phấn

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiên cứu trên cây thuốc lá (Bourgin và Nitsch, 1967) và cây lúa (Niixeki và Ono, 1968)

Kết quả nghiên cứu cho thấy cây đơn bội được tạo ra từ việc nuôi cấy túi phấn hoặc hạt phấn theo 2 cách: phôi phân hóa trực tiếp từ hạt phấn và phát triển thành cây hoàn chỉnh (trực tiếp); hoặc hạt phấn phải qua giai đoạn mô sẹo sau đó hình thành phôi hay chồi bất định rồi phát triển thành cây hoàn chỉnh (gián tiếp) Việc tạo ra thể đơn bội rồi sau đó nhân đôi nhiễm sắc thể của các thể đơn bội để tạo ra các cá thể nhị bội đồng hợp tử giúp rút ngắn thời gian trong các quá trình di truyền và chọn giống

2.2.2.5 Nuôi cấy tế bào đơn

Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lí enzyme Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau

Nuôi cấy tế bào đơn được dùng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên các quá trình sinh trưởng, phát triển và phân hóa của tế bào Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn giống tế bào

2.2.2.6 Nuôi cấy các protoplast

Nuôi cấy các protoplast được phát triển nhờ công trình của Cocking (1960) Ông là người đầu tiên dùng enzyme để thủy phân thành tế bào và tách được protoplast từ rễ cà chua Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Do không có thành tế bào nên protoplast trở nên một đối tượng lí tưởng trong nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật Bằng phương pháp dung hợp hai protoplast

có thể tạo ra các cây lai soma Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gen (Trần Văn Minh, 2003)

2.2.3 Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn trong việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp trong thực tiễn sản xuất và đời sống

 Về mặt lý luận sinh học cơ bản: Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tiến hành so sánh những đặc tính của cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra quy luật về mối tương quan của các bộ phận trong cây Kỹ thuật nuôi cấy mô giúp chúng ta phân biệt được từng giai đoạn theo chu kỳ phát triển của cá thể một các cụ thể và chính xác Điều này tạo thuận lợi cho việc nghiên cứu các quy luật sinh trưởng, phát triển cùng với mối quan hệ của thực vật với môi trường bên ngoài Từ đó có thể thúc đẩy cây trồng phát triển theo chiều hướng mong muốn Ngoài

ra, bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào có thể tìm hiểu và tiến hành nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa kí sinh và kí chủ Như vậy nhiều vấn đề về bệnh lý được giải quyết một cách cơ bản

 Về mặt thực tiễn sản xuất: Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quý có giá trị kinh tế cao Kiểm soát được dịch bệnh cây trồng vì hoàn toàn có thể loại bỏ những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đem vào sản xuất, toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt về sản phẩm

2.2.4 Một số thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thực vật được bắt đầu bằng thành công của White (1934) nuôi cấy được một dòng rễ cà chua sinh trưởng mạnh và liên tục Sau đó,

năm 1938 Nobecourt thu được phân bào ở mô củ cà rốt Daucus carota, White đã nuôi cấy được mô tượng tầng của cây thuốc lá Nicotiana glauca lai với N langsdorffi Năm

1949, Camus ghép chồi lên khối mô nuôi cấy và thấy quá trình phân hóa ống mạch xảy

ra trong khối mô Năm 1956, Miller và Skoog đã tạo chồi thành công từ mô thuốc lá nuôi cấy Trong giai đoạn này, Skoog đã phát hiện ra kinetin là một chất điều khiển quá trình phân bào và phân hóa chồi Từ năm 1958 đến năm 1959, Steward và Reinert

Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật Những thành tựu mà nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả của chúng trong nhiều lĩnh vực

2.3 Nhân giống vô tính in vitro

2.3.1 Sinh sản vô tính và hữu tính

 Nhân giống theo cấu trúc tự nhiên của thực vật:

Dạng căn hành (bull): lá được sắp xếp chồng lên nhau, bên ngoài có lớp lá bảo

vệ, lá là nhu mô dự trữ dày và xốp Dạng căn hành thường được thấy ở họ hoa tulip, họ hành

Dạng giò (corm): nhu mô dự trữ lớn, dây có cấu tạo giống như căn hành, nằm dưới gốc thân, dạng giò thường được thấy ở hoa gladiolus

Dạng củ (rhizome): dây có cấu tạo như thân rễ nằm chìm dưới mặt đất, phía trên là vòm tăng trưởng chứa chồi thân dạng này thường được thấy ở họ hoa iris

Thân bò (stolom): nhánh hay thân mỏng manh, thường là dạng thân bò, chóp ngọn là một cây hoàn chỉnh thấy ở cây dâu tây

Dạng căn hành nhỏ (bulbil): giống căn hành, tròn nằm ở nách lá thấy ở hoa lily

 Nhân giống theo phương thức nông học:

Giâm cành (cutting): thường là một đoạn thân, nhánh không có chồi lá và rễ, sau một thời gian đoạn thân hay nhánh bắt đầu ra rễ và chồi bên

Chiết cành (marcots): là một đoạn thân, một đoạn thân đã được tách lớp biểu bì

và được bó lại bằng vật liệu có cơ cấu xốp nhằm duy trì độ ẩm, sau một thời gian lớp được tách biểu bì ra rễ

Ghép cành (grafis): phần dưới là thân của một giống, phần trên có thể cùng giống hoặc khác giống Phần trên là một đoạn thân, nhánh hay mắt mầm Gốc ghép thường mang đặc tính chống chịu (Trần Văn Minh, 2003)

2.3.2 Mục đích của nhân giống in vitro

2.3.2.1 Ưu điểm của vi nhân giống

Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kì đều có thể tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền

Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1 - 2 năm có thể tạo

ra thành hàng triệu cây

Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp Tiết kiệm không gian: Vì quá trình nhân giống hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống

Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng cây mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc

Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác nhau

có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro (trong ống nghiệm) hoặc

trong bầu đất Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ

Lợi thế về vận chuyển: Các cây non kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng xác nhận là sạch bệnh Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng qui định về vệ sinh thực phẩm quốc tế

Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kì thời gian nào, không phụ thuộc vào mùa vụ

2.3.2.2 Hạn chế của vi nhân giống

Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất

cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng

có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen Nhiều vấn đề về lí thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái

sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp

Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo Do

đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với phương pháp truyền thống như chiết, ghép

và nhân giống bằng hạt

nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất sinh trưởng Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền

2.3.3 Các bước trong nhân giống vô tính in vitro

Theo Geogre (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm:

Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ: Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc

cẩn thận cây mẹ (nguồn mẫu ban đầu) Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu

Nuôi cấy khởi động là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu cấy in vitro Các giai

đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, các mô tồn tại

và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa, cuối cùng là đoạn thân và mảnh lá

Nhân nhanh là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và nhân

nhanh số lượng thông qua các con đường hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính Cần phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để

có hiệu quả cao nhất Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi Nhiệt độ nuôi cấy thường là 25 – 27oC, thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng 2000 – 4000 lux Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ ánh sáng nuôi cấy khác nhau

Tạo cây in vitro hoàn chỉnh: Để tạo rễ cho chồi người ta thường chuyển chồi từ

môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Một số chồi có thể tạo rễ sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất kích thích sinh trưởng

Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên: Để đưa cây từ ống nghiệm ra

ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo những yêu cầu sau: cây trong ống nghiệm đã đạt những hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao

cây) Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp, giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước Phải

chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng vườn ươm cũng như có chế độ dinh

2.3.4 Vai trò của các chất kích thích sinh trưởng đối với tái sinh cây in vitro

Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Bằng cách cung cấp các chất kích thích sinh trưởng ở mức

độ thích hợp có thể điều khiển được chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy Auxin và cytokinin là 2 chất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô

2.3.4.1 Đặc tính của auxin

Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó được sử dụng với cytokinin Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong các loại môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa auxin nội sinh và auxin ngoại sinh (Nguyễn Đức Lượng

và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào Cùng với cytokinin các nhóm auxin kích thích sự phân chia tế bào Các hormone của nhóm này có hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng sáng, tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn Tác động của auxin thường liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ Đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật: IBA (Indoly Butyric Acid), IAA (Indoly Acetic Acid), NAA (α – Naptalen Acetic Acid), 2,4 – D (Dichlorphenoxy Acetic Acid) (Đỗ Năng Vịnh, 2005)

2.3.4.2 Đặc tính của cytokinin

Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Các cytokinin thường được sử dụng nhất là BAP (6-Benzyl Amino Purine), kinetin, zeatin,

BA (6-Benzyl Adenine) Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,1 – 0,2 mg/l Ở nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy

Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật các loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, tuy nhiên người ta hay dùng phối hợp cả auxin và cytokinin ở tổ hợp tỉ lệ khác nhau sẽ cho hiệu quả tốt hơn (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 2005)

2.3.5 Hệ thống hình thành chồi

Sự hình thành chồi có tương quan với hàm lượng etylen và CO2 Chồi phát sinh nhiều nhất khi trong bình nuôi cấy tích lũy 5 – 8 µM C2H4 và 10% CO2 trong 15 ngày nuôi cấy, khi hai chất này được tách ra khỏi bình nuôi cấy thì quá trình biệt hóa bị ức chế Sau 15 ngày các chất này thoát ra ngoài thì cũng không ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa Trong 10 ngày đầu tiên CO2 và C2H4 ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa phù hợp với giai đoạn tăng trưởng và phân chia tế bào dẫn đến sự hình thành vòm đỉnh sinh trưởng Như vậy tác động kích thích của C2H4 trong sự phát sinh hình thái có sự tác động bổ sung của quá trình phân bào

Sự tác động tương hỗ của C2H4 và CO2 cho thấy quy luật tác động của CO2:

Trong 10 ngày đầu CO2 kích thích quá trình sinh tổng hợp C2H4

Sau 10 ngày tác động tương phản với C2H4

Sau cùng CO2 tham gia vào quá trình trao đổi chất, tỷ lệ tác động C2H4/CO2 chỉ

có hiệu quả khi có mặt CO2 và O2 duy trì quá trình trao đổi oxy hóa ở mô SF (shoot forming) và SNF (non shoot forming): chồi mầm được nuôi cấy trên môi trường không

có BA, phát sinh chồi sau 3 ngày thì tiến hành phân chia tế bào và không phân chia trong môi trường có BA thì sự hình thành chồi không xảy ra

Tóm lại có 3 phương thức tạo cây con trong nhân giống in vitro là mẫu mô trực

tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh; mẫu mô phát sinh callus và callus tạo chồi; mẫu mô phát sinh callus, callus phát triển phôi (hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào phát sinh phôi) và từ phôi thu được cây hoàn chỉnh

2.3.5.1 Nhân giống thông qua giai đoạn callus

Callus là khối tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo

ra do sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ, hoặc do các điều kiện đặc biệt như vết thương, xử lý chất điều hòa sinh trưởng (Bùi Trang Việt, 2000)

Trong nhân giống in vitro nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật nuôi

cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng đồng nhất về mặt di truyền Tuy nhiên, nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà

mặt di truyền Để tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơ cấp để tái sinh cây thì hi vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất Thông qua giai đoạn callus còn có thể thu được những cá thể sạch virus (Kehr, Schaffer, 1976) Cắt mẫu vật từ cây (đoạn thân, mảnh lá ) cấy vào môi trường dinh dưỡng thích hợp sau đó cấy gây Từ cấy gây ta có thể tái sinh chồi trực tiếp hoặc cấy vào môi trường dinh dưỡng phù hợp để tạo callus và từ callus tái sinh chồi (tạo chồi bất định)

Kết thúc của quá trình là tạo rễ in vitro nhằm tạo cây in vitro hoàn chỉnh

2.3.5.2 Tạo chồi bất định

Đỉnh chồi bất định có thể phát triển trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật Một số loại mẫu vật được dùng như đoạn thân (thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải), mảnh lá (thuốc

lá, cà chua, bắp cải, cà phê, cacao), cuống lá (thủy tiên), các bộ phận của hoa (súp lơ, lúa mì, thuốc lá), nhánh củ (họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên) và đoạn mầm (măng tây)

Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu mô nằm trong biểu

bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân; một số tế bào này trở thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển Các thể phân sinh này rõ ràng có nguồn gốc

từ các tế bào đơn Tuy nhiên chiều hướng phát triển của thực vật cũng phụ thuộc vào nồng độ phytohormone Nghiên cứu sự tạo chồi ở mô nuôi cấy của cây linh sam (Douglas) cho thấy khi bổ sung cytokinin (BAP 5 µM) chỉ có chồi phát triển Khi nồng

độ auxin cao hơn (NAA > 5 µM) lá mầm tạo ra cả callus và chồi Khi cung cấp chỉ riêng auxin (NAA = 5 µM) thì chỉ có callus được tạo thành

Sự phát triển các chồi bất định gián tiếp đầu tiên qua giai đoạn hình thành callus cơ

sở từ các chồi được tách trong nuôi cấy Chồi sau đó được phát triển từ ngoại vi mô callus và không có quan hệ ban đầu với các mô có mạch dẫn của mẫu vật

2.3.6 Các nhân tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro

2.3.6.1 Mẫu nuôi cấy

Các nhân tố khi chọn mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa

vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu

Kiểu gen: ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy, số lượng chồi tạo được, sự

như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller (1976) cho rằng chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt

Tuổi và sinh lý: tuổi thật của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa tế bào và tuổi sinh lý Thành phần

cơ quan có cấu tạo thấp không thể nuôi cấy in vitro do không thể sử dụng thành phần

khoáng trong môi trường

Mẫu in vitro: mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươm Nuôi cấy mẫu in vitro cho thấy nâng cao khả năng

nhân giống cắt đốt

Sức sống của mẫu: mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus nhằm sản xuất cây sạch bệnh Những cây bị nhiễm virus cũng có thể tạo cây sạch bệnh nhằm nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Dinh dưỡng: sử dụng vật liệu nuôi cấy khỏe và dinh dưỡng của cây mẹ cho thấy rất quan trọng để có mẫu nuôi cấy khỏe

Nhiệt độ: có sự ảnh hưởng trong nuôi cấy mô, các loại mẫu khác nhau được bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau

Ánh sáng: khả năng nuôi cấy túi phấn cao khi cây mẹ sinh trưởng với cường độ ánh sáng cao Khả năng tạo protoplas cao ở cây lúa mạch khi cây mẹ sinh trưởng ở

cường độ ánh sáng thấp Khả năng tăng sinh chồi in vitro tốt khi nuôi cấy chồi cây mẹ

trong bóng râm so với chồi ngoài trời

2.3.6.2 Môi trường nuôi cấy

Mặc dù dinh dưỡng của các mô nuôi cấy là rất khác nhau nhưng môi trường nuôi cấy mô thực vật đặc trưng chứa các thành phần sau:

Các nguyên tố đa lượng: Bao gồm các loại muối của nitrogen, potassium, calcium, phosphorus, magnesium, và sulfur Đây là 6 nguyên tố cần thiết cho sự sinh trưởng của thực vật bậc cao

Các nguyên tố vi lượng: các loại muối của sắt, kẽm, mangan, boron,

Các phụ gia hữu cơ: một lượng nhỏ các loại vitamine

Gần 70% các nghiên cứu thành công đều nhờ vào sử dụng môi trường MS với hàm lượng muối khoáng cơ bản (Ammirato, 1983; Thorpe, 1988) vì môi trường này có chứa hàm lượng nitrate và ammonia Sucrose là một loại đường thường được dùng để

và chồi từ mô sẹo trong khi đó thì galactose và lactose tốt hơn sucrose Người ta còn cho thấy rằng sucrose và auxin có mối tương tác với nhau (Dương Tấn Nhựt, 2007) Ngoài ra hàm lượng các hợp chất hữu cơ khác như: nước dừa, glutamine, casein, tinh chất mạch nha, photphat, amino acid cũng có ảnh hưởng rất lớn tới quá trình hình thành mô sẹo và chồi

Trong nuôi cấy tạo sẹo và chồi cây thân thảo thì môi trường MS là môi trường nuôi cấy phù hợp

2.3.6.3 Tính bất định về mặt di truyền

Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính được sử dụng nhằm mục đích tạo ra quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những quần thể biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào đơn Những biến dị này được nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống cây trồng nhưng rất ít những biến dị có lợi được báo cáo (Evans và Sharp, 1986, 1988; Larkin, 1987)

Tần số biến dị hoàn toàn khác nhau và không lặp lại (Fish và Karp, 1986), nuôi cấy

mô sẹo và tế bào đơn có sự biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh

2.3.6.4 Mẫu đưa vào nuôi cấy

Có 2 tác nhân làm hư mẫu nuôi cấy in vitro là bị virus hay thể giống như virus xâm

chiếm, không hại mẫu nhưng có ảnh hưởng về sau Có sự xâm nhiễm của vi sinh vật

như: Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas vào nhu mô sẽ dẫn truyền sự hoại mẫu

khi tế bào bắt đầu phân chia Để làm giảm tác nhân gây bệnh nên sử dụng mẫu nuôi cấy là nhu mô phân sinh đỉnh Tác nhân thứ hai là bị vi sinh vật hủy hoại, có thể khử trùng mẫu trước khi cấy vào môi trường

Nhằm hạn chế sự hoại mẫu của vi sinh vật như amphotoricin B, nystelin, kanamicin, penicillin khử được vi khuẩn Gram (-), Gram (+), nấm mốc có thể sử dụng từng đơn chất hay phối hợp

2.3.6.5 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cây

Hiện tượng mẫu hóa nâu hay bị đen làm chết mẫu, hay làm giảm sự tăng trưởng Nguyên nhân của hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều tanin hay hydroxyphenol có nhiều trong mô già hơn mô sẹo (Lê Văn Hoàng, 2010)