NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ÁP DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌMTẠM THỜITỰ TẠO TRONG VI NHÂN GIỐNGMÍA ĐƯỜNG KU00161

Mặc dù đã áp dụng phương pháp nuôi cấy mô trong việc sản xuất giống mía mới nhưng giá thành của sản phẩm vẫn còn ở mức cao, nguyên nhân chính là do các thao tác trong qua trình thực hiện

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ÁP DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌMTẠM THỜITỰ TẠO TRONG

VI NHÂN GIỐNGMÍA ĐƯỜNG KU00-1-61

Ngành học CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiệnNGỌ THỊ THẮM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ÁP DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌMTẠM THỜITỰ TẠO TRONG

VINHÂN GIỐNGMÍA ĐƯỜNG KU00-1-61

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn đến:

Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm

Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả các quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian 4 năm tôi học tập tại trường

Cô Tôn Bảo Linh, giảng viên Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã hướng dẫn tận tình, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học

Công ty Thành Thành Công đã hỗ trợ tôi rất nhiều cả về mặt vật chất và tinh thần, tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Gia đình bác Nguyễn Văn Cài, Ấp 11 thị trấn Thủ Thừa, huyện Thủ Thừa, tỉnh Long An đã cung cấp nguồn giống cho tôi thực hiện thí nghiệm trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận

Các anh chị và các bạn làm việc trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình hướng dẫn động viên và giúp đỡ tôi mỗi khi tôi gặp khó khăn

Bạn Clarisse Blanchard đã hợp tác, giúp đỡ,trao đổi kinh nghiệm cùng tôi trong quá trình tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp

Con xin cảm ơn bố mẹ, anh chị đã nuôi dưỡng, yêu thương con, luôn tạo điều kiện tốt nhất để con học tập cho tới ngày hôm nay

Cảm ơn tất cả các bạn, các thành viên trong trong tập thể lớp DH09SH đặc biệt là nhóm bạn thân Kute8girl đã luôn luôn hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian tôi học tập tại trường cũng như những lúc tôi gặp khó khăn trong cuộc sống

Thành Phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 6 năm 2013 Sinh viên thực hiện

Ngọ Thị Thắm

TÓM TẮT

Mía là nguồn nguyên liệu chủ yếu của ngành công nghiệp đường trên thế giới.Cùng với sự phát triển kinh tế toàn cầu, nhu cầu tiêu thụ đường trên thế giới ngày càng gia tăng.Trên thực tế, những giống mía có trữ lượng đường cao chưa đến được với tất cả người nông dân do giá thành nguồn giống vẫn còn khá đắt Mặc dù đã áp dụng phương pháp nuôi cấy mô trong việc sản xuất giống mía mới nhưng giá thành của sản phẩm vẫn còn ở mức cao, nguyên nhân chính là do các thao tác trong qua trình thực hiện thí nghiệm khó phảicần người có trình độ kĩ thuật cao.Vi nhân giống mía đường KU00-1-61 trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời tự tạo sử dụng môi trường nuôi cấy lỏng là phương pháp vi nhân giống mới đang được áp dụng phổ biến hiện nay trong việc sản xuất nguồn giống để đáp ứng cho nhu cầu sản xuất đại trà

Nghiên cứu bao gồm 2 nội dung chính là thiết kế, lắp đặthệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời tự tạo và tìm hiểu khả năng vi nhân giống mía đường KU00-1-61 trong

hệ thống ngập chìm tạm thời tự tạo bằng cách khảo sát ảnh hưởng của kích thước mẫu đến khả năng tái sinh, tạo mô sẹo từ lá mía non và khảo sát khả năng tạo chồi của mẫu sẹo mía, khả năng tăng sinh chồi và tạo rễ của mẫu chồi mía trên 2 dạng môi trường nuôi cấy bán rắn và môi trường nuôi cấy lỏng.Về thiết kế, lắp đặt hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời: đã thiết kế, lắp đặt, hệ thống hoạt động khá tốt và được áp dụng cho nuôi cấy các nghiệm thức trong thí nghiệm 2 và thí nghiệm 3.Về quá trình cảm ứng tạo mô sẹo từ lá mía non cho thấy kích thước mẫu tốt nhất là 0,5 cm x 0,5 cm cho sựtạo thành mô sẹo trong môi trường MS cơ bản có bổ sung 2,4 D nồng độ 2 mg/l.Thí nghiệm tạo chồi trên 2 hệ thống nuôi cấy cho thấy hệ thống nuôi thấy ngập chìm tạm thời tự tạo sử dụng môi trường nuôi cấy lỏng đặt trong điều kiện nhiệt độ phòng cho hiệu quả tạo chồi từ mô sẹo thấp hơn (5,767 chồi với chiều cao trung bình 0,467 cm)

so với hệ thống nuôi cấy truyền thống sử dụng môi trường bán rắn đặt trong điều kiện phòng tăng trưởng (24,567 chồi và chiều cao trung bình đạt 0,733 cm) Tuy nhiên khả năng tạo rễ của cây mía trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời tự tạo lại tốt hơn

so với khả năng tạo rễ khi nuôi cấy trong hệ thống nuôi cấy truyền thống (2,68 rễ/chồi với chiều dài rễ trung bình 1,567 cm so với 2,34 rễ/chồi và chiều dài rễ trung bình là 0,5 cm)

SUMMARY

Thesis titled: “Study of the potential application of the self-built temporary immersion system in sugarcane micropropagation KU00-1-61” was carried out at the Department of Biotechnology, Nong Lam University, Ho Chi Minh city from December 15th2012 to June15th2013

Sugarcane is the main cash of sugar industry in the world.Along with the development of the global economysugar demand is increasing The sugarcane varieties with high sugar reserveshave not reached to the farmers because prices of seed are still quite expensive eventhough mcropropagation has been applied in commercial seed production The plant tissue culture requires skilled perfomers, which makes the cost for seed production become expensive Therefore, temporary immersion system is widely applied inrapid multiplication of sugarcane to supply seeds at reasonable price

The study included 2 main contents which is design, installation of self-built temporary immersion system andevaluation of the potential application of the selt-built system in micropropagation of the sugarcane variety KU00-1-61 through comparison

of multiplication efficiency of the explants in two types of the culture medium is solid and liquid medium

semi-The results show that the size of sample 0.5cm x 0.5cm is the best one size for callus formation of on the basic MS medium supplemented 2,4-D at the concentration

of 2 mg/l.The experiment on the 2 culture systemsshowed that liquid culture systems

at room temperature conditions resulted in lower shoot number than conventional

culture system underin vitro culture conditions, 5.767 shoots with the average height

0.467 cm compared to 24.567 shoots with average height 0.733 cm However, TIS proved to be more efficient better than semi-solid media during root induction stage grow room conditions 2.68 roots/shoot with average long 1.567 cm compared to 2.34 roots/shoot with average long 0.5 cm

Keyword: Liquid culture medium, Bioreactor system, Sugarcane, Sugarcane breeding, Temporary Immersion System, Semi-solid media

MỤC LỤC

Trang 

Lời cảm ơn i 

Tóm tắt ii 

Summary iii 

Mục lục iv 

Danh sách chữ viết tắt vii 

Danh mục các bảng viii 

Danh mục các hình ix 

Chương 1 MỞ ĐẦU 1 

1.1Đặt vấn đề 1 

1.2Yêu cầu của đề tài 2 

1.3Nội dung thực hiện 2 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 

2.1Sơ lược về cây mía 3 

2.1.1Phân loại mía 3 

2.1.2Đặc điểm phân bố của cây mía 3 

2.1.3Đặc điểm thực vật học của cây mía 4 

2.1.3.1Các bộ phận của cây mía 4 

2.1.3.2 Các giai đoạn sinh trưởng và chu kì phát triển của cây mía 4 

2.2Đặc điểm một số giống mía trong nước có năng suất cao 6 

2.2.1 Giống mía K95-156 6 

2.2.2 Giống mía Suphanburi 7 6 

2.2.3 Đặc điểm giống mía KU00-1-61 7 

2.3Giá trị kinh tế của cây mía 8 

2.4Tình hình sản xuất và tiêu thụ đường mía trên thế giới và ở Việt Nam 9 

2.4.1Tình hình sản xuất và tiêu thụ đường mía trên thế giới 9 

2.4.2Tình hình sản xuất và tiêu thụ đường mía ở Việt Nam 9 

2.5Các công trình nghiên cứu nuôi cấy mô cây mía 11 

2.5.1Các công trình nuôi cấy mô trong nước 11 

2.5.2Các công trình nuôi cấy mô nước ngoài 12 

2.6 Áp dụng hệ thống ngập chìm tạm thời trong nuôi cấy mô 12 

2.6.1 Lịch sử ra đời hệ thống ngập chìm tạm thời 12 

2.6.2 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống 13 

2.6.3 Các loại hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 13 

2.6.4 Ưu và khuyết điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 15 

2.6.4.1 Ưu điểm của hệ thống ngập chìm tạm thời 15 

2.6.4.2 Khuyết điểm của hệ thống ngập chìm tạm thời 16 

2.7Các giai đoạn vi nhân giống mía in vitro 17 

2.8Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô 20 

2.8.1 Mô nuôi cấy 20 

2.8.2Điều kiện vô trùng trong nuôi cấy 20 

2.8.3Điều kiện nuôi cấy 21 

2.9Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy trong hệ thống TIS 23 

2.9.1 Thời gian ngập chìm 23 

2.9.2 Thể tích môi trường dinh dưỡng 24 

2.9.3 Thể tích bình nuôi cấy 24 

2.9.4 Sự thoáng khí tự nhiên và thoáng khí cưỡng bức 25 

2.10 Ảnh hưởng của hệ thống TIS đến chất lượng giống cây trồng 25 

2.10.1 Đặc điểm hình thái của thực vật sản xuất từ các hệ thống TIS 25 

2.10.2 Hiện tượng thủy tinh thể 25 

2.11Vai trò các chất kích thích tăng trưởng trong nuôi cấy 26 

2.11.1Auxin 26 

2.11.2Cytokynin 26 

2.11.3Gibberellin 27 

2.11.4Ảnh hưởng của pH và agar 27 

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28 

3.2Vật liệu 28  3.2.1Nguồn mẫu thí nghiệm 28 

3.2.2 Các dụng cụ và thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 28 

3.2.2.1 Dụng cụ 28 

3.2.2.2Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 28 

3.2.3 Hóa chất 29 

3.2.4Điều kiện nuôi cấy 29 

3.2.4.1Điều kiện nuôi cấy trong phòng tăng trưởng 29 

3.2.4.2 Điều kiện nuôi cấy phòng 29 

3.3Phương pháp nghiên cứu 29 

3.3.1Nội dung 1 Thiết kế hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 29 

3.3.2Nội dung 2 Tìm hiểu khả năng vi nhân giống mía đường KU00-1-61 32 

3.3.2.1 Thí nghiệm 1 32 

3.3.2.2 Thí ngiệm 2 33 

3.3.2.3 Thí nghiệm 3 34 

3.4Phương pháp xử lí số liệu 35 

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 

4.1 Nội dung 1 Thiết kế hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 36 

4.2 Thí nghiệm 1 37 

4.2.1 Số mẫu tạo sẹo tốt 39 

4.2.2 Số mẫu tạo sẹo xấu 39 

4.2.3 Số mẫu chết 40 

4.3 Thí nghiệm 2 40 

4.3.1 Số mẫu tạo chồi và số lượng chồi 42 

4.3.2 Chiều cao chồi 42 

4.4 Thí nghiệm 3 44

4.4.1 Chiều caochồi……… 45

4.4.2 Số lượng chồi và số lượng rễ 45 

4.4.3 Chiều dài rễ 45 

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 

5.1 Kết luận 48 

5.2 Đề nghị 48 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D: 2,4 – dichlorophenoxy acetic acid

AC: Activated Charcoal – Than hoạt tính

APCS: Hệ thống nuôi cấy tự động

BA: Benzyladenine

CCS: Comercial cane sugar - Trữ lượng đường trong mía

Ctv: Cộng tác viên

CV: Coefficient of Variation – Độ biến thiên

EDTA: Ethylen Diamin Tetra Acetat

FAO: Tổ chức nông- Lương Liên hiệp quốc

IBA: 1H – indol – 3 – buyric acid

3 – indolebutyric acid

4 – (indol – 3 – yl) butyric acid

MS: Murashige and Skoog

NAA: 1 – naphathalene acetic acid

NN&PTNT: Nông nghiệp và phát triển nông thôn

NR: Chưa có báo cáo

NSC: Ngày sau cấy

TIS: Temporary Immersion System -Hệ thống muôi cấy ngập chìm tạm thời WTO: Tổ chức thương mại thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất mía đường Việt Nam từ năm 2000 đến 2009…… … 10

Bảng 2.2 Sự phân bố diện tích trồng mía của nước ta……….… … 11

Bảng 2.3 Các hình thức vi nhân giống mía đường……… 18

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm 1 ……… ……33

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 2……… …… 34

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm 3……… …….…….…35

Bảng 4.1 Sự ảnh hưởng của kích thước vô mẫu tới sự tạo thành mô sẹo… ……… 38

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tạo chồi từ mô sẹo……… … 41

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tăng sinh chồi và tạo rễ mía …44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1Các bộ phận của mía ……… …….…3

Hình 2.2 Hình thái giống mía KU00-1-61……… ………7

Hình 2.3Hệ thống RITA ……… …….……14

Hình 2.4 Hệthống BIT……….….…….…….…….14

Hình 2.5Hệ thống hệ thống Plantima……… … ……… 15

Hình 2.6 Các vị trí lấy mẫu trên cây mía………… ……… 18

Hình 3.1 Máy bơm khí……….……….30

Hình 3.2 Hệ thống cài đặt thời gian……… 30

Hình 3.3 Một đơn vị bình nuôi cấy……… ………… … 30

Hình 3.4 Mô hình hệ thống nuôi cấy ngập tạm thời kì tự tạo….……….….32

Hình 4.1 Sơ đồ hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời………… ……… 36

Hình 4.2 Các loại mô sẹo……… ……… 38

Hình 4.3 Mô sẹo……… ……….….38

Hình 4.4 Chồi mía sau 7 ngày nuôi cấy từ mô sẹo……… ………41

Hình 4.5 Chồi mía sau một tháng nuôi cấy từ mô sẹo……… 41

Hình 4.6 Chồi mía sau 15 ngày nuôi cấy trong môi trường tạo rễ……… …………46

Hình 4.7 Các giai đoạn vi nhân giống mía áp dụng hệ thống ngập chìm tạm thời… 46

và thường xuyên Chính nhờ vào các giống mía mới có năng suất cao, giàu đường và chống chịu tốt các điều kiện bất lợi tự nhiên, kháng sâu bệnh mà nền sản xuất mía đường ở nhiều nước đã được phát triển tiêu biểu như Úc, Brazil, Ấn Độ, Đài Loan Công tác nghiên cứu giống mía trong nước kể từnăm 1986 cho đến nay đã có những kết quả đáng kể, đặc biệt là sau khi có chương trình 1 triệu tấn đường ra đời vào năm 1995 Từ kết quả các chương trình, đề tài, dự án nghiên cứu cấp Nhà Nước, cấp

Bộ, thông qua các chương trình khuyến nông, phát triển sản xuất giống, diện tích các giống mía mới trong cơ cấu ngày càng nâng cao, nhờ đó năng suất, chất lượng mía nguyên liệu cũng ngày càng được cải thiện Tuy nhiên, so với các nước trồng mía khác

ở khu vực Đông Nam Á, năng suất mía bình quân ở nước ta vẫn còn ở mức khá thấp

52 tấn/ha so với 70 tấn/ha (www.baomoi 2011.com), chất lượng mía không cao, trữ lượng đường chỉ vào khoảng 10 Comrcial Cane Sugar (CCS).Một trong những nguyên nhân của tình trạng trên chính là chất lượng nguồn giống ban đầu chưa cao, những giống mía có hàm lượng CCS cao chưa đến được tay người trồng Thực tế cho thấy nếu ép cùng một khối lượng mía, thì nguyên liệu nào có trữ lượng đường mía cao hơn

sẽ cho trữ lượng đường cao hơn nghĩa là tăng được sản phẩm đường với cùng một chi

phí.Vi nhân giống in vitro là phương pháp tối ưu để nhân nhanh nguồn vật liệu mía ban đầu.Ngay từ đầu công nghệ nhân giống invitro ra đời người ta đã tiến hành nuôi

cấy trên môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng, đây là phương pháp có thể áp dụng để sản xuất ra một lượng lớn cây con trong thời gian ngắn Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp một số khó khăn lớn

như tỉ lệ mẫu nhiễm vi sinh vật (nấm, vi khuẩn) vẫn còn cao, đòi hỏi các thao tác kĩ thuật phải thật tốt nên tốn nhiều chi phí cho nhân công dẫn đến giá thành sản phẩm vẫn còn cao Một phương pháp mới ra đời có thể nhân nhanh số lượng nguồn vật liệu mẫu ban đầu hơn và tỉ lệ mẫu nhiễm cũng ít hơn so với phương pháp nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy bán rắn truyền thống Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System) là bước cải tiến từ hệ thống muôi cấy bioreactor nhưng mẫu cấy chỉ được ngập trong môi trường nuôi cấy (môi trường lỏng) một thời gian ngắn theo chu kì nhất định đã được cài đặt sẵn nên phương pháp này giảm được hiện tượng thủy tinh thể của mẫu, giảm thỉ lệ mẫu chết khi đem cây ra vườn trồng Đây được xem là phương pháp mới cải thiện những nhược điểm của 2 phương pháp nuôi cấy cũ (phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn và phương pháp bioreactor) Từ mong muốn áp dụng hệ thống nuôi cấy mới trong nuôi cấy mô, đặc biệt trong việc nhân nhanh giống mía có năng suất cao, được sự hỗ trợ của công ty Thành Thành Công đề tài: “Tìm hiểu khả năng áp dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìmtạm thời tự tạo trong vi nhân giống míađường KU00-1-61” đã được tiến hành

1.2 Yêu cầu của đề tài

Đề tài nghiên cứu nhằm thiết kếhệ thống nuôi cấyngập chìmtạm thời và tìm hiểu khả năng vinhân giốngmía đườngKU00-1-61 trong hệ thống tự thiết kế

1.3 Nội dung thực hiện

(1) Thiết kế, lắp đặt hệ thống ngâm chìm tạm thời

(2) Tìm hiểu khả năng vi nhân giống mía đườngKU00-1-61 trong hệ thống ngập chìm tạm thời bằng cách thực hiện các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của kích thước mẫu đến khả năng tái sinh, tạo mô sẹo từ lá mía non và khảo sát khả năng tạo chồi của mẫu sẹo mía, khả năng tăng sinh chồi và tạo rễ của mẫu chồi mía trên 2 dạng môi

trường nuôi cấy bán rắn và môi trường nuôi cấy lỏng

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây mía

2.1.1 Phân loại mía

Cây mía thuộc:

Ngành có hạt (Spermatophyta)

Lớp một lá mầm (Monocotyledoneae)

Họ hòa thảo (Gramineae)

Giống Saccharum

Trong giống Saccharum có năm loài:

 Loài nhiệt đới (Saccharum officinarum L.)

 Loài Trung Quốc

(Saccharum sinence Roxh Ement Jesw)

 Loài Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw)

 Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.)

 Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround and Jesw)

Các giống mía thương mại hiện nay là sản phẩm lai tự nhiên, lai nhân tạo giữa

cácloài kể trên với nhau hoặc do quá trình tuyển chọn từ ba loài Saccharum

officinarum, Saccharum sinence, Saccharum barberi (Trần Văn Sỏi, 2003)

2.1.2 Đặc điểm phân bố của cây mía

Hiện nay, cây mía là cây trồng chính ở nhiều nước nhiệt đới trên thế giới Nơicó vĩ độcao nhất mà cây mía được trồng là Natal, Argentina, cực nam của Australia (khoảng

30 độ Nam), phía tây nam Pakistan (khoảng 34 độ Bắc) và phía nam Tây Ban Nha (37

độ Bắc) (Phan Gia Tân, 1990)

Hình 2.1 Các bộ phận của cây mía

(www.google.com.vn)

2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây mía

2.1.3.1 Các bộ phận của cây mía

Cây mía gồm 5 bộ phận chínhlà rễ, thân, lá, hoa và hạt.Rễ mía gồm hai loại rễ là rễ

sơ sinh và rễthứ sinh Rễsơ sinh (còn gọi là rễ hom) mọc ra từ đai rễ củahom trồng; loại rễ này có nhiệm vụ bám đất, hút nước, cung cấp chất dinh dưỡng cho sự nảy mầm

ở thời kìđầu sinh trưởng Khi mầm mía chuyển thành cây con,các rễ thứ sinh mọc ra từ đai rễ của cây con tự hút nước và chất dinh dưỡng để cung cấp cho cây, các rễ sơ sinh

sẽ teo dần và biến mất Thân mía được hình thành bởi nhiều lóng mía hợp lại, có màu sắc và hình dạng khác nhau

Thân mía không chỉ là nơi để giữ bộ lá mà còn có nhiệm vụ dẫn nước, chất dinh dưỡng từ rễ tới lá và dự trữ đường nhờ quá trình quang hợp ở bộ lá Thân mía là đối tượng thu hoạch và là nguyên liệu chính để chế biến đường ăn Bộ phận tiếp theo là lá,

Lá míagồm có bẹ lá và phiến lá Bẹ lá là phần bao bọc thân mía, bảo vệ mắt mầm Phiến lá có hình lưỡi mác (màu xanh hoặc màu xanh thẫm), có một gân giữa màu sáng

và hình dáng, kích thước khác nhau tùy giống Lá míalà tổ chức đồng hóa thực sự của cây, lá có nhiệm vụ hô hấp và thực hiện quá trình quang hợp

Hoa hay còn gọi là bông cờ có tổ chức sinh sản ngầm với cấu trúc đơn giản Mỗi hoa bao gồm cả tính đực và tính cái với ba nhị, một bầu noãn và hai nhụy Khi hoa mía

nở, các bao phấn của nhị tung phấn, nhờ gió mà nhụy cái dễ dàng tiếp nhận hạt phấn

Ở cây mía, có giống ra hoa, có giống không ra hoa, có giống ra hoa sớm, có giống ra hoa muộn Đó là kết quả sinh lý tự nhiên của cây trồng nói chung và cây mía nói riêng Tuy nhiên, trong sản xuất người ta không thích mía ra hoa Bộ phận cuốicùng là hạt mía, hạt míalà vật liệu sinh sản hữu tính, đây là kết quả cuối cùng của giai đoạn sinh thực Hạt mía giống một chiếc vảy nhỏ, hình thoi và nhẵn, độ dài 1 - 1,25 mm,nặng 0,15 - 0,25 mg Hạt mía chỉ có ý nghĩa trong lai tạo tuyển chọn giống mía (Nguyễn Huy Ước, 1999; Trần Thùy, 1996)

2.1.3.2 Các giai đoạn sinh trưởng và chu kì phát triển của cây mía

Theo Đoàn Thị Thanh Nhàn (1996), chu kì sinh trưởng của cây mía gồm 5 thời kì Thời kì nảy mầm là thời kì được tính từ khi đặt hom trồng cho tới lúc mầm mía nảy thành cây con, mở đầu cho hoạt động sống của cây mía.Thời kì cây con, thời kì này

bắt đầu từ khi cây có lá thật thứ nhất cho đến khi phần lớn cây trong ruộng mía có 5 lá thật Rễ cây bắt đầu phát triển khi cây con có hai lá thật, như vậy trong suốt thời gian đầu cây con sống một phần dựa vào rễ hom Sau khi rễ cây đã phát triển mạnh thì nhiệm vụcung cấp dinh dưỡng chính do rễ cây đảm nhiệm Do đó trong thời kì này, phải tạo điều kiện cho lá sinh trưởng mạnh để cây quang hợp tốt, đồngthời thúc đẩy rễ cây phát triển nhanh

Thời kì đẻ nhánh còn gọi là thời kì nhảy bụi hoặc đâm chồi, khi cây mía có từ

6 - 7 lá thật, các mầm nằm ở dưới mặt đất nảy thành nhánh Từ thân mẹ đẻ ra nhánh

và tiếp tục thành một bụi mía Thời gian đẻ nhánh thường kéo dài từ 3 - 4 tháng tùy thuộc giống mía, thời vụ trồng, kĩ thuật chăm sóc Ở thời kì vươn cao (vươn lóng), thân vươn cao nhanh, đường kính thân tăng mạnh, rễ, ngọn phát triển, số lá tăng thêm

và đổi mới không ngừng, trên cơ sở bộ lá và bộ rễ đã phát triển hoàn chỉnh, các quá trình sinh lý của cây đạt tới đỉnh cao, hiệu lực sử dụng độ phì đất đai, phân bón, năng lượng ánh sáng mặt trời tăng lên Trong thời kì này mía sinh trưởng nhanh, tốc độ tăng trưởng chiều cao đạt từ 10 cm/tháng đến 50 cm/tháng Do đó, thời kì vươn cao là thời

kì quyết định trọng lượng thân, tức là thời kì quyết định năng suất mía cây Thời kì cuối cùng là thời kì chín công nghiệp và trổ cờ, tính từ khi cây mía vào cuối thời kì vươn lóng, nhiệt độ và lượng mưa giảm dần (ở nước ta thường là từ tháng 11 trở đi), cây mía sinh trưởng chậm lại và bước vào thời kì tích lũy đường, sự kết hợp của khí cacbonic và nước thành đường đơn glucose với sự có mặt của diệp lục và ánh sáng Giai đoạn hai là quá trình chuyển hóa đường đơn thành đường saccharose và các đường đa khác, giai đoạn này không cần ánh sáng và diệp lục Các bộ phận của cây mía như thân, lá đều có thể tổng hợp đường mía từ đường đơn Đường mía tổng hợp từ

lá chuyển vào thân, một phần dùng cho hô hấp và cấu tạo thân, lá, rễphần còn lại tích lũy trong thân dưới dạng saccharose.Chín công nghiệp là khi hàm lượng đường trong cây mía đạt mức thích hợp để thu hoạch ép đường Lúc cây mía đang sinh trưởng hàm lượng đường glucose trong cây thấp, khi cây sinh trưởng chậm lại phần lớn các sản phẩm đồng hóa do bộ lá tạo thành chuyển sang dạng đường tích lũy trong thân, hàm lượng đường trong cây tăng lên nhanh chóng Khi hàm lượng đường của phần thân ngọn tương đương phần thân gốc là đúng độ chín công nghiệp Trổ cờ là thời kì chín sinh học của cây mía Ở nước ta, mía thường trổ cờ từ tháng 10 (miền Nam) đến tháng

12 (miền Bắc) Khi mía trổ cờ, thân ngừng sinh trưởng, tỉ lệ đường giảm, tỉ lệ xơ tăng

Vì vậy, trong sản xuất mía người ta thường tìm cách hạn chế sự ra hoa kết hạt

2.2 Đặc điểm một số giống mía trong nước có năng suất cao

2.2.1Giống mía K95-156

Nguồn gốc giống míaK95-156là giống mía được lai tạo tại tỉnh Suphan Buri, Thái Lan từ 2 giống mía bố mẹ là PL310 và U-Thong1, được Trung Tâm Nghiên cứu và Phát Triển Mía Đường nhập nội vào Việt Nam năm 2005

Đặc điểm hình thái của giống mía: K95-156 là giống mía thân to, cây không đều, lóng hình trụ nối zigzag có màu xanh ẩn vàng Mầm mía có hình trứng, đỉnh mầm có chùm lông, có cánh mầm hẹp, mầm nằm cách sẹo lá tạo thành vết lõm, không có rãnh mầm Đai sinh trưởng rộng, lồi, màu sáng trong Đai rễ có khoảng 3 – 4 hàng điểm rễ

rõ, xếp đều.Bẹ lá màu xanh, có sáp phủ, rất ít lông Thân cây có 2 tai lá ngắn, tai lá trong dài hình cưa, tai lá ngoài có hình tam giác Cổ lá to hình tam giác, màu hồng, có chùm lông ở mép.Phiến lá ngắn, rộng, lá dày, cứng, mép lá sắc, màu xanh đậm

Đặc điểm nông nghiệp và công nghiệp của giống mía K95-156 là khả năng mọc mầm khỏe, đồng đều, đẻ nhánh khá, tốc độ vươn lóng nhanh, mật độ cây cao, có khả năng chống chịu sâu đục thân, bệnh than, có khả năng chịu hạn tốt, ít bị đổ ngã, khả năng lưu gốc tốt Năng suất cao từ 121 – 162 tấn/ha Hàm lượng đường trong mía cao, kết quả đã được trồng khảo nghiệm ở các tỉnh Long An, Sóc Trăng và Hậu Giang chỉ

số CCS đạt từ11,53 – 12,73%

2.2.2 Giống mía Suphanburi 7

Suphanburi 7 là giống mía được lai tạo tại tỉnh Buri, Thái Lan từ 2 giống bố mẹ là 85-2-352 và K84-200 Năm 2005,Trung Tâm Nghiên Cứu và Phát Triển Mía Đường

đã nhập nội giống mía Suphanburi 7 vào Việt Nam

Đặc điểm hình thái của giống mía Suphanburi 7 là thân to, cây không đều, lóng mía

có hình chùy xuôi, nối thẳng, có màu xanh ẩn vàng, không vết nứt Mầm mía có hình tròn, có cánh mầm, đỉnh mầm không có chùm lông, không có rãnh mầm.Đai sinh trưởng rộng trung bình và lồi Đai rễcó từ 3 – 4 hàng rễ xếp không đều , điểm rễ rõ Bẹ

lá màu xanh ẩn vàng, có sáp phủ, không có lông Lá mía có 2 tai lá, tai lá trong dài hình mác, tai lá ngoài ngắn , to hình tam giác Cổ lá hình tam giác, màu tím.Phiến lá dài, rộng trung bình, lá mỏng, mềm, không sắc, màu xanh.Dáng ngọn xòe cong

Đặc điểm nông nghiệp và công nghiệp của giống míaSuphanburi 7 là khả năng mọc mầm khá, đẻ nhánh mạnh, tốc độ vươn lóng nhanh, có khả năng chống chịu sâu đục thân, bệnh than, khả năng chịu hạn tốt, ít bị đỗ ngã, khả năng lưu gốc tốt Suphanburi 7 là giống mía chịu thâm canh cao, năng suất cao đạt từ 134 – 159 tấn/ha Hàm lượng đường khá, kết quả đã được khảo nghiệm ở Long An, Sóc Trăng và Hậu

Giang có chỉ số CCS đạt từ 11,44 – 12,17%

2.2.3 Đặc điểm giống mía KU00-1-61

GiốngmíaKU00-1-61 là giống mía do trường đại học Kasertsat, Thái Lanlai tạotừ hai giống mía bố mẹ là K84-200 và giống mía đa giao.KU00-1-61 là giống mía được Viện Nghiên cứu Mía đường nhập nội và khảo nghiệm từ năm 2005 Giống mía KU00-1-61 đã được Bộ Nông nghiệp và PTNT công nhận và cho phép sản xuất thử ở vùng Tây Nam bộ theo Quyết định số 55 QĐ-TT-CCN ngày 22/2/2011

Đặc điểm hình thái của giống mía KU00-1-61 là thân mía có màu xanh ẩn vàng, thân to, đồng đều, lóng hình trụ, dáng thẳng.Mầm hình trứng, rãnh mầm ngắn.Đai sinh trưởng rộng điểm rễ rõ 2-3 hàng xếp không đều.Bẹ lá có sáp phủ màu xanh ẩn vàng.Phiến lá rộng, dài và mỏng, màu xanh mép lá sắc, mềm lá hơi rủ xuống.Bẹ lá ôm thân

Hình 2.2Hình thái giống mía KU001-61.(a) Lóng; (b) Mắt mầm; (c) Cổ lá

(www.giongmia.wordpress.com)

Đặc điểm nông nghiệp của giống mía là khả năng mọc mầm tốt, khả năng đẻ nhánh trung bình.Sức vươn lóng nhanh, ít đổ ngã Khả năng chống chịu sâu đục thân, bệnh

than và bệnh thối đỏ tốt Khả năng chịu úng, chịu hạn khá.Năng suất cao, năng suất trung bình đạt 108 tấn/ha.

Đặc điểm công nghiệp của giống mía KU00-1-61, đây là giống mía có hàm lượng đường cao, kết quả đã được trồng khảo nghiệm ở tỉnh Hậu Giang, chỉ số CCS đạt từ 11,44 – 12,17%(www.giongmia.wordpress.com)

2.3 Giá trị kinh tế của cây mía

Mía là loại cây công nghiệp giữ vai trò vô cùng quan trọng trong đời sống hằng ngày, là nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất đường Đường là loại thực phẩm cung cấp năng lượng trực tiếp và gián tiếp cho cơ thể hoạt động Khi được cung cấp vào cơ thể, đường được chuyển hóa thành glucose và fructose, các loại đường này tham gia vào quá trình oxy hóa trong cơ thể để tạo năng lượng cho cơ thể hoạt động Trung bình

1 kg đường cung cấp năng lượng tương đương 0,5 kg mỡ hoặc 50 - 60 kg rau quả Ngoài sản phẩm chính là đường, cây mía còn có những sản phẩm phụ sau :

Bã mía chiếm 25 - 30% trọng lượng mía đem ép Bã mía chứa trung bình 49% nước, 48,5% xơ, 2,5% chất hòa tan (đường) Bã mía có thể dùng ngay làm nhiên liệu đốt lò hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc Ngoài ra, bã mía còn được dùng làm nguyên liệu để sản xuất ethanol sinh học

Mật gỉ chiếm 3 - 5% trọng lượng mía đem ép Thành phần mật gỉ gồm nước (10 %), đường saccharose (35%), đường khử (20%), tro (15%) Mật gỉ là nguyên liệu

để chưng cất sản xuất rượu Rhums và cồn công nghiệp

Bùn lọc chiếm 1,5 – 3% trọng lượng mía đem ép, là sản phẩm cặn bã còn lại sau khi đã chế biến đường Bùn lọc chứa 0,5% N, 1,6% P2O5, 0,4% K2O, 3% protein thô

và một lượng lớn chất hữu cơ Từ bùn lọc có thể rút ra sáp mía để sản xuất nhựa xerezin làm sơn, xi đánh giày, bản sáp roneo Sau khi lấy sáp, bùn lọc được tận dụng làm phân bón

Xét trên phương diện nông học, mía là loại cây trồng có khả năng thích ứng mạnh,

có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau, cho phép tận dụng, cải tạo những vùng đất khó khăn Tóm lại, mía là cây trồng vừa có khả năng cho sinh khối lớn lại vừa có khả năng tái sinh mạnh (trồng một năm thu hoạch được nhiều năm) nên có hiệu quả kinh tế cao (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996)

2.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ đường mía trên thế giới và ở Việt Nam

2.4.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ đường mía trên thế giới

Lượng đường mía sản xuất hàng năm trên thế giới đã không ngừng gia tăng và ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong tổng sản lượng đường trên thế giới Theo thống kê của FAO sản lượng đường mía trên thế giới trong khoảng 80 năm gần đây đã tăng lên gấp 10 lần Trong số 69 nước sản xuất đường mía ở vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới có 12 nước sản xuất nhiều đường mía nhất đáng kể là Brazil, Ấn Độ, Cuba, Mexico, Trung Quốc, Pakistan, Colombia, Mỹ, Philippin, Úc, Nam Phi, Thái Lan sản lượng đạt 2 triệu tấn/năm (Phan Gia Tân, 1990)

Theo số liệu thống kê của phòng phân tích và tư vấn đầu tư (năm 2011)nhu cầu tiêu thụ đường ở các quốc gia có sự chênh lệch khá lớn, ở Mỹ một người tiêu thụ khoảng 35kg/năm, người Brazil khoảng 58 kg/năm, người Ấn Độ khoảng 20 kg/năm và người Việt Nam là 15 kg/năm Giá đường trên thế giới diễn biến phụ thuộc tình hình cung, cầu Ở nước càng phát triển, đời sống càng nâng cao thì nhu cầu tiêu thụ đường càng gia tăng Diện tích trồng mía trên thế giới càng tăng nhanh chủ yếu là ở các nước đang phát triển, do các nước này đang cố gắng phát triển ngành trồng mía làm đường để thỏa mãn nhu cầu tiêu thị nội địa và hình thành những vùng công nghiệp phát triển kinh tế (www.wooricbv.com)

Nước xuất khẩu đường mía nhiều nhất thế giới là Cuba chiếm 21,3% so với lượng đường xuất khẩu trên toàn thế giới (Phan Gia Tân, 1990)

2.4.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ đường mía ở Việt Nam

Mía là một loại cây công nghiệp, đã được trồng ở Việt Nam từ lâu, trải qua nhiều năm, giống mía đã có những biến đổi phù hợp hơn với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng của nước ta và đặc biệt phù hợp với sự phát triển của nền kinh tế thị trường hiện nay

Ở nước ta cây mía trồng phổ biến ở các vùng từ Bắc đến Nam Từ đầu năm tới nay,

cả nước đã xuống giống trồng được 152,8 ngàn ha mía tăng 135,2% so với cùng kỳ năm trước, mức tăng dẫn đầu trong các loại cây công nghiệp (www.vinanet.com.vn)

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất mía đường Việt Nam từ năm 2000 đến 2009

Năm Diện tích mía

(ha)

Sản lượng mía (1.000 tấn)

Năng suất mía (tấn/ha)

Quyết định số 26/2007/QĐ- ttg định hướng đến năm 2020 mức sản xuất đường sẽ là 2,1 triệu tấn (đường luyện 1,5 triệu tấn, đường trắng 500.000 tấn, đường thủ công 100.000 tấn) Như vậy diện tích mía phù hợp phải được đầu tư thâm canh, cải tạo và

mở rộng ở nơi có điều kiện theo hướng trồng giống mía mới, áp dụng công nghệ canh tác tiên tiến Đến 2010 diện tích trồng mía ổn định là 300.000 ha, năng suất bình quân đạt 80 tấn/ ha, sản lượng 24 triệu tấn mía Tổng công suất của các nhà máy đường tăng lên 120.000 tấn mía/ngày phù hợp với những cam kết trong tiến trình thực hiện các quy định của tổ chức thương mại thế giới WTO

Tình hình sản xuất mía ở nước ta không đồng đều giữa các vùng miền, các tỉnh Bắc Trung Bộ có diện tích trồng mía lớn nhất Bảng số liệu dưới đây (bảng 2.2) cho thấy

sự chênh lệch diện tích trồng mía giữa các vùng trong nước (www.docs.google.com)

Bảng 2.2 Sự phân bố diện tích trồng mía của nước ta

1 Miền núi phía Bắc (Cao Bằng, Tuyên Quang, Sơn La,

3 Trung trung bộ (Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên) 47.995

4 Tây Nguyên (Kon Tum Gia Lai, Đắc Lắc, Đắc Nông) 34.747

5 ĐĐông Nam Bộ (Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước,

Long An, Tây Ninh)

29.092

6 Đồng bằng sông Cửu Long (Bến Tre, Trà Vinh, Sóc

Trăng, Tiền Giang, Hậu Giang, Đồng Tháp, Kiên

Giang, Cà Mau)

56.838

( Cục Trồng trọt, Bộ NN&PTNT, ngày 11/5/2010)

2.5 Các công trình nghiên cứu nuôi cấy mô cây mía

2.5.1 Các công trình nuôi cấy mô trong nước

Công nghệ nuôi cấy tế bào lần đầu tiên được áp dụng ở Hà Tĩnh năm 1995 do Trung tâm phát triển khoa học và công nghệ trực thuộc Sở Khoa Học, Công Nghệ và Môi Trường Hà Tĩnh thực hiện Sản phẩm của công nghệ này là nhân nhanh những giống mía đã được xác định có khả năng thích nghi với Hà Tĩnh bao gồm giống ROC1, ROC10, QDD11, F134 nhằm đáp ứng nhu cầu cung cấp nguyên liệu có năng suất, chất lượng cao, thích nghi với điều kiện sinh thái của tỉnh Kết quả của nghiên cứu là sản xuất ra được 35.218 cây, lượng giống này đã được thử nghiệm ở diện rộng với quy mô tương đối lớn Kết quả cho thấy mô hình trồng mía thâm canh sử dụng các giống mía từ nuôi cấy mô tế bào cho năng suất cao hơn giống thông thường không những cung cấp đủ giống cho tỉnh mà còn cung cấp giống cho một số tỉnh lân cận Trước thực tế cây mía tím Khánh Sơn (tỉnh Khánh Hòa) có dấu hiệu thoái hóa, địa phương đã đặt vấn đề nghiên cứu phục hồi nguồn giống bằng con đường nuôi cấy mô, chọn cây đầu dòng có chất lượng tốt để phân lập giống gốc đưa vào nuôi cấy mô tạo cây sạch bệnh, nhân giống nhanh từ một cơ thể mẹ ban đầu, chính vì vậy công nghệ

nuôi cấy mô tế bào được chọn để phục hồi nguồn giống và nhân nhanh cây mía tím Khánh Sơn đi đến thành công (Trần Nhựt Tấn, 2008)

2.5.2 Các công trình nuôi cấy mô nước ngoài

Năm 2010 Snyman và cộng sự đã thực hiện thí nghiệm tìm hiểu hiệu quả của việc

sử dụng một hệ thống RITA trong hai lĩnh vực là cảm ứng phôi soma và giai đoạn nảy mầm trên đối tượng lá mía non Hệ thống này có hiệu quả cao hơn nhiều so với khi nuôi cấy tế bào thực vật trên môi trường bán rắn (môi trường nuôi cấy có chứa agar) cho kiểu gen mía N41 Khi áp dụng nuôi cấy lá mía non trên hệ thống ngập chìm tạm thờithu được khoảng 18.000 cây/cuộnlá với thời gian thí nghiệm 12 tuần, trong khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn thì chỉ thu được khoảng 2000cây/cuộn lá Tuy nhiên,

có một nhược điểm khi sử dụng hệ thống RITA cho nuôi cấy tế bào thực vật là chỉ có khoảng 34% các cây tạo ra từ hệ thống RITA sống sótkhi đưa ra ngoài vườn trồng Tiếp theo đó, cũng trên đối tượng lá mía non, ông đã tiếp tục nghiên cứuvề thời gian ngâm chìm của các mẫu cấy khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, kết quả thu được như sau khi nuôi cấy trên hệ thống RITA với thời gian lưu mẫu từ 1 phút/12 giờ hoặc

1 phút/72 giờ trên môi trường nuôi cấy ½ MS được chứng minh là có lợi nhất, sự thích nghi của thực vật khi đưa ra ngoài vườn trồng lên tới 60%

Năm 2012, Garg và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng và nhiệt độ phòng tăng trưởng đến sự tạo chồi từ mô sẹo của

2 giống mía Co S 96256 và Co S 99259 Kết quả thu nhận được giống nhau ở cả hai giống mía Cường độ ánh sáng phù hợp cho việc tái sinh chồi là 4000 lux, thời gian chiếu sáng phù hợp là 16 giờ/ngày và nhiệt độ phòng tăng trưởng là 25 ± 2°C được ghi nhận là điều kiện tốt nhất cho sự tạo chồi từ mô sẹo của lá mía non

2.6Áp dụng hệ thống ngập chìm tạm thời trong nuôi cấy mô

2.6.1Lịch sử ra đời hệ thống ngập chìm tạm thời

Năm 1983, Harris và Mason đã thiết kế hai hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

là hệ thống nuôi cấy nghiêng và hệ thống Rocker Ít lâu sau, vào năm 1985 Tisserat và Vandercook đã thiết kế một hệ thống nuôi cấy tự động APCS đây là hệ thống có thể thay thếđược môi trường và có thể sử dụng nuôi cấy trong một thời gian dài mà không cần cấy chuyền (Anne, 2005)

2.6.2 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống

Để hệ thống ngập chìm tạm thời hoạt động cần đảm bảo 6 điều kiện sau (1) tránh

sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy; (2) cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ; (3) cung cấp sự hòa trộn đầy đủ; (4) có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động; (5)hạn chế sự nhiễm; (6) giảm giá thành sản phẩm (Anne, 2005)

Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo một nguyên tắc

là phải có khả năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo chu kỳ xác định Các hệ thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với hệ thống chứa mẫu cấy bằng

hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển Các mẫu cấy thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa polypropylene thành một cụm, điều này giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuôi cấy thông thường Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ phận chủ yếu là máy bơm hay máy nén khí,

hệ thống cài đặt thời gian, hệ thống ống dẫn và van điều khiển, các màng lọc và bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh (Anne, 2005)

2.6.3 Các loại hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

Hệ thống RITA (hình 2.3) được phát minh bởiTeisson và Alvard vào năm 1995.Hệ thống bao gồm một bình chứa1Lít gồm có hai phần, phần trên chứa mẫu cấy và phần dưới chứa môi trường.Một áp suất vượt mức tác động vào môi trường lỏng bên trong phần dưới bình và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy.Thời gian mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng nhiều hay ít tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì Trong suốt thời gian ngập, không khí được sục vào trong môi trường lỏng, môi trường được chuyển động làm cho mẫu cấy xoay trở được các mặt tiếp xúc với bề mặt môi trường, áp suất vượt mức sau đó được thoát ra bên ngoài nhờ hệ thống dây nối với máy bơm(Anne K.H, 2005)

Hình 2.3 Hệ thống RITA

Pha 1: mô không ngập trong môi trường, Pha 2: hiện tượng ngập được hoạt hóa, các van mở

ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy môitrường lỏng lên ngập mô cấy,Pha 3: sự trao đổi khí trong hệ thống RITA,Pha 4: chu kỳkết thúc, các van đóng lại và môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới(www.hcmbiotech.com.vn )

Hệ thống bình sinh đôi BIT (hình 2.4) có thể tích lớn hơn và rẻ hơn so với hệ thống RITA được thiết kế bằng cách nối hai bình thủy tinh hay plastic có kích thước từ

250 mL –10L bằng một hệ thống ống dẫn, và điều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình chứa mẫu và ngược lại

Hình 2.4Hệthống BIT (www.hcmbiotech.com.vn)

Hệ thống Plantima

Hệ thống Plantima (hình 2.5)được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA tuy nhiên có thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc Hệthống được sản xuất và cung cấp bởi Công ty A-tech Bioscientific, Ðài Loan

Hình 2.5Hệ thống Plantima.(a)Các bộ phận của hệ thống Plantima; (b) Quá trình điều

khiển chu kỳ ngập(www.hcmbiotech.com.vn)

2.6.4 Ưu và khuyết điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

2.6.4.1Ưu điểm của hệ thống ngập chìm tạm thời

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời có tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn

từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh phôi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi của cây được nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời luôn cao hơn so với những cây nuôi cấy trong hệ thống thông thường trên môi trường rắn hay trong những hệ thống bioreactor thông thường Cây tái sinh và phôi soma thu được trong hệ thống này luôn có chất lượng tốt hơn Từ đó cây

có nguồn gốc từ hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời có tỷ lệ sống sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh trong quá trình thuần hoá ngoài vườn ươm Có thể nói hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã kết hợp thành công những ưu điểm của hệ thống nuôi cấy rắn thoáng khí và hệ thống nuôi cấy lỏng giúp cây tránh được những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên môi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng

Chu kỳ và tần số ngập chìm là các chỉ số chủ yếu ảnh hưởng đến sự phát triển của mẫu cấy cũng như toàn bộ quy trình nhân giống.Khi các chỉ số này được tối ưu hóa, sản lượng sẽ được gia tăng, quá trình kiểm soát sự phát sinh hình thái tốt hơn và còn

b

a

có khả năng hạn chế tối đa hiện tượng thủy tinh thể.Ðây là ưu điểm lớn nhất của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời so với hệ thống nuôi cấy bioreactor thông thường

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thờitiết kiệm được công lao động, không gian phòng nuôi cấy và giảm được chi phí sản xuất Các quá trình nhân nhanh phôi soma, tái sinh nhiều chồi, tạo củ bi có khả năng được tối ưu hoá trên nhiều đối tượng cây trồng từ đó giảm được chi phí sản xuất một cách đáng kể

2.6.4.2 Khuyết điểm của hệ thống ngập chìm tạm thời

Mật độ nuôi cấy là một yếu tố không kém phần quan trọng nhưng hiện nay vẫn chưa được khảo sát một cách sâu rộng Thời gian ngập chìm tối ưu phải được khảo sát

và xác định chính xác cho từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây cũng như thời gian giữa các lần cấy chuyền đối với những hệ thống không thể bổ sung môi trường mới, cuối cùng là phải khảo sát tối ưu hóa thành phần môi trường cho từng giai đoạn nuôi cấy

Nhược điểm tiếp theo của hệ thống là khả năng giảm hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy của mẫu cấy vẫn chưa được đánh giá chính xác

Hiện nay, nhiều nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời về mặt vật lý là rất cần thiết để có thể tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trong những hệ thống này

Trong điều kiện Việt Nam hiện nay, giá thành của những hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời tương đối caodo phải nhập hệ thống này từ nước ngoài như Pháp, Cuba, Đài Loan Do đó nếu muốn ứng dụng hệ thống rộng rãi trong vi nhân giống thực vật thì những hệ thống này nhất thiết phải được nghiên cứu thiết kế ngay trong nước để giảm giá thành Ngoài ra, những thông số kỹ thuật của hệ thống này cần được khảo sát

kỹ lưỡng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây trồng, có như vậy thì việc ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong sản xuất giống cây trồng đại trà mới đạt hiệu quả cao (www.hcmbiotech.com.vn)

2.7 Các giai đoạn vi nhân giốngmía in vitro

Nhân giống in vitro là quá trình phức tạp, phải trải qua nhiều giai đoạn (Trần Thị Dung, 2003), để đạt được sự thành công trong nhân giống in vitro phải trải qua 5 giai

đoạn như sau:

Giai đoạn 1: Khử trùng môi trường nuôi cấyvà mẫu nuôi cấy

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro Mục

đích của giai đoạn này là tạo nguồn nguyên liệu ban đầu vô trùng để đưa vào nuôi cấy

Vô trùng môi trường nuôi cấy là thao tác tương đối dễ dàng, vô trùng môi trường nuôi cấy trên đối tượng mía cũng giống như vô trùng môi trường nuôi cấy trên những đối tượng thực vật khác, đều được khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút bằng nồi hấp khử trùng dùng trong thí nghiệm Có thể có nhiều loại môi trường nuôi cấy khác nhau (môi trường nuôi cấy bán rắn, môi trường nuôi cấy lỏng) nhưng bước khử trùng môi trường nuôi cấy đều giống nhau

Có nhiều loại mẫu nuôi cấy trên cùng một đối tượng nuôi cấy, thông thường trên đối tượng giống mía người ta hay sử dụng mẫu cấy là đỉnh sinh trưởng vì khả năng sống của mẫu cao hơn, khă năng biến dị của mẫu cấy thấp và thao tác khử trùng mẫu cấy dễ dàng hơn so với việc sử dụng các bộ phận khác như lá mía, mầm mía Tuy nhiên, khi sử dụng đỉnh sinh trưởng làm mẫu cấy số lượng đối tượng mía ban đầu phục

vụ cho lấy mẫu nuôi cấy cần nhiều hơn so với khi nuôi cấy sử dụng lá hay mầm mía.Vô trùng mẫu cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên và trên mỗi loại thực vật khác nhau có một quy trình vô trùng mẫu cấy khác nhau, thời gian vô trùng mẫu cấy cũng khác nhau Đối với mô cấy là lá non giống mía KU00-1-61 cách

vô trùng mẫu cấy tương đối đơn giản (xem phụ lục), hoá chất duy nhất cần sử dụng cho việc vô trùng là cồn 70oC và xà bông.Theo Synman (2011) có nhiều vị trí lấy mẫu cấy trên cây mía và trên mỗi vị trí lấy mẫu khác nhau thì tỉ lệ mẫu cấy sống sót và thời gian nuôi cấy cũng khác nhau (bảng 2.3)

Bảng 2.3 Các hình thức vi nhân giống mía đường (Snyman, 2011)

Thời gian nuôi cấy (Tuần)

Tỉ lệ thành công (%)

Tác giả (năm công bố)

(NR : chưa có báo cáo)

Hình 2.6 Các vị trí lấy mẫu cấy trên cây mía.(a) lá mía non; (b) chồi nách; (c) đỉnh

sinh trưởng (www.google.com.vn)

Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mụcđích của giai đoạn này là tái sinh một cách có định hướng trong mô nuôi cấy Quá trình này được điều chỉnh chủ yếu dựa vào tỉ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lí của mẫu cấy Thông thường những mô cấy non, chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành Các nghiên cứu cho thấy rằng các mẫu nuôi cấy trong thời gian cây đang sinh trưởng nhanh cho kết quả rất khả quan tronggiai đoạn tái sinh chồi (Trần Thị Dung, 2003) Đối với giống mía KU00-1-61 việc tái sinh tạo mô sẹo từ mẫu cấy lá mía non, ngoài những chất cơ bản có trong môi trường nuôi cấy MS cơ bản cần bổ sung thêm 2,4-D với nồng độ 2 mg/l, 2,4-D là auxin có tác dụng thúc đẩy quá trình quá trình tạo mô sẹo (Phan Tường Lộc, 2012)

Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi mía

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ số nhân nhanh người ta thường thêm vào môi trường dinh dưỡng các chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokynin, giberell hoặc kết hợp bổ sung các chất auxin và cytokinin, giberell theo tỉ lệ phù hợp kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp để tăng

hệ số nhân chồi(Trần Thị Dung, 2003) Trên đối tượng nuôi cấy là giống mía KU00-1-61 giai đoạn nhân nhanh là giai đoạn tạo chồi Ở giai đoạn này cần bổ sung các chất sinh trưởng auxin và cytokinin vào môi trường nuôi cấy MS cơ bản để thúc đẩy quá trình nhân nhanh chồi, tỉ lệ các chất điều hoà sinh trưởng cần bổ sung là BAP nồng độ 2 mg/l và NAA với nồng độ 1 mg/l Có thể áp dụng các dạng môi trường nuôi cấy khác nhau cho việc nhân nhanh chồi mía như sử dụng môi trường nuôi cấy lỏng hay môi trường nuôi cấy bán rắn (Phan Tường Lộc, 2012)

Giai đoạn 4: Tạo cây mía hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định khoảng 3 đến 4 lá các chồi mía được chuyển từ giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ (Jalaja, 2008) Các chất kích thích tăng trưởng cần thiết cho sự thúc đẩy chồi mía tạo rễ là NAA sử dụng với nồng độ tương đối cao 3mg/l Sau 2 - 3 tuần nuôi cấy các chồi nuôi cấy sẽ xuất hiện rễ tạo thành cây con hoàn chỉnh (Van, 2012)

Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá trình

nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực

tiễn sản xuất (Trần Thị Dung, 2003)

Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống tự

dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể) phù hợp để cây con đạt tỉ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản

xuất Theo nghiên cứu của Jalaja vào năm 2008 ở giai đoạn đưa cây mía in vitro ra

ngoài vườn ươm phải đảm bảo các điều kiện như trước khi đưa mía ra vườn đất trồng cây phải được cày xới kĩ lưỡng, bón phân hữu cơ từ 15- 20 tấn/ha.Trong quá trình trồng cây lưu ý khoảng cách giữa các hàng mía từ90 – 150 cm, hố trồng được đào sâu khoảng 10 cm, khoảng cách các cây từ 60 – 100 cm, sử dụng phân bón N:P:K cho cây với tỉ lệ 75:100:40 kg/ha, tưới nước thường xuyên một ngày ba lần cho cây mới ra vườn ươm

2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

2.8.1Mô nuôi cấy

Theo lí thuyết tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như mô phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non Khi đặt vào môi trường có chứa một lượng hormone thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Tuy nhiên, tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo phân hóa thành rễ, thân, cành, lá khác nhau

Do đó kết quả thu được cũng rất khác nhau ở những mẫu khi đưa vào nuôi cấy Việc chọn mẫu thực vật trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định, nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được kết quả, hoặc thu nhận được những cây không phát triển mạnh, thậm chí có thể ngưng phát triển ở một số giai đoạn nhất định Các kết quả nghiên cứu cho thấy để bắt đầu nhân giống vô tính một loại cây trồng bất kì thì

2 vị trí lấy mẫu đầu tiên mà người ta quan tâm đến là các chồi bên và mô phân sinh đỉnh (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.8.2 Điều kiện vô trùng trong nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển mà tốc độ phân chia của vi khuẩn và nấm

lớn hơn rất nhiều làn so với mô thực vật Nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm phải loại bỏ trong điều kiện này mô không phát triển và chết dần Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc sau vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô đòi hỏi cao mới có thể đạt kết quả

Để đảm bảo các điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy đòi hỏi chúng ta phải thực hiện thật nghiêm khắc các yêu cầu sau (1) vô trùng mô cấy; (2) vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy; (3) thao tác nuôi cấy cẩn thận, tuân theo quy tắc vô trùng trong phòng thí nghiệm

2.8.3 Điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ: Nhiệt độ có ảnh hưởng sâu sắc tới sinh trưởng và phát triển của cây in

vitro qua các tiến trình sinh lí như hô hấp, hình thành các tế bào và cơ quan, nhiệt độ

thích hợp nhất của quá trình nuôi cấy mô tế bào là 20–27oC Tuy nhiên, nhiều đề nghị cho rằng nên tránh nhiệt độ cao bởi vì nhiệt độ cao có thể làm cho khả năng kích thích tạo chồi của cytokynin giảm (Trần Văn Minh, 2004)

Ánh sáng: Chất lượng ánh sáng là chức năng của đèn chiếu sáng trong nuôi cấy và kiểu bình nuôi cấy được sử dụng Thông thường trong các phòng nuôi cấy mô sử dụng đèn ánh sáng trắng, chất lượng ánh sáng bị ảnh hưởng bởi chất lượng đường truyền của bình và kiểu nút đậy Cường độ ánh sáng là nhân tố quan trọng trong quang hợp,

ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro Cường độ ánh sáng tốt nhất sử dụng trong

nuôi cấy mô tế bào thực vật là 4000 lux (Garg, 2012)

Không khí: Các chất khí có tác động lên phát triển của chồi trong nuôi cấy in vitro

bao gồm oxy, cacbon, tuy nhiên tất cả sự đóng kín và đậy nắp sử dụng cho nuôi cấy

mô là trao đổi khí được ở một vài mức độ khác nhau

Môi trường nuôi cấy: Tất cả môi trường nuôi cấy đều bao gồm các thành phần chính sau: các muối khoáng đa lượng, các muối khoáng vi lượng, các vitamin và đường làm nguồn cacbon

Khoáng đa vi lượng: Các khoáng cung cấp cho cây nuôi cấymô ở dạng vô cơ trong

đó đạm là thành phần quan trọng của acid nucleic, đạm đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất, là thành phần chủ yếu trong chất nguyên sinh tế bào, do đó ảnh hưởng

trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Đạm được sử dụng trong nuôi cấy

mô ở dạng ammonium (NH4+) và (NO3-)

Vitamin: Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là Thiamine HCl (vitamin B1), Pyridoxine HCl (vitamin B6), Acid nicotinic, Myo- inositol

Nguồn sắt: Hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelate kết hợp với Ethylen Diamin Tetra Acetat (EDTA) Ở dạng sắt không bị kết tủa và giải phóng ra ngoài môi trường theo nhu cầu của mô thực vât

Nguồn cacbon: Nguồn cacbon là một thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy mô Các lĩnh vực vi nhân giống cho thấy rằng sự hiện diện của đường trong môi trường nuôi cấy là quan trọng cho sự phát triển của rễ và nhân chồi, làm tăng chiều cao của cây con Nồng độ sucrose là 20g/l và 30g/l thường được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực nuôi cấy mô

Các chất hữu cơ như nước dừa được dùng trong nuôi cấy mô Nước dừa cung cấp

bổ sung cho môi trường các loại đường, amino acid, chất sinh trưởng và các chất trao đổi chất khác Nước dừa chỉ kích thích những tế bào hay mầm còn non chưa trưởng thành và sự phát triển phôi, nước dừa thường dùng ở nồng độ 15% Việc sử dụng nước dừa, dịch chiết nhiều loại thực vật bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển cây như chà là, chuối, mầm lúa mì.Tuy nhiên, thông thường các dịch chiết chỉ có trên loài cây trồng không cùng nguồn gốc

Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác định như acid amin hoặc vào môi trường tùy theo nhu cầu của từng đối tượng nuôi cấy Do

đó đã có rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại môi trườngkhác nhau, thông thường ta phân ra 3 loại môi trường cơ bản nhất môi trường nghèo chất dinh dưỡng, môi trường

có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình và môi trường giàu chất dinh dưỡng

Than hoạt tính: Trước đây than hoạt tính (Activated charcoal – AC) thường được

sử dụng để phòng độc, lọc không khí và các chất lỏng Hiện nay, AC đã được tinh chế

và sản xuất rộng rãi nhu một chất có tính hấp thụ cao và được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô nhờ có tác động lên sự phát sinh hình thái và phát sinh cơ quan của thực vật Vai trò của AC trong nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện ‘tối’

cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật như các phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ mẫu môi trường nuôi cấy Ngoài ra, than hoạt tính cũng có thể hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin làm thay đổi tỉ lệ thành phần các chất trong môi trường nuôi cấy cũng như pH môi trường (Dương Tấn Nhựt, 2012)

Từ khi AC được sử dụng trong nuôi cấy mô, các nghiên cứu chủ yếu tập trung công bố về ảnh hưởng của nó trong việc cải tiến môi trường nuôi cấy, tăng cường khả năng tái sinh cây, phát sinh phôi, tăng sinh tế bào trần, ngăn cản sự phát triển bất thường của cây con, kích thích quá trình và phát triển chồi, thúc đẩy hoặc ức chế sự hình thành hay phát triển của rễ Ngoài ra AC còn có khả năng làm giảm hiện tượng thuỷ tinh thể ở một số loài thực vật (Dương Tấn Nhựt, 2012)

Theo Dương Tấn Nhựt và ctv (2012), ông nghiên cứu về hiệu quả định hướng rễ của AC trong nuôi cấy mô thực vật trên 2 đối tượng là cây Cúc và Hồng môn Ông tiến hành cấy chồi vào môi trường được phân thành 2 phần, một phần không có AC và phần còn lại bổ sung AC tối ưu (cho cây hoa Cúc là 3 g/l AC và cây Hông môn là

2 g/l) bằng cách thay đổi vị trí lớp AC trên môi trường nuôi cấy (giữa, trên hoặc lớp dưới của môi trường) Kết thúc thí nghiệm ông đưa ra kết quả là hầu hết các rễ của cây Cúc và Hồng môn đều phát sinh trong lớp môi trường có AC (80% rễ) Tuy nhiên sự định hướng rễ của cây Hồng môn phụ thuộc vào vịtrí lớp AC nhiều hơn là cây Cúc Vị

trí lớp môi trường có AC ở dưới là tối ưu cho sự phát triển của cây và rễ in vitro của cả

2 loại thực vật cây Cúc và cây Hồng môn

2.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy trong hệ thống TIS

2.9.1Thời gian ngập chìm

Thời gian để mẫu ngập trong môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa rất quan trọng do

nó ảnh hưởng tới sự hấp thu chất dinh dưỡng của mô thực vật cũng như tham gia điều khiển hiện tượng thủy tinh thể Yếu tố này thay đổi theo đối tượng nuôi cấy, mục đích

và loại hệ thống ngập chìm sử dụng Thời gian ngập chìm dài (1 giờ ngập trong chu kì

6 giờ) tỏ ra hiệu quả cho sự hình thành khoai củ bi, trong khi thời gian ngập chìm rất ngắn (1 phút trong 12 giờ) lại tốt cho sự hình thành phôi ở cà phê và cao su Ngoài ra tần số ngập chìm cao (30 giây ngập và 30 giây rút) cho hiệu quả nhân chồi cao khi nuôi cấy chồi nho trong hệ thống bioreator nghiêng lắc Krueger và cs (1991) đã chứng minh được tầm quan trọng của tần số ngập chìm ở cây serviceberry Cây bị mọng nước

khi bị xử lí ở chế độ ngập chìm 5 phút/30 phút và không bị mọng nước khi xử lý ngập chìm 5 phút/60 phút Tuy nhiên chế độ xử lý trước (5 phút/30 phút) lại tốt cho sự nhân

về số lượng chồi Qua thí nghiệm tác giả quan sát được khoảng thời gian thích nghi của thực vật khi thời gian ngập chìm bị thay đổi Khi chuyển từ tần số cao sang tần số thấp, một số chồi bị stress và bị chết, nhưng phục hồi trở lại sau đó

2.9.2 Thể tích môi trường dinh dưỡng

Thể tích môi trường cần được tối ưu hóa khi nuôi cấy bằng bioreator ngập chìm mà không cần thay môi trường mới Lorenzo và ctv (1998) đã xác định thể tích môi

trường 50 ml cho một mẫu cấy là tối ưu khi nhân chồi saccharum spp Trong hệ thống

bioreator bình đôi BIT khi tăng dần thể tích từ 5 – 50 ml/mẫu cấy, hệ số nhân chồi tăng từ 8,3 lên 23,9 trong 30 ngày nuôi cấy Tuy nhiên thể tích môi trường sử dụng không ảnh hưởng lên tới chiều dài chồi Thể tích nhiều hơn không tỏ ra hiệu quả cho nhân chồi Giải thích hiện tượng này, tác giả cho rằng trong quá trình nuôi cấy, thực vật tiết ra ngoài tế bào những hợp chất có tác dụng kích thích tạo chồi, và với thể tích nuôi cấy lớn, lượng chất này có thể bị pha loãng đi Cũng sử dụng hệ thống nuôi cấy tương tự Escalona và ctv (1999) chứng minh rằng thể tích tối ưu cho nhân chồi dứa là

200 ml/mẫu cấy Sử dụng thể tích lớn hơn sẽ làm giảm hiệu quả nhân chồi trong trường hợp này

2.9.3 Thể tích bình nuôi cấy

Tất cả các hệ thông bioreator ngập chìm đều có thể tích và không gian thoáng khí bên trên lớn hơn các bình nuôi cấy truyền thống Hơn nữa có thể áp dụng các loại bình chứa khác nhau với thể tích từ 1-20 lít để thiết lập hệ thống Krueger và ctv (1991) đã chứng minh thể tích bình chứa lớn (7lít) có ảnh hưởng tích cực lên hiệu quả vi nhân giống serviceberry, đặc biệt là hệ thống giúp tránh được hiện tượng mẫu cấy tập trung quá nhiều, đồng thời kích thích kéo dài chồi so với các bình cấy dung tích nhỏ (140 ml) Monette (1983) đã chỉ ra rằng nuôi cấy các chồi nho trong những bình chứa lớn sẽ thu được chồi có kích thước dài hơn Chồi cây nho tăng trưởng rất nhanh trong môi trường lỏng có sử dụng hệ thống bioreactor nghiêng lắc (trong những hộp vuông Mason 910 ml, miệng rộng) so với những bình tam giác dung tích 125 ml do mẫu không bị dồn quá nhiều một chỗ, dễ dàng thu được sự thiếu hụt chất dinh dưỡng

Việc sử dụng những bình chứa lớn để nuôi cấy cho phép sử dụng nhiều môi trường, điều này ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành và phát triển của thực vật nuôi cấy bằng bioreactor

2.9.4Sự thoáng khí tự nhiên và thoáng khí cưỡng bức

Thí nghiệm vi nhân giống cây chuối trong môi trường lỏng đã chứng minh rằng sự thiếu hụt oxygen khi nuôi cấy lỏng là nguyên nhân chính dẫn đến sự hình thành những cây con có kích thước nhỏ Cung cấp oxygen bằng cách sục khí có thể kích thích cây tăng trưởng nhưng phương pháp ngập chìm tạm thời tỏ ra có hiệu quả nhất trong trường hợp này Hệ thống ngâm chìm tạm thời có thay môi trường mới bằng áp lực khí

sẽ tạo ra điều kiện thoáng khí cưỡng bức và làm mới bầu khí quyển trong bình cấy sau mỗi chu kì ngập Theo Teisson và Alvard (1995) không khí được thay mới trong quá trình chất lỏng di chuyển và do một lượng khí mới được cấp vào từ máy bơm khí Trong điều kiện cấp thiết bắt buộc, hàm lượng khí và độ ẩm tương đối sinh ra trong bình cấy có thể có ảnh hưởng tích cực đến việc nuôi cấy Độ ẩm tương đối sinh ra do ảnh hưởng của trao đổi khí có tác dụng kích thích sự thoát hơi nước ở thực vật, giúp

cây in vitro có khả năng thích nghi tốt hơn khi chuyển ra môi trường ex vitro

2.10Ảnh hưởng của hệ thống TIS đến chất lượng giống cây trồng

2.10.1 Đặc điểm hình thái của thực vật sản xuất từ các hệ thống TIS

Lá của những chồi phát sinh trong hệ thống ngập chìm tạm thời có kích thước nhỏ hơn lá từ chồi nuôi cấy trong môi trường lỏng Những cụm chồi phát triển từ các chồi bên trong bioreactor thường có hình cầu và có xu hướng tỏa tròn quanh tâm Do đó, một số chồi con có kích thước không lớn và cần kéo dài trong cùng hệ thống trước khi cho ra rễ ngoài ống nghiệm (Trần Văn Minh, 1997)

2.10.2 Hiện tượng thủy tinh thể

Vi nhân giống trong môi trường lỏng giúp cho hấp thu chất thực hiện dễ dàng hơn

và do đó kích thước cây tăng trưởng Tuy nhiên, hiện tượng mọng nước cũng thường xảy ra Hiện tượng này xuất hiện khi mẫu cấy tiếp xúc liên tục với chất lỏng Đặc trưng của thực vật mọng nước là mô có những biểu hiện rối loạn về hình thái và sinh lí như thân mọng nước, có màu trong như thủy tinh, chồi sinh trưởng bất thường, đặc biệt là những dị thường ở lá Có thể giảm bớt hiện tượng mọng nước bằng cách tăng