PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG NẤM MEN THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH LÊN MEN HẠT CA CAO

Việc phân lập và định danh các chủng nấm men hiện diện trong quá trình lên men giúp hiểu rõ hơn về quá trình lên men và đánh giá được ảnh hưởng của các loài nấm men ưu thế trong quá trìn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG NẤM MEN THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH LÊN MEN HẠT CA CAO

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ KIỀU OANH Niên khóa : 2009 – 2013

Tháng 6/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG NẤM MEN THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH LÊN MEN HẠT CA CAO

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS VÕ THỊ THÚY HUỆ NGUYỄN THỊ KIỀU OANH

KS TRẦN THỊ QUỲNH DIỆP

Tháng 6/2013

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng toàn thể quý thầy cô đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời gian học tập tại trường

Cô Võ Thị Thúy Huệ, chị Trần Thị Quỳnh Diệp đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quí báu cũng như tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp đúng thời gian quy định

Quý thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường Trường Đại học Nông Lâm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài

Chị Nguyễn Trương Ngọc Tú, chị Trương Thị Ngọc Hân cùng các bạn làm việc tại công ty TNHH Công nghệ Nông Lâm đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi

Thân ái gửi đến các bạn lớp DH09SH đã cùng học tập với tôi trong suốt 4 năm qua lời cảm ơn và lời chúc sức khỏe, đạt nhiều thành công trong cuộc sống

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ba mẹ, người đã sinh ra con, nuôi nấng con nên người và luôn bên cạnh con những lúc khó khăn, giúp con vượt qua tất cả

Tp Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013

NGUYỄN THỊ KIỀU OANH

TÓM TẮT

Lên men hạt ca cao là một trong những yếu tố quan trọng, quyết định đến chất lượng hạt ca cao thương phẩm Trong đó, vi sinh vật (nấm men và vi khuẩn) chịu trách nhiệm về quá trình lên men ở lớp vỏ nhầy cũng như môi trường lên men

Việc phân lập và định danh các chủng nấm men hiện diện trong quá trình lên men giúp hiểu rõ hơn về quá trình lên men và đánh giá được ảnh hưởng của các loài nấm men ưu thế trong quá trình lên men Từ đó đề tài: “Phân lập và định danh các chủng nấm men trong quá trình lên men hạt ca cao” đã được thực hiện

Tiến hành phân lập, định danh các chủng nấm men và vi khuẩn hiện diện trong quá trình lên men hạt ca cao Đồng thời, khảo sát những biến đổi lý, hóa của hạt ca cao

và những diễn biến của hệ vi sinh vật trong quá trình lên men hạt ca cao bằng phương pháp ủ tự nhiên, chọn ra chủng nấm men thích hợp bổ sung vào quá trình lên men Bố trí nghiệm thức ủ ca cao ở quy mô phòng thí nghiệm với các chủng nấm men đã chọn Tiếp tục khảo sát và đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung nấm men đến các thành phần lý, hóa của hạt ca cao và hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men hạt ca cao

Kết quả phân lập và định danh được 5 chủng nấm men Hanseniaspora uvarum,

Debaryomyces hanseni, Candida orthopsilosis, Candida tropicalis,Candida theae và 3

chủng vi khuẩn thuộc họ Lactobacillus và Bacillus, trong đó các chủng nấm men

Hanseniaspora uvarum, Debaryomyces hanseni, Candida tropicalis là các chủng tối

ưu nhất làm giảm nhanh khối lượng cơm nhầy và làm tăng giá trị pH của hạt nhân sau lên men có bổ sung nấm men hơn so với lên men tự nhiên

SUMMARY

The fermentation of Cocoa is one of the important factors that determine the quality of the commercial cocoa The microorganisms responsible for the fermentation originate from the surface of the pulps, as well as the fermenting environment

The isolation and identification of yeast strains present in the process help decipherdeeper and determine the impact of the dominant species yeast in the fermentation process Hence, we carry out the thesis: "Isolation and identification of yeast strains from the process of cocoa beans fermentation."

This reseach focus on the isolation of yeast, and bacteria through out process The survey on physical, chemical changes within the beans and the microbial ecology

of fermentation, then selecting the appropriate yeast strains which were to the fermentation Fermentation in laboratory scale supplemented with selected yeast strains Continue to survey and assess the impact of the addition of yeast to the physical, chemical of cocoa beans and the microbiology of fermentation

As the result, 5 yeast strains including Hanseniaspora uvarum, Debaryomyces

hanseni, Candida orthopsilosis, Candida tropicalis,Candida theae; and 3 bacteria

strains, belong to Lactobacillus and Bacillus farmily were isolated Among these,

Hanseniaspora uvarum, Debaryomyces hanseni, Candida tropicalis are the most

optimal yeast strains to increase the quality of cocoa beans

Key word: Fermentation of cocoa

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về ca cao 3

2.1.1 Tình hình sản xuất ca cao 3

2.1.2 Đặc điểm của cây ca cao 4

2.1.3 Thành phần hóa học của hạt ca cao 6

2.2 Tổng quan về nấm men 6

2.2.1 Phân loại 6

2.2.2 Đặc điểm hình thái 8

2.2.3 Đặc điểm cấu tạo 8

2.2.4 Đặc điểm sinh thái 9

2.2.5 Sự sinh sản của tế bào nấm men 9

2.2.6 Sinh trưởng của nấm men 10

2.3 Lên men hạt ca cao 11

2.3.1 Các phương pháp ủ hạt ca cao 11

2.3.2 Quá trình lên men hạt ca cao 12

2.3.2.1 Sự lên men của lớp thịt bao quanh hạt 12

2.3.2.2 Những nội phản ứng xảy ra trong các mô của phôi nhũ 13

2.4 Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước 14

2.4.2 Nghiên cứu trong nước 14

2.4.3 Nghiên cứu của nước ngoài 15

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Vật liệu 17

3.3 Phương pháp thí nghiệm 17

3.3.1 Ủ ca cao 17

3.3.2 Phân lập nấm men và vi khuẩn 17

3.3.3 Quan sát hình thái tế bào nấm men và vi khuẩn dưới kính hiển vi 18

3.3.4 Thử nghiệm khả năng lên men đường 19

3.3.5 Phương pháp xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Drop plate Cout) 19

3.3.6 Khảo sát sự thay đổi nhiệt độ, pH, tỷ lệ hạt nhân/cơm nhầy của ca cao trong suốt quá trình ủ tự nhiên 20

3.3.7 Khảo sát mật độ các chủng nấm men và vi khuẩn trong quá trình lên men tự nhiên theo thời gian 21

3.3.8 Khảo sát quá trình lên men hạt ca cao có bổ sung nấm men 22

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Kết quả phân lập và làm thuần nấm men 23

4.2 Kết quả thử nghiệm lên men đường của các chủng nấm men 25

4.3 Kết quả phân lập vi khuẩn hiện diện trong quá trình lên men ca cao 27

4.4 Kết quả quá trình lên men ca cao bằng phương pháp ủ tự nhiên 28

4.4.1 Nhiệt độ khối ủ ca cao trong quá trình lên men tự nhiên 28

4.4.2 pH hạt ca cao trong quá trình lên men tự nhiên 29

4.4.3 Khối lượng hạt ca cao trong quá trình lên men 30

4.4.4 Mật số các chủng nấm men trong quá trình lên men hạt ca cao tự nhiên 30

4.4.5 Mật độ vi khuẩn trong quá trình lên men hạt ca cao tự nhiên 31

4.5 Kết quả quá trình lên men ca cao có bổ sung nấm men 32

4.5.1 pH hạt ca cao trong quá trình lên men có bổ sung nấm men 32

4.5.2 Nhiệt độ thúng ủ ca cao trong quá trình lên men có bổ sung nấm men 32

4.5.3 Khối lượng hạt ca cao trong lên men có bổ sung nấm men 33

4.5.4 Mật số vi khuẩn trong quá trình lên men ca cao có bổ sung nấm men 34

4.5.5 Mật số nấm men trong quá trình lên men ca cao có bổ sung nấm men 35

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Sản lượng ca cao trên thế giới (ngàn tấn) ……… 3

Bảng 2.2 Thành phần hóa học của hạt ca cao tươi ……… 6

Bảng 2.3 Các loài nấm men phân lập từ quá trình ủ hạt ca cao ở một số quốc gia … 16 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm ……… 22

Bảng 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc nấm men và hình thái tế bào nấm men dưới kính hiển vi ……… ……… 23

Bảng 4.2 Kết quả lên men đường của các chủng nấm men ……… 25

Bảng 4.3 Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn … 27

Bảng 4.4 Kết quả thử nghiệm sinh hóa của các chủng vi khuẩn ……… 28

Bảng 4.5 Nhiệt độ của khối ủ hạt ca cao trong quá trình lên men tự nhiên ……… 29

Bảng 4.6 Khối lượng nguyên hạt, cơm nhầy, hạt nhân và tỷ lệ hạt nhân/cơm nhầy của hạt ca cao trong quá trình lên men ca cao tự nhiên ……… 30

Bảng 4.7 Nhiệt độ khối ủ hạt ca cao trong quá trình lên men có bổ sung nấm men 32

Bảng 4.8 Khối lượng nguyên hạt, cơm nhầy, hạt nhân và tỷ lệ hạt nhân/cơm nhầy của hạt ca cao trong quá trình lên men ca cao có bổ sung nấm men ……… 33

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Sơ đồ phân loại nấm men ……… 7 Hình 2.2 Sơ đồ sự chuyển hóa đường của cơm nhầy trong quá trình lên men …… 13 Hình 2.3 Qua trình biễn đổi các chất trong nội nhũ hạt ca cao ……… 14 Hình 4.1 Kết quả lên men đường glucose và sucrose của chủng A1 ……… 27 Hình 4.2 Diễn biến pH hạt ca cao trong quá trình lên men ……… 29 Hình 4.3 Diễn biến mật số các chủng nấm men trong quá trình lên men hạt

ca cao ……… 31

Hình 4.4 Diễn biến mật số vi khuẩn trong quá trình lên men hạt ca cao ……… 31 Hình 4.5 Diễn biến pH trong quá trình lên men có bổ sung nấm men ……… 34 Hình 4.6 Mật số vi khuẩn trong quá trình lên men có bổ sung nấm men ………… 34 Hình 4.7 Mật số các chủng nấm men trong quá trình lên men ca cao không có bổ sung

nấm men ……… 35

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Có mặt từ rất lâu đời, ca cao đi vào cuộc sống của những người dân vùng Châu

Mỹ Latin như một loại thức uống tuyệt hảo mà thượng đế đã ban tặng cho họ Đến đầu thế kỷ 20, ca cao đã trở thành một nét văn hóa ẩm thực đặc trưng của toàn châu Âu và

là một loại thức uống phổ biến trên toàn Thế giới Bờ Biển Ngà, Ghana, Indonesia, Brazil là những quốc gia đứng đầu thế giới về sản lượng và chất lượng hạt ca cao Việt Nam cũng là nước có nhiều tiềm năng để phát triển cây ca cao do có thể trồng xen với nhiều loại cây khác nhau như dừa, điều, cà phê, nhãn Theo thống kê của Bộ NN&PTNT năm 2011, tổng diện tích trồng ca cao tại Việt Nam đạt khoảng 20.100 ha, tập trung chủ yếu tại các tỉnh phía Nam, với năng suất trung bình 1,13 tấn/ha Trên thế giới nói chung và tại Việt Nam nói riêng, ca cao sau thu hoạch được lên men bằng phương pháp tự nhiên truyền thống Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp lên men này cho chất lượng không đồng đều và ổn định, dẫn đến việc giảm giá trị kinh tế hạt ca cao sau lên men

Lên men hạt ca ca cao là một trong những yếu tố quan trọng, quyết định đến chất lượng ca cao thương phẩm và vi sinh vật đóng một vai trò hết sức to lớn trong quá trình lên men hạt ca cao Theo M Ardhana, Graham H.Flect (2003), có khoảng 124 loài vi sinh vật hiện diện trong quá trình lên men hạt ca cao bao gồm các loài: nấm men, vi khuẩn, nấm mốc Nhưng chỉ có một số loài đóng vài trò quyết định trong quá trình lên men Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập và định danh các chủng nấm men trong quá trình lên men hạt ca cao” nhằm xác định các chủng nấm men hiện diện và chiếm ưu thế trong quá trình lên men hạt ca cao

1.2 Yêu cầu của đề tài

Phân lập và định danh được các chủng nấm men hiện diện trong quá trình lên men hạt ca cao

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Thực hiện lên men hạt ca cao bằng phương pháp ủ thúng tự nhiên

- Phân lập và làm thuần các chủng nấm men và vi khuẩn hiện diện trong quá trình lên men hạt ca cao tự nhiên

- Quan sát hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào các chủng nấm men và vi khuẩn đã phân lập

- Thực hiện một số phản ứng sinh hóa đối với nấm men và vi khuẩn

- Định danh nấm men bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Nội dung 2: Khảo sát những biến đổi lý, hóa của hạt ca cao trong quá trình lên

men bằng phương pháp ủ tự nhiên

- Khảo sát sự thay đổi về pH của cơm nhầy và hạt nhân

- Khảo sát sự thay đổi về nhiệt độ của đống ủ

- Khảo sát sự thay đổi về tỷ lệ cơm nhầy : hạt nhân

Nội dung 3: Khảo sát diễn biến của nấm men và vi khuẩn hiện diện trong quá

trình lên men hạt ca cao bằng phương pháp ủ tự nhiên

- Khảo sát mật số các chủng nấm men theo thời gian lên men

- Khảo sát mật số vi khuẩn theo thời gian lên men

Nội dung 4: Tiến hành lên men hạt ca cao bằng phương pháp ủ thúng có bổ

sung nấm men

- Tiến hành nhân sinh khối các chủng nấm men

- Tiến hành ủ hạt ca cao với các chủng nấm men

- Khảo sát sự thay đổi lý, hóa của hạt ca cao trong quá trình lên men hạt ca cao

có bổ sung nấm men (pH, nhiệt độ, tỷ lệ cơm nhầy: hạt nhân)

- Khảo sát diễn biến của nấm men và vi khuẩn hiện diện trong quá trình lên men hạt ca cao có bổ sung nấm men

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về ca cao

2.1.1 Tình hình sản xuất ca cao

Cây ca cao là cây công nghiệp dài ngày sống ở vùng nhiệt đới, thuộc loài thân mộc, sống đa niên Cây ca cao có nguồn gốc từ vùng Amazone Vùng Mayas của Yucatan và Aztecs của Mexico là các vùng trồng ca cao lâu đời cách đây khoảng 500 năm trước công nguyên Người Mayas là những người đầu tiên trên trái đất này sử dụng ca cao làm thực phẩm bằng cách nướng lên, nghiền nhuyễn pha với bột ngô và

sử dụng hạt ca cao trong một số loại nước uống cao cấp Ngày nay ca cao là một trong những mặt hàng xuất khẩu mang lại nhiều ngoại tệ cho một số nước

Bảng 2.1 Sản lượng ca cao trên thế giới (ngàn tấn)

(Nguồn: ICCO Annual Report 2010/2011)

Ở Việt Nam, ca cao được xem như một mặt hàng nông sản tiềm năng với giá bán gấp 2-3 lần so với cà phê Theo số liệu thống kê của Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp – Phát triển Nông thôn cho thấy ngành ca cao Việt Nam có tốc độ phát triển

khá nhanh: năm 2003 diện tích trồng ca cao chỉ đạt 3.000 ha nhưng đến cuối năm

2011, tổng diện tích ca cao trên cả nước ước tính đạt 20.100 ha với sản lượng đạt 5.500 tấn/năm Dự kiến đến năm 2015 diện tích ca cao sẽ được mở rộng lên 35.000 ha với sản lượng 26.000 tấn, và đạt khoảng 50.000 ha, sản lượng 52.000 tấn vào năm

2020 Phần lớn ca cao được trồng xen trong các vườn dừa, vườn cây ăn trái ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long và trong các vườn cây công nghiệp ở vùng Đông Nam Bộ

và Tây Nguyên

2.1.2 Đặc điểm của cây ca cao

 Thực vật học

Theo phân loại truyền thống, ca cao (Thebroma ca cao) thuộc chi Theobroma,

họ Sterculioidea còn theo phân loại của hệ thống APG II thì thuộc phân họ Byttnerioideae của họ Malvaceae (Alvenson et al., 1999) Theo Opeke (1992), Theobroma ca cao là cây có hoa và kết trái trực tiếp từ thân và thuộc dạng nửa rụng lá

Có khoảng 20 loài Theobroma nhưng quan trọng nhất là các loại Criollo, Forastero và Trinitario

Criollo có nguồn gốc từ Trung Nam Mỹ Hạt ca cao Criolo có hương vị đặc biệt, độ mịn cao và ít đắng Tuy nhiên, cây thường cho sản lượng kém, khả năng kháng bệnh thấp, trồng từ 4 – 5 năm mới có trái Do đó, Criollo không được trồng phổ biến Forastero chiếm 80% lượng ca cao trên thế giới Được trồng rộng rãi cả trong canh tác, hoang dã và bán hoang dã Thường gặp ở Brazil, Tây phi, Trung nam Mỹ, Malaysia, Indonesia v.v Sản lượng tương đối cao, kháng sâu bệnh nhưng chất lượng trung bình

Trinitario là giống tương đối mới được cấy ghép bởi Criollo và Forastero, nó có mùi thơm đặc biệt của Criollo và sản lượng cao như Forastero Trinitario bắt đầu được trồng ở Trinidad, lan sang Venezuela và Ecuador, Cameroon, Samoa, Sri Lanka, Java

và Papua New Guinea Đây là giống mới nên ngày nay sản lượng trên thị trường thế giới còn ít, chỉ chiếm 15% sản lượng chế biến của thế giới

 Đặc điểm hình thái

Ca cao là loài cây thân gỗ có thể cao đến 10 – 20 m nếu để mọc tự nhiên Tuy nhiên, trong sản xuất cây thường chỉ cao khoảng 4 – 8 m do mật độ trồng dày và chiều cao được khống chế qua việc tỉa cành Chu kỳ sinh trưởng của cây ca cao trên 40 năm

Hạt sau khi nảy mầm, rễ trụ mọc rất nhanh và có nhiều rễ ngang mọc thẳng góc quanh trụ Khi cây được 3 năm tuổi, rễ trụ dài khoảng 1 – 1,5 m, có nhiều rễ ngang mọc ra, phân nhánh và có nhiều rễ con tập trung ở vùng phía dưới cổ rễ 20 cm (vùng đất mặt)

Thân ca cao phát triển theo hướng thẳng đứng và khi thân phát triển trung bình được từ 1 m đến 1,5 m sẽ tự phân làm 3 – 5 cành ngang Sự phát triển của tầng cành

sẽ được lập lại tạo nên cây ca cao phát triển từ hạt có 3 – 5 tầng cành

Màu sắc lá non thay đổi tuỳ theo giống từ màu xanh nhạt đến vàng, từ màu hồng đến đỏ đậm Khi trưởng thành lá có màu xanh thẫm, cứng cáp hơn và nằm ngang Lá trên thân mọc từ hạt hoặc cành vượt có cuống dài từ 7 – 9 cm và mọc theo hình xoắn ốc Lá trên cành ngang hay trên cây ghép có cuống ngắn từ 2 – 3 cm, mọc đối cách trên cành và chịu được cường độ ánh sáng cao hơn lá trên thân chính

Sau khi thụ phấn trái tăng trưởng chậm trong khoảng 40 ngày đầu và đạt tốc độ tối đa sau 75 ngày Sau khi thụ phấn 85 ngày sự tăng trưởng của trái chậm lại, trong khi hạt bên trong của trái bắt đầu tăng trưởng, đây là thời kỳ hạt tích lũy chất béo Mỗi trái chứa từ 30 – 50 hạt Khoảng 140 ngày sau thụ phấn lớp cơm nhầy được hình thành bao quanh hạt Từ khi hoa nở đến trái chín khoảng 5 – 6 tháng, thời gian này khác nhau tuỳ theo giống Trái có hình dạng, kích thước và màu sắc khá đa dạng Trái chưa chín có màu xanh, tím hoặc xanh phơn phớt tím khi chín chuyển sang màu vàng, vàng cam hoặc đỏ cam Trái ca cao có thể đạt chiều dài 10 – 30 cm, đường kính 7 – 9 cm, cân nặng từ 200 – 1000 g

 Đặc điểm sinh thái

Cây ca cao thường được trồng trong khoảng từ đường xích đạo đến vĩ độ 20, nơi có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây ca cao khoảng 25oC, độ ẩm 70 – 80%, lượng mưa bình quân trên

1500 mm/năm Cây ca cao là cây ưa ánh sáng tán xạ (50 – 60% cường độ ánh sáng tự nhiên) nên thích hợp trồng dưới tán cây ăn trái hoặc được che bóng

Cây ca cao thích hợp với nhiều loại đất khác nhau như đất đỏ, đất xám, đất phù

sa cổ song thích hợp nhất với đất có thành phần cơ giới trung bình đến nhẹ, pH từ 5,5 – 5,8, tầng canh tác dày 1 – 1,5 m, dễ thoát nước, có khả năng giữ nước cao, giàu chất hữu cơ

2.1.3 Thành phần hóa học của hạt ca cao

Tính chất hóa học của hạt ca cao rất phức tạp, chúng thay đổi theo tuổi thọ của

hạt và phụ thuộc vào quá trình chế biến

Bảng 2.2 Thành phần hóa học của hạt ca cao tươi

Các thành phần được tính theo% trọng lượng tươi (Nguồn: F.Hardy, 1960)

2.2 Tổng quan về nấm men

2.2.1 Phân loại

Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường

sinh sản vô tính theo lối nảy chồi Nấm men không thuộc về một taxon phân loại nào

nhất định, chúng có thể thuộc về hai nhóm nấm: nhóm nấm túi tạo thành bào tử được

gộp chung vào lớp nấm túi (Ascomycetes) và nhóm nấm không tạo thành bào tử - lớp

(Mucilage/Sweating)

Vỏ hạt (Shell/Testa)

Phôi nhũ (Cotyledon/Kernel)

13,8 46,0

-

-

-

3,2 4,5 4,9

- 1,1

8,4 2,4 0,8 5,2 Axit hữu cơ (Citric,

Axêtic và oxalic)

0,7 - 0,6

nấm không hoàn thiện (Fungi imperfect) hay còn gọi là lớp nấm bất toàn (Lương Đức

Phẩm, 2006)

Dựa trên bảng phân loại nấm men cho đến hiện nay thì số lượng loài nấm men được biết đến không ngừng tăng lên Lodder J (1970) đã xác định có 349 loài nấm men, thuộc 39 chi khác nhau Barnett J.A., Payne R.W và Yarrow D (1983) xác định

có 483 loài nấm men thuộc 66 chi khác nhau

Hình 2.1 Sơ đồ phân loại nấm men

Saccharomyces Zygosaccharomyces Toruiaspora Pichia 1 Hasenula 1 Debaryomyces

Rất nhiều loài nấm men đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất: công nghiệp sản xuất bia, rượu, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi và cao nấm men; lipid nấm men, các enzyme như amylase, invertase, lactase, uricase, v.v sản xuất esgosterol, axít ribonucleic, các vitamin như methionine, lizin, cisterin Loài

Saccharomyces cerevisiae hiện đang được sử dụng phổ biến nhất trong sản xuất

Tuy nhiên bên cạnh các nấm men có ích cũng có không ít các nấm men có hại, chúng gây ra hiện tượng làm hư hỏng thực phẩm tươi sống hoặc thực phẩm chế biến

Có khoảng 13-15 loài nấm men có khả năng gây bệnh cho người vầ động vật chăn

nuôi Đáng chú ý nhất là các loài Candida albicans, Cryptococcus neoforman, v.v

2.2.2 Đặc điểm hình thái

Hình dạng tế bào nấm men thường thay đổi tùy theo loài, ngoài ra một phần còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh Nói chung, thường nấm men có

hình trứng hay bầu dục (Saccharomyces cerevisiae), hình cầu (Candida utilis), hình

ống (Pychia), hình bình, hình quả chanh, hình tam giác và một số dạng đặc biệt

Một số tế bào nấm men có hình dài nối tiếp nhau thành những dạng sợi gọi là khuẩn ty (Mycelium) hoặc khuẩn ty giả (Pseudomycelium) Thường gặp ở các giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon Nhiều loài nấm men chỉ sinh khuẩn ty giả khi không được cung cấp đầy đủ oxy

Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều, theo từng giống, từng loài Nói chung thường to hơn tế bào vi khuẩn gấp 10 lần Các loài nấm men đơn bào trong công nghiệp thường có kích thước 3 – 5 x 5 – 10 µm (Lâm Thanh Hiền, 2006)

2.2.3 Đặc điểm cấu tạo

Nấm men thuộc nhóm Eukaryote do đó nó có những đặc điểm khác so với vi khuẩn

Tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các thành phần cơ bản sau:

- Thành tế bào nấm men trong suốt, nhờn và dày khoảng 1000 Ao, chiếm khoảng

25 – 30% trọng lượng khô tế bào Thành tế bào có 3 lớp được cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau Trong đó chủ yếu là glucan, manan, protein, lipit và một số thành phần nhỏ khác như kitin, volutin, v.v Thành tế bào giúp duy trì hình thái và áp suất thẩm thấu của tế bào

- Màng nguyên sinh chất gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipid, enzyme permeaza, v.v Chiều dày của màng nguyên sinh chất khoảng 200 Ao Màng nguyên sinh chất thường ăn sâu vào chất nguyên sinh tạo thành mạng lưới nội chất

- Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protid, glucid, lipid và các muối khoáng, enzyme Khi tế bào nấm men còn non, chất nguyên sinh là đồng nhất và độ nhớt thấp hơn so với tế bào trưởng thành Ở tế bào già, tế bào chất không đồng nhất do xuất hiện không bào, các thể ẩn nhập và các cơ quan khác

- Nhân tế bào: tế bào nấm men có nhân thực Nhân có hình bầu dục hay hình tròn, nằm gần không bào trung tâm với kích thước từ 1 – 2 µm Nhân tế bào nấm men chứa protein, axít nucleic, nhiều hệ men và ribosome Lượng nhiễm sắc thể của nhân rất khác nhau tùy loài nấm men và chúng có thể phân chia theo kiểu gián phân hoặc đôi khi theo kiểu trực phân

- Những thành phần – cơ quan khác: không bào, ty thể, ribosome v.v

2.2.4 Đặc điểm sinh thái

Nấm men phân bố hết sức rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, lương thực, thực phẩm, rau quả Đặc biệt chúng thường được phân lập từ các nguyên liệu giàu đường

Ví dụ như các nấm men tự nhiên được tìm thấy trên lớp vỏ ngoài của trái cây chín, mọng nước (nho, táo, đào v.v.) hay dịch tiết từ cây ( nhựa cây) Một số loài nấm men còn được tìm thấy trong đất và ở côn trùng So với các vi sinh vật khác, đặc điểm sinh thái của nấm men không biểu hiện rõ ràng

Nấm men phát triển tốt nhất ở môi trường có pH trung tính hoặc hơi chua

2.2.5 Sự sinh sản của tế bào nấm men

Ở nấm men có 3 hình thức sinh sản chính: sinh sản bằng cách nảy chồi, sinh sản bằng cách phân đôi, sinh sản bằng bào tử

- Sinh sản bằng cách nảy chồi: Đây là hình thức sinh sản phổ biến nhất của nấm men Khi tế bào trưởng thành, nhân sẽ dài ra và bắt đầu thắt lại ở chính giữa Trên tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi non hoặc cùng một lúc tế bào mẹ có thể tạo ra nhiều tế bào con ở nhiều hướng khác nhau (tùy theo giống, loài) Mỗi chồi con sẽ nhận một phần chất nhân và chất nguyên sinh từ tế bào mẹ Khi chồi con trưởng thành, nó

sẽ hình thành một vách ngăn để tách khỏi tế bào mẹ và sống độc lập Kiểu sinh sản này thường gặp ở nấm men giống Saccharomyces, Candida, Torulopsis

- Sự phân chia tế bào: Sinh sản bằng cách phân đôi thường gặp ở nấm men có dạng sợi dài, giống Schizosaccharomyces, giống Endomyces Quá trình phân chia giống như ở tế bào vi khuẩn Lúc đầu tế bào dài ra và thắt lại ở chính giữa Nơi thắt nhỏ dần tới khi đứt hẳn tạo thành tế bào con

- Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử: Nhiều loài nấm men có khả năng hình thành bào tử Nấm men thường hình thành bào tử sau 5 – 10 ngày nuôi cấy trong môi trường mạch nha Có 2 dạng bào tử:

Bào tử túi (ascospore) thường được sinh ra trong những cái túi nhỏ gọi là nang hay là túi Mỗi túi chứa tù 1 – 8 bào tử túi, thường là 1 – 4 , hiếm sẽ có 16 bào tử hay nhiều hơn Bào tử túi có hình dạng và kích thước khác nhau tùy theo loài nấm men Có thể là hình bầu dục, hình bán cầu, hình thoi, v.v Túi có thể được sinh ra theo một trong ba công thức sau: tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinh sản đơn tính

Bào tử bắn (ballistospore) là loại bào tử chỉ thấy ở các loài trong giống Brillera, Spodiobolus, Sporoliomyces và Aessaspora Sau khi hình thành bào tử này có thể bắn mạnh ra phía đối diện

2.2.6 Sinh trưởng của nấm men

Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men được chia làm 4 pha: pha tiềm phát, pha logarit, pha ổn định và pha suy thoái Pha tiềm phát là giai đoạn nấm men mới được cấy vào môi trường còn chưa sinh sản Trong giai đoạn này nấm men còn thích nghi với môi trường mới, một số tế bào bị ức chế thậm chí còn có thể chết Số lượng tế bào nấm men không tăng hay tăng không đáng kể, nhưng sự trao đổi chất của chúng lại xảy ra mạnh mẽ Tế bào có kích thước tăng lên đáng kể, hàm lượng các chất protein, axít nucleic đều tăng lên, các enzyme thích ứng đều được tổng hợp mành mẽ

Ở pha logarit, số lượng và sinh khối nấm men tăng theo cấp số nhân Khả năng thích ứng với điều kiện môi trường tăng lên rõ rệt và xuất hiện hiện tượng lên men Nhìn chung, kích thước của tế bào nấm men ở pha này là nhỏ nhất vì chúng còn phải sinh sản từ nguồn tế bào chất và vỏ tế bào

Trong pha ổn đinh, tế bào nấm men ổn định và mật độ quần thể là tối đa, có sự cân bằng giữa tế bào sống và tế bào chết Kích thước tế bào tăng lên

Pha suy thoái, các tế bào sống giảm dần và tế bào chết tăng dần Các tế bào sống trở nên già đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng và tế bào chất xuất hiện dạng hạt (Lương Đức Phẩm, 2006)

2.3 Lên men hạt ca cao

Hạt ca cao là nguyên liệu quan trọng trong sản xuất bột ca cao và sô cô la Chính vì vậy mà khâu lên men (ủ) hạt ca cao là khâu quan trọng nhất ảnh hưởng đến chất lượng của các sản phẩm làm từ hạt ca cao Mục đích của việc lên men hạt ca cao nhằm gây ra những thay đổi sinh hóa trong phôi nhũ để làm giảm vị đắng và chát trong hạt ca cao Ngoài ra việc lên men còn giúp hóa lỏng và loại bỏ hết lớp nhầy bao quanh hạt ca cao tươi tạo thuận lợi cho quá trình sấy hạt tiếp theo

2.3.1 Các phương pháp ủ hạt ca cao

- Ủ đống:

Đây là phương pháp lên men đơn giản nhất và phổ biến ở vùng Tây Phi Hạt ca cao được đổ thành đống hình nón trên lớp lá chuối được xếp tròn trên mặt đất Bên dưới một lớp lá chuối kê các cành cây để tạo độ thoáng và giúp dịch nhầy chảy ra dễ dàng Các lá chuối sẽ được cuộn lên để bao kín khối hạt nhằm giữ hơi nóng trong suốt quá trình ủ Đống hạt có thể từ 25 - 2500 kg hạt tươi Hai hoặc ba ngày sau khi ủ phải được đảo trộn đều và giữ kín bằng lá chuối cho đến khi quy trình hoàn tất Tuỳ theo nhiệt không khí (tuỳ mùa) mà thời gian ủ kéo dài 5 đến 7 ngày (Michael P.Doyle và ctv, 2001)

- Ủ thúng:

Lót lá chuối xung quanh thúng tre, đổ đầy hạt và đậy thúng lại bằng lá chuối Hai ngày sau khi ủ trộn đều hạt bằng cách đổ từ thúng này sang thúng khác Kích thước thúng tuỳ theo khối lượng hạt để có thể chứa từ 10 - 150 kg hạt ca cao tươi Thời gian

ủ từ 5 - 7 ngày

Trong cách ủ đống và ủ thúng, ở lớp trên khối hạt luôn duy trì nhiệt độ khoảng 45-50oC Nếu hạt dưới 10kg thì phải ủ kỹ đống ủ sau khi nén thật chặt cần thiết phải duy trì nhiệt độ đống ủ nếu thời tiết lạnh

Sau 5 - 7 ngày ủ, nếu ủ đúng cách và đúng mức thì các hạt ca cao đều có màu sậm ngược lại thì các hạt ở phía bên ngoài có màu nâu, phía trong hơi trắng và giữa đống ủ các hạt trắng hơn Có thể hạt còn có màu đen, nấm mốc phát triển và hạt xuất hiện mùi amoniac khi thời gian ủ quá mức

- Ủ thùng:

Ca cao được chứa trong thùng gỗ có đục lỗ ở đáy Kích thước chiều dài và chiều rộng của thùng có thể thay đổi tùy theo lượng hạt nhưng chiều cao khối hạt không nên vượt quá 50 cm Khối lượng ủ từ 50 - 1000 kg Đảo trộn hạt sau hai ngày ủ Thời gian ủ từ 5 - 7 ngày

- Ủ khay:

Khay gỗ có kích thước 1,2 m x 0,9 m x 0,13 m, lót đáy bằng vạt tre cho dễ thoát nước Ca cao đổ vào khay một lớp 10 cm Chồng các khay lên với nhau sau đó dùng vải, bao bì trùm kín lại để giữ nhiệt Không đảo trộn hạt khi ủ Thời gian ủ kéo dài 3 đến 4 ngày

2.3.2 Quá trình lên men hạt ca cao

2.3.2.1 Sự lên men của lớp thịt bao quanh hạt

Lớp thịt bao quanh hạt (lớp cơm nhầy) chiếm 15 – 20% trọng lượng hạt ca cao tươi Theo Schwan, R.F (1998) cơm nhầy chứa 14% đường, 1,5% pectin và pH thấp khoảng 3,5 nhờ sự có mặt của axít citric là môi trường rất thích hợp cho sự phát triển của nấm men Trong 24 giờ đầu của quá trình lên men, các vi sinh vật chuyển hóa đường có trong lớp nhầy trong điều kiện yếm khí thành rượu etylic và khí carbonic

C6H12O6  2C2H5OH + 2 CO2Ngoài ra còn có một số sản phẩm phụ khác như axít lactic, axít oxalic, enzyme ngoại bào, hợp chất hữu cơ dễ bay hơi v.v

Ở 24 giờ tiếp theo, thịt quả sẽ bị thủy phân và chiết rút ra ngoài tạo điều kiện thông thoáng cho khối ủ, độ axít giảm, pH tăng đạt khoảng 5.0 Sau 2-3 ngày đầu tiên thường tiến hành trộn khối ủ làm cho không khí thâm nhập vào khối ủ Sự có mặt của oxi làm gia tăng lượng axit axêtic do sự oxi hóa ethanol

C2H5OH + O2  CH3COOH + H2O + Q Cuối quá trình lên men, lượng ethanol và axít lactic giảm dần, chỉ còn axit axêtic

Theo Kenten và Powell (1960), các phản ứng do hoạt động của vi sinh vật làm cho nhiệt độ khối ủ tăng lên, có thể đạt 50oC Nhiệt độ tăng đều trong suốt 48 giờ và đạt khoảng 42 - 48oC vào cuối quá trình lên men

Nhờ axit axêtic và nhiệt độ cao làm cho màng tế bào bị phá vỡ, hạt chết không còn khả năng nảy mầm và các chất dễ hòa trộn vào nhau Điều này cho phép một số

chất phức tạp chuyển sang trạng thái hoạt động, đây là yếu tố quyết định đến màu và mùi của bột ca cao sau này

2.3.2.2 Những nội phản ứng xảy ra trong các mô của phôi nhũ

Sự lên men bên trong hạt ca cao bao gồm một loạt phản ứng phức tạp, các tử diệp co rút lại từ áo hạt và biến đổi màu sắc, bên cạnh đó nhiệt độ tăng có tác dụng diệt chết phôi hạt, từ đó bắt đầu các phản ứng lên men trong phôi nhũ Quá trình này diễn

ra có mãnh liệt hay không phụ thuộc vào hàm lượng axit axêtic và axít lactic trong quá trình lên men lớp cơm nhầy Khi các axít này thấm vào nội nhũ sẽ gây hiện tượng vỡ các thành tế bào

Các mô của phôi nhũ do 2 tế bào tạo thành là tế bào sắc tố chứa polyphenol, các purin và các tế bào dự trữ không có màu sắc chứa những tinh thể bơ ca cao, protein, các enzyme

Khi hạt ca cao chết, phôi nhũ sẽ hút ẩm làm cho vách tế bào dự trữ thấm nước, nội chất của tế bào khuếch tán qua các mô Các enzyme của tế bào dự trữ sẽ được tiếp xúc với polyphenol của tế bào sắc tố Hoạt động thủy phân protein sẽ xảy ra trong các polyphenols sẽ bị thủy phân hóa cho ra cyanidin và hai đường khử Anthocyanin, là các chất không màu khi bị oxy hóa sẽ có màu nâu đặc biệt (màu nâu ca cao) Những polyphenols khác sẽ tản di một phần hoặc chịu những biến đổi hóa học làm giảm vị

Trong phần cơm nhầy

Nấm men phát triển

CƠM NHẦY Pectin Citric Đường Nước

Hình 2.2 Sơ đồ sự chuyển hóa đường của cơm nhầy trong quá trình lên men

(Nguồn: Hylayat, 2007)

đắng và chát của hạt Các phản ứng trên xảy ra cho tới cuối đợt lên men và còn tiếp tục trong quá trình phơi khô

Trong quá trình lên men lượng đạm tổng số giảm do theobromine bị hao hụt, các chất protein bị phá hủy Khoảng 40% theobromine khuếch tán vào các mô và di chuyển vào vỏ làm giảm vị đắng Còn các protein sẽ bị tủy phân thành các amino axít, peptid v.v phản ứng với polyphenol tạo thành các chất không hòa tan là các vị hương

và màu sắc của hạt

Hương vị ca cao được quyết định bởi các tiền chất tạo hương sô cô la (đường khử, aminoaxít, polyphenol, v.v ) nên lượng các tiền chất này càng nhiều thì quá trình tạo ra hương vị ca cao càng tốt và hạt ca cao càng có chất lượng cao

2.4 Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.4.2 Nghiên cứu trong nước

Năm 2002, nhóm tác giả Trần Xuân Ngạch và ctv đã phân lập được 4 chủng

nấm men trong quá trình lên men hạt ca cao Quãng Ngãi: Hansenia sporauvarum,

Galatomyces resii, Candida Sorboxylosa, Candida fructus

Theo Vương Thanh Tùng và Hà Thanh Toàn (2006) đã tiến hành khảo sát chất lượng hạt ca cao lên men trong điều kiện tự nhiên, những biến đổi sinh hóa và mật số các vi sinh vật chủ yếu trong quá trình lên men Kết quả cho thấy lên men hạt ca cao là một chuỗi các quá trình lên men của các nhóm vi sinh vật nối tiếp nhau Đầu tiên là sự phát triển của nấm men, tiếp theo là vi khuẩn, cuối cùng là sự phát triển của một số

Trong nội nhũ

Đường đơn Amino axít

Tiền hương vị chocolate Chất thải

NỘI NHŨ Đường đa Polyphenol Protein

Hình 2.3 Quá trình biến đổi các chất trong nội nhũ hạt ca cao

(Nguồn: Hylayat, 2007)

nấm sợi trên bề mặt khối ủ Chất lượng hạt ca cao sau lên men tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ lên men ở 40oC, độ ẩm nguyên liệu là 82% và thời gian lên men trong 7 ngày

2.4.3 Nghiên cứu của nước ngoài

Martelli H.L và Dittmar H.F.K., (1961) đã tiến hành phân lập nấm men từ hạt

ca cao trong quá trình lên men Kết quả Saccharomyces rosei, Hasennula anomala,

Pichia fementans, Pichia membranaefaciens và Trichosporon cutaneum đã được tìm

thấy trong hạt ca cao lên men Nhưng chỉ có S rosei, H.anomala, P fementans có khả

năng lên men tốt các loại đường trong ca cao Các loài thuộc họ Saccharomyces được xác định là nhân tố chịu trách nhiệm chính trong lên men ca cao thành rượu

Trong khi đó, nghiên cứu về hệ vi sinh trong hạt ca cao lên men ở Indonesia của Ardhana MM và Fleet GH (2003) cho thấy trong 2 – 3 ngày đầu tiên của quá trình lên men được đặc trưng bởi sự phát triển của nấm sợi, nấm men, vi khuẩn lactic và vi

khuẩn axêtic Các loài được tìm thấy chủ yếu Penicillium citrinum, 1 loài Basidiomycete, Kloeckera apis, Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis,

Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus plantarum và Acetobacter pasteurianu Còn

trong giai đoạn cuối của quá trình lên men chủ yếu xuất hiện các loài vi khuẩn Bacillus

như Bacillus pumilus và Bacillus licheniformi

Theo nghiên cứu của Swhan và ctv (2004) về vai trò của vi sinh vật trong lên men ca cao đối với chất lượng sô cô la, quá trình lên men hạt ca cao có sự tham gia của vi khuẩn, nấm men tạo ra axit lactic và axit axêtic Nhiệt độ của quá trình lên men

có thể lên tới 50oC làm chết tử diệp và tạo ra những tiên hương vị sô cô la

Năm 2007, Lagunes Gálvez S và ctv đã tiến hành nghiên cứu vi sinh vật và sinh hóa trong lên men ca cao tại Cộng hòa Dorminican Kết quả cho thấy nhiệt độ lên men tối đa trung bình đạt 51oC sau 48 giờ lên men và độ pH đạt 4,5 sau 144 giờ lên men Trong 48 giờ lên men đầu tiên lượng glucose, fructose và axít citric giảm đáng kể Các nấm men phân lập thuộc các chi Hanseniaspora và Candida, các vi khuẩn lactic thuộc chi Lactobacillus và vi khuẩn axêtic thuộc chi Acetobacter

Bảng 2.3 Các loài nấm men phân lập từ quá trình ủ hạt ca cao ở một số quốc gia

Các loài nấm men có tên in đậm là các loài chiếm ưu thế

Nguồn (Hugh Douglas Dircks 2009)

Quốc gia Tác giả PP lên

men

Loài nấm men Giống ca

cao Ghana Jespersen

và cs,

2005 Nielsen

và cs, 2007b

Hộp (100kg,

500 kg)

và Khay(10

0 kg)

C.intermedia, C.krusei,

C.parapsilosis, C.quercitrusa, C.silvicola, C.stellimalicola,

Forastero

Malaysia Carr và

cs, 1979

Hộp (2.500 kg)

Candida sp., Debaryomyces sp., Hanseniaspora sp., Hansenula sp., Kloeckera sp., Rhodotorula sp., Saccharomyces sp., Torulopsis sp

Candida tropicalis, C.pelliculosa,

C.humicola, Kloeckera apis,

Candida krusei, Hansenula

anomala, Pichia fermentans,

Pichia membranifaciens, Saccharomyces cerevisiae var ellipsoides,

Schizosaccharomyces pombe, Trichosporon pullulans

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ ngày 15/12/2012 đến ngày 15/05/2013 tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

- Nguyên liệu: Sử dụng hạt được tách từ trái ca cao tươi lấy từ Tiền Giang

- Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Tủ cấy vô trùng , lò vi sóng, kính hiển vi, máy lắc, nhiệt kế, máy đo pH, cân điện tử 2 số OHAVS (Golo Series), cân điện tử 4 số Precisa XT220A, nồi hấp khử trùng và các dụng cụ thường có ở phòng thí nghiệm vi sinh (đĩa petri, bình tam giác, micropipet, becher, que cấy chan, que cấy vòng, v.v.)

- Môi trường: Môi trường tổng hợp DRBC, môi trường MAE, môi trường phenol red carbohydrat, môi trường MRS

3.3 Phương pháp thí nghiệm

3.3.1 Ủ ca cao

Ca cao sẽ được tiến hành ủ theo phương pháp ủ thúng:

- Chuẩn bị 3 thúng Lót một lớp lá chuối quanh thúng

- Cân 10 kg ca cao trái tươi, tách vỏ, lấy hạt cho vào 1 thúng Tương tự ở 2 thúng còn lại

- Đậy thúng bằng lá chuối

- Sau 24 giờ ủ tiến hành đảo trộn và lấy mẫu, định kỳ lấy mẫu 24 giờ/lần Quá trình ủ kéo dài 6 ngày

3.3.2 Phân lập nấm men và vi khuẩn

- Phương pháp lấy mẫu: Ca cao sau khi ủ được 1 ngày tiến hành lấy 25g hạt Mẫu lấy cho vào túi nilon tiệt trùng Tương tự ở thời điểm 2,3,4,5,6 ngày lên men

- Phương pháp phân lập:

Bước 1: Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường DRBC và môi trường MRS đã hấp khử trùng Các bình tam giác chứa 225 ml dung dịch pepton 0,1% và ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pepton 0,1% đã hấp khử trùng

Bước 2: Cân 25g hạt ca cao sau 1 ngày lên men cho vào bình tam giác chứa 225

ml dung dịch pepton 0,1% được nồng độ pha loãng 10-1 Lắc đều trong 15 phút

Bước 3: Hút 1ml dung dịch trên cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pepton 0,1% đã hấp khử trùng, trộn đều, được nồng độ 10-2 Hút tương tự để pha loãng đến nồng độ 10-5

Bước 4: Hút 0,1ml dung dịch ở mỗi độ pha loãng khác nhau cho vào 2 đĩa thạch môi trường DRBC và MRS Dùng que gạt thủy tinh trải đều mặt thạch đến khi khô Thực hiện ở 3 độ pha loãng liên tiếp 10-3,10-4, 10-5, mỗi độ pha loãng lặp lại 3 đĩa petri Bước 5: Ủ nhiệt độ phòng trong 48 giờ đến khi quan sát được các khuẩn lạc nấm men và vi khuẩn

- Phương pháp làm thuần: Chọn khuẩn lạc đặc trưng của nấm men và vi khuẩn đem cấy ria trên môi trường thạch MRS Lặp lại khoảng 2-3 lần cho đến khi nhận được chủng thuần

- Phương pháp giữ giống: Giống thuần chủng sẽ được lưu giữ trong ống thạch nghiêng Sử dụng que cấy vòng thu giống đã thuần chủng cấy ziczac lên môi trường bên trong ống nghiệm, đậy nút bông, bọc kín đầu ống nghiệm bằng parafin Giữ giống trong điều kiện lạnh 8-10oC (theo Hugh Douglas Dircks, 2009)

3.3.3 Quan sát hình thái tế bào nấm men và vi khuẩn dưới kính hiển vi

- Nấm men

Nấm men có cấu tạo đơn bào, có kích thước tương đối lớn Hình dạng tế bào nấm men rất đa dạng nên khi quan sát cần chú ý đến các đặc điểm hình dạng và kích thước tế bào

Nguyên tắc: sử dụng tiêu bản giọt để quan sát hình thái tế bào nấm men

Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị phiến kính, cho 1 giọt nước cất đã khử trùng lên phiến kính, trải đều một ít sinh khối khuẩn lạc nấm men, đậy lame Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X và 100X

- Vi khuẩn

Phương pháp nhuộm gram vi khuẩn

Bước 1: Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm Nhỏ 1 giọt nước vào phiến kính Lấy 1

ít sinh khối vi khuẩn và dàn đều trên giọt nước

Bước 2: Cố định mẫu trên ngọn lửa đèn ethanol

Bước 3: Dùng thuốc nhuộm Crystal violet nhuộm mẫu trong 1 phút

Bước 4: Rửa nước tối đa 5 giây

Bước 5: Thêm dung dịch Lugol trong 1 phút

Bước 6: Rửa bằng ethanol trong 10 giây

Bước 7: Nhuộm tiếp với Fuchsin trong 1 phút

Bước 8: Rửa qua nước Để khô

Bước 9: Tiến hành quan sát lam kính dưới kính hiển vi

Gram dương: bắt màu xanh đen hay tím

Gram âm: bắt màu hồng

3.3.4 Thử nghiệm khả năng lên men đường

Nguyên tắc: Nấm men có khả năng lên men nhưng không phải nó có khả năng lên men tất cả các loại đường Sản phẩm của quá trình lên men có thể là các loại axít hữu cơ, rượu hay một số hợp chất không có tính axít Để xác định khả năng lên men đường người ta bổ sung vào môi trường thuốc thử phenol red Axít tạo ra trong môi trường sẽ làm cho phenol red có màu vàng Nếu môi trường sau khi lên men không có axít, dung dịch sẽ có màu đỏ

Phương pháp thực hiện: Cấy nấm men vào môi trường phenol red carbohydrate chứa 0,5 – 1% các loại đường khác nhau Ủ dịch nuôi cấy ở nhiệt độ phòng và xem kết quả sau 24 – 48 giờ nuôi cấy

3.3.5 Phương pháp xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Drop plate Cout)

- Nguyên tắc: Xác định số lượng nấm men thông qua đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đĩa sau 48 giờ nuôi cấy Nguyên tắc căn bản đó là xem mỗi một khuẩn lạc là một tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu

- Phương pháp thực hiện:

Bước 1: Chuẩn bị các bình tam giác 100 ml chứa 50 ml dung dịch môi trường MAE, hấp khử trùng ở 121oC, 20 phút Chuẩn bị đĩa petri chứa sẵn môi trường MAE

đã được hấp khử trùng Chuẩn bị nước cất đã khử trùng

Bước 2: Cấy lần lượt các chủng nấm men đã phân lập và giữ trong ống giống vào đĩa môi trường MAE, ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Mỗi chủng lặp lại trên 3 bình tam giác

Bước 3: Dùng que cấy khử trùng chuyển 1 khuẩn lạc từ đĩa petri ở bước 2 vào bình tam giác chứa 50 ml môi trường MAE Đem ủ ở máy lắc định ôn ở 37oC, tốc độ lắc 100 vòng/ phút

Bước 4: Sau 24 giờ, hút lấy 100 μl dung dịch khuẩn ở bình tam giác cho vào eppendoft có chứa 900 μl nước cất tiệt trùng Pha loãng dung dịch đến độ pha loãng

10-8

Bước 5: Chuẩn bị 2 đĩa môi trường MAE cho 1 mẫu, mỗi đĩa chia làm 3 hàng Đĩa thứ nhất có 3 hàng tương ứng với 3 độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5; đĩa thứ 2 có 3 hàng tương ứng 3 độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8

Bước 6: Sau khi trộn đều các eppendoft chứa các độ pha loãng khác nhau, dùng micropipet nhỏ giọt dung dịch ở mỗi độ pha loãng theo hàng ngang trên đĩa (hút 20 μl dung dịch/ 1 giọt, 3 giọt/1 hàng ngang) Nhỏ những giọt gọn, nhẹ sao cho từng giọt tỏa tròn đều, thẳng hàng và không dính nhau Ủ ở nhiệt độ phòng ở vị trí yên tĩnh, sau 24 – 48 giờ đếm số khuẩn lạc xuất hiện Chọn đếm hàng có các khuẩn lạc rời và số lượng

đủ lớn trong mỗi giọt, tính số khuẩn lạc trung bình

Bước 7: Lặp lại bước 4 sau khi lắc bình tam giác chứa nấm men ở 32, 48, 56,

72, 80, 96 giờ

Công thức tính số lượng nấm men trong 1 ml dịch mẫu ở một độ pha loãng:

A(vsv/ml) = a x B x h Trong đó :

a: số khuẩn lạc trung bình có trên một hàng ngang ở một độ pha loãng

ai: số khuẩn lạc trên một hàng ngang ở một độ pha loãng n: số lần lặp lại cho mỗi độ pha loãng

h: hệ số pha loãng B: hệ số thể tích quy ra 1 ml Sau khi tính số lượng nấm men trong 1 ml mẫu ở 1 độ pha loãng Tính trung bình số lượng nấm men được lặp lại 3 lần ở 3 bình tam giác

3.3.6 Khảo sát sự thay đổi nhiệt độ, pH, tỷ lệ giữa hạt nhân và cơm nhầy của ca cao trong suốt quá trình ủ tự nhiên

- Mục đích: Nhằm khảo sát sự thay đổi nhiệt độ, pH, tỷ lệ hạt nhân/cơm nhầy của

ca cao trong quá trình lên men theo phương pháp ủ thúng, làm cơ sở để đánh giá chất lượng hạt ca cao sau lên men

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 yếu tố (thời gian ủ) và 3 lần lặp lại

- Tiến hành thí nghiệm: Trái ca cao chín được tách lấy hạt cân khối lượng và tiến hành ủ Mỗi ngày tiến hành cân khối lượng hạt ca cao và ghi lại các giá trị nhiệt độ 1 lần bằng nhiệt kế, mỗi lần ở 3 vị trí khác nhau Đồng thời tiến hành lấy mẫu để phân tích pH của cơm nhầy và pH của hạt nhân (phôi nhũ)

- Cách đo khối lượng hạt ca cao: Mỗi ngày lấy 10 hạt ca cao tách riêng cơm nhầy

và hạt Tiến hành cân riêng khối lượng cơm nhầy và khối lượng hạt Ghi nhận số liệu (theo Hugh Douglas Dircks, 2009)

lệ 1 : 1 tính theo w/v), trộn đều và đo pH (theo Hugh Douglas Dircks, 2009)

3.3.7 Khảo sát mật số các chủng nấm men và vi khuẩn trong quá trình lên men

tự nhiên theo thời gian

- Mục đích: Nhằm khảo sát tỷ lệ các chủng nấm men và vi khuẩn theo ngày trong

quá trình lên men hạt ca cao, làm cơ sở cho việc xác định các chủng nấm men và vi khuẩn có lợi tham gia chính vào quá trình lên men ảnh hưởng đến chất lượng hạt ca

cao

- Bố trí và tiến hành thí nghiệm: Tương tự mục 3.3.6

- Phương pháp đếm khuẩn lạc:

Tương tự từ bước 1 đến bước 4 của mục 3.3.2.2

Bước 5: Ủ 48 giờ ở nhiệt độ phòng đến khi quan sát được các khuẩn lạc nấm men và vi khuẩn Đếm khuẩn lạc, ghi nhận các độ pha loãng có từ 25 - 250 Cfu/1 đĩa petri

Bước 6: Lặp lại từ bước 2 ở 2, 3, 4, 5, 6 ngày ủ hạt ca cao

Công thức tính số lượng nấm men và vi khuẩn: c      

Trong đó:

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa có 25 – 300 khuẩn lạc

ni: Số đĩa có khuẩn lạc trong khoảng mật độ đếm được

vi: Thể tích dịch pha loãng cho vào mỗi đĩa petri (ml)

fi: Bậc pha loãng

3.3.8 Khảo sát quá trình lên men hạt ca cao có bổ sung nấm men

- Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung nấm men đến thành phần lý, hóa của hạt ca cao và hệ sinh vật tham gia trong quá trình lên men

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 2 nghiệm thức mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

Bước 3: Mỗi ngày tiến hành lấy mẫu cân khối lượng cơm nhầy và hạt ca cao, đo

pH, nhiệt độ, đếm mật độ nấm men và vi khuẩn

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập và làm thuần nấm men

Trong 6 ngày tiến hành lên men hạt ca cao, sau khi phân lập và làm thuần kết quả thu nhận được 5 chủng nấm men ký hiệu là A1, A2, A3, B1, B2

Bảng 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc nấm men và hình thái tế bào dưới kính hiển vi

Ký

hiệu

chủng

Hình dạng khuẩn lạc (MT MAE – màu nâu, MT

Hanseniaspora uvarum

Debaryomyces hanseni

* Tên của các chủng nấm men sau khi định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH

Bảng 4.1(tt) Đặc điểm khuẩn lạc nấm men và hình thái tế bào dưới kính hiển vi

Ký

hiệu

chủng

Hình dạng khuẩn lạc (MT MAE – màu nâu, MT

DRBC – màu hồng)

Hình dạng tế bào Định danh

chủng * A3

Khuẩn lạc tròn, lồi, bề mặt

vun đều, trơn bóng, đường

kính 2 – 3 mm

Tế bào hình ovan, kích thước lớn, 1,5 – 3 x 4 – 6

µm sinh sản bằng cách tạo chồi

Candida orthopsilosis

µm

Candida tropicalis

Candida theae

* Tên của các chủng nấm men sau khi định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH

Nhìn chung, các chủng nấm men này đều phát triển mạnh nên sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch đã quan sát được các khuẩn lạc đơn Nhưng để quan sát rõ hình thái khuẩn lạc, cần phải xem sau 48 giờ nuôi cấy

Hình thái của các chủng nấm men được thể hiện rõ ở bảng 4.1 Đa số các khuẩn lạc có dạng tròn, trơn bóng và có màu trắng đục trên môi trường MAE, màu trắng hồng trên môi trường DRBC Khuẩn lạc nấm men trên môi trường DRBC dễ quan sát hơn trên môi trường MAE

Đối với hình thái tế bào nấm men, các chủng nấm men được quan hình thái tế bào dưới kính hiển vi ở vật kính 100X Kết quả cho thấy các chủng nấm men đa số có hình ovan, elip, có kích thước tương đối lớn và sinh sản bằng cách tạo chồi ở cực Hình thái tế bào và kích thước nấm men quan sát rõ nhất sau 48 giờ nuôi cấy

4.2 Kết quả thử nghiệm lên men đường của các chủng nấm men

Các chủng nấm men sau khi được phân lập và tiến hành quan sát hình thái tế bào và hình thái khuẩn lạc sẽ được khảo sát khả năng lên men các loại đường glucose, mantose, lactose, manitol, sucrose và saccharose trong 48 giờ Kết quả được thể hiện tại bảng 4.2

Bảng 4.2 Kết quả lên men đường của các chủng nấm men

Glucose Mantose Lactose Manitol Succrose Saccharose

(): âm tính, (+): dương tính yếu, (++): dương tính mạnh

Hầu hết các chủng nấm men đã phân lập có khả năng lên men glucose, sucrose, mantose và saccharose trừ chủng A1 không có khả năng lên men đường mantose và saccharose Đối với 2 loại đường lactose và manitol, các chủng nấm men này đều không lên men được

Hình 4.1 cho thấy, các chủng nấm men lên men mạnh sẽ làm đục màu môi trường và chuyển màu môi trường từ màu đỏ sang màu vàng Còn các chủng nấm men lên men đường yếu chỉ làm môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu đỏ cam hoặc cam