ỨNG DỤNG VI SINH VẬT NHẰM GIẢM HÀM LƯỢNG NITRATE TRONG DƯA MUỐI CHUA

Thí nghiệm được bắt đầu bằng việc tiến hành thu thập các mẫu dưa cải trên thị trường, sau đó tiến hành xác định hàm lượng nitrate theo ngày ủ chua bằng phương pháp so màu với Natri salic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG VI SINH VẬT NHẰM GIẢM HÀM LƯỢNG

NITRATE TRONG DƯA MUỐI CHUA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG VI SINH VẬT NHẰM GIẢM HÀM LƯỢNG

NITRATE TRONG DƯA MUỐI CHUA

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS NGUYỄN TIẾN THÀNH NGUYỄN THỊ ÁNH CHÂU ThS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG

Tháng 6/2013

LỜI CÁM ƠN

Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay, em đã nhận được rất nhiều

sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Ban giám hiệu nhà trường, quý Thầy Cô ở Bộ môn Công Nghệ Sinh học – Trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và hoàn thành tốt đề tài này

Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Tiến Thành, ThS Trương Phước Thiên Hoàng cùng với tri thức và tâm huyết của mình đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập cũng như quá trình thực hiện đề tài, tận tâm hướng dẫn em qua từng buổi nói chuyện, thảo luận về các vấn đề trong đề tài cũng như trong cuộc sống Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của thầy cô

em nghĩ đề tài này của em rất khó có thể hoàn thiện được Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy cô

Để có được thành công bước đầu như ngày hôm nay, em cũng xin gửi lời cảm

ơn chân thành tới:

Cô Nhã Trầm đã tận tâm dìu dắt, hỗ trợ lớp 09SH trong suốt bốn năm qua

KS Trương Thị Ngọc Hân, KS Nguyễn Tường Ngọc Tú, KS Nguyễn Phan Thành, anh Tuấn đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Bạn Huy, Pháp, Quý, Đô, nhóm K8 đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Hai bạn Hải và Vân lớp DH12SH cũng đã nhiệt tình giúp đỡ tôi rất nhiều

Cuối cùng tôi cũng xin cảm ơn các anh chị khoá trước và tập thể lớp DH09Sh

đã đóng góp, động viên giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này

Xin chân thành cảm ơn

Tp Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013 Nguyễn Thị Ánh Châu

TÓM TẮT

Dưa cải muối chua là thức ăn phổ biến và rất được ưa chuộng tại Việt Nam Theo Hải Yến và Xuân Tươi (2013), sản phẩm này rất có triển vọng đối với thị trường trong nước cũng như xuất khẩu sang các nước Vì vậy, đòi hỏi sản phẩm không những đạt chất lượng cao mà phải an toàn Do đó, đề tài được thực hiện nhằm mục đích phân lập, bổ sung vi khuẩn làm giảm hàm lượng nitrate trong dưa cải giúp hoàn thiện, nâng cao chất lượng sản phẩm và tăng hiệu quả kinh tế Từ đó góp phần định hướng cho các ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp chế biến thực phẩm

Thí nghiệm được bắt đầu bằng việc tiến hành thu thập các mẫu dưa cải trên thị trường, sau đó tiến hành xác định hàm lượng nitrate theo ngày ủ chua bằng phương pháp so màu với Natri salicylate Từ 10 mẫu dưa cải khác nhau được thu thập quanh khu vực Thủ Đức và các vùng lân cận tiến hành phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải nitrate trên môi trường đặc trưng Giltay chứa cơ chất là KNO3, kết hợp với kiểm tra các đặc tính sinh hóa của các chủng phân lập được Cuối cùng tiến hành muối dưa cải có bổ sung chủng vi khuẩn có khả năng khử nitrate cao nhất và so sánh hàm lượng nitrate với các mẫu đối chứng

Kết quả sau khi khảo sát các mẫu dưa cải cho thấy hàm lượng nitrate trong dưa cải vượt ngưỡng cho phép của Tổ chức Sức khỏe Thế giới (WHO) (2.000 – 5.000 mg/kg,so với ngưỡng cho phép của WHO về hàm lượng nitrate có trong rau, củ từ 60 – 1.500 mg/kg) ở các ngày thứ nhất, hai và ba trong thời gian lên men

Quá trình phân lập các chủng vi sinh phản nitrate đã phân lập được 6 chủng có khả năng khử nitrate trên môi trường Giltay và tuyển chọn 2 chủng có khả năng khử nitrate cao khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể nitrate

Cuối cùng khi bổ sung hai chủng vi khuẩn trên vào các mẫu dưa cải cho thấy hàm lượng nitrate thấp hơn so với mẫu không bổ sung vi khuẩn Trong đó mẫu bổ sung kết hợp 2 chủng vi khuẩn chiếm ưu thế cao nhất nhưng chất lượng cảm quan không tốt bằng mẫu đối chứng

Từ khóa: muối chua dưa cải, phương pháp so màu với Natri salicylate, vi khuẩn khử nitrate

SUMMARY

The subject: “Application of beneficial microorganisms to reduce the nitrate content in fermented cabbage” at the laboratory of the Research Institute of Biotechnology and Environment, Nong Lam University, from December 2012 to May 2013 Advisors: Dr Nguyen Tien Thanh

ME Truong Phuoc Thien Hoang

The study was carried out to apply beneficial bacteria in reducing nitrate concentration in fermented cabbage The strains of beneficial bacteria ware isolated and added in fermented cabbage to evaluate the nitrate reduction efficiency during the fermentation process The samples were collected from households and retailers in some markets in Thu Duc area for further fermentation procedure evaluation and nitrate level determination The total of 10 samples collected from the market were use

to determine the nitrate concentration using color comparison with sodium salicylate The strains of nitrate-reducing bacteria were isolated and cultured on specific media Giltay containing KNO3, combining with biochemical characteristics testing of the isolated strains After that, the cabbage was fermented with additional nitrate-decomposing bacteria and the nitrate concentration was compared with the control treatment

The results showed that, the nitrate concentration in 10 collected samples in the survey varied from 2000 – 5000 mg/kg exceeded the allowable level of WHO (60 –

1500 mg/kg) on the first, second and the third days of fermentation The results of isolation have collected 6 strains capable of decomposing nitrate in Giltay media and 2 strains with very high nitrate decomposing ability were selected Finally, adding 2 selected strains in the fermentation process showed lower nitrate level compared to the control treatment and the lowest nitrate level was found in the treatment which was added both 2 nitrate-decomposing bacterial trains

Keyword: Color comparison with Sodium salicylate, Fermented cabbage, Nitrate Reducing Bacteria, Photometric method

MỤC LỤC

Trang

Lời cám ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu nguyên liệu 3

2.1.1 Cải bẹ 3

2.1.1.1 Thành phần hoá học của cải bẹ 3

2.1.1.2 Tính chất của cải bẹ 5

2.1.1.3 Tính chất công nghệ 6

2.1.1.4 Têu chuẩn chọn nguyên liệu 6

2.1.2 Củ hành tím (Allium schoenoprasum) 6

2.1.3 Ớt (Capsicum frutescens L.) 6

2.1.4 Tỏi (Allium sativum L.) 7

2.1.5 Muối ăn 7

2.1.6 Đường 8

2.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình muối chua 8

2.2.1 Quá trình lên men tổng quát của vi khuẩn lactic 8

2.2.1.1 Các dạng lên men lactic 8

2.2.1.2 Các giai đoạn trong quá trình lên men lactic 10

2.2.2 Vi sinh vật trong lên men lactic 10

2.2.2.1 Vi khuẩn 10

2.2.2.2 Nấm men 12

2.2.2.3 Nấm mốc 12

2.3 Nitrate và Phản ứng phản nitrate 12

2.3.1 Nitrate 12

2.3.1.1 Đặc điểm và tính chất 12

2.3.1.2 Nguồn gốc của Nitrates (NO3) 13

2.3.1.3 Nitrate trong thực vật 13

2.3.1.4 Ảnh hưởng của nitrate tới sức khỏe và tuổi thọ con người, động vật 14

2.3.2 Phản ứng phản nitrate hóa 15

2.3.2.1 Các vi sinh vật khử nitrate 15

2.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình khử nitrate của vi khuẩn 16

2.3.3 Một số phương pháp định lượng nitrate 16

2.3.3.1 Phương pháp thể tích 17

2.3.3.2 Phương pháp so màu 17

2.3.3.3 Phương pháp dòng chảy (FIA) 19

2.3.3.4 Phương pháp cực phổ 19

2.3.3.5 Phương pháp đo khí 20

2.3.3.6 Phương pháp xác định tổng NO3- và NO2- 20

2.4 Quy trình chế biến dưa cải 21

2.4.1 Quy trình chế biến dưa cải truyền thống 21

2.4.2 Quy trình chế biến dưa cải công nghiệp 22

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Thời gian địa điểm 25

3.2 Khảo sát quy trình muối chua dưa cải 25

3.3 Khảo sát hàm lượng nitrate trong mẫu dưa cải vào các thời điểm khác nhau 25

3.3.1 Nguồn gốc mẫu thí nghiệm 25

3.3.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 25

3.3.3 Chuẩn bị mẫu 26

3.3.4 Xác định hàm lượng nitrate bằng phương pháp so màu với Natri salicylate 28

3.4 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng khử nitrate 28

3.4.1 Vật liệu 28

3.4.2 Phương pháp phân lập 29

3.4.3 Phương pháp kiểm tra sinh hóa của các chủng vi sinh vật phân lập được 29

3.5 Bổ sung vi khuẩn khử nitrate vào quy trình muối chua dưa cải 30

3.5.1 Quy trình sản xuất Cải muối chua dự kiến 30

3.5.1.1 Quy trình dự kiến 30

3.5.1.2 Thuyết minh quy trình 30

3.5.2 Bố trí thí nghiệm 31

3.5.2.1 Thí nghiệm khảo sát khả năng khử nitrate của các chủng M1, M2 31

3.5.2.2 Khảo sát hàm lượng nitrate dưa cải 32

3.5.2.3 Phương pháp đánh giá các thông số của môi trường thí nghiệm 32

3.5.2.4 Đánh giá chỉ tiêu vi sinh 32

3.5.2.5 Theo dõi sự thay đổi và đánh giá cảm quan 33

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Kết quả khảo sát quy trình muối chua dưa cải truyền thống 34

4.2 Kết quả khảo sát hàm lượng nitrate có trong dưa cải tại các điểm khác nhau 35

4.3 Kết quả quả phân lập các chủng vi sinh vật khử nitrate 36

4.3.1 Kết quả quả phân lập và làm thuần 36

4.3.2 Kết quả định danh vi khuẩn bằng các phản ứng sinh hóa 37

4.3.2.1 Kết quả nhuộm Gram 37

4.3.2.2 Kết quả kiểm tra khả năng khử nitrate của 6 chủng phân lập được 38

4.3.2.3 Kết quả kiểm tra sinh hóa chủng M1 và M2 39

4.4 Bổ sung vi khuẩn khử nitrate vào quy trình muối chua dưa cải 40

4.4.1 Hàm lượng nitrate trong các mẫu dưa cải có bổ sung vi khuẩn 40

4.4.2 Các thông số môi trường 42

4.4.2.1 Thông số pH trong quá trình thí nghiệm 42

4.4.2.2 Hàm lượng acid tổng số trong quá trình thí nghiệm 43

4.4.2.3 Mật độ vi khuẩn khử nitrate ở sau 24 và 120 giờ lên men 44

4.4.3 Kết quả các chỉ tiêu vi sinh 45

4.4.4 Sự thay đổi cảm quan và đánh giá cảm quan 46

4.5 Đề xuất quy trình muối chua dưa cải có hàm lượng nitrate đạt giới hạn an toàn 49

4.5.1 Sơ đồ quy trình 49

4.5.2 Giải thích quy trình 50

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC

FAO Food and Agriculture Organization

MR – VP Methyl Red, Voges - Proskauer

UV – VIS Ultraviolet - Visible

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của cải bẹ (% khối lượng) 4

Bảng 2.2 Thành phần các chất màu trong 100g nguyên liệu 6

Bảng 2.3 Thành phần chất dinh dưỡng trong 100g phần ăn được của tỏi 7

Bảng 2.4 Chỉ tiêu về đường saccharose sử dụng trong sản xuất 8

Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu và nơi lấy mẫu 25

Bảng4.1 Thống kê kết quả khảo sát (%) 34

Bảng 4.2 Mật độ vi khuẩn tổng số trong mẫu phân lập 36

Bảng 4.3 Đặc tính các khuẩn lạc phân lập trên môi trường Giltay 37

Bảng 4.4 Đặc điểm nhuộm Gram của các chủng phân lập được 38

Bảng 4.5 Một số phản ứng sinh hóa dùng để định danh chủng M1 và M2 39

Bảng 4.6 Hàm lượng nitrate trong thời gian lên men 40

Bảng 4.7 Sự tạo thành acid tổng số trong thời gian muối chua 43

Bảng 4.8 Mật độ vi khuẩn khử nitrate sau 24 và 120 lên men 44

Bảng 4.9 Kết quả các chỉ tiêu đánh giá vi sinh sau 120 giờ lên men 45

Bảng 4.10 Những thay đổi cảm quan trong quá trình muối dưa sau 48 giờ 47

Bảng 4.11 Những thay đổi cảm quan trong quá trình muối dưa sau 120 giờ 48

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chế biến dưa cải truyền thống 21

Hình 2.2 Quy trình chế biến dưa cải tại các hộ gia đình ở làng Tân Lược 22

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình chế biến dưa cải công nghiệp 24

Hình 3.1 Quy trình ly trích nitrate từ dưa cải chua theo phương pháp nghiền 27

Hình 3.2 Phân lập vi khuẩn phản nitrtate trên môi trường Giltay 29

Hình 3.3 Sơ đồ quy trình muối chua dưa cải dự kiến 30

Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 32

Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện tỷ lệ phần trăm lượng người sử dụng dưa cải 35

Hình 4.2 Sự biến thiên nồng độ nitrate trong dưa cải theo thời gian 35

Hình 4.3 Kết quả nhuộm Gram 38

Hình 4.4 Kết quả kiểm tra khả năng khử nitrate 38

Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện sự biến thiên pH của các mẫu dưa cải theo thời gian 42

Hình 4.6 Sơ đồ quy trình muối chua dưa cải đạt tiêu chuẩn về hàm lượng nitrate 49

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Dưa cải muối chua hay còn gọi là dưa cải muối là một món ăn dân dã, quen

thuộc ở Việt Nam đặc biệt là trong những ngày lễ Tết được chế biến theo cách thức lên men kị khí với nguyên liệu chính là rau cải (cải bẹ) Dưa cải chua còn được bày bán khá phổ biến ở các điểm bán lẻ cho đến các chợ lớn, quán ăn, nhà hàng…Đây là món

ăn kèm, giải ngán cho những món quá nhiều dầu mỡ Dưa cải muối thường kích thích

vị giác (do có vị chua), nên tạo sự ngon miệng và thèm ăn Ngoài ra trong môi trường acid của thực phẩm lên men, các khoáng chất như canxi, sắt dễ hấp thụ vào cơ thể hơn Hấp thu tiêu hóa thức ăn tốt hơn nhờ tác dụng của men vi sinh vật, gluxit dạng phức hợp được cắt nhỏ thành các đường mạch ngắn, chất đạm được cắt nhỏ thành các acid amin dễ tiêu hóa hấp thụ Giúp tăng sức đề kháng: cung cấp vi khuẩn lactic - loại vi khuẩn có lợi trong đường ruột Quá trình lên men còn tạo ra các chất kháng thể, chất kháng sinh ức chế vi khuẩn có hại Dưa chua cũng rất giàu Vitamin C là một chất chống oxy hóa rất tốt

Bên cạnh những mặt có lợi mà món ăn dân dã, đơn giản này mang lại thì cũng luôn tìm ẩn những yếu tố gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng Hàng năm vẫn có nhiều trường hợp ngộ độc khi sử dụng món ăn dân dã này vì nhiều lý do khác nhau Người bị ngộ độc, nhẹ thì đau bụng, tiêu chảy, nặng thì phải nhập viện điều trị (Hồ

Đăng Khoa và Tuân Nguyễn, 2012)

Ngoài ra nếu muối dưa chưa đạt độ chín có thể còn vi khuẩn gây bệnh, ký sinh trùng gây nhiễm trùng Đối với các loại rau cải thường sử dụng phân đạm urê để chăm bón, quá trình lên men sẽ khiến hàm lượng nitrate có trong rau bị khử thành nitrite Hàm lượng nitrite tăng cao trong một vài ngày đầu và giảm dần khi dưa đã vàng và tăng cao trở lại khi dưa bị hư hỏng (Vương Văn Quân, 2007) Khi ăn dưa muối chưa đạt, hàm lượng Nitrate dư có thể gây ra các bệnh về hồng cầu, dễ thấy nhất là bệnh xanh da ở trẻ nhỏ Theo Bạch Văn Cam, Bệnh viện Nhi Đồng 1, hàm lượng nitrate cao trong nước uống và thực phẩm sẽ làm trẻ sơ sinh bị nhẹ cân, chậm phát triển, nhũn xương Khi nitrate vào cơ thể sẽ bị hệ thống men khử thành nitrite Nitrite có khả năng kết hợp với hồng cầu trong máu sẽ gây bệnh thiếu ô-xy trong máu và bệnh máu trắng

(trích dẫn bởi Kim Oanh, 2003) Do tính chất nguy hiểm đến sức khoẻ của con người

mà việc loại bỏ hoặc làm giảm nitrate trong thực phẩm trước khi đưa vào sử dụng rất được quan tâm Do đó xác định được hàm lượng của nó là cơ sở để đánh giá chất lượng thực phẩm cũng như việc cần có một phương pháp nào đó để có thể làm giảm hàm lượng Nitrate có trong dưa muối Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài :

“Ứng dụng vi sinh vật có lợi nhằm giảm hàm lượng nitrate trong dưa muối chua” được thực hiện

1.2 Yêu cầu

Làm giảm hàm lượng nitrate trong dưa cải bằng vi sinh vật Từ đó, đề xuất quy trình muối chua dưa cải đạt tiêu chuẩn về hàm lượng nitrate nhằm hoàn thiện chất lượng và nâng cao hiệu quả kinh tế của sản phẩm dưa chua

1.3 Nội dung đề tài

Khảo sát quy trình muối dưa cải truyền thống

Khảo sát hàm lượng nitrate có trong mẫu dưa cải được bán trên thị trường Phân lập vi khuẩn khử nitrate từ dưa cải trên môi trường chuyên biệt tạo cơ cở

để bổ sung vi khuẩn đã phân lập được vào quy trình ủ chua dưa cải

Bổ sung vi khuẩn khử nitrate vào quy trình muối chua dưa cải

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu nguyên liệu

Gồm các giống cải như cải Đông Dư, cải Lạng Sơn…

Cải bẹ là loại cây đã được trồng từ lâu và rất phổ biến khắp mọi nơi trên đất nước ta, là loại cải có cuống dẹp, lá to có màu xanh thẫm, chịu được rét cao, thường được thu hoạch lúc đã lớn để muối chua

Cải bẹ là là loại rau ăn lá và thân được sử dụng để chế biến nhiều món ăn khác nhau như: xào, luộc, muối chua Cải bẹ rất dễ trồng và cũng chóng thu hoạch, nói chung sau gieo khoảng 30 – 40 ngày là có thể thu hoạch được

Về mặt cung cấp năng lượng thì cải bẹ là loại rau có độ năng lượng tương đối thấp so với các loại rau củ khác

Mặt khác, cải bẹ lại rất giàu hàm lượng chất khoáng, đặt biệt có nhiều canxi, photpho, và nhiều vitamin C Nguồn dinh dưỡng chính đối với các giống rau cải là các loại muối khoáng và vitamin C

Khác với các loại rau quả khác cải bẹ chỉ có ứng dụng duy nhất là muối dưa, rất

ít khi dùng nấu canh hay xào nấu dưa cải bẹ là một trong những sản phẩm muối chua phổ biến nhất nước ta

2.1.1.1 Thành phần hoá học của cải bẹ

Thành phần hóa học của cải luôn thay đổi phụ thuộc vào các yếu tố: giống, điều kiện gieo trồng, mức độ chin, quá trình thu hoạch, vận chuyển và bảo quản Nói chung thành phần của cải gồm các chất khác nhau như: nước, gluxit, (đường, tinh bột, xenlulose, pectin, chất chát, chất màu, các acid hữu cơ, các chất chứa nitơ trong đó kể

cả protein, các chất khô, các vitamin, các enzyme và muối khoáng…)

Hiện nay có rất ít công trình nghiên cứu về rau cải bẹ Theo Nguyễn Văn Thắng

và Trần Khắc Thi (1996), thành phần hóa học của rau cải bẹ thể hiện trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của cải bẹ (% khối lượng)

Thành phần hóa học Nước Protein Đường Chất xơ Tro Vitamin, mg %

Nước tự do là loại nước thường được chứa trong tế bào, là dung môi hoà tan của các chất như đường, acid hữu cơ, các muối khoáng và các chất khác Chúng dễ bị tách ra khỏi tế bào khi phơi hoặc sấy, số lượng nước tự do ở trong rau nhiều hơn so với

số lượng nước liên kết

Nước liên kết chiếm không quá 6% khối lượng, là phần nước tham gia vào các thành phần keo của hệ mixen keo và đồng thời là lượng nước chứa các ion hoặc phân

tử của các chất hoà tan Chúng ta khó làm cho nước liên kết tách khỏi tế bào của rau quả Ở các loại rau chứa nhiều nước tự do thì nước bốc hơi càng mạnh

Hàm lượng nước ở trong rau phụ thuộc vào mức độ hút nước của các chất keo

và mức độ ngấm nước của chúng Cho nên khả năng chứa nước ở mô tế bào của rau quả phụ thuộc vào từng loại giống, mức độ chín, thời gian và điều kiện bào quản trước khi chế biến

Thành phần của nước là chỉ tiêu quan trọng trong việc bảo quản nguyên liệu, thời gian và khả năng bảo quản của nguyên liệu phụ thuộc rất nhiều vào hàm lượng nước vì nó là dung môi hòa tan các chất hữu cơ, chất khoáng và các chất khác Trong quá trình sống nếu hàm lượng nước trong rau mất đi từ 5 – 7% thì rau sẽ bị héo, ảnh hưởng đến quá trình trương, co nguyên sinh phá vỡ sự trao đổi chất bình thường trong

tế bào mặt khác nước còn kích thích sự hoạt động của các men ở trong rau quả

Thành phần nước cũng là chỉ tiêu quan trọng trong giai đoạn cắt nhỏ nguyên liệu chuẩn bị cho quá trình muối chua, lượng nước càng nhiều càng làm dễ gãy nát,

thất thoát dịch bào gây tổn thất đường – nguyên liệu của quá trình lên men Chính vì vậy cần phải có giai đoạn làm héo nguyên liệu để giảm hàm lượng nước trước khi cắt nhỏ

 Gluxit

Là thành phần chủ yếu trong hàm lượng chất khô của rau cải (cũng như các loại rau), gluxit là nguồn dự trữ năng lượng cho các quá trình sống của rau tươi khi bảo quản Vì lượng chất khô trong rau không nhiều nên lượng gluxit cũng không nhiều (4,5%), độ sinh năng lượng của rau không lớn lắm (100 g rau cho 25-40 kcal)

Mặc khác, gluxit còn là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của sản phẩm rau Gluxit bao gồm: đường, tinh bột, chất xơ như: inulin, xenlulose, hemixenlulose, và các chất khác

Đường: trong rau cải hàm lượng đường từ 0,8 - 12%, loại thường gặp nhất là Glucose, frutose, và cả saccharose Hàm lượng đường quyết định chất lượng của rau, đường càng nhiều thì chất lượng rau càng tăng, rất tốt cho quá trình lên men sau này

Tinh bột: hầu hết các loại rau có hàm lượng tinh bột rất ít chỉ khoảng gần 1% Xenlulose: là thành phần chủ yếu của rau cải xanh có nhiệm vụ cấu tạo nên màng tế bào và bảo vệ rau quả Hàm lượng xenlulo trong rau xanh khoảng 0,5 – 2%, xenlulo có ảnh hưởng đến mùi vị, trạng thái và độ tiêu hoá của rau cải Ở rau càng mềm hàm lượng xenlulo thấp và dễ tiêu hoá có mùi vị thơm ngon

Hemixenlulose: là một loại polysaccharide cao phân tử, nó là loại gluxit dễ bị thuỷ phân hơn xenlulose Tham gia vào việc xây dựng các mô thực vật và là nguồn chất dự trữ

 Các chất khác: như pectin, acid hữu cơ, các chất chát thuỷ phân và ngưng tụ, sắc tố vitamin, chất chứa nitơ, chất thơm, chất khoáng cũng có trong thành phần của rau cải nhưng với hàm lượng thấp

thật của sản phẩm Màu này được quyết định chủ yếu bởi hàm lượng Beta carotene, lutein và zeaxanthin và thường thì sản phẩm có màu vàng

Bảng 2.2 Thành phần các chất màu trong 100g nguyên liệu

2.2.2.1 Tiêu chuẩn chọn nguyên liệu

Nên dùng loại nguyên liệu cải bẹ có hàm lượng đường cao, hàm lượng nitrate thấp Không nên dùng bắp cải quá non hoặc quá già, mô lá không quá giòn để sản phẩm đỡ gãy nát

2.1.2 Củ hành tím (Allium schoenoprasum)

Củ hành tím được bổ sung vào quá trình muối chua nhằm mục đích:

Hoàn thiện: làm tăng hương vị cho sản phẩm

Bảo quản: do hành tím được cho là có chất kháng sinh có tác dụng bảo quản sản phẩm Trong thành phần của nó có chứa chất alliin bản chất của một sulfoxyde là một dẫn xuất của amino acid cysteine Khi hành bị cắt và làm nát thì enzyme alliinase sẽ

làm biến đổi alliin thành allicin, một chất kháng sinh

2.1.3 Ớt (Capsicum frutescens)

Ớt cay được xem là cây gia vị nên có mức tiêu thụ ít, gần đây ớt trở thành một mặt hàng có giá trị kinh tế vì ớt không chỉ là gia vị tươi mà còn sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm Năng suất ớt tươi 7 - 10 tấn/ha

2.1.4 Tỏi (Allium sativum)

Trong tỏi có chứa iod và tinh dầu (100kg tỏi chứa 60 ÷ 200 g tinh dầu) Thành phần chủ yếu của tinh dầu tỏi là allycin, allicin là một chất kháng sinh có tác dụng diệt

vi khuẩn rất mạnh Trong tỏi tươi không có allycin mà chỉ chứa allyn (một acid amin)

Do tác dụng của enzyme alynase có sẵn trong tỏi nên khi bảo quản sẽ cho ra allycin Allycin với nồng độ 1/8500 ÷ 1/125000 đủ sức ức chế sự sinh trưởng của các vi khuẩn

Staphylococcus, thương hàn, tả, lị, bạch hầu…Do đó bổ sung tỏi với mục đích:

Bảo quản: ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật có hại

Hoàn thiện: là một gia vị làm tăng hương vị cho sản phẩm

Bảng 2.3 Thành phần chất dinh dưỡng trong 100g phần ăn được của tỏi

Muối ăn có tính sát trùng nhẹ, ức chế một số vi sinh vật nhưng không diệt được

vi sinh vật ưa muối

Muối ăn góp phần vào việc tạo vị cho sản phẩm Trong sản phẩm rau muối chua, muối ăn chủ yếu là gây ra hiện tượng co nguyên sinh ở tế bào rau làm dịch bào trong rau tiết ra Trong dịch bào có chứa đường và các chất dinh dưỡng khác sẽ tạo điều kiện tốt cho vi khuẩn lactic hoạt động và phát triển tạo sự lên men tốt, làm sản phẩm đạt chất lượng cao Vì vậy việc bổ sung NaCl với mục đích: bảo quản, hoàn thiện, khai thác

Thành phần chủ yếu của muối ăn là NaCl, ngoài ra còn có những tạp chất như các khoáng chất không tan, các ion Ca2+, Mg2+, Fe3+ Lượng nước trong muối ăn thay

đổi rất nhiều, nếu độ ẩm không khí lớn hơn 75% thì muối ăn hút nước nhiều Trong muối ăn có nhiều CaCl2, MgCl2, độ hòa tan của hai muối này lớn hơn độ hòa tan của NaCl Khi nhiệt độ tăng thì độ hòa tan của hai muối này rất cao Do đó, nếu hàm lượng của hai muối này chiếm tỉ lệ cao trong muối ăn thì sẽ làm giảm độ hòa tan của muối NaCl Nếu như trrong muối ăn có từ 0,15 ÷ 0,18% muối CaCl2, MgCl2 thì muối ăn sẽ

có vị đắng

Tiêu chuẩn muối ăn: Sử dụng trong sản phẩm là hàm lượng ion Ca2+, Mg2+ không vượt quá 0,7% (Ca2+ = 0,6 %, Mg2+ = 0,1%)

2.1.6 Đường cát trắng (đường tinh luyện RE)

Đường được sản xuất từ củ cải đường hoăc mía đường, ở nước ta là một nước nhiệt đới nên đường được sản xuất từ cây mía Trong quá trình muối chua đường có tác dụng sau:

Hoàn thiện: Tạo hương vị hài hòa cho sản phẩm

Bảo quản: Kìm hãm một số vi sinh vật có hại

Chuẩn bị: Là môi trường tốt cho nấm men và vi khuẩn phát triển Đường có thành phần chủ yếu là saccharose, có cấu tạo phân tử là C12H22O11 Đường có dạng tinh thể màu trắng, rất dễ tan trong nước với tỉ lệ nước đường là 1 : 2 Đường không tan trong dung môi hữu cơ

Bảng 2.4 Chỉ tiêu về đường sử dụng trong sản xuất

Thành phần, % Đường kính loại I Đường kính loại II

2.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình muối chua

2.2.1 Quá trình lên men tổng quát của vi khuẩn lactic

2.2.1.1 Các dạng lên men lactic

Lên men lactic là một trong những quá trình sinh hoá phổ biến trong thiên nhiên,

đó là quá trình chuyển hoá các chất gluxit thành acid lactic nhờ hoạt động sống trực tiếp của hệ vi sinh vật lactic Trong thiên nhiên vi khuẩn lactic tồn tại dưới hai dạng:

 Nhóm vi khuẩn lactic đồng hình: có khả năng phân huỷ đường đơn giản và tạo nên acid lactic, đây là quá trình lên men lactic đồng hình:

CH3COCOOH + 2H Lacticodehydrogenase CH3CHOHCOOH

 Nhóm vi khuẩn lactic dị hình: tạo ra quá trình lên men phức tạp hơn, gọi là lên men lactic dị hình, chúng tạo nên trong môi trường ngoài acid lactic còn có nhiều sản phẩm phụ: acid aceitc, rượu etylic, CO2, H2, một số chất thơm như diacetyl ester

C6H12O6 CH3CHOHCOOH + COOHCH2CH2COOH + CH3COOH + CH3CH2OH

+ CO2 + H2

Số lượng các sản phẩm phụ này hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh Nói chung acid lactic thường chiếm 40% lượng đường đã phân huỷ, acid succinic gần 20%, rượu etylic khoảng 10% và các khí vào khoảng 20% Đôi khi lượng khí ít hơn và thay vào đó là lượng acid formic

Lên men lactic thì cần có sự lên men đồng thời của vi khuẩn lactic đồng hình và dị hình Vì quá trình lên men dị hình ngoài việc tạo thành acid lactic còn tạo các sản phẩm phụ như acid và rượu sinh ra ester có mùi thơm làm cho sản phẩm có hương vị đặc trưng

Acid lactic tích tụ lại có tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật có hại, nhất là vi sinh vật gây thối rữa Do đó, rau quả muối chua có thể giữ được một vài tuần đến một tháng Mặt khác, acid lactic tạo môi trường acid cho sản phẩm, nên lượng vitamin C ít bị hao hụt hơn so với các dạng sản phẩm khác của rau quả Các vi khuẩn lactic trong khi thực hiện sự lên men lactic còn có khả năng tổng hợp vitamin B1, do

đó làm tăng thêm giá trị dinh dưỡng cho sản phẩm rau quả muối chua (Trần Minh Tâm, 1998)

2.2.1.2 Các giai đoạn trong quá trình lên men lactic

Quá trình lên men lactic trong sản phẩm rau quả muối chua có thể chia thành ba giai đoạn:

 Giai đoạn đầu: do muối ăn tạo nên áp suất thẩm thấu lớn nên đường và các chất dinh dưỡng khuyếch tán vào muối và bắt đầu có sự hoạt động của vi khuẩn lactic và một số vi khuẩn khác Trên bề mặt nước muối xuất hiện bọt khí, do hoạt động của các

vi sinh vật có khả năng sinh khí Cần kết thúc quá trình này càng nhanh càng tốt, vì nếu không quá trình lên men sẽ là lên men tạp Trong giai đoạn này, lượng acid lactic sản sinh ra với lượng rất nhỏ (<1%)

 Giai đọan hai: các vi khuẩn lactic phát triển rất mạnh mẽ và acid sinh ra tích tụ nhiều Phần lớn vi khuẩn gây thối bị ức chế với độ pH của môi trường giảm xuống còn

3 - 3,5 Giai đoạn này là giai đoạn rất quan trọng của quá trình lên men lactic với sản phẩm tích tụ được lượng acid cao và tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm

 Giai đoạn ba: khi acid lactic bị tích tụ với lượng khá cao thì các vi khuẩn cũng

bị ức chế Khi ấy nấm men và nấm mốc có thể phát triển mạnh và làm giảm chất lượng của sản phẩm Vì thế, trong giai đoạn này cần ngăn ngừa các hiện tượng trên bằng cách bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ thấp (khoảng 2 – 4oC) hoặc bảo quản trong điều kiện yếm khí hay bảo quản bằng các hóa chất diệt khuẩn như sorbic, natri benzoate Sự lên men lactic phải trải qua nhiều giai đoạn tạo thành các sản phẩm trung gian, trong điều kiện yếm khí acid pyruvic chuyển thành acid lactic (Nguyễn Thị Hiền, 2004)

2.2.2 Vi sinh vật trong lên men lactic

Rất nhiều sản phẩm thực phẩm được thu nhận trên cơ sở vi sinh vật, trong đó quá trình muối chua rau quả là một trong những quá trình mà vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn giữ vai trò hỗ trợ rất quan trọng

2.2.2.1 Vi khuẩn

 Nhóm vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic được Pasteur tìm ra từ sữa chua, nó có dạng hình cầu, hình que ngắn Ít thấy có sự hiện diện của vi khuẩn trong nước, đất mà do nó có nhiều chất dinh dưỡng khi phát triển nên thường gặp trong sữa, sản phẩm của sữa, thực vật và xác thực vật đang bị phân giải, cả trong ruột và một vài lớp màng nhày của người và động vật

Có thể dễ gặp vi khuẩn lactic trong môi trường tự nhiên như dưa chua, sữa chua, thức

ăn ủ cho gia súc Vi khuẩn lactic được chia thành hai nhóm:

 Nhóm vi khuẩn lên men đồng hình

Nhóm vi khuẩn này lên men đường cho sản phẩm chủ yếu là acid lactic

(khoảng 90 - 98%) bao gồm một số giống: Streptococcus lactis, Streptococcus

thermophilis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Bacterium cucumeris fermentati, Bacterium brassiceae fermentati

Giống Streptococcus: là loại giống không nha bào dạng liên cầu khuẩn Đại diện đồng hình của chúng là Streptococcus lactic, có khả năng lên men nhiều loại

đường như: glucose, lactose, maltose và hình thành được khoảng 5% acid lactic, nhiệt

độ thích hợp cho việc phát triển của nó là 30oC

Giống Lactobacillus: là giống được sử dụng rộng rãi Chúng có dạng

hình que thẳng hay hơi cong Nhiệt độ phát triển thích hợp:

Loại ưa nóng: 40 – 60oC như Lactobacillus bulgaricus

Loại ưa ấm: 28 – 35oC như Lactobacillus plantarum

 Nhóm vi khuẩn lên men dị hình

Nhóm vi khuẩn này gây lên men phức tạp hơn Chúng tạo nên trong môi trường ngoài acid lactic còn nhiều sản phẩm phụ khác như acid aceitc, rượu etylic, CO2, H2,

một số chất thơm như diacetyl ester bao gồm: Leuconostoc mesenteroides,

Lactobacillus pentoacetum, Lactobacillus brevis, Bacterium – coli arrogenes, Betabacterium breve

Giống Leuconostoc: có dạng hình cầu, nhưng trong môi trường acid tế bào dài

ra và nhọn hai đầu Trong đó loài Leuconostoc mesenteroides cùng một số vi khuẩn đồng hình khác như Lactobacillus plantarum tham gia vào việc chế biến rau muối chua

Lactobacillus pentoacetum: là loài trực khuẩn không sinh bào tử

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 30 – 35oC khi lên men glucose

Bacterium – coli arrogenes: là giống đại diện chủ yếu của lên men lactic dị hình Có

dạng hình que, không hình thành bào tử, nhiệt độ thích hợp phát triển là 35 – 38oC Sản phẩm của sự lên men của vi khuẩn này là acid lactic, rượu etylic, acid acetic, CO2,

H2 và indol

 Vi khuẩn gây thối

Đa số thuộc nhóm vi khuẩn sinh bào tử Vi khuẩn gây thối chia làm hai loại:

Loại hiếu khí: Bacillus mensentericus, Bacillus subtilis

Loại yếm khí: Bacillus putrificans, Bacillus botulinum

Các vi khuẩn gây thối hoạt động sinh ra H2S, indol, NH3 làm rau dưa bị thối Các vi khuẩn này đều có khả năng sinh bào tử, chịu nhiệt cao, có hại cho sản phẩm trong quá trình bảo quản (Nguyễn Đức Lượng, 1999)

Giống thường gặp là Saccharomyces, có tế bào hình cầu, elip, hình ống Loại được sử dụng rộng rãi là Saccharomyces cerevisiae có ý nghĩa quan trọng trong lên

men rượu và lên men lactic

2.2.2.3 Nấm mốc

Nấm mốc là tên chung chỉ các nhóm nấm không phải là nấm men , nấm lớn có quả thể Nấm mốc thuộc vi nấm, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có cấu trúc hình sợi phân nhánh, phát triển rất nhanh, tạo thành màng sợi chằng chịt gọi là hệ sợi nấm Nấm mốc là nhóm tạo khuẩn ty ở dạng bột màu xanh, vàng, trắng, đen

Là những loại vi sinh vật hiếu khí Nhiều loại nấm mốc có lợi được sử dụng trong công nghệ sản xuất các chế phẩm enzyme tổng hợp acid hữu cơ…Nhưng bên cạnh đó một số loại gây tác hại như làm mốc sản phẩm, thực phẩm có thể gây bệnh

cho người Trong và sau quá trình lên men lactic thường gặp các loại mốc: Aspergillus,

Penicillium, Aspergillus cidium lactic

và hoá trị ba thường ở dạng hydrate

Muối nitrate khan của kim loại kiềm khá bền với nhiệt (chúng có thể thăng hoa trong chân không ở 380 – 500oC) Còn các nitrate của kim loại khác dễ phân huỷ khi đun nóng Độ bền nhiệt của muối nitrate phụ thuộc vào bản chất cation kim loại

Cadimi là một kim loại kém hoạt động nên trong môi trường acid yếu có thể khử được NO3- về NO2-: NO3- + Cd(Cu) + 2H+ > NO2- + Cd2+ + H2O Dựa vào phản ứng đặc trưng này mà người ta có thể xây dựng các phương pháp khác nhau để phát hiện và định lượng nitrate

2.3.1.2 Nguồn gốc của Nitrate (NO3)

Nitrate là chất không màu, không mùi và không vị nên không thể nhận biết nếu không xét nghiệm bằng các phân tích hóa học

Nitrate (NO3) được tạo thành tự nhiên từ nitơ trong lòng đất Nitơ là một loại khí chiếm tới gần 80% bầu khí quyển và rất cần thiết cho sự sống Rễ cây hấp thụ càng nhiều nitơ thì năng xuất của mùa màng càng cao

Quá trình hình thành Nitrate là một giai đoạn không thể thiếu trong vòng tuần hoàn của nitơ trong tự nhiên (Zumft, 1997) Thực phẩm và đồ uống có chứa một hàm lượng nitrate thấp thì không có hại cho sức khỏe Cây cối hấp thụ nitrate trong đất để lấy dưỡng chất và có thể sẽ tạo một dư lượng nhỏ trong lá và quả Do tính cơ động cao, nitrate dễ dàng thấm vào nguồn nước ngầm Nếu con người và súc vật uống phải nước có nhiều nitrate sẽ dễ bị mắc các chứng bệnh về máu, đặc biệt là đối với trẻ nhỏ

(tài liệu kỹ thuật, Công ty TNHH XNK Long Thịnh)

2.3.1.3 Nitrate trong thực vật

Theo Van Duijvenboden and Matthijsen (1989) thì nhiều rau và trái cây có chứa

200 – 2500 mg/kg nitrate Hàm lượng nitrate của rau có thể bị ảnh hưởng bởi cách chế biến thực phẩm, hàm lượng phân bón và điều kiện phát triển của thực vật, đặc biệt là nhiệt độ đất và cường độ ánh sáng (Gangolli và ctv, 1994; FAO/WHO, 1995) Các loại rau như củ cải đường, rau diếp, củ cải và rau bina thường chứa hàm lượng nitrate trên

2500 mg/kg, đặc biệt là khi chúng được trồng trong nhà kính

Nhiều loại rau, củ được trồng hoặc bán ở TPHCM có hàm lượng nitrate cao vượt tiêu chuẩn cho phép của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Đây là kết quả khảo sát của nhóm nghiên cứu do thạc sĩ Nguyễn Thị Thu Vân, Khoa Công nghệ Hóa học và Dầu khí, ĐH Bách khoa TPHCM, làm chủ nhiệm được công bố vào ngày 23 -7 - 2003 (trích dẫn K Oanh, 2003)

2.3.1.4 Ảnh hưởng của nitrate trong cơ thể tới sức khỏe và tuổi thọ con người, động vật

Theo Bùi Quang Xuân và ctv (1996), dù rằng độc tính không cao, nitrate trong lương thực, thực phẩm, nước uống lại đe dọa sức khỏe và tuổi thọ con người do khả năng khử thành nitrite trong quá trình bảo quản, vận chuyển và ngay trong bộ máy tiêu hóa của chúng ta Nồng độ nitrate cao gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng vì đó là căn nguyên gây đột biến về gen, gây các bệnh ung thư và thiếu máu ở người và động vật (Bitton G, 1999)

Theo Lê Văn Khoa và ctv (1999) thì nitrate không phải là vấn đề mới Cách đây hàng trăm năm, người ta đã ghi nhận nồng độ cao của nó trong các giếng nước ăn Nhưng điều phát hiện mới là nitrate có liên quan tới sức khỏe cộng đồng gây nên 2 loại bệnh: Methaemoglobinaemia (hội chứng trẻ xanh ở trẻ sơ sinh), ung thư dạ dày ở người lớn

Methaemoglobinaemia: lần đầu tiên mối quan hệ giữa bệnh Methaemoglobine

và việc sử dụng nước uống có hàm lượng nitrate cao được phát hiện vào năm 1945 ở Jerusalem, Israel (Shuval and Gruener, 1974) Nitrate trong cơ thể con người không trực tiếp gây ra bệnh methemoglobine, nhưng chúng có thể biến thành nitrite bởi vi

khuẩn microflora đường ruột, tiếp đó hình thành Methaemoglobinaemia từ

haemoglobine làm mất khả năng vận chuyển oxy trong máu Đầu thập kỷ 50 ở Đức, người ta đã phát hiện một số bệnh ở trẻ em do nitrite gây nên Các bệnh này xảy ra ở một vùng sử dụng Spinash làm thức ăn cho trẻ em Spinash tuy là một loại rau ăn lá giàu dinh dưỡng chứa nhiều các acid amin thiết yếu, các vitamin, chất khoáng và các nguyên tố vi lượng nhưng cũng là loại rau có khả năng tích lũy nitrate cao hơn so với các loại rau khác Năm 1950 ở bang Missouri (Mỹ) rất nhiều gia súc bị chết ngạt do bệnh Methaemoglobinaemia bởi ăn cỏ có hàm lượng nitrate quá cao (Brown và Smith, 1966)

Nitrate và ung thư dạ dày: Nghiên cứu ở Columbia và Allborg, Đan Mạch, cho thấy mối tương quan giữa tỷ lệ mắc ung thư dạ dày và nồng độ nitrate nước giếng (Cuello và ctv, 1976 ; Fraser và ctv, 1980) Một nghiên cứu ở chuột đã chỉ ra rằng các hợp chất N-nitroso là nguyên nhân gây quái thai (Druckery 1966; Givelber 1969) Trong một nghiên cứu đã chứng minh là có sự gia tăng khối u ở chuột khi cho chúng

uống nước có cả hai chất nitrite và heptamethyleneimine so với khi cho riêng từng chất (Taylor và Lijinsky, 1975)

Quá trình phản nitrate hóa có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, nhưng đặc biệt mạnh trong điều kiện kỵ khí

Phản nitrate khử NO3- thành N2 theo 4 giai đoạn như sau :

NO3- → NO2- → NO (k) → N2O (k) → N2 (k) Trong đó NO2-, NO, N2O là sản phẩm trung gian và mỗi giai đoạn của quá trình được xúc tác bởi một hệ enzym khác nhau Quá trình này còn được gọi là quá trình dị hoá (Shapleigh, 2000)

2.3.2.1 Các vi sinh vật khử nitrate

Khác với quá trình nitrate hoá, số lượng vi khuẩn có thể thực hiện quá trình phản nitrate hoá tương đối phong phú Có ít nhất 14 chủng vi khuẩn được biết là có

khả năng phản nitrate hoá Ví dụ như chủng: Bacillus, Pseudomonas (Pseudomonas

denitrificans), Methanomonas, Paracocus, Spirillum, Thiobacillus, Achromobacter, Chromobacterium, Mycoplana, Serratia, Vibrio

Hầu hết vi khuẩn khử nitrate hoá là vi khuẩn hô hấp không bắt buộc, chúng có thể sử dụng O2 hoặc NO3 làm chất nhận điện tử cuối cùng trong quá trình hô hấp, trường hợp vi khuẩn sử dụng O2 làm chất nhận điện tử trong quá trình hô hấp gọi là hô hấp hiếu khí , còn trường hợp vi khuẩn sử dụng NO3- hoặc NO2- gọi là hô hấp thiếu khí Cơ chế của 2 quá trình là tương tự nhau, sự khác nhau duy nhất giữa hô hấp hiếu khí

và hô hấp thiếu khí là enzyme xúc tác cho sự vận chuyển điện tử O2 phải được loại trừ

để tạo điều kiện cho quá trình phản nitrate hoá diễn ra Nếu cả O2 và NO3- cùng có mặt thì vi sinh vật sẽ sử dụng O2 làm chất nhận điện tử do hô hấp hiếu khí sinh ra nhiều năng lượng hơn hô hấp thiếu khí

Phần lớn vi khuẩn khử nitrate hoá là vi khuẩn dị dưỡng tức là cần nguồn cacbon hữu cơ để tổng hợp tế bào, chỉ có một số ít vi khuẩn khử nitrate hoá là vi khuẩn tự

dưỡng, sử dụng nguồn cacbon vô cơ để tổng hợp tế bào Ví dụ : Loài Thiobaccillus

denitrificans có khả năng ôxy hoá lưu huỳnh nguyên tố lấy năng lượng và sử dụng

nguồn cacbon từ CO2 hoà tan hoặc HCO3- để tổng hợp tế bào

2.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình khử nitrate của vi khuẩn

Các vi khuẩn khử nitrate trên đây đều là vi khuẩn háo khí Nên trong điều kiện đất thoáng khí, cung cấp đủ ôxy cho vi khuẩn, quá trình khử nitrate sẽ chậm lại Tuy nhiên điều kiện đủ ôxy này lại làm gia tăng quá trình nitrate hóa đạm NH4, cung cấp cho quá trình khử nitrate Ở đất ngập nước, và trong tầng khử, vì vi khuẩn khử nitrate thiếu ôxy nên khử ôxy của NO3, do đó quá trình này xảy ra nhanh hơn so với ở đất thoáng khí Ở đất thoáng khí (thoát thủy tốt) mức độ mất N do khử nitrate tùy thuộc vào ẩm độ, nhiệt độ và pH của đất

Đối với ẩm độ, đất có ẩm độ dưới 70% (khả năng bảo hòa nước của đất) có mức

độ mất N do khử nitrate tương đối ít Ẩm độ đất càng tăng cao (cho đến mức độ ruộng

bị ngập nước) mức độ mất N do khử nitrate càng tăng (Firestone và Davidson, 1989)

pH của đất cũng ảnh hưởng đến mật số vi khuẩn khử nitrate trong đất Mật số vi khuẩn khử nitrate rất kém ở đất chua Đất có pH từ 5,5 trở lên có mật số vi khuẩn khử nitrate cao nhất Mặt khác pH của đất còn ảnh hưởng trên loại khí thải ra trong quá trình khử nitrate Ở đất quá chua, vi khuẩn có khuynh hướng thải ra NO Ở đất hơi chua, pH khoảng 6 - 6,5, phân nửa lượng khí thải ra là N2O Và ở đất trung tính hoặc hơi kiềm lúc đầu vi khuẩn thải ra N2O nhưng sau đó N2 chiếm thể tích phóng thích quan trọng hơn Ảnh hưởng này có thể do các hệ phân hóa tố của vi khuẩn nhạy cảm với pH của môi trường

Nhiệt độ cũng có ảnh hưởng đến quá trình khử nitrate của vi khuẩn Ở 20°C quá trình xảy ra rất chậm Quá trình xảy ra nhanh nhất ở nhiệt độ khoảng 25 - 30°C, tăng nhiệt độ 60 – 65°C quá trình khử nitrate vẫn mạnh Tuy nhiên, quá trình khử nitrate sẽ ngừng

ở 70°C hoặc hơn Điều này chứng tỏ nhóm vi khuẩn khử nitrate là vi khuẩn chịu nhiệt

http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Quá_trình_chuyển_hóa_vật_chất_chứa_nitơ_trong_đat

2.3.3 Một số phương pháp định lượng nitrate

Có thể nói từ khi con người nhận thấy tác hại của sự nhiễm độc nitrate đối với môi trường sống và sức khỏe, đã có vô số phương pháp xác định nitrate ra đời Tùy từng đối tượng cụ thể và hàm lượng nitrate có trong đó mà ta sử dụng những phương pháp thích hợp Ở nước ta, phương pháp trắc quang vẫn là phương pháp chủ lực và

phổ biến Bên cạnh đó, phương pháp điện hóa, sắc ký là những phương pháp được xem là mới mẻ trong lĩnh vực định lượng nitrate

2.3.3.1 Phương pháp thể tích

Người ta có thể xác định nitrate theo phương pháp này dựa trên phản ứng khử

NO3- về các trạng thái oxy hoá thấp hơn bằng các chất khử thích hợp Sau đó tiến hành phép chuẩn độ (có thể sử dụng chuẩn độ trực tiếp hay chuẩn độ ngược)

Với phép chuẩn độ ngược thì một lượng chính xác dung dịch chuẩn Fe2+ được cho dư so với lượng cần thiết vào dung dịch mẫu Sau đó lượng dư Fe2+ được chuẩn độ bằng dung dịch Cr2O72+ với chất chỉ thị là ferroin Các phản ứng xảy ra như sau:

NO3- + 3Fe2+ + 4H+ -> NO + 3Fe3+ + 2H2O 2Fe2+ + Cr2O72+ + 14H+ -> 6Fe3+ + 2Cr3+ + 7H2O Phản ứng giữa Fe2+ và NO3- xảy ra nhanh hơn khi đung nóng dung dịch và có mặt của lượng dư acid H2SO4 65%

Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, cho phép xác định lượng NO3-với nồng độ cao

Nhược điểm: do NO sinh ra phản ứng với oxy không khí tạo thành các chất có

khả năng bị khử hay bị oxy hoá bởi Fe2+ nên trong quá trình phản ứng và chuẩn độ phải được tiến hành trong môi trường khí CO2 Điều này được thực hiện bằng cách thêm một lượng nhỏ NaHCO3 trước khi đun nóng và chuẩn độ (Trần Lê Vân Thanh, 2008)

2.3.3.2 Phương pháp trắc quang (Phương pháp so màu)

Các phương pháp so màu cũng được dùng để xác định NO3- dựa trên ba loại phản ứng sau:

 Nitrate hoá các hợp chất phenolic

 Oxy hoá các hợp chất hữu cơ có nhóm mang màu đặc trưng

 Khử NO3- thành NO2- hoặc NH3 rồi xác định chúng theo phương pháp thích hợp

Trong đó, phương pháp nitrate hoá chủ yếu được sử dụng để xác định NO3- với thuốc thử thường dùng là acid phenol đisunfonic Khi sử dụng thuốc thử acid phenol 2,4 đisunfonic, ion NO3- phản ứng với acid này tạo thành acid nitrophenolđisunfonic không màu Trong môi trường kiềm, acid nitrophenolđisunfonic tạo thành một muối

có màu vàng cho độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 410 nm Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ ion NO3- có trong mẫu phân tích

Phương pháp này đơn giản và cho độ nhạy khá cao (0,05 ppm) Nhưng khi có mặt các chất hữu cơ, clorua, NO2-, các ion có màu sẽ gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích Do đú cần phải loại bỏ chúng trước khi phân tích Sử dụng acid Sunfamin, urê, hay thiurê để tách loại NO2-, Cl- được loại bỏ bằng cách cho phản ứng kết tủa với

Ag2SO4 Loại trừ ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ bằng cách oxy hoá bởi H2O2 hay

sử dụng than hoạt tính

 Thuốc thử natri salicylate

Trong môi trường acid sulfuric đậm đặc, nitrate tham gia phản ứng với natri salicylate tạo thành phức màu p-nitrosalicylate natri hoặc sản phẩm có thể là o-nitrosalicylate natri Ở môi trường bazơ mạnh phức này có màu và được đo tại bằng máy đo quang tại bước sóng λ = 410 nm Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ ion NO3- có trong mẫu phân tích

Trong môi trường kiềm, phức chất phân ly thành ion gốc axit làm phân tử trở nên phân cực Vì vậy, các electron hóa trị chuyển động hỗn loạn hơn nên phức chất có cường độ màu tăng và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng dài Dung dịch phức bền màu trong vòng từ 10-15 phút

Ưu điểm: Cho phép xác định NO3- với hàm lượng lớn, phương pháp đơn giản

nitrite là ion gây cản trở thường gặp nhất trong các phương pháp định lượng nitrate Ion này cần được loại trừ bằng axit Sunfamin, urê, hay thiurê (Trần Lê Vân Thanh, 2008)

2.3.3.3 Phương pháp dòng chảy (FIA)

FIA là một phương pháp kĩ thuật phân tích động, trong đó mẫu phân tích ở dạng lỏng được bơm trực tiếp vào dòng chất mang chuyển động liên tục Sau đó mẫu đi đến vòng phản ứng, rồi trong vòng phản ứng chất phân tích sẽ phản ứng với thuốc thử có trong chất mang để tạo ra sản phẩm có thể phát hiện được theo một tính chất hoá lí nào

đó của nó nhờ một Detector thích hợp Các tính chất hóa lí có thể phát hiện như: sự

hấp thụ quang phân tử UV – VIS, sự hấp thụ quang nguyên tử, tính chất huỳnh quang,

sự thay đổi chiết suất trong pha động, sự thay đổi điện thế

2.3.3.4 Phương pháp cực phổ

 Phương pháp sử dụng dòng xúc tác

Nguyên tắc: Ion NO3- tạo thành một sóng đặc trưng trong nền zirconyl clorua (ZrOCl2), sóng này bị giảm khi cho thêm lượng dư FeSO4 vào do hiệu ứng xúc tác của ion Fe(II) Ghi dòng I1 trước và dòng I2 sau khi thêm FeSO4 Sự sai biệt ΔI giữa dòng I1 và I2 tỉ lệ với hàm lượng nitrat Bằng cách xây dựng đồ thị chuẩn dựa vào giá trị ΔI

ta có thể phân tích mẫu chứa hàm lượng Nitrat – Nitơ trong khoảng 0,1 – 25 ppm Độ tin cậy của phương pháp là 95%

Ưu điểm: cho phép xác định NO3- ở hàm lượng nhỏ, qui trình phân tích đơn giản, hóa chất rẻ tiền

Nhược điểm: trong dung dịch nền ZrOCl2, nitrite cho sóng cực phổ hoàn toàn giống Nitrate khi thêm FeSO4 Do đó, nhất thiết phải loại trừ lượng NO2- ban đầu có trong mẫu phân tích (Trần Lê Vân Thanh, 2008)

 Phương pháp cực phổ gián tiếp

Đây là phương pháp dựa trên sự khử những hợp chất Nitro tạo thành từ phản ứng Nitro hóa giữa NO3- và các chất có chứa vòng thơm Phương pháp này được thực hiện tương tự như phương pháp trắc quang nghĩa là sau khi sản phẩm Nitro hóa tạo thành thay vì hiện màu để đo quang thì dùng phương pháp cực phổ để xác định Ở đây các thuốc thử hữu cơ thông dụng trong phương pháp trắc quang để xác định như acid sufosalicilic, phenol, 2,6 – xylenol được sử dụng trong phép phân tích bằng cực phổ Nguyên tắc: Trong môi trường axit, nitrate tham gia phản ứng nitro hóa với các hợp chất có chứa vòng thơm Sản phẩm của quá trình Nitro hóa sẽ bị khử trên điện cực

giọt thủy ngân Cường độ dòng giới hạn khuếch tán tỉ lệ với nồng độ của các Nitroaromatic, do đó cũng sẽ tăng theo hàm lượng của NO3- có trong dung dịch

Ưu điểm: Độ nhạy cao, cho phép xác định đến 10-6 M và khoảng tuyến tính rộng từ10-6.

Nhược điểm: Oxi tạo sóng khử trong vùng thế khảo sát nhưng có thể loại trừ đơn giản bằng cách dùng khí trơ như N2 hoặc Ar để đuổi Cũng như phương pháp quang, phương pháp cực phổ bị ảnh hưởng mạnh bởi ion Cldo nitrat tham gia phản ứng oxi hóa khử với anion clorua tạo nitrosylclorua

2.3.3.5 Phương pháp đo khí

Hassan là người đưa ra một phương pháp đo khí đơn giản thích hợp cho việc xác định đồng thời nitrate và nitrit trong cùng một mẫu Theo ông, đầu tiên nitrite được phân huỷ bằng Urê (CO(NH2)2) hoặc acid sunfamit (HSO3NH2) để tạo ra khí N2trong môi trường acid yếu Trong điều kiện này, nitrate không tham gia phản ứng Khí Nitơ tạo ra được đo bằng một trắc đạm rất nhỏ Các phản ứng xảy ra:

2KNO2 + CO(NH2) + 2HCl -> 2N2 + CO2 + 3H2O + 2KCl

KNO2 + HSO3 -> N2 + KHSO4 + H2O Sau đó, đun nóng dung dịch và tạo môi trường acid mạnh thì nitrate sẽ phản ứng tạo thành khí N2O:

Ion NO2- được xác định nhờ phản ứng tạo màu azô hoá bằng acid sunfanilic và α - naphtylamin Phức tạo thành có cường độ màu lớn, cực đại hấp thụ ở bước sóng 520 nm Phương pháp này được dùng để phân tích NO3- với nồng độ nhỏ hơn 1ppm mà các phương pháp khác không đủ nhạy để phát hiện

2.4 Quy trình chế biến dưa cải

2.4.1 Quy trình chế biến dưa cải truyền thống

Ở Việt Nam, dưa muối có thể được coi là sản phẩm truyền thống của dân tộc từ giữa thế kỷ 18 đến giữa thế kỷ 19 nhân dân đã tiếp thu kinh nghiệm của người Hoa làm

ra dưa muối từ các loại rau củ quả Trong dân gian có sự phân biệt giữa hai kiểu muối:

 Muối xổi: dưa muối xổi còn gọi là dưa góp hoặc làm để có thể ăn ngay trong ngày Thường dùng các loại rau cải non, loại củ quả cắt nhỏ được ngâm trong nước pha đường, muối, tỷ lệ vừa đủ không quá mặn hay quá ngọt có thể kết hợp với dấm thanh hoặc nước cốt chanh để tăng vị chua Các chuyên viên y tế Việt Nam khuyến cáo không nên ăn dưa cải theo cách muối xổi

 Muối chua hay muối nén là kiểu muối như trình bày ở hình 2.1 bên dưới

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chế biến dưa cải truyền thống

Ở quy mô hộ gia đình thì mỗi nhà có một công thức muối chua dưa cải riêng, phần lớn là làm theo kinh nghiệm Sự khác nhau đặc biệt là ở phần dung dịch lên men (công thức pha nước muối) Cách làm dưa cải muối tuy thật dễ nhưng để có được dưa cải muối thật ngon lại đòi hỏi thêm những bí quyết gia truyền: dưa ngon là dưa giòn khôn nhũn, vừa độ dẻo, độ chua vừa phải, màu vàng nhạt tự nhiên; đòi hỏi tay nghề và tài pha chế khéo léo của các bà nội trợ

Cải bẹ

(1)

Rửa sạch phơi héo

sơ, cắt lát vừa ăn

Bổ sung thêm tỏi , hành tím thái mỏng (2)

Cho vào thố/hũ muối dưa, nhấn cải xuống cho gọn gàng

Đổ nước muối đã pha sẵn vào thố ngập trên mặt cải

(1) Cải phải còn nguyên bắp không bị dập nát,

cải không quá non cũng không quá già

(2) Có hoặc không có bước này

(3) Nước muối được pha từ nước nóng đun

sôi và thêm muối mặn/nhạt/vừa tùy kinh

nghiệm mỗi người Hoặc: Lấy 1 bát 1/2 nước

nấu sôi cho muối và đường vào quậy cho tan,

cho 1/2 bát nước lọc và 2 cup nước vo gạo và

dấm vào quậy đều hoặc pha với tỷ lệ 1lít

nước :3 thìa muối :1thìa đường…

(4) Cải phải nằm dưới nước

2.4.2 Quy trình chế biến dưa cải công nghiệp

Ở Việt Nam dưa cải muối là một món ăn tự làm trong phạm vi gia đình riêng tại miền Nam Việt Nam có những làng chuyên làm dưa cải muối quy mô hơn như làng Tân Lược (Vĩnh Long) để bán khắp vùng chung quanh đén tận Cà Mau, Sóc Trăng Tại huyện Bình Tân (Bình Minh cũ) có khoảng gần 30 gia đình chuyên sản xuất dưa cải muối theo kiểu công nghệ (muối từ 5 kg/mẻ đến 50 kg /mẻ) Mặc dù chế biến dưa cải đã phát triển thành làng nghề nhưng quy trình chế biến vẫn là bí quyết của từng hộ gia đình Theo đó, quá trình lên men vẫn được thực hiện trong các lu khạp và gài nén bằng nan tre hay bao bì plastic với thời gian và nồng độ muối sử dụng thay đổi tùy thuộc vào từng địa phương (Thanh, 2007)

Các nghiên cứu chế biến dưa cải ở quy mô công nghiệp với chất lượng ổn định

và đảm bảo sức khỏe người tiêu dùng cũng chưa được quan tâm Trong khi đó, các quốc gia lân cận như Thái Lan, Trung Quốc (đặc biệt là Đài Loan) lại có nhiều nghiên cứu phát triển dưa cải và sản xuất ở quy mô công nghiệp dựa trên sản phẩm truyền thống của Việt Nam (Srilaong, 2007; Acedo, 2010) Việt Nam hiện chưa có tiêu chuẩn cụ thể

về yêu cầu chất lượng của rau muối chua (trích dẫn Nguyễn Văn Mười và ctv, 2012)

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chế biến dưa cải tại các hộ sản xuất dưa cải ở làng Tân Lược

Trong công nghiệp, đặc biệt ở các nước Châu Âu thì quá trình muối chua các sản phẩm rau quả được tiến hành trong những bể có thể tích lớn, quá trình lên men lactic diễn ra ở nhiệt độ thấp, thời gian dài Có thể làm tăng chất lượng sản phẩm bằng cách sử dụng chủng vi sinh vật lên men lactic thuần khiết được đưa vào dưới dạng dịch men, được phun đều lên trên lớp bề mặt của nguyên liệu trong bể muối

Cải làm dưa

(1)

Xử lý sơ bộ (2)

Chần trong nước sôi (3)

Rửa và làm nguội cải (4)

Cải được xếp chặt trong các túi nilon

Rót dung dịch mối, phẩm màu (5)

Lên men (6)

(1) Thu hoạch, phơi héo tại ruộng

(2) Cắt tỉa lá, loại bỏ các lá dập nát (không rửa)

(3) Chảo lá sen hoặc nồi

(4) Có thể bổ sung đường chảy

(5) Lên men khoảng 2 – 5 ngày

Để điều chế dịch men sử dụng các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết, không sinh hơi và nấm men mà các cơ sở chế biến nhận về dưới dạng lỏng chứa trong các chai thủy tinh Điều chế dịch men bằng cách nhân giống các chủng vi sinh vật thuần khiết, nấm men và vi khuẩn phải được nhân giống riêng sau đó mới trộn lại với nhau Môi trường dùng điều chế dịch men thường là nước dưa cũ và dịch chiết bắp cải (đối với muối bắp cải còn đối với các sản phẩm khác có thể thay thế bằng loại môi trường khác) Sau ngày thứ ba hoặc thứ tư tính từ ngày bắt đầu muối, lấy nước ra khỏi

bể muối Không nên lấy nước dưa ở thời điểm muộn hơn vì khi đó nước dưa chỉ còn lại ít chất dinh dưỡng do các vi sinh vật đã sử dụng để lên men lactic Nếu nước lấy ra

ở bể chưa đủ số lượng cần thiết thì bổ sung thêm nước với tỷ lệ 1: 1 và cho thêm đường với tỷ lệ 1% so với tổng lượng nước dưa và nước cho thêm Lọc rồi đun sôi trong 1 giờ để tiệt trùng Canh bắp cải được điều chế bằng cách nấu bắp cải tươi với nước, cưa 100 lít nước cất nấu với 20 – 25 kg bắp cải, khi bắp cải đã nhừ lọc lấy nước

để pha với nước dưa

Để loại trừ vi sinh vật lạ phát triển thì môi trường cần được tiệt trùng bằng hơi nước

ở 105 – 110oC/30 – 40 phút Sau đó môi trường được đổ vào thùng gỗ làm nguội xuống

35oC rồi cho vào thùng 1% dịch men thuần khiết, khuấy đều rồi để 3 ngày ở 25 - 30oC, sau khi đã nhân giống vi khuẩn và nấm men riêng rẽ thì trộn lẫn với nhau và cho vào bể muối nguyên liệu theo tỷ lệ 1,25% (gồm 1% dịch vi khuẩn và 0,25% dịch nấm men)

Sau khi lên men lactic đạt đến nồng độ acid lactic cần thiết thì tiến hành hạ nhiệt độ để quá trình lên men diễn ra chậm, tránh tổn thất acid, vitamin C làm cho sản phẩm có chất lượng tốt hơn Sau đó sản phẩm thường được bảo quản ở nhiệt độ thấp trong thời gian dài Khi sử dụng chủng vi sinh vật thuần thiết trong quá trình muối chua rau quả thì sản phẩm thu được có chất lượng ổn định, có thể bảo quản trong thời gian dài (Quách Đĩnh và ctv, 1996)

Hình 2.3 Quy trình muối chua dưa cải quy mô công nghiệp

Nguyên liệu

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian địa điểm

Thực hiện từ ngày 15/12/2012 đến 30/05/2013

Địa điểm: đề tài được thực hiện tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học Môi Trường phòng 213, bộ môn Công nghệ thực vật phòng 113 viện A1 thuộc viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Khảo sát quy trình muối chua dưa cải

Phiếu khảo sát quy trình được chuyển trực tiếp tới cho các điểm bán dưa cải ở khu vực Thủ Đức, Dĩ An – Bình Dương

3.3 Khảo sát hàm lượng nitrate có trong mẫu dưa cải thu thập được vào các thời điểm khác nhau

3.3.1 Nguồn gốc mẫu thí nghiệm

Mẫu dưa cải chua được thu thập tại các địa điểm khác nhau ,

Bảng 3.1 Ký hiệu mẫu và nơi lấy mẫu

3.3.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

 Dụng cụ, thiết bị: các dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh hóa như :

Cối sứ, chày sứ Cốc thủy tinh 100 ml, 1000 ml

Bình định mức 250 ml, bình tam giác 250 ml

Bếp đun cách thủy Cân, kéo, kẹp, giấy bạc

Máy quang sắc kế, kính lọc ở bước sóng 410 nm và cuvets

 Hóa chất: Các hóa chất của phương pháp so màu với Natri salicylate: Chất chuẩn KNO3: sấy khan không lẫn nitrite, Nước cất, Natri salicylate, H2SO4đậm đặc

Các phương pháp nêu ở trên đều có những hạn chế nhất định: phương pháp nghiền làm cho dịch nghiền có màu ảnh hưởng đến phép xác định nitrate Phương pháp ngâm ít bị ảnh hưởng của màu nhưng thời gian ngâm chiết lầu do đó kéo dài thời gian phân tích

Phương pháp nghiền được chọn để ứng dụng vào đề tài, khắc phục những vấn

đề trên bằng cách cho dịch nghiền lọc qua hai lớp giấy lọc cùng với than hoạt tính nhằm loại bỏ hoàn toàn hợp chất tạo màu Việc ly trích nhiều lần cũng giúp chiết tách nitrate có hiệu quả cao hơn Sau đây là quy trình chiết tách nitrate từ mẫu dưa cải:

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình ly trích nitrate từ dưa cải chua theo phương pháp nghiền

Cân 50 g dưa cải

Cho vào bát sứ, cắt và nghiền nhỏ

Chuyển sang cốc thủy tinh 50 ml

3.3.4 Xác định hàm lượng nitrate bằng phương pháp so màu với Natri salicylate

 Nguyên tắc

Hợp chất nitrate + Natri salicylate + NaOH  Phức màu vàng chanh

Đo độ hấp thu quang ở bước sóng 410 nm

 Cách tiến hành

Hũ nhựa 2 lít đã vô trùng thông qua tráng nước sôi sẽ được gửi cho 10 điểm bán dưa cải và muối dưa cải Mỗi mẫu dưa cải đem phân tích được lặp lại 2 lần và khảo sát hàm lượng nitrate liên tục trong 5 ngày sau khi ủ chua 1 ngày theo phương pháp so màu với Nitrate salicylate

Tiến hành dựng đường chuẩn với các nồng độ chất chuẩn (mg/l): 0, 2, 4, 6, 6,

10 Ghi kết quả độ hấp thu quang A Tiến hành vẽ đường chuẩn của gía trị độ hấp thu quang A đo được phụ thuộc vào nồng độ đã biết Sau khi đã có dãy dung dịch chuẩn tiến hành các thao tác phân tích mẫu hoàn toàn tương tự như với đường chuẩn

3.4.4 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng khử nitrate

3.4.1 Vật liệu

 Nguồn gốc mẫu thí nghiệm

Các mẫu dưa chua lấy từ các quầy hàng bán tự do ở khu vực Thủ Đức và một số vùng lân cận Các mẫu được thu nhận khoảng 4 – 5 giờ chiều và cho vào các bọc nilon

đã hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, bảo quản lạnh ở 20oC trước khi phân lập

Môi trường Giltay: phân lập và làm thuần chủng vi sinh vật khử nitrate

Môi trường dịch thể nitrate: thử nghiệm khả năng sử dụng nitrate và tăng sinh chủng vi sinh vật khử nitate

Môi trường Simmon citrate agar: phát hiện enzyme citratase

Môi trường canh tryptone: sinh indol

Môi trường gelatin: phát hiện enzyme gelatinase

Môi trường O/F: phát hiện khả năng oxy hóa hoặc lên men glucose

Môi trường VP-MR: phát hiện các sản phẩm acid từ quá trình chuyển hóa glucose Môi trường Urea: phát hiện enzyme urease

Môi trường Phenol red lactose broth: khả năng lên men lactose

Môi trường NA : thử khả năng di động

Hình 3.2 Phân lập vi khuẩn phản nitrtate trên môi trường Giltay (a) cấy trang; (b) cấy

ria; (c) cấy điểm

3.4.3 Phương pháp kiểm tra sinh hóa của các chủng vi sinh vật phân lập được

Các chủng phân lập được trên môi trường Giltay sau khi được làm thuần và được hoạt hóa trên môi trường thạch nghiêng ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 18 -

24 giờ Sau đó thực hiện nhuộm Gram và thử khả năng khử nitrate Các chủng trên được nuôi cấy trong môi trường dịch thể nitrate và sử dụng bộ test NO3 để kiểm tra khả năng khử nitrate theo từng ngày Chọn chủng nào có khả năng khử nitrate cao nhất lần lược thực hiện các thử nghiệm sinh hóa khác: thử nghiệm di động, Catalase, Oxydase, thử nghiệm O/F, len men lactose, len men glucose, thử nghiệm Citrate, Indole, VP, Glelatine, thử nghiệm Urea, Arginine dyhydroxylase của các chủng phân lập được Việc kiểm tra thêm các đặc tính sinh hóa khác sẽ giúp ích cho việc định danh