KẾT HỢP THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN RƠM RẠ TẠO ETHANOL BẰNG NHÓM VI SINH VẬT CHỊU NHIỆTCÓ TRONG BÙN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KẾT HỢP THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN RƠM RẠ TẠO ETHANOL BẰNG NHÓM VI SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KẾT HỢP THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN RƠM RẠ TẠO

ETHANOL BẰNG NHÓM VI SINH VẬT CHỊU NHIỆTCÓ TRONG BÙN

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN ĐỨC TRỌNG Niên khóa :2009-2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

    KẾT HỢP THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN RƠM RẠ TẠO

ETHANOL BẰNG NHÓM VI SINH VẬT CHỊU NHIỆTCÓ TRONG BÙN

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp ở viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ Đức, được sự hướng dẫn tận tình của các thầy cô, các anh chị và các bạn, tôi đã hoàn thành tốt bài báo cáo này Tôi xin cảm ơn chân thành đến:

Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện để cho tôi có thể được học tập và trau dồi kiến thức tại trường.Các thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học trường đại học Nông Lâm Thành phố HồChí Minh, những người thầy tâm huyết đã trao cho tôi những kiến thức quý báu về sinh học cũng như cách để sống tốt hơn trong cuộc sống

Thầy Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng vi sinh viện Sinh Học Nhiệt Đới đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài

Chị Phạm Kiều Diễm, sinh viên thực tập tại phòng vi sinh ứng dụng, viện Sinh Học Nhiệt Đới Chị đã tham gia hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình làm đề tài Các bạn trong lớp DH09SH cũng như những bạn bè khác đã quan tâm, giúp đỡ

và chia sẻ mọi thứ với tôi trong suốt thời học sinh và sinh viên

Cuối cùng, con xin nói lời cám ơn sâu sắc nhất tới bố mẹ, người đã nuôi nấng, chăm sóc, dạy dỗ và cho con ăn học thành người có ích cho xã hội

Tp.Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 06 năm 2013 Sinh viên

Nguyễn Đức Trọng

TÓM TẮT

Trong khi nguồn dầu mỏ của thế giới đang dần cạn kiệt thì bioethanol được coi là một trong những giải pháp tối ưu nhất Hàng năm, nước ta thải ra môi trường trung bình 55 tấn rơm và số lượng rơm này là một nguồn nguyên liệu tuyệt vời để dùng cho sản xuất ethanol Vậy đâu là phương pháp tối ưu để sản xuất ethanol từ rơm? Làm sao

có thể kết hợp thủy phân và lên men rơm trong một quy trình để tiết kiệm thời gian và chi phí? Đó là lý do đề tài này được thực hiện

Cơ chất dùng cho lên men là rơm được lấy từ 1 cánh đồng tại Đồng Nai, sau đó được cắt nhỏ với kích thước trung bình 0,5 cm rồi đem sấy khô trước khi cho vào môi trường nuôi cấy Vi sinh vật sử dụng cho thí nghiệm là nhóm vi sinh vật có trong bùn.Các mẫu bùn thì được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau Trong các mẫu bùn này

có chứa nhómcác vi sinh vật, ta sử dụng các nhóm vi sinh vật này để thủy phân và lên men rơm So sánh khả năng thủy phân giấy lọc của các mẫu bùn ở nhiệt độ 500C và

600C cùng với hai môi trường PCS và RM chưa khử Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng ethanol tạo ra: xử lý bùn với nhiệt và axít, thời gian xử lý bùn, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy

Kết quả: môi trường nuôi cấy phù hợp là môi trường RM chưa khử, nhiệt độ nuôi cấy là 600C Các mẫu bùn được xử lý với nhiệt độ 600C trong 30 phút cho hàm lượng ethanol cao hơn so với các mẫu không xử lý nhiệt hoặc xử lý với nhiệt độ và thời gian khác Đối với các mẫu bùn xử lý bằng axít H2SO4 thì hàm lượng ethanol không cao hơn nhiều thậm chí thấp hơn so với mẫu bùn không xử lý Và trong thời gian nuôi cấy

30 ngày của các mẫu thì ngày thứ 21 hầu hết các mẫu cho hàm lượng ethanol cao nhất với bốn mẫu tiêu biểu là: O, N, T, BS

Tóm lại, quy trình nuôi cấy đối với các mẫu bùn nghiên cứu để thủy phân và lên men tạo hàm lượng ethanol tối ưu nhất là bùn được xử lý tại nhiệt đô 600C trong 30 phút, sau đó nuôi cấy trong môi trường RM chưa khử tại nhiệt độ 600C trong 21 ngày Trong các mẫu bùn nghiên cứu, khi được nuôi cấy với quy trình tối ưu trên thì mẫu BS cho hàm lượng ethanol cao nhất với hàm lượng ethanol là 2.042,4 (mg/l)

is to solve the problem: “How can we combine hydrolysis and fermentation into only one process to save time and money?”

Materials is used for fermentation is rice straw Rice straw collected from a field

in Dong Nai province, then cut into small species about 0.5 cm before being dried And microorganisms used in this experiment are community microorganisms living in mud Many different mud samples are taken from many different places These microorganisms are used to hydrolyze and ferment rice straw

Comparing the ability of filter paper hydrolysis of each mud sample at 500C and

600C with two cultures: PCS and pre - reduced RM Investigating many factors effecting of bioethanol concentrations: heat treatment and acid treatment, treated time

of mud samples, time and culture for culture community microorganisms

Result: the best culture and temperature for this experiment is pre - reduced RM culture and 600C Mud samples which are treated at 600C in 30 minutes have more ethanol than others without heat treatment.In otherwise, mud samples with H2SO4acid treatment get less ethanol than others samples without acid treatment In 30 days culture samples with community microorganisms, the highest concentration of ethanol belong to the 21st day with 4 typical samples: O, N,T, BS

In conclusion, the best way to make the highest concentration of ethanol is to treat rice straw with acid and heat at 600C for 30 minutes Then, using pre - reduced

RM culture to culture community microorganisms with rice straw samples within 21 days The highest concentration of ethanol is BS sample with ethanol concentration is 3075.1 mg/l

Key words: rice straw, combine hydrolysis and fermentation, community microorganisms, bioethanol, mud

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh sáchcác hình vii

Danh sáchcác bảng và biểu đồ viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Hiện trạng cây lúa ở Việt Nam 3

2.2 Hiện trạng sử dụng năng lượng từ rơm rạ ở Việt Nam 4

2.3 Bioethanol từ rơm rạ 4

2.4 Xử lý sinh học hợp nhất (Consolisated bioprocessing) 4

2.5 Vi sinh vật chịu nhiệt 5

2.6 Quá trình lên men 6

2.7 Giới thiệu về ethanol 8

2.7.1 Tính chất của ethanol 8

2.7.2 Lịch sử ethanol nhiên liệu 8

2.7.3 Ứng dụng của ethanol nhiên liệu 9

2.7.4 Tình hình ethanol nhiên liệu ở Việt Nam 10

2.7.5 Triển vọng ethanol tương lai 10

2.8 Giới thiệu về lignocellulose 11

2.8.1 Tổng quan về Cellulose 12

2.8.2 Tổng quan vềhemicellulose 14

2.8.3 Tổng quan về lignin 16

2.8.4 Enzyme thủy phân lignocelluloses 18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

3.2 Vật liệu 22

3.3 Môi trường nuôi cấy 22

3.4 Phương pháp nghiên cứu 23

3.4.1 Nuôi cấy khảo sát với môi trường 24

3.4.2 Phương pháp tách chiết enzyme 24

3.4.3 Các phương pháp phân tích 25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Chọn lọc mẫu bùn, môi trường nuôi cấy và nhiệt độ nuôi 29

4.2 Khảo sát ngày với các mẫu đã chọn lọc 32

4.2.1 Hàm lượng glucose 32

4.2.2 Hoạt tính cellulase 33

4.2.3 Hàm lượng ethanol 34

4.2.4 Khối lượng bã rơm còn lại 35

4.3 Ảnh hưởng của tác nhân nhiệt và axít đối với mẫu bùn lên sự tạo thành ethanol 36

4.3.1 Xác định nhiệt độ thích hợp 36

4.3.2 Xác định thời gian xử lý bùn thích hợp 37

4.3.3 Chọn nồng độ axít thích hợp 38

4.4 Thảo luận 40

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CBP : Consolisated bioprocessing CMC : Carbonxyl Methyl Cellulose CTV : Cộng tác viên

DNS : Dinitrosalicylic axít

PCS : Peptonecellulosesolution

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 2.1 Tỷ lệ (%) trong tổng giá trị sản lượng nông nghiệp 3

Hình 2.2So sánh chi phí giữa sản xuất ethanol 3

Hình 2.3 Quá trình đường phân 7

Hình 2.4 Công thức hóa học của cellulose 13

Hình 2.5 Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập 13

Hình 2.6 Glucomannan 15

Hình 2.7 Galactoglucomannan 15

Hình 2.8 Arabinoglucuronoxylan 16

Hình 2.9 Cấu tạo lignin 17

Hình 2.10Tác dụng của từng enzyme trong cellulase 19

Hình 2.11Cấu trúc của hemicellulose 21

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 23

Hình 3.2 Bình nuôi cấy 24

Hình 3.3 Sơ đồ hệ thống sắc ký khí 28

Hình 3.4 Cột nhồi và cột mao quản 28

Biểu đồ 4.1 Hàm lượng glucose của các mẫu khảo sát ngày 33

Biểu đồ 4.2 Hoạt tính cellulase của các mẫu khảo sát ngày 34

Biểu đồ 4.3 Hàm lượng ethanol của các mẫu khảo sát ngày 35

Biểu đồ 4.4 Khối lượng bã rơm rạ còn lại của các mẫu 36

Biểu đồ 4.5Hàm lượng ethanol của các mẫu bùn được xử lý với các nhiệt độ 37

Biểu đồ 4.6Hàm lượng ethanol của các mẫubùn được xử lý với các thời gian 38

Biểu đồ 4.7Hàm lượng ethanol của các mẫubùn được xử lý với các nồng độ axít 39

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Cơ cấu giá trị sản lượng nông lâm ngư nghiệp 3

Bảng 2.2 Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp 12

Bảng 2.3 Phân loại các enzyme cellulase có khả năng thủy phân 19

Bảng 4.1 Khảo sát khả năng phân hủy giấy lọc trên 2 môi trường tại 50ºC 29

Bảng 4.2 Khảo sát khả năng phân hủy giấy lọc trên 2 môi trường tại 60ºC 30

Bảng 4.3 Hàm lượng glucose của bảy mẫu qua các ngày khảo sát 32

Bảng 4.4 Hoạt tính cellulase của bảy mẫu qua các ngày khảo sát 33

Bảng 4.5 Hàm lượng ethanol của bảy mẫu qua các ngày khảo sát 34

Bảng 4.6 Khối lượng bã rơm của bảy mẫu qua các ngày khảo sát 35

Bảng 4.7 Hàm lượng ethanol của các mẫu xử lý nhiệt 36

Bảng 4.8 Hàm lượng ethanol các mẫu xử lý nhiệt ở 600C 37

Bảng 4.9 Hàm lượng ethanol có trong các mẫu xử lý axít trong 30 phút 39

Ethanol là một loại nhiên liệu thay thế dạng cồn, được sản xuất bằng phương pháp lên men và chưng cất các loại ngũ cốc chứa tinh bột có thể chuyển hóa thành đường đơn, như bắp, lúa mì, lúa mạch Ngoài ra, ethanol còn được sản xuất từ cây, cỏ

có chứa cellulose, gọi là ethanol sinh học

Ethanol là chất phụ gia để tăng trị số octane (trị số đo khả năng kích nổ) và giảm khí thải độc hại của xăng Trong chính sách năng lượng của mình, từ khối EU đến Mỹ, Trung Quốc, Australia, Nhật Bản,… đều chú trọng đến ứng dụng ethanol

Việt Nam là nước xuất khẩu lúa gạo đứng thứ hai trên thế giới Từ năm 2002 đến nay, trung bình nước ta sản xuất khẩu 34 triệu tấn thóc/năm Năm 2008 sản lượng lúa

đã đạt 37,6 triệu tấn, chiếm 5,6% sản lượng lúa gạo toàn cầu

Do đó, hàng năm nước ta sẽ thải ra khoảng 55 triệu tấn rơm rạ Số rơm rạ này một phần làm phân bón sinh học, còn chủ yếu được đốt bỏ ngay trên cánh đồng gây lãng phí và ảnh hưởng đến môi trường Nếu tận dụng được nguồn rơm rạ này để sản xuất nhiên liệu sinh học sẽ có ý nghĩa hết sức to lớn về nhiều mặt

Đầu tiên, cồn sinh học được sản xuất từ việc lên men đơn giản các nguyên liệu giàu sucrose và tinh bột như mía, củ cải đường, ngũ cốc và sử dụng nấm men

Saccharomyces cerevisiae (Howard và ctv, 2010)

Gần đây, các nghiên cứu lên men đã được mở rộng ra với các nguồn nguyên liệu

rẻ tiền hơn như rơm rạ giàu lignocellulose và các chủng vi khuẩn có khả năng lên men

khác Các chủng vi sinh như Zymomonas mobilis và S cerevisiae là các loài cho lượng

ethanol cao có thể được xử lý để tăng giới hạn sử dụng cơ chất (Lynd, 1999;Bettiga và

cvt, 2006;Jarboe, 2007) Trong khi Escherichia coli và Klevsiella oxytoca có khả năng

sửdụng nhiều loại đường được dùng để cải thiện việc sản xuất ethanol (Lynd, 1999) Khác với nấm men, một số loài vi khuẩn có trong bùn thể thủy phân tạo đường

và lên men chúng thành ethanol, tất cả các bước của quá trình chuyển đổi lignocellulose thành ethanol có thể được kết hợp trong một bước duy nhất gọi là consolisated bioprocessing (CBP) mà trên lý thuyết sẽ giúp làm giảm chi phí sản xuất (Parachin và cvt, 2011)

Có thể thấy được các chủng vi khuẩn này lên men tạo ethanol từ nguyên liệu giàu lignocellulose là những đối tượng nghiên cứu đầy hứa hẹn

Vì những lý do trên mà đề tài: “Kết hợp thủy phân và lên men rơm rạ tao ethanol bằng nhóm vi sinh vật chịu nhiệt có trong bùn” được tiến hành với hy vọngqua quá trình nghiên cứu và thực nghiệm sẽ tuyển chọn được những mẫu cho hoạt tính enzyme thủy phân lignocellulose cao và xác định được khả năng lên men tạo ethanol của hỗn hợp vi sinh vật từ mẫu bùn đã thu nhận

1.2 Yêu cầu

Đề tài tiến hành với mục tiêu nghiên cứu chọn lọc ra quy trình và nhóm vi sinh vật thủy phân và lên men rơm rạ tạo ethanol tối ưu nhất trong các mẫu nhóm vi sinh vật nghiên cứu

1.3 Nội dung thực hiện

Sử dụng nhóm vi sinh vật có trong các mẫu bùn thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau để nuôi cấy khảo sát khả năng thủy phân và lên men rơm rạ tạo ethanol của các mẫu này Rơm rạ thí nghiệm được lấy từ một cánh đồng tại Đồng Nai Sau khi thu nhận về rơm được cắt nhỏ với kích thước trung bình 0,5 cm rồi đem sấy khô để sử dụng cho nuôi cấy Tiến hành nuôi cấy nhóm vi sinh vật trong chai thủy tinh thể tích 100ml với các môi trường và điều kiện nhiệt độ khác nhau, rồi tiến hành khảo sát khả năng phân hủy giấy lọc, hoạt tính enzyme thủy phân cellulose, khối lượng bã rơm còn lại, hàm lượng ethanol tạo ra

Kết luận đưa ra quy trình nuôi cấy và nhóm vi sinh vật tối ưu nhất để thủy phân

và lên men rơm rạ tạo ethanol trong các điều kiện khảo sát

g 80% tronphương thứ

u giá trị sản

nh 2.1 Tỷ lệ

ệu và đồ thị uồn nguyên

2000 với lượlượng lớn ch

)

ệ (%) trongtrên cho th

n liệu Rơm ợng năng lư

ho nước ta

ệ % trong tổ

NôTổng số

78,3 91,6 69,9

g lâm ngư n

g tổng giá trhấy vị trí vàchiếm 62,6ượng chứa đ

ổng giá trị sông nghiệpLúa C

38,046,353,5

3.9

QUAN TÀ

ng nghiệp vđòn gánh kĐBSCL) vànông dân tuyền thống

nghiệp của

ị sản lượng

à tiềm năng 6% trong tổđựng là 866

sản lượng N

Các nguồn khác 40,3 45,3 16,4

Ngư nghi Lâm nghi Cây lúa Các nguồ

ÀI LIỆU

và kinh tế Vkhổng lồ vớ

à Đồng bằtham gia sảViệt Nam n

(H

g nông nghiệrất lớn của ổng khối lư6,600 GJ R

Nông - Lâm

Lâm nghiệp

3,9 1,0 2,1

ệp iệp

Hồ Sĩ Tráng, 2

ệp rơm trong ượng biomaRơm hứa hẹ

m - Ngư ngh

p

Ngnghi

17,7,418,

Hình

à hai Hồng gạo,

2003)

viêc ass ở

ẹn là

hiệp

gư iệp

,8

40 ,5

2.2Hiện trạng sử dụng năng lượng từ rơm rạ ở Việt Nam

Mặc dù rơm rạ là một nguồn năng lượng lớn, rơm rạ nói riêng và từ biomass nói chung không dược sử dụng một cách hiệu quả ở Việt Nam Phần lớn rơm rạ được bón trở lại ruộng sau khi thu hoạch, sử dụng làm chất đốt cho các hộ nhà nông, làm thức ăn cho gia súc, 

Biomass chỉ chiếm 3,8% trong tổng năng lượng sử dụng của thành phố Hồ Chí Minh năm 2003, trong khi đó, nguồn năng lượng này chiếm 89% trong tổng năng lượng sử dụng ở nông thôn năm 2001 Ở nông thôn, biomass chủ yếu được dùng làm chất đốt và hiệu suất sử dụng năng lượng của quá trình này chỉ được 10% (Nguyễn Thế Bảo và Bùi Tuyên, 2001)

2.3Bioethanol từ rơm rạ

Ngày nay sức ép từ khủng hoảng dầu mỏ và nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất cứ quốc gia nào trên thế giới Mỹ và Brazil đã thành công trong việc sản xuất ethanol từ nguồn sinh học là bắp và mía Điều này đã khích lệ các nước khác đầu tư nghiên cứu vào lĩnh vực nhiên liệu sinh học

Bên cạnh sản xuất ethanol từ nguồn tinh bột (bắp) và đường (mía), ethanol có thể được sản xuất từ lignocellulose Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thế giới Vì vậy sản xuất ethanol từ biomass cụ thể là từ nguồn lignocellulose là một giải pháp thích hợp đặc biệt là với các quốc gia nông nghiệp như Việt Nam

Nền nông nghiệp Việt Nam hằng năm tạo ra một lượng lớn phế phẩm nông nghiệp, chủ yếu là lignocellulose từ các vụ mùa Tận dụng nguồn nguyên liệu này, cụ thể là rơm rạ để sản xuất bioethanol là phương pháp sử dụng rơm rạ một cách hiệu quả đồng thời góp phần giải quyết vấn đề năng lượng cho nước ta

2.4Xử lý sinh học hợp nhất (Consolisated bioprocessing)

Sản xuất nhiên liệu tái tạo, đặc biệt là ethanol sinh học từ sinh khối lignocellulose, có tiềm năng đáng kể để đáp ứng các nhu cầu năng lượng hiện tại cũng như để giảm thiểu phát thải khí nhà kính cho một môi trường bền vững (Lynd và ctv, 2005)

Hình 2.2So sánh chi phí giữa sản xuất ethanol bằng hệ thống thông thường và CBP

(Lynd, 2005)

Đối với các sinh khối lignocellulose, để tiến hành lên men cần tiến hành các bước tiền xử lý nguyên liệu thông qua các tác nhân vật lý, hóa học, sinh học,…Do đó, việc lên men ethanol từ nguyên liệu lignocellulose đòi hỏi tốn nhiều thời gian và tiền bạc Trong khi đó nhóm một số các loài vi sinh vật có thể chuyển đổi lignocellulose thành ethanol trong một bước duy nhất gọi là consolisated bioprocessing (CBP) mà trên lý thuyết quá trình này sẽ giúp giảm chi phí sản xuất rất nhiều

2.5Vi sinh vật có trong bùn đất và vi sinh vật chịu nhiệt

Trong bùn có rất nhiều vi sinh vật sống Chúng được chúng ta xếp vào 5 nhóm chính: nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn, tảo và nguyên sinh động vật (protozoa) Trong số đó

có những vi khuẩn phân hủy cellulose (cellulose decomposer):

nhưClostridium,Myrothecium,Cellulomonas Đặc biệt là trong những khu vực bùn đất

có nhiều xác, bã thực vật (Phạm Văn Kim, 1996)

Các chủng vi sinh vật thường thấy có khả năng chịu nhiệt là những chủng có khả năng sinh bào tử, xạ khuẩn,… Là những chủng vi khuẩn có khả năng sống và phát

triển tốt ở nhiệt độ khá cao từ 550C đến 650C Các enzyme và các chất mang của nhóm

vi khuẩn này đều được cân bằng ở nhiệt độ khá cao Hầu hết chúng đều cần nguyên tố lưu huỳnh để phát triển Vì vậy thường gặp ở những nơi có hàm lượng lưu huỳnh cao

và nhiệt độ thích hợp như trong các suối nước nóng, các khu vực gần núi lửa hoạt động hoặc phân ủ, rơm ủ trồng nấm, bùn(Nguyễn Lân Dũng, 1962)

2.6Quá trình lên men

Lý thuyết quá trình lên men đã được nhiều nhà sinh học nghiên cứu từ rất lâu Năm 1769, Lavoisier phân tích sản phẩm lên men rượu và nhận thấy khi lên men, đường không chỉ tạo thành ethanol và CO2 mà còn tạo ra axít acetic

Năm 1810, Gay - Lussac nhận thấy rằng cứ 45 phần khối lượng đường sẽ chuyển thành 23 phần ethanol và 22 phần khí carbonic Trên cơ sở đó ông đưa ra phương trình tổng quát như sau:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + Q

Năm 1857, Louis Pasteur tiếp tục nghiên cứu và thu nhận kết quả sau: cứ 100 phần đường saccharose khi lên men sẽ tạo ra 51,1 phần ethanol, 48,4 phần CO2, 32,0 phần glycerin, 0,7 phần axít succinic và hai phần các sản phẩm khác

Từ đó suy ra cứ 45 phần khối lượng glucose khi lên men sẽ tạo ra 21,8 phần ethanol chứ không phải 23 phần như Gay - Lussac đã tính Tuy nhiên phương trình lên men do Gay - Lussac đưa ra vẫn đúng và dùng làm cơ sở lý thuyết để tính hiệu suất thu hồi rượu theo lý thuyết Gay - Lussac còn kết luận sự lên men là quá trình sinh học có liên hệ mật thiết đến sự hoạt động của tế bào nấm men

Vào khoảng 1871 - 1872 Manaxemi đem nghiền tế bào nấm men với cát thạch anh rồi mới cho vào lên men dịch đường thì hiện tượng lên men vẫn xảy ra Năm 1879, Buchuer tiến hành nghiền nát tế bào nấm men rồi chiết lấy dịch trong không chứa xác nấm men rồi cho vào dịch đường thì thấy dịch chiết vẫn có khả năng lên men Từ đó người ta gọi các chất trong dịch tế bào nấm men là zymase Đây chính là hợp chất của nhiều enzyme cùng tham gia chuyển hóa đường thành ethanol và khí carbonic (Cao Đình Khánh Thảo, 2007)

Hình 2.3 Quá trình đường phân

(http://violet.vn/hochiminh/document/show)

Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử Quá trình oxy hóa này lại xảy ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme, cho nên người ta gọi quá trình lên men là quá trình oxy hóa sinh học

Sự tạo thành rượu từ glucose phải trải qua nhiều giai đoạn, sơ đồ hình thành rượu

từ glucose được biễu diễn ở hình 2.3

Sau đó, pyruvate sẽ chuyển thành ethanol theo các phương trình sau:

2.7.Giới thiệu về ethanol

Ethanol có thể được sản xuất ở hai dạng: thủy hợp và khan Ethanol thủy hợp thường được sản xuất bởi việc lên men các sinh khối, chứa 95% ethanol và còn lại là nước Nó là loại nhiên liệu thích hợp cho động cơ đánh lửa trực tiếp ở khí hậu nóng hoặc dùng để hòa trộn với nhiên liệu Diesel (trộn 15%)

Quá trình khử nước được yêu cầu để sản xuất ethanol khan cho việc dùng để hòa trộn với xăng Trừ việc dùng làm đồ uống, hầu như ethanol sử dụng trong công nghiệp

là hỗn hợp 95% ethanol và 5% nước (cồn 95%) Ethanol sử dụng làm nhiên liệu thì đã được thêm một lượng nhỏ, thường là xăng (2% - 5%) để không thể uống được Ethanol loại nhiên liệu sinh học, ít độc hại, không gây ô nhiễm nguồn nước, nếu tràn ra môi trường thì gây ô nhiễm không nhiều

Ethanol là chất làm tăng trị số octan (giảm tiếng gõ cho động cơ khi làm việc) và tăng tính oxy hóa Màu của hỗn hợp pha trộn xăng -ethanol tùy thuộc vào màu của xăng hòa trộn và mùi của hỗn hợp có mùi xăng (Đỗ Ngọc Toàn, 2008)

2.7.1Tính chất của ethanol

Ethanol là một chất lỏng, không màu, trong suốt, mùi thơm dễ chịu và đặc trưng,

vị cay, nhẹ hơn nước (khối lượng riêng 0,789 g/ml ở 200C), dễ bay hơi (sôi ở nhiệt độ 78,390C), hóa rắn ở -114,150C, tan vô hạn trong nước, tan trong ether và cloroform, hút ẩm, dễ cháy, khi cháy không có khói và ngọn lửa có màu xanh da trời

Ethanol tan vô hạn trong nước và có nhiệt độ sôi cao hơn nhiều so với este hay aldehyde có khối lượng phân tử xấp xỉ là do sự tạo thành liên kết hydro giữa các phân

tử rượu với nhau và với nước

2.7.2Lịch sử ethanol nhiên liệu

Nguyên mẫu đầu tiên của động cơ đốt trong (Samuel Morey, 1826) Điều này được xem là sự bắt đầu của động cơ gasoline nhưng thực tế ông sử dụng ethanol để cấp nguồn năng lượng cho động cơ Năm 1908, Henry Ford xây dựng mô hình nổi tiếng về

xe ô tô chạy bằng ethanol Cuối cùng, công nghiệp dầu mỏ "chiến thắng" trong sự cạnh tranh với ethanol Sự thúc đẩy thương mại hóa ethanol trong giao thông vận tải phát triển trong suốt thập niên 1970 Cuộc khủng hoảng dầu mỏ vào năm 1973 và cuộc cách mạng của người Iran vào năm 1978 làm cho giá của dầu gia tăng một cách nhanh chóng, ảnh hưởng lớn đến vấn đề an ninh năng lượng quốc gia Ethanol nhiên liệu trở nên có giá trị Tại thời điểm này, cơ quan bảo vệ môi trường (EPA) đã tìm kiếm một

chất thay thế cho chì trong gasoline để gia tăng chỉ số octan Ethanol sớm thiết lập một chỗ đứng vững mạnh trong việc gia tăng chỉ số octane Một động cơ khác thúc đẩy công nghệ sản xuất ethanol ở Mỹ trong suốt những năm 80, đó là khi giá bắp hạ thấp Các nhà lập pháp Mỹ xem ethanol từ bắp là một phương tiện để ổn định thu nhập của nông nghiệp

2.7.3Ứng dụng của ethanol nhiên liệu

Gasohol còn gọi là xăng sinh học được chế tạo từ hỗn hợp ethanol khan 99,5% pha xăng tỷ lệ 5, 10, 20 hoặc 40% ethanol khan, với hỗn hợp ethanol trong gasohol khoảng 10-20% thì không cần cải tạo động cơ

Khi xem xét ứng dụng hiện nay của bioethanol, hiển nhiên cần bắt đầu từ Brazil Brazil đã thành công trong việc sản xuất bioethanol theo quy mô công nghiệp từ những năm 1970 khi nước này phụ thuộc nặng nề vào dầu nhập khẩu Lệnh cấm vận dầu

mỏ của Trung Đông đã bắt buộc Brazil phải tìm kiếm những những nguồn nhiên liệu vững bền hơn cho nhu cầu năng lượng của đất nước Tuy rằng có những vấn đề nảy sinh, nhưng chương trình này của Brazil được xem như một mô hình thành công trong việc phát triển bền vững Ngày nay, toàn bộ xe hơi ở Brazil sử dụng xăng có pha ít nhất 25% ethanol, và 60% số xe có khả năng linh động về nhiên liệu (có thể sử dụng 100% ethanol làm nhiên liệu)

Brazil sản xuất bioethanol hầu như chỉ từ cây mía Trong mô hình này, mỗi tấn mía cho năng suất 72 lít ethanol Loại ethanol này có thể được tinh lọc thêm để pha vào xăng,hoặc dùng làm ethanol nhiên liệu tinh Rõ ràng con số này cho thấy có rất nhiều thành phần không được sử dụng trong quá trình chuyển hóa biomass thành ethanol Hầu hết những thành phần này là hemicellulose và cellulose

Nước Mỹ đang bám theo Brazil và đầu tư mạnh vào sản xuất nhiên liệu sinh học Hiện tại Mỹ đang sử dụng toàn bộ xăng có pha 10% ethanol, với những cải tiến nhằm tăng tỉ số này Đa phần mọi phương tiện bán ở Mỹ đều phải có động cơ linh hoạt về nhiên liệu Liên minh Châu Âu cũng đã tiến đến việc khuyến khích năng lượng tái sinh cho tương lai với những đạo luật về điều khoản sử dụng phương tiện giao thông tối thiểu cho các nước thành viên

Trong tương lai, Colombia bắt buộc những thành phố có dân số trên 500.000 dân phải bán xăng có pha 10% ethanol Ở Venezuela, công ty dầu quốc gia đang hỗ trợ dự

án xây dựng 15 nhà máy chế cồn từ mía trong 5 năm tới khi chính phủ sắp ban hành đạo

luật bắt buộc sử dụng xăng E10 (pha 10% ethanol) Chính phủ Canada nhắm đến việc 45% xăng trong cả nước có pha 10% ethanol vào năm 2010 Ở Đông Nam Á, Thái Lan

đã ban hành luật cho việc sử dụng xăng pha 10% ethanol bắt đầu từ 2007 Ở Ấn Độ, một chương trình bioethanol đã kêu gọi người dân sử dụng xăng E5 trên cả nước, tiến tới việc

sử dụng xăng E10 và E20 (Trần Bình Nam, 2002)

2.7.4Tình hình ethanol nhiên liệu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, công nghiệp sản xuất ethanol đã được hình thành từ rất lâu Phần đông ethanol sản xuất từ rỉ đường mía, dùng làm ethanol cho thực phẩm và công nghiệp Tổng cộng năng suất là 25 triệu lít/năm, trong đó có 3 nhà máy sản xuất

15000 -30000 lít/ngày là nhà máy đường Lam Sơn, nhà máy đường Hiệp Hoà và nhà máy rượu Bình Tây và hàng trăm cơ sở sản xuất 3000 -5000 lít/ngày

Cho đến thời điểm này, ethanol nhiên liệu vẫn chưa được tiêu thụ trên thị trường Tuy nhiên, có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện trong lĩnh vực này Điển hình là sự hợp tác giữa Công ty rượu Bình Tây, Saigon Petro và Công ty Nguyễn Chí từ năm

2005 Các doanh nghiệp này đã triển khai 5 đề tài: gasohol từ cồn công nghiệp (cồn 96%), gasohol từ cồn khan (cồn 99,5%), đầu tư nhà máy sản xuất gasohol, đầu tư nhà máy sản xuất cồn công nghiệp, đầu tư nhà máy sản xuất cồn khan Tất cả nhằm mục đích đưa xăng sinh học với tỉ lệ 10 - 12% vào thị trường năng lượng (Minh Quang, 2001)

2.7.5Triển vọng ethanol tương lai

Cần có những nghiên cứu để tăng hiệu quả của bioethanol cũng như của quá trình chuyển hóa biomass thành nhiên liệu bền vững để thay thế xăng dầu Điều này có liên quan đến việc giảm chi phí chuyển hóa, tăng năng suất và tăng sự đa dạng của các nguồn nguyên liệu có thể sử dụng Hướng đi cho những nghiên cứu để phát triển và cải tiến bioethanol là tìm những phương pháp chuyển hóa hemicellulose thành đường

để lên men

Một khía cạnh rất thú vị, và cũng được nghiên cứu trong đề tài này, là quá trình đường hóa và lên men đồng thời (CBP) Những phương pháp hiện nay có thể đạt được hiệu suất ethanol cao cho mỗi gam glucose, giới hạn bởi khả năng chịu ảnh hưởng của vi sinh vật đối với ethanol Điều này dẫn đến hướng khả thi nghiên cứu những chủng vi sinh vật có khả năng chịu ức chế tốt hơn Ở khía cạnh này, công nghệ sinh học và vi sinh sẽ đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ gene, phát triển những giống vi sinh vật khác

có khả năng chuyển hóa cellulose và lignin tạo thành đường và lên men ethanol

2.8 Giới thiệu về lignocellulose

Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô,…và nó là một nguồn nguyên liệu rẻ tiền Trong tự nhiên, chúng

ta có thể tìm thấy lignocellulose ở thực vật hay các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp

và các chất thải rắn trong thành phố Các chất thải này bao gồm các loại vật liệu như: mùn cưa, bã mía, chất thải giấy, các loại ngũ cốc, rơm rạ,… Chất thải lignocellulose được tích lũy hàng năm với số lượng lớn gây ra các vấn đề về môi trường Tuy nhiên,

do thành phần cấu tạo của chúng có chứa nhiều đường và các hợp chất được quan tâm nên chúng có thể được sử dụng để sản xuất một số sản phẩm có giá trị như ethanol, phụ gia thực phẩm, axít hữu cơ, men và những sản phẩm khác

Các thành phần chính của lignocellulose là: cellulose(35 -50%),hemicellulose(25 - 30%) và lignin(25 -30%) (WeidongWang và ctv, 2011)

Về cơ bản, trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và được bao bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose và kết dính như lignin Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và liên kết cộng hóa trị với nhau Các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và axít 4- O -methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin (Hetti Palonen, 2004)

Lignocellulose bao gồm: lignin, hemicellulose và cellulose (Bảng 2.2) (Betts và ctv, 1991; Sun và Cheng, 2002) cho thấy tỉ lệ điển hình của ba thành phần trong các vật liệu chứa lignocellulose khác nhau

Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản Các sợi này được gắn lại với nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25 nm Các vi sợi này được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của ezyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân (Charles và Wyman, 1996) Các đại phân tử hemicellulose thường là polymer của pentose (xylose và arabinose), hexose (chủ yếu là mannose) và một số axít đường trong khi cellulose là polymer đồng nhất của glucose

Trong số ba thành phần của lignocellulose thì lignin là cấu trúc khó phân hủy nhất và ngược lại với cellulose Và vì có cấu trúc tinh thể được sắp xếp chặt chẽ nên

nó có khả năng chống thủy phân tốt hơn hemicellulose Kiềm (Chahal, 1992) và axít (Grethlein và Converse, 1991; Nguyen, 1993) là những phương pháp thủy phân được

sử dụng để phân hủy lignocellulose (Roehr, 2001)

Bảng2.2 Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp

Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%)

Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C6H10O5)n,và là thành phần

chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4 - O -(β -

D - Glucopyranosyl) - D - glucopyranose Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều

nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 1011 tấn cellulose

(trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%)

Hình 2.4 Công thức hóa học của cellulose

(http://i156.photobucket.com/albums/t39/)

Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn công (Charles và Wyman, 1996) Có hai mô hình cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng tinh thể và vô định hình như hình 2.5(Hetti Palonen, 2004)

Hình 2.5Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập

(http://chemvn.com/archive/index.php/)

Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose Cellulose là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết β -1→ 4 -glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác Giống như tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất

500 phân tử glucose Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi

cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, vì vậy giữa các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hidro được tạo thành giữa các nhóm OH của chúng Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose

Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa Vi khuẩn trong dạ

cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose Nấm đất và vi sinh vật trong bùn cũng có thể phân hủy cellulose Vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn

2.8.2Tổng quan vềhemicellulose

Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng

70 đến 200 DP.Hemicellulose chứa cả đường 6 gồm glucose, mannose và galactose

và đường 5 gồm xylose và arabinose Thành phần cơ bản của hemicellulose là - D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết - (1,4)

Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung gồm:

Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết - (1,4)

Xylose là thành phần quan trọng nhất

Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O - liên kết với vị trí 2 hoặc 3

Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin

là nhờ các mạch nhánh này Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng

vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân

Gỗ cứng, gỗ mềm và nguyên liệu phi gỗ có các đặc điểm hemicellulose khác nhau: Gỗ cứng chủ yếu có hai loại hemicellulose:

Acetyl - 4 - O - methylglucuronoxylan, là một loại polymer có mạch chính gồm

- D -xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết -D (1,4) Trong đó 70% các nhóm OH

ai có mạch

O tại nhómarles và Wyũng bao gồmtrọng nhất nopyranoseơng ứng là 3

(http://en

4 - O - metthế ở vị trí (Charles vàolysaccharidylglucuroniman, 1996)

m hai loại helàgalactog

e liên kết vớ3:1 Tuy nhi

2.6 Glucoma

annan.com/im

- D -galactop

rí C6 với -L)

emicelluloseglucomanna

ới D - glucoiên, tỉ lệ này

Galactogluco

org/wiki/Gal

onoxylan, c

t 4 -O - met1996) Đốitạo từ các Dtrí C3 sẽ tạ

m ở vị trí Comannan, p

e (Charles và

annan

mage/molecu

pyranose, phâL-arabinose,

e chính:

an, đây là popyranose b

y thay đổi tù

omannan

lactoglucom

cấu tạo từ cthyl - glucu với cỏ, 20

D - xylopyra

ạo mạch nhá

2 liên kết vpolymer này

ùy theo loại

mannan)

các D - xyluronic, ở vị

0 - 40% hanose, OH ánh với -L

với axít 4

y chứa một 1996)

ại hemicellutose hoặc ax

ấu thành từ

ết -(1,4) với

i gỗ (Charle

opyranose,trí 3 bằng emicellulos

Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình được đề nghị là: guaiacyl (G), chất gốc là rượu trans - coniferyl; Syringly (S),chất gốc là rượu trans- sinapyl;p - hydroxylphenyl (H), chất gốc là rượu trans - courmaryl

Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của

nó trong gỗ Ngoài việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin

có thể được phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringly lignin

Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaicyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringly Nghiên cứu chỉ

ra rằng guaicyl lignin hạn chế sự trương nở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu đó sẽ khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringly lignin (Hetti Palonen, 2004)

Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu trúc Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu Lignin trong tế bào thực vật bậc cao hơn không có vùng vô định hình Các vòng phenyl trong lignin của gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào Ngoài ra, cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng polysaccharide

Hình 2.9 Cấu tạo lignin

(http://www.hcs.ohio-state.edu/hcs300/biochem3.htm)

Việc mô hình hóa động học phân tử cho thấy rằng nhóm hydroxyl và nhóm methoxyl trong các oligomer tiền lignin sẽ tương tác với vi sợi cellulose cho dù bản chất của lignin là kỵ nước

Nhóm chức ảnh hưởng đến hoạt tính của lignin là nhóm phenolic hydroxyl tự do, methoxy, benzylic hydroxyl,ether của benzylic với các rượu thẳng và nhóm carbonyl Guaicyl lignin chứa nhiều nhóm phenolic hydroxyl hơn syringyl Lignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và ngay cả với cellulose (không nhiều) độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết và cấu trúc hóa học của lignin và những đơn vị đường tham gia liên kết (Nguyễn Đức Lượng, 2001) Carbon alpha (C) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất với khối

hemicellulose Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và axít 4 - O - methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin Các liên kết có thể

là ether, ester (liên kết với xylan qua axít 4 - O - methyl - D - glucuronic), hay glycoxit (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin)

Cấu trúc hóa học của lignin dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn

2000C, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose Những nghiên cứu trước đây cho thấy đối với gỗ cứng, nhóm ether - O-4 aryl bị phá trong quá trình nổ hơi Đối với gỗ mềm, quá trình nổ hơi làm bất hoạt các nhóm hoạt động của lignin ở vị trí  như nhóm hydroxyl hay ether, các nhóm này bị oxy hóa thành carbonyl hoặc tạo cation benzylic, cation này sẽ tiếp tục tạo liên kết C - C (Hetti Palonen, 2004)

2.8.4 Enzyme thủy phân lignocelluloses

2.8.4.1 Tổng quan về cellulase

Trong hầu hết các vật liệu lignocelluloses, cellulose là một trong ba thành phần chính Cellulose bao gồm phần không hòa tan và chuối tuyến tính của β - (1→ 4) liên kết với các đơn vị glucose với một cấp độ trung bình của liên kết polymer khoảng

10000 đơn vị nhưng có thể thấp nhất là 15 đơn vị (Eveleigh, 1987) Nó bao gồm các vùng tinh thể và các vùng vô định hình (không phải tinh thể) tạo thành một cấu trúc có

độ bền cao, nói chung là đề kháng với sự thủy phân của enzyme, đặc biệt là các vùng tinh thể (Walker và Wilson, 1991)

Cellulase chịu trách nhiệm cho quá trình thủy phân của cellulose, nó bao gồm một hỗn hợp phức tạp của các protein enzyme với đặc điểm riêng khác nhau để thủy phân những liên kết glycoside Cellulase có thể được chia thành ba lớp enzyme hoạt động chính (Goyal và ctv, 1991; Rabinovich và ctv, 2002): endoglucanase hoặc endo-1,4 - β - glucanase, cellobiohydrolase và β -glucosidase Endoglucanase thường gọi là carboxymethylcellulose (CM), được xem là khởi sự cho cuộc tấn công ngẫu nhiên tại nhiều vị trí nội bộ trong khu vực vô định hình các vị trí mở của các sợi cellulose, tạo thuận lợi cho các cuộc tấn công tiếp theo của cellobiohydrolase (Wood, 1991)

Cellobiohydrolase, thường được gọi là một exoglucanase, thành phần chính của cellulose nấm chiếm khoảng 40 - 70% của cellulose tổng và có thể thủy phân cellulose tinh thể (Esterbauer và ctv, 1991) Cellobiohydrolase loại bỏ mono - và các dimer từ cuối chuỗi glucose Thủy phân β - glucosidase, các dimer glucose và trong một số trường hợp các cello - oligosaccharide thành glucose Nói chung, endoglucanase và cellobiohydrolase làm việc đồng thời trong quá trình thủy phân cellulose nhưng các chi tiết của cơ chế tham gia vẫn chưa rõ ràng (Rabinovich và ctv, 2002)

ủa vi khuẩncủa xạ khuẩ

un tròn ucanase ; en

- β -glucan

và mannase

m kị khí của nấm sợiglucanase

vật thường x

v, 1987; Sh

à những procác họ cel

i và vi khuẩ

xuất hiện nh

en và ctv, otein đa milulose hiện

ẫn không cabinovich v

cellulase

0-%20Cellu

yễn Đức Lư

Số hiệu 3.2.1.78 3.2.1.4 3.2.1.4

3.2.1.58 3.2.1.4/733.2.1.39 3.2.1.4 3.2.1.78 3.2.1.4 3.2.1.75 3.2.1.123

t của endo hemicellulahắc chắn tr

và ctv, 20

lase.asp)

ượng, 2004

H5/A5/A5/A

5/A

5/A5

- exo glucaase hầu hếtrong định n002) Bảng

)

ọ A1 A2 A3

(Rabinovich và ctv, 2002) cho thấy phân loại hiện tại của các cellulase (Rabinovich và ctv, 2002) Phân loại này bao gồm họ 10/F xylanase và các xylanse thuộc họ 11/G đặc trưng cho sự phân giải xylan nhưng không bao gồm họ 16 và 17, trong đó bao gồm 1,

3 (4) - β - glucanase có hoạt động tương tự với 1, 4 - β - glucanase

2.8.4.2 Tổng quan về lignase

Hai hệ enzyme lignolytic được coi là đóng một vai trò quan trọng trong việc làm suy thoái lignin là: phenol oxidase (laccase); peroxidase (lignin peroxidase LIP) và peroxidase mangan (MNP) (Krause và ctv, 2003; Malherbe và Cloete, 2003) Các enzyme có vai trò không rõ ràng bao gồm các enzyme sản xuất H2O2: glyoxal oxidase (Kersten và Kirk, 1987); glucose oxidase (Kelley và Reddy, 1986); các veratryl oxidase (Bourbonais và Paice, 1988); methanol oxidase (Nishida và Eriksson, 1987)

và oxido- reductase (Bao và Renganathan, 1991)

Enzyme tham gia vào việc phá hủy lignin quá lớn để thâm nhập vào các thành tế bào nguyên vẹn của thực vật vì vậy các câu hỏi phát sinh là làm thế nào để lignase ảnh hưởng đến sự phân hủy sinh học lignin

Câu trả lời tạm thời được chấp nhận là lignase sử dụng phân tử thấp, những hợp chất phản ứng có thể khuếch tán để tạo các thay đổi ban đầu đến cơ chất lignin (Call

Hình 2.11Cấu trúc của hemicellulose

(http://ifbholz.ethz.ch/natureofwood/pc/ch/ch12.html)

Hemicellulose thường được kết hợp với amylase, glucanase, cellulase hoặc xylanase

Hemicellulase thương mại là các enzyme chứa các thành phần xylanase, mananase

từ Aspergillus niger Product Number H2125

3 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN

CỨU

3.1Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện từ 15/12/2012 đến 25/06/2013

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng vi sinh của viện Sinh Học Nhiệt Đới, số 9/621 xa lộ Hà Nội, khu phố 6, phường Linh Trung, quận Thủ Đức, TP Hồ Chí Minh

3.2Vật liệu

Các mẫu bùn được thu thập từ nhiều nguồn khác nhau:

Nhà máy chế biến gỗ Đồng Nai (N), bùn ô nhiễm sông Đồng Nai (O), ruộng rau muống Thủ Đức (R1), ruộng rau muống Biên Hòa (R2), ruộng rau muống Quận 12 (R3), bùn ruộng An Sương (BR), bùn sông Đồng Nai (BS), bùn đất Tiền Giang (BD), bùn cống nước thải sinh hoạt Thủ Đức 1 (BC1), bùn cống nước thải sinh hoạt Thủ Đức

2 (BC2), kênh nước thải Thủ Đức 1(K1), kênh nước thải Thủ Đức 2 (K2), ruộng lúa Long An (LA), ao tù Tiền Giang (TG)

Các mẫu bùn được thu nhận từ nhiều nguồn về được bảo quản trong hộp nhựa và giữ ở 40C trong tủ lạnh

Rơm rạ được lấy từ một cánh đồng lúa tại Đồng Nai

3.3Môi trường nuôi cấy

Môi trường PCS: tryptone (5 g/l), yeast extract (1 g/l), NaCl (5 g/l), CaCO3 (5 g/l), rơm (24 g/l), cysteine-HCl (0,5 g/l)

Môi trườngRM chưa khử: urê (2 g/l), KH2PO4 (2 g/l), K2HPO4 (3 g/l), yeast extract (2 g/l), L - cystein hydrochloride (1 g/l), resazurin (0,002 g/l), dung dịch khoáng: MgCl2.6H2O (20 g/l), CaCl2.2H2O (5 g/l), FeSO4.7H2O (0,25 g/l).

3.4.Phương pháp nghiên cứu

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Mẫu

Nuôi cấy với môi trường PCS và RM chưa khử ở nhiệt độ 500C và 600C

Khảo sát khả năng phân hủy giấy lọc của vi sinh vật trên hai môi trường ở hai

nhiệt độ 500C và 600C

Chọn ra được môi trường,nhiệt độ nuôi cấy và mẫu phân hủy giấy lọc cao

Khảo sát ngày nuôi cấy tối ưu nhất trong 30 ngày

Đưa ra quy trình và mẫu thủy phân và lên men rơm rạ tạo ethanol tối ưu nhất

trong quá trình thí nghiệm Khảo sát mẫu tiền xử lý bùn với nhiệt và axít H2SO4

3.4.1Nuôi cấy khảo sát với môi trường

Quá trình nuôi cấy nhóm vi sinh vật:

- Lấy 60 ml môi trường nuôi cấy PCS hoặc RM chưa khử và cân 1,5 g rơm đã được sấy khô và 3 mảnh giấy lọc kích thước 1x6 (50 mg) cho vào bình thủy tinh

100 ml được đậy kín bằng nút cao su và nắp nhôm

- Sau khi đóng nắp nhôm bình nuôi cấy, tiến hành cắm kim tiêm vào bình nuôi cấy rồi đem đi hấp khư trùng ở 1210C trong 20 phút (cắm kim tiêm với mục đích tránh trong quá trình hấp nhiệt độ và áp suất cao làm vỡ bình nuôi cấy)

- Cân 5g mẫu bùn cấy vào bình môi trường đã hấp khử trùng

Hình 3.2 Bình môi trường nuôi cấy vi sinh vật 3.4.2Phương pháp tách chiết enzyme

Bước 1: Tiến hành thu dịch nuôi cấy từ bình nuôi cấy 100 ml trong tủ cấy và sử dụng micropipep để hút dịch ra eppendoft

Bước 2: Lọc qua giấy lọc để loại bỏ tạp chất

Bước 3: Ly tâm lạnh 10000 vòng trong 4 phút

Bước 4: Thu được dịch enzyme

3.4.3.Các phương pháp phân tích

3.4.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính FPase

Nguyên tắc:Dựa trên nguyên tắc thủy phân giấy lọc whatman No.1 để tạo ra đường trong thời gian ủ một giờ đồng hồ Phương pháp này của Madels (1975) bằng cách lấy 50 mg giấy lọc ủ với 0,5 ml dịch enzyme thô ở nhiệt độ 500C, pH 7,0 với tổng

thể tích là 1,5 ml trong một giờ (Chandra và ctv, 2008; Karmakar và Ray, 2011)

Hóa chất và vật liệu:

Giấy lọc: Sử dụng găng tay cao su, kẹp và kéo cắt giấy lọc với kích thước 1 x 6

cm, tương ứng với khối lượng 50 mg (cân và điều chỉnh lại giấy lọc cho chính xác) Thuốc thử DNS (3,5 - dinitrosalicylic axít): Hòa tan 10,6 g DNS và 19,8 g NaOH trong 1416 ml nước cất Sau khi hòa tan hoàn toàn, cho thêm 350 g muối Rochelle (KNaC4H4O6) và 7,6 ml phenol ở 50oC, 8,3 g Na2S2O5 Lưu trữ trong chai sẫm màu và bảo quản lạnh Lưu ý: DNS có thể bảo quản lạnh ở 40C trong nhiều nhất một tháng Nếu để lâu nó có thể mất khả năng sử dụng)

Đệm citrate 1M, pH 4,5:Hòa tan 201 g axít citric 98% với 750 ml nước cất Thêm 50 - 60 g NaOH đến tan hoàn toàn.Tiếp tục thêm nước cất đến 1000 ml, đo chỉnh pH=4,5 bằng cách thêm NaOH.Đệm citrate 4,8: Tử đệm citrate 4,5 thêm nước

cất tỉ lệ (1 đệm : 19 nước cất) để được dung dịch đệm citrate pH 4,8

Dung dịch glucose standard stock - 1 g/l: Cân 0,1 g glucose hòa tan trong nước cất, pha thành 100 ml dung dịch

Tiến hành:

Bước 1: Cho giấy lọc (1 x 6 cm, 50 mg) đã cuộn tròn vào ống nghiệm

Bước 2:Cho thêm 1 ml dung dịch đệm citrate (pH 4,8) vào ống nghiệm (giấy lọc phải chìm trong dung dich đệm)

Bước 3:Chuẩn bị enzyme đã được pha loãng, một tạo ra hơn 2 mg đường và một

ít tạo ra ít hơn 2 mg đường

Bước 4:Chuẩn bị pha loãng đường chuẩn (GSs) như sau:

GS1: 1,0 ml glucose standard stock + 4,0 ml đệm = 2 mg/ml (1,0 mg/ 0,5 ml) GS2: 1,0 ml glucose standard stock + 2,0 ml đệm = 3,3 mg/ml (1,65 mg/ 0,5 ml) GS3: 1,0 ml glucose standard stock + 1,0 ml đệm = 5 mg/ml (2,5 mg / 0,5 ml) GS4: 1,0 ml glucose stanndard stock + 0,5 ml đệm = 6,7 mg/ml (3,35 mg/ 0,5 ml)

Thêm 0,5 ml dung dịch của GS1 - 4 vào ống nghiệm và thêm 1 ml đệm acetate

Bước 5: Ống blank và ống controls:Reagent blank (RB): 1,5 ml đệm acetate Enyme control (EC1-2): 1,0 ml đệm acetate + 0,5 ml enzyme pha loãng Subtrate control (SC1 - 2): 1,5 ml đệm acetate + mảnh giấy lọc

Bước 6: Ủ ấm trước ở 50oC những dung dịch enzyme (được pha loãng), blank và controls đến khi trạng thái cân bằng (nghĩa là nhiệt độ dung dịch bằng nhiệt độ bể ủ, khoảng 10 phút)

Bước 7: Thêm 0,5 ml dung dịch enzyme pha loãng vào ống nghiệm có cơ chất giấy lọc (E1-E3), thêm 0,5 ml enzyme pha loãng vào ống nghiệm không có giấy lọc (EC1 -EC2)

Bước 8: Ủ những ống nghiệm E1 - 3, GSs, RB, EC1 - 2 và SC1-2 ở 500C trong

bể ủ nhiệt khoảng 60 phút

Bước 9: Thêm 3 ml DNS reagent để dừng phản ứng và trộn đều

Bước 10: Đun cách thủy các ống nghiệm trong 5 phút

Bước 11: Chuyển các ống nghiệm đến một bể nước lạnh để làm nguội

Bước 12: Hút 10 ml nước cất cho vào mỗi ống nghiệm rồi vortex

Bước 13: Đo ở bước sóng 540nm và ống RB được sử dụng làm ống Blank

Tính toán:

Vẽ đường chuẩn glucose 1 g/l (hàm lượng glucose nằm trên trục x, độ hấp thụ ở 540nm nằm trên trục y)

Tính hàm lượng đường được giải phóng bởi phản ứng thủy phân theo công thức:

∆OD = OD (Test) - OD (EC) - OD (SC)

Sử dụng phương trình của đường chuẩn để tính hàm lượng đường khử thực sự được giải phóng bởi phản ứng thủy phân

Hoạt tính enzyme được tính theo công thức:

FPU (Filter paper unit) (UI) = (mg glucose được giải phóng) x 0,185