XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CAO VÀ CHẾ PHẨM TỪ HỖN HỢP CÁC DƯỢC LIỆU ĐỂ ĐIỀU TRỊ BỆNH HÔ HẤP

Nội dung thực hiện gồm xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm của hai loại cao được phối trộn từ các dược liệu đều có tác dụng chữa trị bệnh hô hấp, đó là xạ can, bọ mắm, quế, dâu tằm.. Các tiê

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CAO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CAO

VÀ CHẾ PHẨM TỪ HỖN HỢP CÁC DƯỢC LIỆU

ĐỂ ĐIỀU TRỊ BỆNH HÔ HẤP

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS.DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC NGUYỄN THỊ DỊU HIỀN

Tháng 6 /2013

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên con xin được cám ơn cha mẹ vì những gì cha mẹ đã hi sinh cho

con, không ngại gian lao, cực khổ, vẫn luôn tận tình nuôi dạy con bằng cả tấm lòng để

con có thể yên tâm học tập, học hỏi và trao dồi cho mình những kiến thức hay để con

trưởng thành và vững bước trên đường đời sau này

Tiếp theo, em gởi lời cám ơn chân thành đến:

Ban giám hiệu trường, thầy Lê Đình Đôn, trưởng bộ môn Công nghệ sinh học,

cô chủ nhiệm Trầm và các thầy cô trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tạo điều

kiện giúp em học tập và trao dồi cho mình nhiều kiến thức hay và bổ ích trong chuyên

ngành cũng như trong cuôc sống trong suốt 4 năm học vừa qua

PGS.TS Trần Công Luận, Giám Đốc Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM đã

tạo điều kiện cho em được làm việc và học tập những kiến thức thực tế tại Trung tâm

và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

Cô ThS Dương Thị Mộng Ngọc, chị Nguyễn Thị Ngọc Đan và chị Lâm Bích

Thảo là người trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích và tận

tình giúp đỡ em mỗi khi em gặp khó khăn trong công việc giúp em thực hiện đề tài tốt

hơn

Cô Nguyễn Thị Hoa, anh Bùi Thế Vinh và quý thầy cô, anh chị em trong Trung

tâm đã hết lòng giúp đỡ, động viên và chia sẻ với em trong suốt thời gian em thực hiện

khóa luận của mình Em xin cám ơn các anh chị đã tạo cho em một môi trường làm

việc thoải mái, vui vẻ, ham học hỏi để làm tốt công việc của mình Những ngày tháng

làm việc ở trung tâm sẽ luôn ghi nhớ trong tim em

Các bạn sinh viên trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Sư

Phạm, các bạn nhóm K8 và tất cả các bạn trong lớp DH09SH đã bên cạnh động viên,

chia sẻ giúp Hiền vượt qua những khó khăn trong cuộc sống trong thời gian Hiền làm

đề tài

Một lần nữa em xin chân thành cám ơn tất cả mọi người

Nguyễn Thị Dịu Hiền

TÓM TẮT

Ngày nay, môi trường ngày càng bị ô nhiễm, không khí đi vào bên trong cơ thể đồng thời cũng mang theo các mầm bệnh như virus, vi khuẩn, khói bụi và các chất độc hại khác Đây cũng chính là nguyên nhân gây nên tình trạng các bệnh về đường hô hấp ngày càng gia tăng Hiện nay có rất nhiều loại thuốc trên thị trường giúp hỗ trợ sức khỏe hoặc chữa trị bệnh Các loại thuốc tổng hợp hóa học có tác dụng nhanh, hiệu quả cao, tuy nhiên cũng có không ít tác dụng phụ Vì vậy xu hướng hiện nay con người đang quay về với thiên nhiên Nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn, đề tài “Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao và chế phẩm từ hỗn hợp các dược liệu để điều trị bệnh hô hấp” được thực hiện

Nội dung thực hiện gồm xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm của hai loại cao được phối trộn từ các dược liệu đều có tác dụng chữa trị bệnh hô hấp, đó là xạ can, bọ mắm, quế, dâu tằm Sau đó tương tự thực hiện xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm của hai loại chế phẩm từ hai loại cao phối trộn này Các tiêu chí kiểm nghiệm gồm: cảm quan, thử độ tinh khiết, định tính thành phần hóa thực vật bằng phương pháp hóa học

và sắc ký lớp mỏng, cuối cùng là định lượng hàm lượng flavonoid toàn phần trong từng loại cao và chế phẩm theo chuẩn rutin bằng phương pháp đo quang UV-Vis

Kết quả đạt được sau quá trình nghiên cứu là lập được bốn bảng tiêu chuẩn cơ

sở về kiểm nghiệm chất lượng của hai loại cao phối và hai loại chế phẩm này gồm các tiêu chí như trên

SUMMARY

Today, the environment is increasingly polluted, the air enters the body also carry pathogens such as virus, bacteria, dust and other harmful substances This is the condition causes respiratory diseases is increasing There are many drugs on the market to help support health or treat disease The synthetic chemical drugs are fast acting, highly effective, but also have side effects So now the human tendency is to return to nature To meet practical needs, titled "Building high standards and tested products from mixtures of pharmaceuticals for the treatment of respiratory disease" is done

Contents include building performance testing standards of the two blended from herbal treatment effects are respiratory diseases, such as radiation can, beetle sauce, cinnamon, mulberry Then perform the same test standard formulation of the two preparations of these two types of high-mix The test criteria include: sensory, test the purity, chemical composition of the plant by chemical methods and thin layer chromatography, the final concentration of total flavonoids in each high and preparations rutin standard method by UV-Vis spectrophotometer

high-The results achieved after the study table is set for four basic standards for quality testing of two high and two coordinating the preparations of the above criteria Keyword: rutin, flavonoids, thin layer chromatography, UV-Vis

MỤC LỤC

Lời cám ơn i 

Tóm tắt ii 

Summary iii 

Mục lục iv 

Danh mục các chữ viết tắt vii 

Danh sách các bảng viii 

Danh sách các hình ix

Chương 1 Mở đầu 1 

1.1  Đặt vấn đề 1 

1.2  Mục tiêu đề tài 2 

1.3  Nội dung thực hiện 2 

Chương 2 Tổng quan tài liệu 3 

2.1  Tổng quan dược liệu 3 

2.1.1 Bọ mắm 3 

2.1.2 Dâu tằm 4 

2.1.3 Quế 5 

2.1.4 Xạ Can 6 

2.2  Đại cương về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên 8 

2.2.1  Alkaloid 8 

2.2.2  Flavonoid 8 

2.2.3  Saponin 9 

2.3  Các phương pháp chiết 9 

2.3.1  Chiết lỏng – lỏng 10 

2.3.2  Chiết siêu âm 10 

2.3.3  Chiết soxhlet 10 

2.4  Định tính bằng phương pháp hóa học 10 

2.5  Phương pháp sắc ký lớp mỏng 10 

2.6  Quang phổ hấp thu tử ngoại và khả kiến (UV – vis) 11 

2.6.1  Khái niệm 11 

2.6.2  Đặc điểm 12 

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 13 

3.2  Vật liệu nghiên cứu 13 

3.2.1  Đối tượng nghiên cứu 13 

3.2.2  Dung môi – hóa chất – trang thiết bị 13 

3.3  Phương pháp nghiên cứu 14 

3.3.1  Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng cao phối 14 

Cảm quan 14 

Độ ẩm 14 

Độ tro toàn phần 14 

Định tính các thành phần hóa học trong cao bằng phản ứng hóa học 15 

Định lượng hàm lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp UV-Vis 16 

3.3.2  Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng chế phẩm 19 

Cảm quan 19 

Độ ẩm 19 

Độ tro toàn phần 19 

Định tính các thành phần hóa học bằng phương pháp hóa học 19 

Xác định sự hiện diện bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 20 

Định lượng hàm lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp UV-Vis 24 

Chương 4 Kết quả và thảo luận 26 

4.1  Tiêu chuẩn hóa kiểm nghiệm cao phối I và chế phẩm A 26 

4.1.1  Cảm quan 26 

4.1.2  Độ ẩm 26 

4.1.3  Độ tro 27 

4.1.4  Định tính bằng phản ứng hóa học 27 

Định tính thành phần hóa học trong cao phối I 27 

Định tính thành phần hóa học trong chế phẩm A 28 

4.1.5  Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 28 

Xác định sự hiện diện của nguyên liệu quế 28 

Xác định sự hiện diện của nguyên liệu xạ can 29 

Xác định sự hiện diện của nguyên liệu dâu tằm và chất rutin 30 

4.2  Tiêu chuẩn hóa kiểm nghiệm cao phối II và chế phẩm B 32 

4.2.1  Cảm quan 32 

4.2.2  Độ ẩm 32 

4.2.3  Độ tro 33 

4.2.4  Định tính thành phần hóa học 33 

Định tính thành phần hóa học trong cao phối II 33 

Định tính thành phần hóa học trong chế phẩm A 34 

4.2.5  Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 34 

Xác định sự hiện diện của bọ mắm 34 

Xác định sự hiện diện của xạ can 35 

Xác định sự hiện diện của dâu tằm và chất rutin 36 

4.2.6  Định lượng hàm lượng flavonoid toàn phần theo chuẩn rutin 377 

Chương 5 Kết luận và đề nghị 388  

5.1  Kết luận 388 

5.2  Đề nghị 39 

Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao phối I Error! Bookmark not defined.  Tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm A Error! Bookmark not defined.  Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao phối II 402 

Tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm B 413 

Tài liệu tham khảo 434  

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(CH3CO)2O Anhydric acetic

Anisal Dung dịch anisaldehyd trong ethanol

CH3COOH Acid acetic

DĐVN Dược điển Việt Nam

FeCl3 Sắt (III) clorid

RSD Relative standard deviation, độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard deviation, độ lệch chuẩn

SKLM Sắc ký lớp mỏng

TT Thuốc thử

UV Ultraviolet

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Dung môi – hóa chất – trang thiết bị 13 

Bảng 3.2 Định tính hợp chất flavonoid 16 

Bảng 3.3 Định tính hợp chất alkaloid 16 

Bảng 3.4 Định tính hợp chất saponin 16 

Bảng 4.1 Kết quả độ ẩm cao phối I 26 

Bảng 4.2 Kết quả độ ẩm chế phẩm A 26 

Bảng 4.3 Số liệu độ tro cao phối I 27 

Bảng 4.4 Số liệu độ tro chế phẩm A 27 

Bảng 4.5 Kết quả định tính cao phối I 27 

Bảng 4.6 Kết quả định tính chế phẩm A 28 

Bảng 4.7 Kết quả định lượng hàm lượng flavonoid có trong cao phối I 31 

Bảng 4.8 Kết quả định lượng hàm lượng flavonoid có trong chế phẩm A 31 

Bảng 4.9 Kết quả độ ẩm cao phối II 32 

Bảng 4.10 Kết quả độ ẩm chế phẩm B 32 

Bảng 4.11 Số liệu độ tro cao phối II 33 

Bảng 4.12 Số liệu độ tro chế phẩm B 33 

Bảng 4.13 Kết quả định tính cao phối II 33 

Bảng 4.14 Kết quả định tính chế phẩm B 34 

Bảng 4.15 Kết quả định lượng hàm lượng flavonoid có trong cao phối II 37 

Bảng 4.16 Kết quả định lượng hàm lượng flavonoid có trong chế phẩm B 37 

Bảng 5.1 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao phối I 39 

Bảng 5.2 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm A 400 

Bảng 5.3 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao phối II 411 

Bảng 5.4 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm B 422 

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây bọ mắm 3 

Hình 2.2 Cây dâu tằm 4 

Hình 2.3 Vỏ quế 5 

Hình 2.4 Cây xạ can 6 

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chiết mẫu cao để thực hiện định lượng flavonoid 17 

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình chiết mẫu dược liệu để chấm sắc ký 21 

Hình 4.1 Cao phối I và chế phẩm A 26 

Hình 4.2 SKLM sự hiện diện của quế trong cao phối I và chế phẩm A 28 

Hình 4.3 SKLM sự hiện diện của xạ can trong cao I và chế phẩm A 29 

Hình 4.4 SKLM sự hiện diện của dâu tằm và chất rutin trong cao I và chế phẩm A 30 

Hình 4.5 Đỉnh hấp thu của mẫu chuẩn tại bước sóng cực đại max = 422 nm 31 

Hình 4.6 Cao phối II và chế phẩm B 32 

Hình 4.7 SKLM xác định sự hiện diện của bọ mắm trong cao II và chế phẩm B 34 

Hình 4.8 SKLM sự hiện diện của xạ can trong cao II và chế phẩm B 35 

Hình 4.9 SKLM sự hiện diện của dâu tằm và chất rutin trong cao II và chế phẩm B 36 

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Phổi là cơ quan thực hiện chức năng trao đổi khí Bên cạnh việc cung cấp oxy cần thiết cho mọi tế bào của cơ thể, phổi còn giúp thải khí carbonic Tuy nhiên với thời đại công nghiệp hóa - hiên đại hóa ngày càng phát triển thì bên cạnh đó là môi trường

ngày càng ô nhiễm, không khí đi vào cơ thể cũng đồng thời có thể mang theo nhiều mầm bệnh như vi khuẩn, virus, khói, bụi và các chất độc hại khác… Đây chính là một

trong những nguyên nhân dẫn đến các nguy cơ mắc bệnh về hô hấp ngày càng tăng ở người cũng như động vật

Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại thuốc khác nhau giúp hỗ trợ sức khỏe cũng như để chữa trị bệnh Các loài thuốc tổng hợp hóa học có tác dụng chữa trị cao

và hiệu quả nhanh, tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích tức thời, có không ít các loại thuốc có nhiều phản ứng phụ, những tác dụng ngoài mong muốn, đặc biệt là các loại thuốc càng đặc trị chuyên biệt thì tác dụng không mong muốn càng nhiều như các loại thuốc ức chế miễn dịch, thuốc lao, thuốc diệt nấm, thuốc chống ung thư Ngoài ra, mặc dù hóa học tổng hợp hữu cơ đạt được rất nhiều thành tựu quan trọng nhưng nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học vẫn còn khó tổng hợp hoặc có thể tổng hợp được nhưng chi phí rất đắt Vì vậy, xu hướng hiện nay là kết hợp Đông y và Tây y với phương châm vừa áp dụng kinh nghiệm chữa bệnh của ông cha ta bằng thuốc Nam, vừa nghiên cứu tính năng tác dụng của cây thuốc bằng cơ sở khoa học hiện đại (Đỗ Tất Lợi, 1999)

Theo thống kê của Tổ chức Y Tế thế giới có tới 2000 loài thảo dược đã được

sử dụng 80% dân số thế giới dựa vào nguồn thuốc có nguồn gốc dược liệu Trên 25% thuốc sử dụng trên lâm sàng có nguồn gốc thực vật Thị trường thuốc có nguồn gốc thực vật trên thế giới hiện nay vào khoảng 30 tỉ USD Nhiều biệt dược Đông dược của châu Á được tiêu thụ mạnh ở châu Âu

Trong đó nước ta là một nước có hệ thống động thực vật rất phong phú và đa dạng từ núi cao cho tới đồng bằng và bờ biển, cả nước ước tính có khoảng 12.000 loài trong đó có khoảng 4.000 loài cây đang được sử dụng làm thuốc Đây là điều kiện thuận lợi để ta phát triển các loài thuốc có nguồn gốc từ thảo dược

Trong quá trình nghiên cứu một sản phẩm điều trị bệnh thì việc đánh giá chất lượng của nguyên liệu và các bán thành phẩm, đảm bảo hiệu quả sử dụng và tính an toàn của nguyên liệu và các bán thành phẩm trong sản xuất, quản lý, phân phối và sử dụng thì công tác kiểm nghiệm cần phải được quan tâm nhiều hơn Tùy từng loại thuốc khác nhau mà xây dựng quy trình kiểm nghiệm khác nhau

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, Trung tâm Sâm và Dược Liệu TP.HCM đang nghiên cứu các sản phẩm điều trị bệnh hô hấp từ các dược liệu Để nối tiếp các nghiên cứu đang được triển khai, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao và chế phẩm từ hỗn hợp các dược liệu để điều trị bệnh hô hấp”

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài này được thực hiện với mục tiêu là xây dựng các chi tiêu để kiểm định chất lượng của 2 loại cao phối I , II và 2 chế phẩm A Cao phối I bao gồm các cao chiết từ các nguyên liệu xạ can, quế, dâu tằm Cao phối II bao gồm các cao chiết từ các nguyên liệu xạ can, bọ mắm, dâu tằm Chế phẩm A dạng thuốc bột từ cao phối I và chế phẩm B dạng thuốc bột từ cao phối II

1.3 Nội dung thực hiện

Đề tài được thực hiện với các nội dung sau:

Cảm quan, quan sát hình dạng và màu sắc các cao phối và chế phẩm;

Thử độ tinh khiết của cao phối và chế phẩm bao gồm: độ ẩm, độ tro toàn phần; Định tính các hợp chất hóa thực vật trong cao phối và chế phẩm bằng phương pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng;

Định lượng hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao phối và chế phẩm theo chuẩn rutin bằng phương pháp UV-Vis

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan dược liệu

4 nhị, nhụy lép; hoa cái có bao hoa dạng túi, miệng khía răng có lông, bầu hình quả lê,

có lông, vòi nhụy dài và mảnh

Bộ phận dùng: Toàn thân, thu hái quanh năm, bỏ rễ, phơi hoặc sấy khô

Thành phần hóa học: Cây chứa các flavon, flavonoid, tanin, caroten, các carotenoid, ascorbic, tartaric, malic acid và pectic acid, …(Ghani, 2003)

Tác dụng dược lý : Cao khô có các tác dụng như kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng trên hô hấp, tác dụng chống co giật do sốc điện, tác dụng lợi tiểu và tác dụng trên

một số loại tế bào ung thư in vitro

Tính vị, công năng: Bọ mắm có vị ngọt, đắng nhạt, tính mát, có tác dụng tiêu khát, trừ đờm, lợi tiểu, tiêu viêm, rút mủ

Công dụng: Bọ mắm chữa viêm họng, viêm ruột lỵ, đinh nhọt, viêm da mủ, viêm vú, tắc tia sữa, vết thương đụng đập, nhiễm trùng tiết niệu, ho, bệnh về phổi, đau

răng, đái rát, đái buốt Ngày 20 – 40 g cây tươi hoặc 10 – 20 g cây khô, sắc hoặc nấu cao uống Dùng ngoài không kể liều lượng

Bộ phận dùng: Chuyên luận này sử dụng lá dâu tằm để thực hiện điều chế cao

Thành phần hóa học: Lá dâu chứa các thành phần bay hơi và thành phần không bay hơi Các thành phần bay hơi như tinh dầu, gồm các phân đoạn trung tính, acid, phenol, carbonyl, base Phân đoạn trung tính chứa isobutanol, alcol isoamylic, isoamyl acetat và acetophenol Phân đoạn acid chứa acid acetic, acid propionic, acid butyric, acid isobutyric, acid isovaleric, acid caproic, acid isocaproic, acid lactic Phân đoạn phenol chứa o -, m -, p - cresol, guaiacol, eugenol, methyl salicylat Phân đoạn carbonyl chứa benzaldehyd và phenylacetaldehyd Các thành phần không bay hơi gồm nhiều hợp chất thuộc nhiều nhóm hóa học khác nhau như: protein, carbohydrat,

flavonoid, coumarin, vitamin và một số thành phần khác

Tác dụng dược lý: Cao nước và cao kiềm của lá có tác dụng ức chế các vi khuẩn gram dương và các men Lá dâu còn có tác dụng hạ huyết áp yếu, tác dụng này

bị đảo ngược bởi atropin Đồng thời nó có tác dụng giãn mạch Chế phẩm an thần Passerynum gồm lá dâu, lạc tiên, vông nem, lá sen, thảo thuyết minh, hạt tơ hồng, hạt keo giậu, củ sâm đại hành, đã thể hiện độc tính thấp, giảm được trạng thái hưng phấn ở chuột nhắt bị kích thích bởi cafein, gây hạ huyết áp, tăng tần số và biên độ hô hấp của

thỏ, có khuynh hướng làm giảm nhịp tim và sức co bóp của sợi cơ tim Áp dụng điều trị trên lâm sàng, Passerynum có tác dụng gây hạ thân nhiệt của bệnh nhân, không làm thay đổi huyết áp, không gây trạng thái buồn ngủ hoặc ngủ gà, chỉ làm bệnh nhân ngủ

dễ dàng và ngon giấc Thuốc có tác dụng an thần cho bệnh nhân với tỷ lệ 16/25người,

so với placebo tỷ lệ 6/15 người, chứng tỏ yếu tố tâm lý có vai trò quan trọng trong mất

ngủ

Tính vị, công năng: Lá dâu có vị đắng, ngọt, tính lạnh, có tác dụng tán phong,

thanh nhiệt, lương huyết, sáng ánh sáng

Công dụng: Lá dâu chữa cảm mạo, phong nhiệt, sốt nóng, ho, viêm họng, đau răng, nhức đầu, ánh sáng đỏ, chảy nước ánh sáng, đậu lào, phát ban, cao huyết áp, mất ngủ Ngày dùng 4 - 12g, dạng thuốc sắc

2.1.3 Cây quế

Tên khoa học: Cinnamomum cassia Bl

Họ: Long não (Lauraceae)

(Nguồn: www.mdidea.com)

Mô tả thực vật: Cây quế là loài cây thân gỗ, sống lâu năm, ở cây trưởng thành

có thể cao trên 15 m, đường kính ngang ngực (1,3 m) có thể đạt đến 40 cm Trong các

bộ phận của cây quế như vỏ, lá, hoa, gỗ, rễ đều có chứa tinh dầu, đặc biệt trong vỏ có hàm lượng tinh dầu cao nhất, có khi đạt đến 4 – 5%

Bộ phận dùng: Vỏ thân, vỏ cành non được phơi hoặc sấy khô Tinh dầu trong

-phenylpropanal 0,8%, (Z) - aldehyd cinnamic 0,6%, coumarin 0,6%, benzaldehyd 0,3%, eugenol 0,3%, β - caryophylen 0,1%, benzyl benzoat 0,1%, camphor 0,1%, salicylaldehyd 0,1%, α - terpineol 0,1% (Prosea 13, 1999) Ngoài ra, trong vỏ quế có các hợp chất diterpenoid, phenyl glycosid, chất nhầy, các hợp chất flavonoid, tanin, coumarin

Tác dụng dược lý: Tinh dầu quế chứa aldehyd cinnamic là thành phần chủ yếu

có tác dụng diệt khuẩn in vitro đối với một số vi khuẩn ở độ pha loãng cao Tác dụng

kháng khuẩn đối với các giống vi khuẩn khác nhau, theo thứ tự hoạt tính giảm dần: :

Salmonella typhi, tụ cầu vàng, Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, Candida albicans, Shigella flexneri, Sh Dysenteriae, liên cầu khuẩn tan máu, trực khuẩn lao, phế cầu

khuẩn Tác dụng mạnh đối với phẩy khuẩn tả Eltor, Inaba và Ogawa là 2/10000 Bên cạnh đó, aldehyd cinnamic còn có tác dụng an thần, hạ áp do làm giản mạch ngọai vi

Tính năng, công vị: Quế có vị ngọt, cay, mùi thơm, tính rất nóng, có tác dụng

bổ hỏa, hồi dương, ấm thận tỳ, thông huyết mạch, trừ hàn tích

Công dụng: Những người bị cảm lạnh, ho dai dẳng, viêm xoang nên dùng ăn hỗn hợp 1 thìa mật ong trộn với 1/4 thìa quế hằng ngày trong 3 ngày liên tục Quế cũng giúp điều trị cảm cúm, đau họng và chứng sung huyết Ngoài ra còn có rất nhiều các tác dụng khác như: giảm viêm đường tiết niệu, chống tắc nghẽn mạch, giảm đau

do chứng viêm khớp, giảm đau cơ và đau khớp,…

mặt phẳng và xòe ra như cái quạt Cụm hoa phân nhánh, dài 30-40cm Lá bắc dạng vảy, hoa có cuống dài, xếp trên nhánh như những tán đơn, màu vàng cam điểm những đốm tía, đài có răng nhỏ hình mũi mác Tràng có cánh rộng và dài hơn lá đài, nhị 3, đính ở gốc cánh hoa Quả nang hình trứng, hạt nhiều, màu đen bóng Mùa hoa quả vào tháng 7 - 10 Cây có thể mọc hoang hoặc được trồng, ưa nắng nên trồng ở các tỉnh phía Nam có tỷ lệ hoa quả cao

Bộ phận dùng: Thân, rễ thu hái vào mủa xuân khi cây ra nụ hoặc mùa thu khi

bộ phận trên mặt đất tàn héo, loại bỏ đất cát, rễ con, rồi đem phơi hoặc sấy khô Khi dùng thái phiến

Thành phần hóa học: Thân và rễ xạ can chứa chủ yếu tectorigenin,

iristectorigenin A, belamcandin, dichotomidin, irisfloretin, irigenin

Tác dụng dược lý: Xạ can có rất nhiều tác dụng như chống nấm và virus, khử đờm, kháng vi sinh, kháng viêm, tác dụng đối với nội tiết và tác dụng giải nhiệt Chích

liều cao dung dịch xạ can, in vitro thấy có tác dụng ức chế nhiều loại nấm da Thuốc

cũng có tác dụng chống virus hô hấp (Trung Dược Học) Ngoài ra, nếu cho chuột nhắt uống nước sắc xạ can, thấy hô hấp tăng, tống đờm ra mạnh hơn (Ngô Trạch Phương, Trung Dược Dược Lý Dữ Lâm Sàng 1985, (1): 153) Nước sắc xạ can còn có tác dụng

ức chế Bồ đào cầu khuẩn, Liên cầu khuẩn, khuẩn bạch hầu, khuẩn thương hàn (Quách

Võ Phi, Trung Hoa Y Học Tạp Chí 1952, 38 (4): 315)

Tính vị, công năng: Xạ can có vị đắng, tính mát, hơi có độc, vào hai kinh: phế

và can, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tán huyết, tiêu đờm

Công dụng: Xạ can được coi là vị thuốc quý chữa các bệnh về họng, viêm amidan có mủ, ho nhiều đờm, khản tiếng; còn được dùng chữa sốt, đại tiểu tiện không thông, sưng vú tắc tia sữa, đau kinh và làm thuốc lọc máu Ngày dùng 3 – 6 g dưới dạng thuốc sắc hoặc bột làm viên ngậm, uống, hoặc dùng 10 – 20 g thân rễ tươi rửa sạch, nhúng qua nước sôi, giã nát với vài hạt muối, vắt nước ngậm hoặc nuốt dần, bã

hơ nóng, đắp vào cổ Ngoài ra, để chữa rắn cắn, dùng cả cây, giã nát, thêm nước gạn uống, đắp bã

2.2 Đại cương về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên

2.2.1 Alkaloid

Là những hợp chất thiên nhiên với nhiều dạng cấu trúc khác nhau và có hoạt tính sinh học rõ rệt Đa số alkaloid hiện diện trong loài cây hạt kín, cây có hoa nhưng cũng tìm thấy trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật và thực vật hạ đẳng

Đa số alkaloid không màu, ở dạng kết tính rắn, có nhiệt độ nóng chảy hoặc nhiệt độ phân hủy xác định Vài alkaloid ở dạng keo, vô định hình và alkaloid ở dạng lỏng (nicotin, coniin) hoặc có màu (berberin màu vàng; betanidin màu đỏ)

Các alkaloid ở dạng base tự do thường hoà tan được trong dung môi hữu cơ, tuy nhiên các alkaloid ở dạng base thứ cấp thì chỉ hòa tan trong nước Muối của đa số alkaloid thì hòa tan trong nước Độ hòa tan của alkaloid và các muối của chúng giữ vai trò quan trọng trong kỷ nghệ dược phẩm; trong việc trích ly chúng ra khỏi cây cỏ và trong việc bào chế alkaloid thành các dạng thuốc phù hợp Đa số alkaloid có tính kiềm, điều này khiến cho alkaloid cực kỳ nhạy cảm, dễ bị thủy phân khi gặp ánh sáng hoăc nhiệt độ Nhiều alkaloid đã được sử dụng để làm thuốc trị bệnh Alkaloid có tác dụng kích thích thần kinh như: strychnine, cafein, lobelin…có khả năng diệt ký sinh trùng

và các nguyên sinh động vật như: emetin, quinin, conessin, berberin Các alkaloid có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương nên được dùng làm thuốc giảm đau trong khi giải phẩu hoặc khi bị bệnh ung thư giai đoạn cuối: morphin và các dẫn xuất của morphin như: heroin, codein (tuy nhiên các hợp chất này có thể gây ra tình trạng uể oải, buồn ngủ, khó thở và nghiện thuốc) Có alkaloid được bào chế làm thuốc để giảm

hệ thần kinh giao cảm: reserpin, propanolol Một số alkaloid như: berberin, palmatin, taspin…có khả năng ức chế con men sao chép ngược (reverse trancriptase) đây là con men chủ yếu của retrovirus mà các loại thuốc kháng HIV tập trung tiêu diệt

Chalcone hiện diện ít trong tự nhiên; flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp; flavone và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên Các glicisid flavonol như: rutin, quercitrin, daempherol Kaempherol rất thường xuyên hiện diện Antocyanidine dạng glycosid ví dụ như: pelargonidin; cyanidin; delphinidin…tạo màu xanh, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu Flavone

có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; chalcone màu vàng đến cam - đỏ Các isoflavone; flavanone; flavanonol; leucoantocyanidine; catechin kết tinh không màu Antocyanidine có màu đỏ, tím, xanh dương tạo màu cho nhiều loại hoa và trái Quercetin ở môi trường kiềm thì có tác dụng kháng khuẩn kém nhưng ở môi trường acid thì có tác dụng rất rõ với vi khuẩn tụ cầu vàng, vi khuẩn tụ cầu trắng Salmonella oranienbur có tác dụng kháng nấm thực vật Một số hợp chất thuộc loại isoflavonoid như rotenon (trích từ dây thuốc cá Derris elliptica Benth, họ Đậu) có tính độc đối với cá và côn trùng nhưng không độc với các động vật hữu nhũ Cũng có những hợp chất có tính diệt côn trùng như hợp chất pyrethrin (trích từ cây trừ trùng Chrysanthemum cinerariaefolium, họ Cúc)

2.2.3 Saponin

Là một loại glycosid phân bố khá rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu còn gọi là tính phá huyết Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy thường cao từ 200oC trở lên và có thể trên 300oC Saponin có thể bị tủa bởi acetat chì, hydroxid barium, sulfat amonium nên có thể lợi dụng tính chất này để cô lập saponin Nhiều saponin steroid là nguyên liệu đầu để tổng hợp các chất hormone steroid có hoạt tính cao Nhiều loại saponin có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn

2.3 Các phương pháp chiết

Chiết là một phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi một hỗn hợp các chất Tùy từng cơ chế và đặc điểm của quá trình chiết mà ta chọn phương pháp chiết thích hợp

2.3.1 Chiết lỏng – lỏng

Chiết lỏng – lỏng, còn gọi là chiết bẳng dung môi, là một phương pháp để tách các hợp chất riêng biệt dựa trên tính tan của hai chất lỏng khác nhau, thường là nước và một dung môi

2.3.2 Chiết siêu âm

Chiết siêu âm là phương pháp sử dụng song với tần số 20.000 Hz

Cách tiến hành: Cho cao (hoặc chế phẩm) vào dụng cụ chứa rồi cho thêm một lượng dung môi đã chọn Đặt dụng cụ chứa vào trong bể siêu âm, sau đó bật máy và chỉnh thời gian chiết Sau khi chiết xong, lọc lấy dịch chiết rồi thêm dung môi cho lần chiết sau

2.3.3 Chiết soxhlet

Cách thực hiện: Cao (hoặc chế phẩm) được đặt vào trong một túi vải (hoặc giấy lọc) rồi cho vào ống chứa mẫu Rót dung dịch đã chọn vào bình cầu bằng cách rót trực tiếp vào ống chứa mẫu Kiểm tra hệ thống kín, mở ống sinh hàn, cắm bếp điện và điều chỉnh sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ

2.4 Định tính bằng phương pháp hóa học

Cao phối được phối trộn từ nhiều loại cao của các dược liệu khác nhau Mỗi loại dược liệu đều có các nhóm hợp chất xác định Có thể dựa vào các nhóm hợp chất này chọn các hợp chất chứa nhiều trong cao phối để định tính bằng phản ứng màu hoặc kết tủa đặc trưng

Ví dụ:

- Các alkaloid: dựa vào phản ứng kết tủa với các thuốc thử chung (TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat)

- Saponin: thử tính tạo bọt, phản ứng Liebermanm – Burchard,…

- Flavonoid: dựa vào phản ứng màu với kiềm, acid, FeCl3,…

2.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi

để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc

Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động

di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách

Về bản chất đây là hệ sắc ký rắn – lỏng , trong đó pha tĩnh rắn (là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo yêu cầu phân tích, thường là silicagel, nhôm oxyt) được trải thành lớp mỏng đồng đều trên bản kính, nhựa hay kim loại Sau đó đưa hỗn hợp chất cần tách lên pha tĩnh bằng cách chấm dung dịch mẫu thử nghiên cứu lên bản mỏng Pha động là một hệ dung môi khai triển đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo một tỷ lệ nhất định Dưới tác dụng của lực mao quản, dung môi sẽ chuyển động qua lớp hấp phụ, các cấu tử sẽ di chuyển theo hướng pha động nhưng với vận tốc khác nhau đưa đến việc tách các cấu tử ra khỏi nhau, ta thu được một sắc ký đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau trên lớp mỏng

Hệ số di chuyển Rf, đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích, được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

b

a f

R Trong đó:

a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm

Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l

Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động

2.6 Quang phổ hấp thu tử ngoại và khả kiến (UV – vis)

2.6.1 Khái niệm

Phổ tử ngoại - khả kiến là các dạng của bức xạ điện từ, có bản chất là sóng điện

từ, chúng chỉ khác nhau về độ dài sóng Vùng tử ngoại - khả kiến bao gồm các bức xạ điện từ có độ dài sóng trong khoảng 200 - 800 nm (vùng khả kiến 360 - 800 nm) Khi phân tử hấp thụ bức xạ tử ngoại hoặc khả kiến thì những electron hóa trị của nó bị kích thích và chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích Sự hấp thụ bức xạ của phân tử được ghi lại, phổ thu được gọi là phổ tử ngoại - khả kiến và cũng được gọi phổ hấp thụ electron

2.6.2 Đặc điểm

Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và vùng khả kiến phụ thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử Chỉ một số dạng cấu trúc trong các hợp chất hữu cơ mới có sự hấp thụ nêu trên, thực tế việc ứng dụng phổ tử ngoại cũng giới hạn trong một số hợp chất, chủ yếu là các chất có cấu trúc dây nối đôi liên hợp

Đặc điểm của phổ tử ngoại là phổ của một chất phức tạp có thể rất giống với phổ của một chất đơn giản nếu 2 chất này cùng chứa một nhóm cấu trúc giống nhau

- Hoạt động của phổ tử ngoại - khả kiến:

Vùng tử ngoại - khả kiến bao gồm các bức xạ điện từ có độ dài sóng trong khoảng 200 - 800 nm (vùng khả kiến 360 - 800 nm) Sự hấp thụ có nhiều ứng dụng trong quang phổ tử ngoại là trong vùng từ 200 - 380 nm, gọi là vùng tử ngoại gần Trên phổ tử ngoại các vị trí băng hay còn gọi là dải hấp thụ được đo bằng độ dài sóng λ, đơn vị là nanomet (nm) hoặc Angstrom (Ao) Cường độ của tia đơn sắc trước

và sau khi đi qua môi trường hấp thụ được liên hệ với nhau bởi định luật Lambert - Beer

Khác với vùng phổ hồng ngoại, ở vùng phổ tử ngoại - khả kiến, định luật Lambert - Beer được tuân theo tốt hơn nhiều, do đó thường được xác định chính xác

và có tính lặp lại

Phổ tử ngoại - khả kiến (Phổ UV - Vis) thường cho ta đường cong phụ thuộc độ hấp thụ A (lg (Io/I)) vào bước sóng của ánh sáng chiếu tới Phổ hấp thụ của một chất được đặc trưng bởi bước sóng λ max mà tại đó sự hấp thụ là lớn nhất

Theo định luật Lambert - Beer mật độ quang phụ thuộc vào nồng độ của chất hấp phụ

Chương 3 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện nghiên cứu từ tháng 12/2012 đến tháng 6/2013 tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM

Địa chỉ: 41 Đinh Tiên Hoàng, Phường Bến Nghé, Quận 1, TP.HCM

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu nguyên liệu mua ở cửa hàng thuốc Kim Anh (Địa chỉ: 88 Hải Thượng Lãng Ông, quận 5, TP.HCM) Các mẫu được xay thành bột có kích thước 2 mm và lưu

ở Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM

- Cao phối I bao gồm các cao chiết từ nguyên liệu Xạ can, Quế, Dâu tằm

- Cao phối II bao gồm các cao chiết từ nguyên liệu Xạ can, Bọ mắm, Dâu tằm

- Chế phẩm A dạng thuốc bột từ các cao phối I

- Chế phẩm B dạng thuốc bột từ các cao phối II

3.2.2 Dung môi – hóa chất – trang thiết bị

Bảng 3.1 Dung môi – hóa chất – trang thiết bị

- Cân phân tích Sartorius

- Máy đo quang phổ khả kiến

Thermo Spectronic HEIOS

- Máy đánh sóng siêu âm

Ultrasonic LC 60 H

- Tủ sấy Memmert

- Nồi đun cách thủy Memmert

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng cao phối

3.3.1.1 Cảm quan cao phối

Quan sát và ghi nhận màu sắc của 2 loại cao phối

2 lần cân không quá 0,5 mg) Quy trình được lặp lại 3 lần

trong đó:

A : độ ẩm (khối lượng/khối lượng, %)

p : khối lượng cao trước khi sấy (g)

a : khối lượng cao sau khi sấy (g)

3.3.1.3 Độ tro toàn phần cao phối

- Nguyên tắc

Xác định độ tro là xác định hàm lượng các chất vô cơ không bay hơi có trong dược liệu Đây là thành phần các chất vô cơ có trong dược liệu, nhưng cũng có thể có thêm những tạp chất vô cơ (như đất, cát) lẫn vào dược liệu

Tro toàn phần là khối lượng cắn vô cơ còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một

dược liệu Cắn vô cơ cấu tạo chủ yếu là các carbonat và oxyd kim loại

- Tiến hành

Nung một chén nung bằng sứ cho tới khối lượng không đổi (khoảng 2 giờ), để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén không

Cân khoảng 0,5 g cao cho vào chén nung Trải đều nguyên liệu ở đáy đáy chén

và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi cao cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói

Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở 500 - 600oC cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen) trong 4 giờ Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm Cân và ghi lại lượng cân

Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 2 giờ nữa Tiếp tục làm như vậy đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chén có tro (a) chênh lệch không quá 0,5 mg

Quy trình được lặp lại 3 lần

- Công thức

Tro toàn phần tính trên nguyên liệu khô kiệt theo công thức:

100 )

b a X

trong đó:

X : tro toàn phần của cao (%)

a : khối lượng chén có tro (g)

b : khối lượng chén không (g)

c : khối lượng cao dùng (g)

A: độ ẩm của cao (%)

3.3.1.4 Định tính thành phần hóa thực vật có trong cao phối bằng phản ứng hóa

học

Sử dụng các phản ứng hóa học đặc trưng để khảo sát các hợp chất có trong cao

và chế phẩm dựa trên các hợp chất có trong các dược liệu ban đầu

- Định tính hợp chất flavonoid

Lấy 0,3 g cao, chiết siêu âm 15 phút với 20 ml MeOH, lọc Dịch lọc được cô đến cắn Hòa cắn với 15 ml ethanol, siêu âm cho tan hết cắn, lọc để được dung dịch A Dịch lọc A được dùng để thực hiện các phản ứng sau:

Bảng 3.2 Định tính hợp chất flavonoid

Với TT NaOH 20% 2 ml dd A + 3 giọt NaOH 10% Tủa đỏ cam

Với TT FeCl3 5% 2 ml dd A + 2 giọt FeCl35% Màu xanh rêuVới TT chì acetat 2 ml dd A + 2 giọt chì acetat Tủa vàng nâu

- Định tính hợp chất alkaloid

Lấy 0,5 g cao, chiết siêu âm 15 phút với H2SO4 5% (3 lần × 5 ml), lọc Tập trung dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm để làm phản ứng

Bảng 3.3 Định tính hợp chất alkaloid

Với TT Mayer 2 ml dịch lọc + 3 giọt TT Mayer Tủa vàng camVới TT Dragendroff 2 ml dd A + 3 giọt TT Dragendroff Tủa cam

Với TT Bouchardat 2 ml dd A + 3 giọt TT Bouchardat Tủa nâu đỏ

Hòa cắn với 5 ml nước nóng, lọc

Pha loãng với nước cất cho đủ khoảng 10 ml, lắc dọc theo chiều thẳng đứng của ống nghiệm

Xuất hiện vòng ngăn cách màu đỏ sậm

3.3.1.5 Định lượng hàm lượng flavonoid toàn phần có trong cao phối theo chuẩn rutin bằng phương pháp UV-Vis

- Nguyên tắc

Dựa vào phản ứng tạo phức màu giữa ruitn với AlCl3 tạo phức hợp màu vàng Phức này có khả năng hấp thụ ánh sáng ở vùng khả kiến, do đó có thể dùng phương pháp đo độ hấp thụ ở vùng khả kiến

- Chuẩn bị mẫu

Trước khi thực hiện định lượng hàm lượng flavonoid có trong cao phối trộn, ta thực hiện chiết mẫu cao với các dung môi thích hợp

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình chiết mẫu cao để thực hiện định lượng flavonoid

Cân chính xác 1 g mỗi loại cao phối vào bình Soxhlet Thêm 250 ml ether dầu, chiết đến khi dịch chiết không còn màu Để nguội và gạn bỏ dịch ether dầu, cao được chiết tiếp tục với 250 ml methanol 70%, cho đến khi dịch chiết không còn màu Dịch chiết methanol 70% được chuyển vào bình định mức 250 ml, bổ sung methanol 70% vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu dung dịch I (cao phối I) và dung dịch II (cao phối)

Chất chuẩn: Cân chính xác 0,012 g chuẩn rutin, sau đó định mức bằng MeOH 70% trong bình định mức 10 ml Lấy chính xác 0,5 ml dung dịch mẫu chuẩn vừa pha cho vào các ống nghiệm và cô đến cắn ta thu được mẫu chuẩn rutin 60 µg

Thuốc thử: AlCl3 5% trong methanol 70%

- Định lượng hàm lượng flavonoid toàn phần có trong cao phối I:

Mẫu trắng: methanol 70%

Mẫu chuẩn: Thêm vào ống nghiệm chứa 60 µg chuẩn rutin đã chuẩn bị ở trên chính xác 5 ml methanol 70% và 75 l dung dịch AlCl3 5% trong methanol 70%, lắc đều

Mẫu trắng thử: Lấy chính xác 1 ml dung dịch I cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm chính xác 4,075 ml methanol 70%, lắc đều

Mẫu thử: Lấy chính xác 1 ml dung dịch I bằng micropipet, cho vào ống nghiệm

có nắp vặn, thêm chính xác 4 ml methanol 70% và 75 l dung dịch AlCl3 5% trong

Dung dịch cao phối

Chiết bằng MeOH 70% trong dụng cụ soxhlet đến khi dịch chiết hết màu

Định mức 250 ml bằng MeOH 70%

methanol 70%, lắc đều (tiến hành lặp 3 mẫu thử tương tự với mỗi mẫu chiết cao phối I

để lấy giá trị trung bình)

- Định lượng hàm lượng flavonoid toàn phần có trong cao phối II:

Mẫu trắng: methanol 70%

Mẫu chuẩn: Thêm vào ống nghiệm chứa 60 µg chuẩn rutin đã chuẩn bị ở trên chính xác 5 ml methanol 70% và 75 l dung dịch AlCl3 5% trong methanol 70%, lắc đều

Mẫu thử: Lấy chính xác 0,625 ml dung dịch II bằng micropipet, cho vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm chính xác 4,375 ml methanol 70% và 75 µl dung dịch AlCl35% trong methanol 70%, lắc đều (tiến hành lặp 3 mẫu thử tương tự với mỗi mẫu chiết cao II để lấy giá trị trung bình)

Mẫu trắng thử: Lấy chính xác 0,625 ml dung dịch II cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm chính xác 4,450 ml methanol 70%, lắc đều

- Tất cả các mẫu đều để ở nhiệt độ phòng lạnh, đậy kín ống nghiệm, sau 30 phút tiến hành đo, thỉnh thoảng lắc nhẹ cho phản ứng xảy ra hoàn toàn

- Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu ở đỉnh hấp thu cực đại max= 422 nm - 424 nm trên máy UV – Visible Spectrophotometre, dùng methanol 70% làm mẫu trắng để chỉnh máy về 0

- Lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin có trong chế phẩm được tính theo công thức sau:

m

n d m A

A A

c

t t

410

A’t : Độ hấp thu mẫu trắng thử

Ac : Độ hấp thu mẫu chuẩn

mc : Khối lượng chất chuẩn (µg)

d : Độ tinh khiết của chất chuẩn

m : Khối lượng cao phối cần định lượng đã trừ ẩm (g)

n : độ pha loãng

3.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng chế phẩm

2 lần cân không quá 0,5 mg) Quy trình được lặp lại 3 lần

Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở 500 - 600oC cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen) trong 4 giờ Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm Cân và ghi lại lượng cân

Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 2 giờ nữa

Tiếp tục làm như vậy đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chén có tro

chênh lệch không quá 0,5 mg Quy trình được lặp lại 3 lần

3.3.2.4 Định tính thành phần hóa thực vật có trong chế phẩm bằng phương pháp hóa học

Sử dụng các phản ứng hóa học đặc trưng để khảo sát các hợp chất có trong cao

và chế phẩm dựa trên các hợp chất có trong các dược liệu ban đầu

- Định tính hợp chất flavonoid:

Lấy 3 g bột chế phẩm, chiết siêu âm 15 phút với 20 ml MeOH, lọc Dịch lọc được cô đến cắn Hòa cắn với 15 ml ethanol, siêu âm cho tan hết cắn, lọc Dịch lọc được dùng để thực hiện các phản ứng định tính hợp chất flavonoid có trong chế phẩm