XÂY DỰNG GIẢI PHÁP TẬN DỤNG BÃ CÀ PHÊ LÀM CHẤT HẤP THU Ô NHIỄM KIM LOẠI NẶNG VÀ THU NHẬN HOẠT CHẤT ỨC CHẾ SINH VẬT GÂY HẠI

Đề tài nghiên cứu được thực hiện trên ba nội dung chính gồm xác định điều kiện tối ưu cho quá trình tách chiết alkaloid bằng phương pháp chiết xuất trên hệ thống Soxhlet và Microwave; sa

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG GIẢI PHÁP TẬN DỤNG BÃ CÀ PHÊ

LÀM CHẤT HẤP THU Ô NHIỄM KIM LOẠI NẶNG

VÀ THU NHẬN HOẠT CHẤT ỨC CHẾ SINH VẬT GÂY HẠI

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ HƯƠNG LAN Niên khóa : 2009 - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tháng 6/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG GIẢI PHÁP TẬN DỤNG BÃ CÀ PHÊ

LÀM CHẤT HẤP THU Ô NHIỄM KIM LOẠI NẶNG

VÀ THU NHẬN HOẠT CHẤT ỨC CHẾ SINH VẬT GÂY HẠI

LỜI CẢM ƠN

Sau sáu tháng thực hiện khóa luận tốt nghiệp, lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Thầy Bùi Minh Trí, người đã định hướng đề tài nghiên cứu, luôn quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp Kính chúc Thầy luôn hạnh phúc trong cuộc sống

Trên hết con xin bày tỏ lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến gia đình Cám

ơn Cha mẹ đã sinh thành, dưỡng dục, cho con được đến trường, đến với giảng đường đại học Cám ơn Cha mẹ đã luôn động viên, là chỗ dựa tinh thần cho con khi con gặp khó khăn Em xin gửi lời cám ơn đến Anh Chị đã quan tâm và ủng hộ tinh thần cho em

Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập

Em xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng các Thầy, Cô của trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh đã truyền đạt những kiến thức,những kinh nghiệm quý báulàm hành trang cho em vững bước trên đường đời Đặc biệt, em xin gửi lời cám ơn chân thành, lời chúc sức khỏe đến cô Tô Thị Nhã Trầm, người

đã quan tâm, động viên và giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

Tôixin gửi lời cảm ơn đến bạn Quản Thị Thu và bạn Nguyễn Ngô Yến Ngọc đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, cùng các Anh Chị đang công tác tại phòng Công nghệ sinh học thực vật đã quan tâm, động viên và chia

sẻ những kinh nghiệm trong học tập cũng như trong cuộc sống

TP Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013

Sinh viên

Nguyễn Thị Hương Lan

TÓM TẮT

Bã cà phê-chất thải rắn thu được từ bột cà phê sau khi nhúng trong nước nóng để chuẩn bị cà phê hòa tan - là một loại vật liệu lignocellulose, với cấu trúc xốp, nhiều lỗ trống, có khả năng hấp phụ tốt các kim loại nặng trong nước thải Trong bã cà phê cũng còn hiện diện nhiều alkaloid, các thành phần kháng sinh lý như tannin, axit chlorogenic Đây cũng là những độc tố có tác dụng ngăn cản một số sinh vật gây hại Nghiên cứu nàyđược thực hiện nhằm xây dựng quy trình chiết xuất alkaloid từ bã cà phê, sau đó sử dụng chất rắn làm vật liệu hấp thu kim loại nặng và thu nhận tổng alkaloid để ức chế vi sinh vật gây hại

Đề tài nghiên cứu được thực hiện trên ba nội dung chính gồm xác định điều kiện tối ưu cho quá trình tách chiết alkaloid bằng phương pháp chiết xuất trên hệ thống Soxhlet và Microwave; sau đó đánh giá hiệu quả hấp thukim loại nặngbằng phương pháp hấp phụ trên cột và đánh giá khả năng ức chế sinh vật gây hại bởi alkaloid được chiết xuất từ bã cà phê bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

Sau khi tiến hành chiết xuất alkaloid trên hệ thống Soxhlet với tỉ lệ vật liệu/thể tích dung môi là 1:25 ở 40oC đã nhận được khối lượng tổng alkaloid cao nhất Hiệu quả sẽ gia tăng khi xử lý bằng sóng microwave trong 3 phút Thêm vào đó, chất rắn thu được từ quá trình chiết alkaloid được tận dụng làm chất hấp thu kim loại nặng với hiệu suất hấp thu cao nhất ở tốc độ dòng chảy bằng 2 ml/phút, tỉ lệ vật liệu/thể tích Cr (VI) bằng 1:75 g/ml

và pH dung dịch bằng 2 Hoạt tính ức chế vi sinh vật gây hại bởi tổng alkaloid chiết xuất được từ bã cà phê đạt cao nhất ở nồng độ 600 ppm với vòng ức chế tương ứng là 1,43 cm

in a column The third part was evaluating microbial suppression activity of alkaloids extracted from the coffee grounds using agar diffusion method.After the extraction of alkaloids by Soxhlet methodwith the material/solvent ratio (volume/volume) was 1:25

at 40oC The total amount of alkaloids harvested and the collected solid were higher when usingmicrowave extraction method In addition, the solid obtained from the extraction processwas utilized as adsorbents for heavy metal with the highest adsorption capacity a flow rate of 2 ml per minute, the ratio between materials/Cr (VI) (volume/volume) was 1:75 g/ml and pH 2 Finally, inhibitory activity of harmful organisms by the alkaloid derived from coffee grounds at concentration of 600 mg/ml with diameter of growth inhibition reached 1.43 cm

Key words: coffee grounds, total alkaloids, Cr (VI), antimicrobial activity

MỤC LỤC

Trang

Lời cám ơn i 

Tóm tắt ii 

Summary iii 

Mục lục iv 

Danh sách các chữ viết tắt vi 

Danh sách các bảng vii 

Danh sách các hình viii 

Chương 1 MỞ ĐẦU viii 

1.1 Đặt vấn đề 1 

1.2 Yêu cầu của đề tài 2 

1.3 Nội dung thực hiện 2 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 

2.1 Tổng quan về bã cà phê 3 

2.1.1 Thành phần của bã cà phê 3

2.1.2 Công dụng và tình hình nghiên cứu tận dụng bã cà phê 5

2.1.2.1 Công dụng của cafein hiện diện trong bã cà phê 5

2.1.2.2 Tình hình nghiên cứu tận dụng bã cà phê trong và ngoài nước 6 

2.2 Tổng quan về alkaloid 6 

2.2.1 Khái niệm về hợp chất alkaloid 6 

2.2.1.1 Định nghĩa 6 

2.2.1.2 Tính chất cơ bản của alkaloid 6 

2.2.2 Các phương pháp chiết alkaloid và ứng dụng 6 

2.2.3 Phương pháp định tính alkaloid trong dịch chiết 8 

2.2.3.1 Phản ứng tạo tủa 8 

2.2.3.2 Phản ứng tạo màu 9 

2.2.4 Các phương pháp định lượng alkaloid sau khi chiết xuất 9 

2.2.4.1 Phương pháp cân 9 

2.2.4.2 Phương pháp trung hòa 10 

2.2.4.3 Định lượng alkaloid trong môi trường khan 10 

2.2.4.4 Phương pháp so màu 10 

2.2.4.5Phương pháp định lượng alkaloid hiện đại 11 

2.2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về ảnh hưởng của alkaloid đến sinh vật 11 

2.3 Tổng quan về crom 12 

2.3.1 Giới thiệu về crom 12 

2.3.2 Tính chất hóa học của crom 12 

2.3.3 Ảnh hưởng của crom đối với sinh vật 13 

2.3.3.1 Ảnh hưởng của crom đối với động và thực vật 13 

2.3.3.2 Ảnh hưởng của crom đối với con người 13 

2.3.4 Tình hình nghiên cứu xử lý crom trong và ngoài nước 14 

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16 

3.2Vật liệu 16 

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 

3.3.1 Xác định điều kiện tối ưu cho quá trình tách chiết alkaloid từ bã cà phê 16 

3.3.1.1 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và tỉ lệ nguyênliệu/chloroform 16 

3.3.1.2 Xác định ảnh hưởng của chế độ xử lý Microwave (cường độ và thời gian) 18 

3.3.2 Đánh giá hiệu quả hấp thu Cr (VI) của bã cà phê sau khi tách chiết alkaloid 18 

3.3.2.1 Xác định ảnh hưởng của tốc độ dòng chảy đến hiệu quả hấp thu Cr (VI) 18 

3.3.2.2 Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ vật liệu/thể tích đến hiệu quả hấp thuCr (VI) 19 

3.3.2.3Xác định ảnh hưởng pH đến hiệu quả hấp thu Cr (VI) 19 

3.3.3 Đánh giá tác động của tổng alkaloid đến sinh vật gây hại 21 

3.4 Xử lý số liệu 21 

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 

4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu quả tách chiết 22 

4.2 Ảnh hưởng của chế độ xử lý Microwave (cường độ và thời gian) đến hiệu quả tách chiết 22 

4.3 Ảnh hưởng của tốc độ dòng chảyđến hiệu quả hấp thuCr (VI) 25 

4.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ vật liệu/thể tích đến hiệu quả hấp thuCr (VI) 26 

4.5 Ảnh hưởng pH đến hiệu quả hấp thu Cr (VI) 27 

4.6 Ảnh hưởng của của các nồng độ alkaloid đến nấm P.chrysospirium 28 

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30

5.1 Kết luận 30 

5.2 Đề nghị 30 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 Phụ lục

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HPLC High performance liquid chromatography

MAE Microwave assisted extraction

PGA Potato glucose agar

pHzpc pH of zero point of charge

SEM Scanning electron microscope

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1Các thành phầncơ bản của bã cà phê 3 

Bảng 3.1Các thông số nhiệt độ và tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 17 

Bảng 3.2Các chế độ xử lý Microwave ở các công thức thí nghiệm 18 

Bảng 3.3 Thông số tốc độ dòng chảy của dung dịch Cr (VI) 18 

Bảng 3.4Tỉ lệ vật liệu/thể tích dung dịch Cr (VI) ở các công thức thí nghiệm 19 

Bảng 3.5Giá trị pH của dung dịch Cr (VI) ở các công thức thí nghiệm 21 

Bảng 3.6Các nồng độ alkaloid xử lý nấm P.chrysospirium 21 

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và tỉ lệ BCP/dung môi đến khối lượng alkaloid 21 

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và tỉ lệ BCP/dung môi đến khối lượng chất rắn 21

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của chế độ xử lý Microwave đến khối lượng alkaloid 23

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của chế độ xử lý Microwave đến khối lượng chất rắn 23

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của tốc độ dòng chảy đến hiệu quả hấp thu Cr (VI) 26 

Bảng 4.6Ảnh hưởng của tỉ lệ BCP/thể tích đến hiệu quả hấp thuCr (VI) 26 

Bảng 4.7 Ảnh hưởng pH đến hiệu quả hấp thu Cr (VI) 27 

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của các nồng độ alkaloid đến nấmP.chrysospirium 28

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Hình ảnh SEM của bã cà phê (bar = 100 µm) 3 

Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của cafein 4 

Hình 2.3Sơ đồ quy trình tách chiết alkaloid bằng dung dịch nước axit 8

Hình 3.1 Quy trình khảo sát tốc độ dòng chảy của dung dịch Cr (VI) 18

Hình 4.1 Quy trình chiết alkaloid bằng phương pháp chiết với sự hỗ trợ Microwave 24 Hình 4.2 Ảnh hưởng của tổng alkaloid đến nấm Phanerochaete chrysosporium 29

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, sự hiện diện của kim loại nặng trong nguồn nước thải công nghiệp đang

là vấn đề đáng lo ngại (Thomas và ctv, 2008) bởi tính chất độc hại và khả năng tích lũy lâu dài trong cơ thể sống (Ghodbane và Hamdaoui, 2008) Đáng chú ý nhất đó là crom Crom thường tồn tại trong nước thải của các ngành công nghiệp mạ điện, thuộc da, dệt nhuộm, có nồng độ dao động từ 10 đến 100 mg/l (Dermou và ctv, 2005) Cr (VI) thường độc hơn Cr (III) (Lalvani và ctv, 1998) bởi vì Cr (VI) có khả năng gây ung thư và đột biến gen (Xu Han và ctv, 2006) Vì vậy, cần phải có các biện pháp nhằm loại bỏ crom hoặc làm giảm sự ô nhiễm bằng cách oxi hóa Cr (VI) thành Cr (III) (Owladvà ctv, 2009) trong nước thải công nghiệp trước khi thải ra môi trường tự nhiên

Một số phương pháp thường sử dụng để loại bỏ crom trong nước thải công nghiệp như kỹ thuật kết tủa, trao đổi ion và màng lọc Tuy nhiên, những phương pháp này không mang lại hiệu quả hay lợi ích kinh tế khi nồng độ kim loại nặng dao động trong khoảngtừ 1 đến100 mg/l (Xu Han và ctv, 2006)

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung sử dụng các vật liệu hấp phụ giá rẻ được chế tạo từ phụ phẩm nông nghiệp như tro trấu, bã mía, xơ dừa(Thomas

và ctv, 2008) trong việc xử lý nguồn nước bị ô nhiễm bởi kim loại nặng nhưng bã cà phê ít được chú ý tới

Bã cà phê là chất thải rắn thu được từ bột cà phêđã qua sử dụng Một số nghiên cứu cho thấy bã cà phê có cấu trúc rỗng với nhiều lỗ trống có đường kính nhỏ khoảng 30

µm (Ivo và ctv, 2012), có thể dự đoán đây là loại vật liệu lọc lý tưởng Ngoài ra, các nhóm chức năng carboxyl, hydroxyl trong thành phần chính lignocellulose của bã cà phê

có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại (Garima và Dhiraj, 2013) hiện diện trong nước thải công nghiệp Vì thế bã cà phê có thể trở thành vật liệu hấp phụ các kim loại nặng trong nước thải, với ưu điểm là nguồn vật liệu dễ kiếm, sinh khối dồi dào và giá rẻ Mặt khác, bã cà phê còn chứa đựng nhiều alkaloid, chủ yếu là cafein Các nghiên cứu cho thấy cafein có tác dụng trên một số loài sinh vật gây hại như ốc sên, ấu trùng muỗi và nhiều nhóm vi sinh vật (Marluci và Hermione, 2007) Việc tận dụng nguồn alkaloid được chiết xuất từ bã cà phê sẽ là một hướng ứng dụng mới trong lĩnh vực kiểm

soát các sinh vật gây hại khi vấn đề kháng kháng sinh, kháng thuốc trừ sâu đang ngày càng gia tăng và việc sử dụng ồ ạt đang tác động tiêu cực đến môi trường tự nhiên Hơn nữa, ở Việt Nam, hàng ngày, một lượng lớn bã cà phê từ các hộ gia đình, nhà hàng, quán cà phê,được thải ra môi trường nhưng có rất ít công trình nghiên cứu tận dụng nguồn sinh khối dồi dào này Chính vì lý do đó, đề tài “Xây dựng giải pháp tận dụng bã cà phê làm chất hấp thu kim loại nặng và thu nhận hoạt chất ức chế sinh vật gây hại” được thực hiện nhằm xây dựng quy trình chiết xuất alkaloid từ bã cà phê, sau đó sử dụng chất rắn làm vật liệu hấp thu kim loại nặng và thu nhận tổng alkaloid

để ức chế sinh vật gây hại

1.2 Yêu cầu của đề tài

Xây dựng quy trình phân tách bã cà phê để thu nhận thành phần có khả năng hấp thu kim loại nặng và ức chế sinh vật gây hại

Hấp thu kim loại nặng từ nguồn nước thải nhân tạo bằng chất rắn thu được sau quá trình tách chiết

Ức chế sinh vật gây hại bằng hợp chất alkaloid được chiết xuất từ bã cà phê

1.3 Nội dung thực hiện

Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết alkaloid từ bã cà phê bằng cách chiết trên hệ thống Soxhlet và với sự hỗ trợ của microwave, nhằm xây dựng

và tối ưu hóa quy trình phân tách

Thu nhận chất rắn và đánh giá hiệu quả hấp thu kim loại nặng thông qua việc khảo sát các yếu tố như tốc độ dòng chảy của dung dịch Cr (VI), tỉ lệ vật liệu/thể tích dung dịch và các giá trị pH, bằng phương pháp hấp phụ trên cột

Thử nghiệmcác nồng độalkaloid sau quá trình tách chiết để ức chế một loại nấm gây hại thực vật bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về bã cà phê

2.1.1 Thành phần của bã cà phê

Bã cà phê–chất thải rắn thu được từ bột cà phê đã qua sử dụng, là chất thải chủ

yếu của ngành công nghiệp cà phê Trung bình mỗi năm trên thế giới có khoảng sáu

triệu tấn bã cà phê được tạo ra (Tokimoto và ctv, 2005)

Bã cà phê có thể được xem như là vật liệu lignocellulose (Bảng 2.1), có khả năng

tách kim loại nặng hòa tan trong nước thải nhờ vào cấu trúc xốp, nhiều lỗ hổng có

đường kính nhỏ khoảng 30 µm (Hình 2.1) (Ivo và ctv, 2012)

Bảng 2.1Các thành phầncơ bản của bã cà phê

(Caetano, Silva và Mata, 2013)

Hình 2.1 Hình ảnh SEM của bã cà phê (bar = 100 µm) (Ivo và ctv, 2012)

g kháng vi sxit protocat,7–trimethy

và thức uốn

gh và Sahuhận của cây

n, cafein chủ

g thức hóa h.2 Cafein tivới điểm nó

6 đến 9 (Mu

n cafein tro) Ở giống cphê Arabicctv, 2008; C

Hình

(ht

òn bao gồmenic (42,2%

nic II (19,3biến sinh dđến bệnh usinh vật (khtechnic (Doylxanthine)

g mà chúng, 2006; Naj

y như lá, hạt

ủ yếu có ở chọc của cafeinh khiết khóng chảy 23umin và ctv

là một loại

g ta sử dụngafi và ctv, 2

t hay quả thcây cà phê, hfein là C8H1hông màu, d

g hợp chất

ng biến đổiRichelle và

và kháng vctv, 2002)

alkaloid ch

g trong cuộ2003) Tronhuộc 63 loàhạt coca, qu

0N4O2 và cdạng bột m

g hoa ở 178rke và Mac

ất khác nha

ea canephor

ó khoảng 05; Franca và

c của cafein

ki/Caffein)

cafein,các

%), axit isnày có thể

i di truyền ctv, 2001) virus) như a

8oC và giá tare, 1985)

ể bảo vệ tếxảy ra tron

và một sốaxit caffeic,

ìm thấy ở n

ng ngày (Mucafein được(Mumin và

á trà (Mumi

a học được tọng lượng ptrị pH dao đ

la và ctv, 2ảng2,2% ca

% cafein (Be)

háng nic I bào

ng tế axit , axit

nhiều umin

c tìm

à ctv,

in và trình phân động

2004; afein, elay,

2.1.2 Công dụng và tình hình nghiên cứu tận dụng bã cà phê trong và ngoài nước 2.1.2.1 Công dụng của cafein hiện diện trong bã cà phê

Bã cà phê còn chứa một lượng nhỏ các alkaloid, chủ yếu là cafein Tùy theo nồng

độ sử dụng,cafein sẽ gây ra một số tác động tiêu cực đến sinh lý và tâm lý của con người Khi tiêu thụ một lượng lớn cafein sẽ gây mỏi cơ, kích thích hệ thống thần kinh trung ương, tăng bài tiết axit gastric và lợi tiểu (Zhang và ctv, 2005; Minamisawa, 2004; Yukawa, 2004;Bolton và Null, 1981) Ngoài ra , khi nồng độ cafein trong cơ thể sống tăng cao có thể dẫn đến một số rối loạn như bệnh tim mạch, rối loạn chức năng thận, bệnh hen suyễn, thói quen ngủ, hiệu suất làm việc, sự tập trung (Najafi và ctv, 2003;Zhang và ctv, 2005; Bolton và Null, 1981; Singh và Sahu, 2006) Cafein có xu hướng hấp thụ nhanh, hoàn toàn từ đường ruột và được loại thải ra khỏi vòng tuần hoàn máu khi được chuyển hóa thành dẫn xuất của axit uric và diaminourcil (Abebe, 2011) Nghiên cứu ở Brazil cũng chỉ ra rằng cafein có ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát

triển của loài Aedes (Stegoymyia) aegypti L (Laranja và ctv, 2003)

Do đó việc tận dụng nguồn alkaloid trong bã cà phê làm chất kháng sinh vật gây hại sẽ là một giải pháp thay thế hiệu quả khi tình hình kháng kháng sinh ở sinh vật gia tăng và việc sử dụng với liều lượng cao đang tác động mạnh đến môi trường tự nhiên

2.1.2.2Tình hình nghiên cứu tận dụng bã cà phê trong và ngoài nước

Theo Silva và ctv (1998), bã cà phê được tái sử dụng làm nhiên liệu trong các lò hơi công nghiệp do nhiệt lượng tỏa ra cao vào khoảng 5000 kcal/kg, là nguồn nguyên liệu kháng oxy hóa (Yen và ctv, 2005), hoặc như một nguồn polysaccharide với hoạt tính kích thích miễn dịch (Simoes và ctv, 2009) Kondamudi và ctv (2008) đã chứng minh rằng bã

cà phê có thể được tái sử dụng để sản xuất diesel sinh học và nhiên liệu dạng bánh

Bã cà phê là nguồn nguyên liệu sẵn có, sinh khối dồi dào và giá rẻ Ngoài ra, trong thành phần cơ bản của bã cà phê chủ yếu chứa cellulose và hemicellulose (Solange và ctv, 2011) Do đó, bã cà phê được sử dụng để loại bỏ thuốc nhuộm ở dạng cation trong xử lý nước thải (Franca và ctv, 2009), làm chất hấp thụ kim loại nặng như

Cd, Cu, Pb, Zn, Cr và Ni (Azouao và ctv, 2010; Boonamnuayvitaya và ctv, 2004; Ozdes và ctv, 2009; Sari và ctv, 2007, 2008), formaldehyde (Boonamnuayvitaya và ctv, 2005), phenol (Namane và ctv, 2005)

Mặt khác, bã cà phê chế phin và bã cà phê công nghiệp chứa lần lượt 19,95% và 19,75% dầu Dầu từ bã cà phê có hàm lượng axit không bão hòa khá cao (60,2% và

54,07%); trong đó, hàm lượng axit béo không bão hòa đa lần lượt là 33,26% và42,5%

Bã cà phê được cho là cơ chất thích hợp để nuôi trồng nấm Linh Chi Khối lượng tươi quả thể nấm Linh Chi thu được trên cơ chất chứa 100% bã cà phê là31,7%, cao hơn nhiều so với nấm Linh Chi trồng trên môi trường đối chứng trong điều kiện thí nghiệm (Chu Thị Bích Phượng và ctv, 2012) Ngoài ra, nghiên cứu của Nguyễn Văn Đạt và ctv (2011) đã ly trích thành công dầu cà phê từ bã cà phê phế thải với hiệu suất 12,4%

và tổng hợp được dầu diesel sinh học từ dầu cà phê với hiệu suất 74,5% ở quy mô phòng thí nghiệm

2.2.1.2 Tính chất cơ bản của alkaloid

Các alkaloid không mùi, vị đắng Đa số alkaloid không màu, trừ một số ít có màu

Về thể chất: Nhóm alkaloid có oxy trong phân tử thường ở thể rắn Ngược lại, nhóm alkaloid không chứa nhóm oxy trong phân tử thường ở thể lỏng hay bay hơi được

Về độ tan: Alkaloid dạng kiềm tan trong dung môi hữu cơ kém phân cực, ít tan trong nước Ngược lại, alkaloid dạng muối tan trong nước, ít tan trong dung môi hữu

cơ.Riêng một số alkaloid có nitơ bậc bốn và N–oxit có tính tan ngoại lệ (alkaloid dạng

kiềm ít tan trong dung môi hữu cơ, alkaloid dạng muối không tan trong nước)

2.2.2 Các phương pháp chiếtalkaloid và ứng dụng

Dựa vào tính chất chung của alkaloid, có thể đưa ra hai phương pháp để chiết tách alkaloid ra khỏi nguyên liệu thực vật Bao gồm phương pháp chiết alkaloid dưới dạng kiềm bằng dung môi hữu cơ không phân cực và phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước axit hoặc cồn (methanol, ethanol) (http://luan-van.net.vn/luan-van/de-tai-chiet-tach-cac-hop-chat-alkaloid-trong-cay-binh-voi-21176/)

- Chiết alkaloid dạng kiềm

Nguyên tắc: Các alkaloid thường tồn tại trong cây dưới dạng muối, do đó, trước khi chiết vật liệu được tẩm với dung dịch kiềm để chuyển đổi các alkaloid ở dạng muối

trở thành dạng kiềm tự do, kế tiếp dùng dung môi hữu cơ như benzene, dietyl eter, chloroform, etyl acetat để chiết alkaloid dạng kiềm (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007) Cách thức tiến hành: Vật liệu trước khi chiết được tẩm với dung dịch kiềm Thường dùng amoni hydroxyt, cũng có thể dùng cacbonat kiềm nhưng chỉ thích hợp với những alkaloid có tính kiềm mạnh Vôi, natri hydroxyt chỉ dùng khi cần thiết để đẩy các alklaoid có tính kiềm mạnh, đặc biệt đối với những alkaloid tồn tại trong cây ở dạng kết hợp với tannin hoặc dùng để biến các alkaloid có nhóm chức phenol thành phenat tan trong nước, không tan trong các dung môi hữu cơ

Chiết vật liệu sau khi đã kiềm hóa như trên bằng dung môi hữu cơ không phân cực thích hợp, dung môi này hòa tan các alkaloid dạng kiềm vừa được giải phóng Ở phòng thí nghiệm thường sử dụng benzen và chloroform Trong sản xuất công nghiệp thường dùng dung môi rẻ tiền, ít độc và khó cháy Có thể chiết nguội trong bình ngấm kiệt hoặc chiết nóng trong thiết bị Soxhlet. 

Dịch chiết được cô đặc và lắc với dung dịch axit loãng (2% – 5%) (thường dùng HCl hay H2SO4) Các alkaloid được chuyển sang dạng muối tan trong nước, còn mỡ, sắc tố, sterol, ở lại trong dung môi hữu cơ Trong phòng thí nghiệm người ta lắc trong bình gạn, trong công nghiệp cần phải có thiết bị phù hợp

Gộp các dịch chiết muối alkaloid lại rồi kiềm hóa để chuyển alkaloid sang dạng kiềm, lắc với dung môi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alkaloid dạng kiềm Việc chiết bằng dung môi hữu cơ có thể dùng bình gạn hoặc các dụng cụ chiết chất lỏng giống như bình ngấm kiệt

Sau khi lấy riêng lớp dung môi hữu cơ chứa alkaloid kiềm, loại nước bằng muối trung tính khan nước (Na2SO4 khan) rồi cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi

sẽ thu cặn alkaloid thô (Vũ Thị Phương Thảo, 2010)

Ưu điểm: Hiệu suất chiết các hoạt chất từ dược liệu cao do dịch chiết rút ra sạch,

dễ tinh chế và loại các tạp chất kèm theo Các dung môi hữu cơ không phân cực thường là các dung môi có khả năng chiết chọn lọc đối với các alkaloid ở dạng kiềm Nhược điểm: Dung môi hữu cơ thường là các dung môi đắt tiền Khi sử dụng các dung môi này để chiết đòi hỏi thiết bị phức tạp

Ứng dụng: Hiện nay hầu hết các alkaloid được sản xuất trong nước cũng như trên thế giới đều sử dụng phương pháp này Mặt khác,khi sử dụng phương pháp này để chiết các dược liệu có nhiều chất nhầy và độ trương nở cao, có thể tránh được sự

trương nở quá mức của dược liệu và sự hòa tan chất nhầy vào dung môi, gây khó khăn cho quá trình rút dịch chiết và tinh chế

- Chiết alkaloid dưới dạng muối

Nguyên tắc: Trước hết dùng axit thích hợp để chuyển hoàn toàn các alkaloid dạng kiềm sang dạng muối, sau đó dùng dung môi thích hợp để chiết muối alkaloid ra khỏi dược liệu (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Ưu điểm: Dung môi sử dụng rẻ tiền, dễ kiếm Thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư ít Nhược điểm: Dịch chiết lẫn nhiều tạp chất, khó tinh chế và hiệu suất chiết thấp.Đối với các vật liệu chứa nhiều chất nhầy, việc sử dụng nước làm dung môi sẽ gặp khó khăn trong khâu rút chiết

2.2.3 Phương pháp định tính alkaloid trong dịch chiết

Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng tạo màu hoặc tạo tủa với alkaloid Trong đó

có ba loại thuốc thử thông dụng là thuốc thử Mayer, Dragendoff, Wagner Ngoài ra còn một số thuốc thử khác để phát hiện các alkaloid đặc thù (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

2.2.3.1 Phản ứng tạo tủa

Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất và hòa tan 5 g KI trong 10ml nước cất Hỗn hợp hai dung dịch và định mức đến 100 ml Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch axit loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất

Hình 2.4Sơ đồ quy trình tách chiết alkaloid bằng dung dịch nước axit

(Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ và Huỳnh Vĩnh Khang, 2000)

Nguyên liệu thực vật

Qua cột cationit Rửa cột bằng NH4OH/cồn

Thu hồi cồn

Kiềm hóa (pH = 9 – 12) Lắc với dung môi hữu cơ Thu hồi dung môi

Axit hóa, chiết bằng nước và cồn

Alkaloid kiềm

Tinh chế Dịch muối alalkaloidDịch chiết Thu hồi còn 1/3 thể tích, lắng lọc

hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt, nhưng tủa tạo thành sẽ có thể hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi acetol, etanol có sẵn trong dung dịch thử

Thuốc thử Wagner: Hòa tan 1,27 g I2 và 2 g KI trong 20 ml nước cất và định mức đến 100 ml Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch axit loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu

Thuốc thử Dragendorff: Hòa tan 8 g Bi(NO3)3.H2O trong 25 ml HNO3 30% và hòa tan 28 g KI, 1 ml HCl 6 N trong 5 ml nước cất Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ

100 ml nước cất sẽ thu được dung dịch có màu đỏ cam, dùng để thử nghiệm trong ống nghiệm hay để pha thuốc phun xịt bản mỏng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Định tính alkaloid: Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch axit loãng

có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu; hoặc phunxịt lên tấm bản mỏng, nếu có alkaloid sẽ cho vết màu cam – đỏ(Vũ Thị Phương Thảo, 2010)

2.2.3.2 Phản ứng tạo màu

Có một số thuốc thử khi tác dụng với alkaloid sẽ tạo ra những màu đặc biệt khác nhau, do đó người ta cũng dùng phản ứng tạo màu để xác định alkaloid Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết có alkaloid gì trong dịch chiết Thuốc thử tạo màu thường là những hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ hòa tan trong axit H2SO4 đậm đặc Những thuốc thử tạo màu quan trọng là: thuốc thử Frohde (axit sulfomolybdic), thuốc thử Marquis (sulfofocmol), thuốc thử Mandelin (axit sulfovanadic).Trong dịch chiết có nhiều alkaloid và còn lẫn tạp chất khác thì phản ứng lên màu không thật rõ bằng những alkaloid đã được chiết và phân lập ở dạng tinh khiết Do đó để kết luận được chắc chắn người ta thường dùng phản ứng màu kết hợp với phương pháp sắc kí lớp mỏng có alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh (Phạm Thanh Kỳ và ctv, 2002)

2.2.4 Các phương pháp định lượng alkaloid sau khi chiết xuất

Có nhiều phương pháp định lượng alkaloid như kỹ thuậtcân, đo axit, so màu, trung hòa, quang phổ tử ngoại.Các kỹ thuật này gồm hai giai đoạn chính: Lấy riêng alkaloid ra khỏi dược liệu và định lượng (tùy theo tính chất của alkaloid mà lựa chọn phương pháp cho thích hợp) (Phạm Thanh Kỳ và ctv, 2002)

2.2.4.1 Phương pháp cân

Để định lượng alkaloid bằng phương pháp cân, cần phải chiết được alkaloid tinh khiết không lẫn tạp Phạm vi sử dụng phương pháp cân là những alkaloid có tính kiềm

yếu Ngoài ra, phương pháp cân còn được dùng trong trường hợp những alkaloid chưa xác định rõ cấu trúc hóa học hoặc hỗn hợp nhiều alkaloid có phân tử lượng rất khác nhau Khi định lượng, người ta phải chiết alkaloid tinh khiết bằng một dung môi hữu

cơ, sấy tới khối lượng không đổi rồi đem cân

Định lượng bằng phương pháp cân trực tiếp khó chính xác nên phương pháp này không được sử dụng khi hàm lượng alkaloid trong dược liệu rất thấp (Phạm Thanh Kỳ

và ctv, 2002)

2.2.4.2 Phương pháp trung hòa

Định lượng bằng phương pháp cân thường cho sai số vì các tạp chất bị lôi cuốn theo, lẫn với cặn alkaloid Do đó định lượng alkaloid bằng phương pháp trung hòa được sử dụng nhiều hơn

Muốn định lượng bằng phương pháp này thì alkaloid phải chiết ở dạng kiềm Dung dịch alkaloid kiềm phải trong vì nếu vẫn đục hay lẫn phần nhỏ nhũ dịch sẽ gây

ra hiện tượng hấp phụ các chất kiềm làm cho kết quả định lượng có sai số Ngoài ra, nếu có lẫn các chất kiềm như amoniac, các amin cũng như chất màu và chất béo cũng ảnh hưởng tới kết quả định lượng

Sau khi đã có dịch chiết alkaloid kiềm tinh khiết có thể tiến hành định lượng bằng cách: lắc alkaloid trong dung môi hữu cơ có lượng axit chuẩn độ dư, sau đó định lượng alkaloid bằng kiềm tương ứng, hoặc làm bốc hơi dung môi hữu cơ, sau đó cặn alkaloid còn lại được định lượng trực tiếp hay gián tiếp bằng axit chuẩn độ (thường dùng HCl hay H2SO4 có nồng độ 0,01 – 0,1 N).Các chỉ thị màu dùng trong định lượng phần lớn là methyl đỏ và phần lớn màu thay đổi là do thay đổi pH (Phạm Thanh Kỳ và ctv, 2002)

2.2.4.3 Định lượng alkaloid trong môi trường khan

Đối với alkaloid có tính kiềm yếu khi chuẩn độ trong môi trường dung dịch nước

sẽ cho kết quả không chính xác vì muối tạo ra khi trung hòa sẽ thủy phân mạnh nên khó quan sát vùng chuyển màu của chỉ thị Do vậy nếu hòa tan alkaloid vào trong dung môi không phải là nước (gọi là môi trường khan) thì có thể định lượng được những alkaloid có tính kiềm yếu này Thường dùng axit percloric 0,1 N và chỉ thị màu là gentian tímđể định lượng alkaloid (Phạm Thanh Kỳ và ctv, 2002)

2.2.4.4 Phương pháp so màu

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng tạo màu của alkaloid, dùng dung dịch có màu để định lượng Những alkaloid không thể tạo thành dung dịch có màu để định lượng trực

tiếp thì cho tác dụng với thuốc thử tạo tủa có màu, sau đó tách riêng tủa và hòa tan trong dung môi thích hợp sẽ được dung dịch có màu dùng để định lượng alkaloid.Phương pháp so màu chỉ cần một lượng nhỏ alkaloid, có độ nhạy và kết quả nhanh do đó phương pháp hay dùng để định lượng alkaloid (Phạm Thanh Kỳ và ctv, 2002)

2.2.4.5 Phương pháp định lượng alkaloid hiện đại

Hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và hệ thống điện di mao quản (CE) là hai phương pháp hiện đại được sử dụng để định lượng alkaloid

Hệ thống sắc ký lỏng cao áp là kỹ thuật phân tích được sử dụng khá phổ biến trong các lĩnh vực nghiên cứu, kiểm nghiệm vàtách các chế phẩm đa thành phần Kỹ

thuật cho kết quả nhanh, tốt cả về mặt định tính lẫn định lượng

Ngược lại, hệ thống điện di mao quản cần lượng mẫu ít 5–30 µl, với thể tích bơm mẫu 10–50 nl, ngưỡng phát hiện thấp Thời gian phân tích mẫu ít từ vài phút đến 30 phút Xác định được danh tính và nồng độ các phân tử trong hỗn hợp dựa vào chất chuẩn(Phạm Thanh Kỳ và ctv, 2002)

2.2.5 Tình hình nghiên cứutrong và ngoài nước về ảnh hưởng của alkaloid đến sinh vật

Theo Garba và Okeniyi (2012), nghiên cứu về hoạt tính của tổng alkaloidđược

chiết xuất từnăm loài thực vật Jatropha curcas, Calotropis procera, Magifera indica,

Carica papaya và Psidium guajava, cho thấy khả năng kháng vi sinh vật của cao chiết

trên baloài vi khuẩn và hai loài nấm Staphylococcus aureus, Streptococci,

Lacto-bacillus spp., Actinomycetes và Candida albicans bằng phương pháp khuếch tán trên

thạch.Thí nghiệm được tiến hành với ba nồng độ tổng alkaloid 2×102,4×102và 6×102µg/cm3 Hoạt tính kháng vi sinh vật tối ưu nhất được tìm thấy ở nồng độ 6×102 µg/cm3 Kết quả cho thấy alkaloid được chiết xuất từ thực vật là một nguồn nguyên liệu tiềm năng trong việc ức chế các sinh vật gây hại

Thêm vào đó, alkaloid quinolizidine được chiết xuất từ loài Lupinus arboreus có

ảnh hưởng phổ rộng lên các tác nhân gây bệnh, côn trùng và động vật ăn cỏ (Mankinen và ctv, 1975; Wink, 1992; Wink và Latz, 1995)

Ngoài ra, các hợp chất Conessin được chiết xuất từ cây Mức hoa trắng cũng có một số tác dụng dược lý nhất định như diệt lị amip Thí nghiệm cho thấy nồng độ có

hiệu quả đối với Entamoeba histolytica của Conessin là 1:71000 – 45000, còn của

emetin là 1:300000 đến 1:2000000 Kết quả cho thấy tác dụng diệt amip của Conessin

kém hơn emetin (Hoàng Thị Tuyết Nhung, 2012) Conessin còn có tác dụng diệt

Trichomonas vaginalis và Trichomonas intestinalis (Viện Dược liệu, 2004) Ngoài ra

Conessin còn có tác dụng đối kháng với thụ thể H3 histamin (Zhao và ctv, 2008) Ở liều cao, tác dụng của Conessin gần giống như morphin, gây liệt trung tâm hô hấp Nếu tiêm, Conessin gây tê tại chỗ nhưng lại kèm theo hoại tử nên không dùng để gây

tê (Đỗ Tất Lợi, 2001)

Hợp chất Nuciferin được chiết từ lá Sen có tác dụng giải thắt co cơ trơn, ức chế thần kinh trung ương, chống viêm, giảm đau, chống ho, kháng serotonin và có hoạt tính phong bế thụ thể adrenergic (Đỗ Trung Đàm và Đỗ Thị Phương, 2006; Đỗ Tất Lợi, 2001; Nguyễn Thị Nhung, 2001;Viện Dược liệu, 2004;Choi và ctv, 2011).Nuciferin có tác dụng tăng cường quá trình ức chế các tế bào thần kinh vùng vỏ não cảm giác – vận động và thể dưới thân não trên thỏ thí nghiệm, có tác dụng an thần và kéo dài giấc ngủ của pentobarbital trên chuột thí nghiệm (Choi và ctv, 2011)

2.3 Tổng quan về Crom

2.3.1 Giới thiệu về Crom

Crom là kim loại màu trắng, nặng, sáng chói, bóng nhưng lại giòn và dễ bể Ở nhiệt độ phòng crom bền với nước và không khí, do tạo một lớp oxit rất mỏng che ở bề mặt Tính chất này giải thích cho việc sử dụng crom để xi mạ, tạo lớp che phủ trên bề mặt, đối kháng lại với tác nhân ăn mòn thông thường

Trong nước tự nhiên, Cr3+ tồn tại ở dạng Cr(OH)2+, Cr(OH)2 +, Cr(OH)4- Còn Cr6+tồn tại ở dạng CrO42- và Cr2O72-.Cr3+ tạo phức bền với các amin và bám vào các khoáng sét Crom thường tồn tại chủ yếu ở dạng Cr3+, Cr6+.Crom không cần thiết cho cây trồng nhưng lại là nguyên tố cần thiết cho động vật ở một giới hạn nhất định Nếu vượt quá giới hạn đó thì crom lại gây độc đối với động vật

2.3.2 Tính chất hóa học của Crom

Crom là chất khử giống như Al trên bề mặt được bao phủ bởi màng oxit mỏng, bền với không khí.Crom không phản ứng trực tiếp với H2 Ở điều kiện thường không phản ứng với O2, nhưng khi đốt cháy trong không khí tạo thành Cr2O3

4Cr (rắn) +3O2 = 2Cr2O3DeltaH = –1141KJ/Mol

Crom khử H+ trong các dung dịch HCl, H2SO4 loãng:Cr + 2H+ = Cr2+ + H2 Crom thụ động trong axit HNO3và H2SO4 đặc nguội, không tác dụng với nước và

H2do có lớp oxit bảo vệ.Crom tan trong dung dịch kiềm và tác dụng với muối của những kim loại có thế tiêu chuẩn cao hơn tạo thành muối Cr(II)

2.3.3 Ảnh hưởng của Crom đối với sinh vật

Các nghiên cứu cho thấy con người hấp thụ Cr6+ nhiều hơn Cr3+ nhưng độc tính của Cr6+ lại cao hơn Cr3+ gấp khoảng 100 lần (http://congnghehoahoc.word-press.com/2012/03/04/crom/)

2.3.3.1 Ảnh hưởng của crom đối với động và thực vật

Ảnh hưởng của hợp chất crom lên sự sống của cá chép được khảo sát bằng cách ngâm trứng cá sau khi đã thụ tinh vào nước có chứa Cr (VI) Khi nồng độ crom từ3,9 – 9,6 mmol/l và ở pH = 8, crom không ảnh hưởng đến tỷ lệ trứng nở nhưng khi nồng độ crom đạt đến 9,6 mmol/l và ở pH = 6,3 tỉ lệ cá mắc bệnh khác nhau về da và tử vong tăng Nếu ngâm trứng vào dung dịch Cr (VI) có nồng độ 3,9 mmol/l và ở pH= 6,3 thì tỉ

lệ cá mắc bệnh tuỷ sống tăng lên, mang và vây khô hơn, khả năng chịu lạnh kém hơn Ngoài ra, crom còn gây ảnh hưởng đến quá trình phát triển của thực vật như gây bệnh vàng lá ở lúa

2.3.3.2 Ảnh hưởng của crom đối với con người

Nồng độ crom trong nước thải sinh hoạt có thể lên tới 0,7 µg/ml, chủ yếu ở dạngCr (VI) có độc tính với nhiều loại động vật có vú Dù chỉ một lượng nhỏ Cr (VI) cũng có thể gây độc đối với con người Nếu crom có nồng độ lớn hơn giá trị 0,1 mg/l

sẽ gây rối loạn sức khỏe như nôn mửa Khi thâm nhập vào cơ thể, crom sẽ liên kết với các nhóm sulfhydryl (–SH) trong enzym và làm mất hoạt tính của enzym, gây ra nhiều bệnh đối với con người

Crom và các hợp chất chủ yếu gây các bệnh ngoài da Khi Cr (VI) xâm nhập vào

cơ thể qua da, nó kết hợp với protein tạo thành phản ứng kháng nguyên và gây bệnh ở người Khi crom xâm nhập theo đường hô hấp dễ dẫn tới bệnh viêm yết hầu, viêm phế quản, viêm thanh quản do niêm mạc bị kích thích (sinh ngứa mũi, hắt hơi, chảy nước mũi) Nhiễm độc crom có thể bị ung thư phổi, ung thư gan, loét da, viêm da tiếp xúc Những công việc có thể gây nhiễm độc crom: Chế tạo ắc quy, luyện kim, sản xuất nến, sáp, thuốc nhuộm, chất tẩy rửa, mạ điện, mạ crom Đặc biệt ngành mạ crom thường được tiến hành ở nhiệt độ khoảng trên 40oC và hơi dung dịch axit cromic có nồng độ cao (thường lớn hơn 200 g/l) sẽ tác động đến hệ thống hô hấp của công nhân Hàm lượng crom có trong nước ngọt khoảng 0,1–6µg/mlvà trong nước biển là 0,2 – 50

µg/l Trong các loại thức ăn, hàm lượng crom dao động từ 20 – 600 mg/kg Trong nước crom chỉ tồn tại ở hai dạng Cr3+, Cr6+ nhưng dạng Cr3+ thường gặp hơn

2.3.4 Tình hình nghiên cứu xử lý Crom trong và ngoài nước

Theo Nguyễn Trung Dũng và Nguyễn Công Hào(2012), khả năng hấp phụ Cr6+ và màu trong nước thải dệt nhuộm của bã cà phê được hoạt hóa bởi H2SO4 0,1 N và NaOH 0,1 N cho thấy hiệu suất loạiCr6+> 40% và màu trong nước thải > 50% ở điều kiện pH =

3, thời gian hấp phụ là60 phút, liều lượng hấp phụ là 1,5 g/l

Theo Xu Han và ctv (2006), loài tảo Chlorella miniata được nuôi trồng nhân tạo trong

môi trường Bristol, có khả năng loại bỏ Cr (VI) ở nồng độ 100 mg/l với hiệu suất đạt 65% tại pH = 2, sinh khối 5 g/l trong 2 giờ đầu và loại bỏ hoàn toàn Cr (VI) sau 150 giờ

Theo Djati và  Hunter (2006), bã cà phê được sử dụng làm vật liệu hấp phụ các kim loại năng như Cu2+, Zn2+, Cd2+, Pb2+ Kết quả cho thấy sự hấp phụ hiệu quả trong khoảng pH rộng khi vật liệu được hoạt hóa bởi NaOH 0,01 M và HNO3 0,01 M

Theo Agarwal và ctv (2006), hạt me(Tamarindus indica) có khả năng loại bỏ Cr

(VI) trong nước thải cao hơncác phụ phẩm nông nghiệp khác như mụn dừa, vỏ hạnh nhân, vỏ đậu phộng và vỏ quả óc chó.Nghiên cứu cho thấy hạt me có thể làm giảm nồng độ Cr (VI) xuống mức không thể phát hiện được Ngoài ra, khả năng loại bỏ Cr (VI) của hạt me giảm khi tăng pH, tăng nhiệt độ và giảm nhẹ khi tăng nồng độ

Theo Parinda và ctv (2006), xơ dừa chứa hàm lượng lignin,cellulose cao tương ứng 45,84% và43,44% Nghiên cứu cho thấy xơ dừa có khả năng hấp thuCr (VI) trong nước thải mạ điện với hiệu suất đạt 99,9% tại pH = 2, sau 18 giờ Khả năng loại bỏCr(VI) cao tại pH thấp là do sự khử Cr (VI) thành Cr (III), sự tương tác tĩnh điện giữa chất hấp phụ tích điện dương và bichromate (HCrO4-) tích điện âm

Theo George (2012), bã cà phê có khả năng hấp phụCr (VI) tối đa là 45 mg/g ở điều kiện pH = 5, tốc độ lắc 140 vòng/phút, khi vật liệu được xử lý với dung dịch formaldehyde 2% với kích thước hạt là 475 – 525 µm

Tóm lại, các phế thải nông nghiệp nói chung và bã cà phê nói riêng, trước khi sử dụng làm chất hấp phụ kim loại nặng trong nước thải thì các vật liệu này phải được xử

lý hóa học, do đó quá trình xử lý nước bị ô nhiễm không đem lại hiệu quả kinh tế Vì vậy, đề tài tiến hành nghiên cứu sử dụng bã cà phê sau khi tách chiết alkaloid để làm chất hấp phụ kim loại nặng – Cr (VI), điều này vừa thu nhận hợp chất alkaloid trong

bã cà phê vừa tạo điều kiện hấp phụ tốt kim loại nặng do trong quá trình tách chiết đã

loại bớt một số hợp chất liên kết với cellulose trong thành tế bào, làm cho vật liệu có ái lực cao với ion kim loại trong dung dịch.

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiệntrong khoảng thời gian từ tháng 12/2012 đến tháng 6/2013 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông LâmTp Hồ Chí Minh

3.2Vật liệu

Bã cà phê, chất thải rắn thu được từ bã đã qua sử dụng của nhãn hiệu cà phê Trung Nguyên Sau đó mẫu được phơi khô và bảo quản ở nhiệt độ phòng tại Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trường

Hóa chất dùng trong nghiên cứu xuất xứ từ Trung Quốc bao gồm amoniac,axit clohydric, axeton, diphenylcarbazide, sodium sulfate, axit nitric, kalidicromat, thủy ngân clorua, kali iot, nitrat bismuth và chloroform. 

Thiết bị cần thiết cho quá trình nghiên cứu gồm hệ thống Soxhlet (Ấn Độ), máy

cô quay BUCHI–114 (Thụy Sĩ), máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến (Bio–Rad), microwave (Sanyo). 

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Xác định điều kiện tối ưu cho quá trình tách chiết alkaloid từ bã cà phê 3.3.1.1 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và tỉ lệ nguyênliệu/chloroform

Mục tiêu: Xác định nhiệt độ và tỉ lệ nguyên liệu/chloroform tối ưu cho quá trình tách chiết alkaloid trên bã cà phê

Cách thức tiến hành: Tẩm 10 g bã cà phê bằng 15 ml NH4OH 25% trong1 – 2 giờ, phơi khô Sau đó chiết kiệt bằng máy chiết Soxhlet Tiếp theo, cô cạn còn 1/3 thể tích và lắc nhiều lần với axit clohydric 2%, mỗi lần 30 ml cho đến khi thử với thuốc thử Dragendoff và Mayer không cho phản ứng alkaloid nữa Gộp các dịch chiết và kiềm hóa đến pH = 10 bằng dung dịch NH4OH 25% rồi chiết kiệt bằng chloroform Cuối cùng làm khan dịch chloroform bằng Na2SO4 khan, lọc và cô áp suất thu được cặn alkaloid

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên hai yếu

tố, trong đó nhiệt độ được điều chỉnh là 20, 40, 60oC và tỉ lệ nguyên liệu/chloroform là

1:15, 1:20, 1:25 Thí nghiệm lặp lại 3 lần với 9 nghiệm thức

Bảng 3.1Các thông sốnhiệt độ và tỉ lệ nguyên liệu/chloroform ở các công thức thí nghiệm

Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng tổng alkaloid và khối lượng chất rắn

- Xác định khối lượng tổng alkaloid bằng cách cân khối lượng bình trước và sau

khi cô quay đuổi dung môi và sấy trong 15 phút Sau đó ghi nhận kết quả Tiếp theo

tính hiệu suất chiết xuất alkaloid bằng công thức sau:

Trong đó:

H : Hàm lượng alkaloid toàn phần trong 100g mẫu (g)

P : Khối lượng cặn alkaloid (g)

m : Khối lượng mẫu đem định lượng (g)

A : Độ ẩm của mẫu (%)

- Độ ẩm của mẫu được được xác định như sau: Tiến hành sấy đĩa petri đựng mẫu

đến khối lượng không đổi ở 70oC và cân đĩa Sau đó cân chính xác 1 g bã cà phê trên

đĩa, đem sấy ở 70oC khoảng 2 giờ Tiếp theo lấy ra để nguội trong bình hút ẩm khoảng

15 phút, sau đó cân và ghi kết quả.Tiếp tục sấy và cân cho đến khi kết quả ở hai lần

cân liên tiếp không đổi hoặc chênh lệch nhau không quá 5 mg.Thực hiện trên 3 mẫu và

lấy giá trị trung bình.Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức:

Trong đó:

A: độ ẩm của bã cà phê (%) a: khối lượng đĩa petrisau khi sấy (g) b: khối lượng đĩa petri và mẫu trước khi sấy (g) c: khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi sấy (g)

- Xác định khối lượng chất rắn sau khi chiết xuất bằng cách để khô chất rắn sau

khi chiết trong 1–2 ngày, sau đó cân khối lượngvà ghi nhận kết quả

Tỉ lệ nguyên liệu/chloroform (g/ml) Nhiệt độ (

3.3.1.2 Xác định ảnh hưởng của chế độ xử lý Microwave (cường độ và thời gian)

Mục tiêu: Xác định cường độ và thời gian xử lý microwave tối ưu trong quá trình tách chiết alkaloid từ bã cà phê

Sử dụng kết quảtỉ lệ nguyện liệu/chloroform tối ưu của mục 3.3.1.1 để tiếp tục tiến hành thí nghiệm

Cách tiến hành:Tẩm 10 g bã cà phê bằng 15 ml NH4OH 25% trong1 – 2 giờ, phơi khô Chiết kiệt bằng Microwave Sau đó cô cạn còn 1/3 thể tích và lắc nhiều lần với axit clohydric 2%, mỗi lần 30 ml cho đến khi thử với thuốc thử Dragendoff và Mayer không cho phản ứng alkaloid nữa.Các dịch axit này được gom lại, kiềm hóa đến pH = 10 bằng dung dịch NH4OH 25% rồi chiết kiệt bằng chloroform Cuối cùng làm khan dịch chloroform bằng Na2SO4 khan, lọc và cô áp suất thu được cặn alkaloid

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên hai yếutố, trong đó cường độ được điều chỉnh là 0, 2, 4, 6, 8, 10 và thời gian là 1, 3, 5 phút Thí nghiệm lặplại 3 lần với 18 nghiệm thức

Bảng 3.2 Các chế độ xử lý Microwave đối với các công thức thí nghiệm khác nhau

Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng alkaloid tổng và khối lượng chất rắn

3.3.2 Đánh giá hiệu quả hấp phụCr (VI) của bã cà phê sau khi tách chiết alkaloid 3.3.2.1 Xác định ảnh hưởng của tốc độ dòng chảy đến hiệu quả hấp thuCr (VI)

Mục tiêu: Xác định tốc độ dòng chảy tối ưu ảnh hưởng đến hiệu quả hấp thuCr (VI) trong dung dịch của bã cà phê sau khi tách chiết alkaloid

Cách thức tiến hành: Nhồi cột bằng cách lót dưới đáy một ít bông thấm nước, giấy lọc, rồi thêm2g bã cà phê sau khi tách chiết và 100 ml dung dịch Cr (VI) nồng độ50 ppm Sau đó điều chỉnh tốc độ dòng chảy cần khảo sát Tiếp theo hút 50ml dung dịch mẫu sau khi chảy qua cột cho vào bình định mức100ml, thêm 40ml nước cất, 2

ml axit HNO3 65% và 2 ml thuốc thử diphenylcarbazide.Đo độ hấp thu sau 5–15 phút

ở bước sóng 540nm và tính hiệu suất hấp thu Cr (VI) (Hình 3.1)

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một

yếu tố với tốc độ dòng chảy được điều chỉnh là 2, 4, 6, 8 ml/ phút Thí nghiệm gồm 4

nghiệm thức và lặp lại 3 lần

Bảng 3.3 Thông số tốc độ dòng chảy của dung dịch Cr (VI) ở các công thức thí nghiệm

Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất hấp thu Cr (VI)

- Hiệu suất hấp thu Cr (VI) của bã cà phê được tính dựa trên nồng độ Cr (VI) sau

khi hấp phụ theo công thức:

Trong đó:

H : Hiệu suất hấp thu kim loại nặng (%)

C0: Nồng độ dung dịch Cr (VI) ban đầu (mg/l)

Ce: Nồng độ dung dịch Cr (VI) lúc sau (mg/l)

Đo OD540 nm

Hiệu suất hấp thu Cr (VI) 

2 g Vật liệu

100 ml Cr (VI)

- Nồng độ dung dịch Cr (VI) sau khi hấp phụ được tính theo công thức:

a : độ nhạy (độ dốc của đường chuẩn)

- Độ nhạy được xác định dựa theo đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa

mật độ quang và nồng độ Cr (VI) có phương trình y = ax + b

3.3.2.2 Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ vật liệu/thể tích đến hiệu quả hấp thuCr (VI)

Mục tiêu: Xác định tỉ lệ vật liệu/thể tích dung dịch Cr (VI) tối ưu ảnh hưởng đến hiệu quả hấp thu kim loại nặng của bã cà phê sau khi tách chiết alkaloid

Sử dụng kết quảcủa mục 3.3.2.1 để tiếp tục tiến hành thí nghiệm

Cách tiến hành: Nhồi cột bằng cách lót dưới đáy cột một ít bông thấm nước, giấy lọc, rồi thêm2g bã cà phê sau khi tách chiết Sau đó, hút 50ml dung dịch mẫu sau khi chảy qua cột cho vào bình định mức100ml, thêm 40ml nước cất, 2 ml axit HNO365%

và 2 ml thuốc thử diphenylcarbazide Cuối cùng đo độ hấp thu sau 5–15 phút ở bước sóng 540nm và ghi nhận kết quả

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với tỉ lệ vật liệu/thể tích Cr (VI) được điều chỉnh là 1:75; 1:100; 1:125; 1:150 g/ml Thí nghiêm lặp lại 3 lần, gồm 4 nghiệm thức

Bảng 3.4 Tỉ lệ vật liệu/thể tích dung dịch Cr (VI) ở các công thức thí nghiệm khác nhau

Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất hấp thu Cr (VI)

3.3.2.3 Xác định ảnh hưởng pH đến hiệu quả hấp thu Cr (VI)

Mục tiêu: Xác định pH tối ưu ảnh hưởng đến hiệu quả hấp thuCr (VI) của bã cà phê sau khi tách chiết alkaloid

Kết quả củamục 3.3.2.1 và 3.3.2.2được sử dụng để tiếp tục tiến hành thí nghiệm

Cách tiến hành:Dung dịch Cr (VI) trước khi qua cột hấp thu được điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 0,1M hoặc HCl 0,1M Hút 50ml dung dịch mẫu sau khi chảy qua cột cho vào bình định mức100ml, thêm 40ml nước cất, 2 ml axit HNO3 65% và 2

ml thuốc thử diphenylcarbazide Tiếp theo đo độ hấp thu sau5–15 phút ở bước sóng 540nm và ghi nhận kết quả

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với pH = 2, 4, 6, 8 Thí nghiệm lặp lại 3 lần với số nghiệm thức là 4

Bảng 3.5Giá trị pH của dung dịch Cr (VI) ở các công thức thí nghiệm khác nhau

Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất hấp thu Cr (VI)

3.3.3 Đánh giá tác động của các nồng độ alkaloid đến nấm P chrysosporium

Mục tiêu: Xác địnhnồng độalkaloid tối ưu nhằm ức chế nấm Phanerochaete

chrysosporium gây hại gỗ

Cách tiến hành:Nuôi cấy tăng sinh nấm Phanerochaete chrysosporiumtrên môi

trường PGA trong đĩa petri khoảng 48 giờ Sau đó thêm 10 ml nước cất vô trùng vào đĩa petri Dùng que cấy trang cà nhẹ lên bề mặt thạch để lấy hết bào tử, tạo dịch huyền phù Tiếp theo, hút 100 µl dịch huyền phù (chứa khoảng 106 bào tử nấm/ml) cho vào đĩa petri

có chứa sẵn môi trường PGA và trang đều trên mặt thạch Đục lỗ thạch với đường kính khoảng 1 cm và cho vào 50 µl dung dịch alkaloid tổng.Đối với đĩa đối chứng thì hút 50

µl chloroform Cuối cùng ủ, quan sát và ghi nhận kết quả sau 48 giờ

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với các nồng độ 400, 600, 800, 1000 ppmvà lặp lại 3 lần Số nghiệm thức là 4

Bảng 3.6Các nồng độ alkaloid ở các công thức thí nghiệm khác nhau

Nồng độ tổng alkaloid (ppm) Đối chứng 400 600 800 1000

Chỉ tiêu theo dõi: Vòng ức chế sự tăng trưởng của nấm P chrysosporium được đánh

giá bằng cách sử dụng thước đo milimét đo đường kính vùng ức chế và ghi nhận kết quả theo công thức: Vùng ức chế = đường kính vòng ngoài vùng ứcchế - đường kính lỗ thạch

3.4 Xử lý số liệu

Số liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC và tính giá trị trung bình bằng phần mềm Excel

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1Ảnh hưởng của nhiệt độ và tỉ lệ bã cà phê/chloroform đến khối lượng alkaloid

và chất rắn sau khi tách chiết

Qua quá trình nghiên cứu tách chiết alkaloid bằng hệ thống Soxhlet với tỉ lệ

nguyên liệu/chloroformvà nhiệt độ được khảo sát, đề tài đã thu được kết quả như sau:

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và tỉ lệ bã cà phê/chloroform đến khối lượng alkaloid

Các giá trị trung bình của các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa về thống kê ở mức

P >0,05.Các số liệu được biểu thị dưới dạng số trung bình ± SD (Standard deviation)

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và tỉ lệ bã cà phê/chloroform đến khối lượng chất rắn

Các giá trị trung bình của các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa về thống kê ở mức

P >0,05.Các số liệu được biểu thị dưới dạng số trung bình ± SD (Standard deviation)

Qua quá trình nghiên cứu tách chiết alkaloid bằng hệ thống Soxhlet với tỉ lệ bã cà

phê/chloroform và nhiệt độ được khảo sát, đề tài có thể nhận thấy trong cùng một nhiệt

độ, nhưng tỉ lệ thay đổi thì có sự biến thiên về khối lượng alkaloid Các kết quả được

trình bày tại bảng 4.1 có thể cho thấy ở nhiệt độ 20oC và 40oC, khối lượng alkaloid

tăng dầnkhi giảm tỉ lệ bã cà phê/chloroform; ngược lại, ở nhiệt độ 60oC, khối lượng

này có sự suy giảm (từ 0,47 g xuống 0,41 g) Điều này xảy ra có thể do trong quá trình

Khối lượng alkaloid (g)