THU NHẬN, NHÂN DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYME LIGNIN PEROXIDASE H8 TỪ NẤM MỤC TRẮNG Phanerochaete chrysosporium VÀO E. coli

cDNA LIPH8 mã hóa enzyme LiPH8 của dòng BKM-F 1767 đã được phân lập thành công từ RNA tổng số và không nhận thấy sự khác biệt về trình tự acid amin do cDNA LIPH8 mã hóa với trình tự do

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THU NHẬN, NHÂN DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYME LIGNIN PEROXIDASE H8 TỪ NẤM MỤC TRẮNG

Phanerochaete chrysosporium VÀO E coli

Sinh viên thực hiện : LÊ THỊ HUỲNH TRÂM Niên khóa : 2009 – 2013

Tháng 6/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THU NHẬN, NHÂN DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYME LIGNIN PEROXIDASE H8 TỪ NẤM MỤC TRẮNG

Phanerochaete chrysosporium VÀO E coli

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

Tháng 6/2013

LỜI CẢM ƠN

Vậy là tôi đã bước đến những vạch cuối cùng của con đường Đại học và ngày

hôm nay, để có thể hoàn thành được luận văn này, đầu tiên tôi chân thành cảm ơn các

thầy cô giáo bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ

Chí Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi

trong suốt 4 năm đại học

Tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Th.S Nguyễn Xuân Đồng đã định hướng ý

tưởng nghiên cứu cho tôi, giúp đỡ tôi về kiến thức chuyên môn, tận tình hướng dẫn tôi

trong suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp cũng như chỉnh sửa luận văn Tôi cũng cảm

ơn Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM và các anh chị phòng Công nghệ Vi sinh

đã tạo điều kiện, hỗ trợ tôi về kinh phí cũng như thiết bị để tôi có thể thực hiện đề tài

Tôi cũng chân thành cảm ơn bạn Tùng đã luôn ủng hộ, động viên và hỗ trợ tôi

trong suốt thời gian làm đề tài; và các bạn Tiên, Linh, Đông,… cũng đã nhiệt tình giúp

tôi tôi những lúc khó khăn

Và cuối cùng, hơn ai hết, từ đáy lòng con cảm ơn ba mẹ đã sinh ra con, nuôi

dạy con khôn lớn, luôn bên con, động viên, tạo mọi điều kiện tốt nhất cả về tinh thần

và vật chất để con có thể trở thành con của ngày hôm nay

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn

TÓM TẮT

Cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu năng lượng của con người ngày một tăng đã dẫn đến sự thiếu hụt về nhiên liệu.Trong khi đó, nhiên liệu hóa thạch, nguồn năng lượng chính hiện nay, đang dần cạn kiệt và gây ra nhiều tác động xấu đến môi trường Do đó, ethanol sinh học, một nguồn năng lượng mới có nguồn gốc từ thiên nhiên và không gây ô nhiễm môi trường, đã được nhiều nước sản xuất nhằm thay thế nguồn nhiên liệu hiện có Tuy nhiên quy trình sản xuất ethanol sinh học từ rơm rạ vẫn còn nhiều khó khăn và tốn kém chi phí, đặc biệt ở giai đoạn loại bỏ thành phần lignin

Vì vậy, đề tài này là một giai đoạn quan trọng nhằm hướng đến mục tiêu tăng khả năng sản xuất enzyme lignin peroxidase, từ đó nâng cao hiệu quả việc loại bỏ lignin, tạo điều kiện thuận lợi cho quy trình sản xuất ethanol sinh học từ rơm rạ

Trong nghiên cứu này, nhận thấy nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium

là loài có hệ enzyme phân giải lignin hoàn chỉnh, nên hai dòng P chrysosporium

BKM-F 1767 và LG17 được kiểm tra sự hiện diện của gen mã hóa enzyme LiPH8 trong hệ gen của chúng bằng phương pháp PCR Sau đó, nuôi cấy hai dòng này trong môi trường hạn chế nitrogen tạo điều kiện cho sự biểu hiện mRNA mã hóa cho enzyme LiPH8 Sử dụng phương pháp RT-PCR để thu nhận cDNA mã hóa cho enzyme LiPH8 của hai dòng cDNA này được gắn chèn vào vector biểu hiện pPIC9K

Sau đó, plasmid tái tổ hợp pPIC9K mang gen LIPH8 được biến nạp vào E coli DH5α

Kết quả PCR và giải trình tự cho thấy cả hai dòng đều mang gen mã hóa cho

enzyme LiPH8, sự tương đồng của gen LIPH8 của dòng LG17 lên đến 98% so với trình tự gen LIPA trên NCBI cDNA LIPH8 mã hóa enzyme LiPH8 của dòng BKM-F

1767 đã được phân lập thành công từ RNA tổng số và không nhận thấy sự khác biệt về

trình tự acid amin do cDNA LIPH8 mã hóa với trình tự do gen LIPA mã hóa Ngoài ra,

do chưa thu nhận được cDNA LIPH8 của dòng LG17, nên gen TH-LIPH8 được tiến

hành tổng hợp nhân tạo dựa theo trình tự DNA của dòng LG17 Đoạn gen này được tối

ưu hóa trình tự DNA nhằm biểu hiện tốt hơn trên hệ thống biểu hiện của Pichia

pastoris Plasmid pIDTSmart-TH-LIPH8 mang gen LIPH8 tổng hợp được biến nạp

thành công vào E coli DH5α Sau đó đã tạo dòng thành công E coli DH5α mang plasmid biểu hiện pPIC9K chứa gen TH-LIPH8

SUMMARY

“Isolating, cloning gene encoding enzyme lignin peroxidase H8 from white-rot

fungus Phanerochaete chrysospoirum into E coli” Along with the development of

society, the increase of energy demands lead to fuel shortage Particularly, fossil fuels, the major source of energy today, are being depleted and cause many negative effects

on environment Hence, many countries are producing bioethanol, a new energy source, which originates in nature and doesn’t cause pollution, to replace the existing fuel sources However, the bioethanol production process from rice straw not only faces many difficulties but it also costs a lot of money, especially in removing lignin Therefore, this thesis is an important period in our main target It is increasing efficiency of lignin peroxidase production, that helps improve the lignin removal, creating convenient conditions for bioethanol production process from rice straw

In this study, realising Phanerochaete chrysosporium has a complete lignin degrading system, so two strains P chrysosporium BKM-F 1767 and LG17 was

checked the presence of gene encoding LiPH8 in their genome by applying PCR method Next, these strains were cultured under nitrogen-limited condition to stimulate

expression of mRNA encoding LiPH8 LIPH8 cDNA was isolated from RNA by using

RT-PCR technique, and then it was ligated to pPIC9K expression vector Plasmid

recombination pPIC9K containing LIPH8 gene was transformed into E coli DH5α

The result of PCR reaction and sequencing showed that gene encoding LiPH8 presents in genome of both strains BKM-F 1767 and LG17, when compared with

nucleotide sequence of LIPA gene in NCBI, similar to LIPH8 gene of LG17, and LIPA gene is up to 98% LIPH8 cDNA was isolated from total RNA of BKM-F 1767 and there is no difference between amino acid sequence encoded by LIPH8 cDNA and that

by LIPA gene In addition, because LIPH8 cDNA of LG17 hasn’t been isolated yet,

TH-LIPH8 gene was synthesised basing on nucleotide sequence from DNA of LG17

and changed to optimized expression in Pichia pastoris Plasmid

pIDTSmart-TH-LIPH8 containing pIDTSmart-TH-LIPH8 gene synthesised was cloned into E coli DH5α Plasmid

recombination pPIC9K bringing TH-LIPH8 gene was also cloned into E coli DH5α

Keywords: Phanerochaete chrysosporium, lignin degration system, lignin

peroxidase H8 gene, molecular biology, cloning

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về lignocellulose và lignin 3

2.1.1 Cấu tạo và đặc điểm của lignocellulose 3

2.1.2 Đặc điểm của lignin 4

2.1.2.1 Cấu tạo và vai trò của lignin 4

2.1.2.2 Loại bỏ lignin trong sản xuất ethanol sinh học 6

2.2 Hệ enzyme phân giải lignin 6

2.2.1 Manganese peoxidase, MnP (EC 1.11.1.13) 7

2.2.2 Laccase (EC 1.10.3.2) 7

2.2.3 Lignin peroxidase, LiP (EC 1.11.1.14) 8

2.3 Nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium 8

2.4 Hệ gen mã hóa enzyme lignin peroxidase của P chrysosporium 10

2.4.1 Trình tự gen LIP 11

2.4.2 Vùng mã hóa 11

2.4.3 Trình tự mở đầu 12

2.4.4 Cấu trúc intron 12

2.4.5 Trình tự điều hòa 13

2.4.6 Gen LIP ở các loài nấm khác 14

2.5 Ứng dụng của lignin peroxidase 14

2.6 Một số nghiên cứu về tạo dòng gen mã hóa enzyme lignin peroxidase 16

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

3.2 Vật liệu 18

3.2.1 Chủng vi sinh vật 18

3.2.2 Enzyme dùng trong các phản ứng 18

3.2.3 Kit phân tích mẫu 18

3.2.4 Vector biến nạp vào E coli DH5α 18

3.2.5 Mồi dùng trong phản ứng PCR 19

3.2.6 Hóa chất 20

3.2.7 Các thang chuẩn 20

3.2.8 Môi trường 21

3.3 Phương pháp thực hiện 22

3.3.1 Khảo sát hoạt tính enzyme LiP của P chrysosporium 22

3.3.2 Kiểm tra sự hiện diện của gen LIPH8 mã hóa cho enzyme LiPH8 trong hệ gen của hai dòng P chrysosporium BKM-F 1767 và LG17 23

3.3.3 Thu nhận cDNA mã hóa cho LiPH8 của P chrysosporium 24

3.3.4 Tạo dòng cDNA LIPH8 mã hóa LiPH8 trong tế bào E coli DH5α 26

3.3.4.1 Tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-LIPH8 26

3.3.4.2 Biến nạp plasmid pPIC9K-LIPH8 vào tế bào E coli DH5α 28

3.3.4.3 Chọn lọc dòng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp 29

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Hoạt tính enzyme LiP của P chrysosporium 31

4.2 Kiểm tra sự hiện diện của gen LIPH8 mã hóa cho enzyme LiPH8 trong hệ gen của hai dòng P chrysosporium BKM-F 1767 và LG17 33

4.3 Thu nhận cDNA mã hóa cho LiPH8 của P chrysosporium 35

4.3.1 Tách chiết RNA tổng số của P chrysosporium BKM-F 1767 và LG17 35

4.3.2 Thu nhận cDNA mã hóa gen LIPH8 36

4.4 Tạo dòng cDNA LIPH8 và gen TH-LIPH8 vào E coli DH5α 41

4.4.1 Sàng lọc các dòng E coli DH5α mang gen TH-LIPH8 bằng phương pháp PCR

khuẩn lạc 41

4.4.2 Tạo dòng E coli DH5α mang vector biểu hiện pPIC9K chứa các gen LIPH8 và TH-LIPH8 của P chrysosporium 44

4.4.2.1 Sàng lọc các dòng E coli DH5α mang vector tái tổ hợp pPIC9K-TH-LIPH8 và pPIC9K-LIPH8 bằng phương pháp PCR khuẩn lạc 44

4.4.2.2 Kiểm tra các dòng E coli DH5α mang vector tái tổ hợp pPIC9K-TH-LIPH8 bằng enzyme cắt giới hạn 46

4.4.2.3 Kiểm tra các dòng E coli DH5α mang vector tái tổ hợp pPIC9K-TH-LIPH8 bằng giải trình tự 47

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

5.1 Kết luận 50

5.2 Đề nghị 50

Tài liệu tham khảo 51

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

FPLC Fast protein liquid chromatography

mRNA messenger ribonucleic acid

MEB Mineral Salts Broth

NCBI National Center for Biotechnology Information

PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

tRNA Transfer ribonucleic acid

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần cellulose, hemicellulose và lignin trong một số thực vật 3

Bảng 3.1 Các mồi sử dụng trong quá trình nghiên cứu 20

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen LIPH8 với cặp mồi LipH8F/LipH8R 24

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng phiên mã ngược 26

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme NotI và SnaBI 27

Bảng 3.5 Thành phần phản ứng nối LIPH8 vào pPIC9K 27

Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi AOX1F/AOX1R và RiH8F/RiH8R 29

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cấu tạo lignocellulose 3

Hình 2.2 Các đơn vị cơ bản của lignin 5

Hình 2.3 Nấm mục trắng P chrysosporium 10

Hình 2.4 Vị trí của các intron trên gen LIP 13

Hình 3.1 Bản đồ gen plasmid pPIC9K 19

Hình 3.2 Các thang chuẩn DNA 20

Hình 4.1 Hoạt tính enzyme LiP của hai dòng BKM-F 1767 và LG17 31

Hình 4.2 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen LIPH8 33

Hình 4.3 Sự tương đồng về trình tự nucleotide giữa gen LIPH8 với 4 gen LIPA, LIPB, LIPH và LIPE 35

Hình 4.4 Điện di RNA tổng số 36

Hình 4.5 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn cDNA mã hóa enzyme LiP8 37

Hình 4.6 Điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E coli DH5α/pIDTSmart-TH-LIPH8 với cặp mồi RiH8F/RiH8R 41

Hình 4.7 Điện di sản phẩm phản ứng cắt plasmid pIDTSmart-TH-LIPH8 và pPIC9K với hai enzyme cắt NotI và SnaBI 42

Hình 4.8 Điện di sản phẩm PCR plasmid pIDTSmart-TH-LIPH8 với cặp mồi RiH8F/RiH8R 44

Hình 4.9 Điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E coli DH5α/pPIC9K-TH-LIPH8 với cặp mồi AOX1F/AOX1R 45

Hình 4.10 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pPIC9K-TH-LIPH8 của dòng ETH.1 với hai enzyme cắt NotI và SnaBI 46

Hình 4.11 Kết quả blast trình tự protein của trình tự trong plasmid pPIC9K-TH-LIPH8 trên NCBI 48

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, cùng với sự tăng trưởng của nền kinh tế, khoa học kỹ thuật và bùng

nổ dân số là sự gia tăng về nhu cầu sử dụng năng lượng toàn thế giới Điều này đã dẫn đến thiếu hụt nhiên liệu cũng như tăng cao về giá thành Theo Hội đồng Năng lượng Thế giới, khoảng 82% nhu cầu nhu cầu năng lượng toàn cầu được cung ứng bởi nguồn nguyên liệu hóa thạch như xăng dầu, khí đốt và than đá Ngoài ra, việc sử dụng nguyên liệu hóa thạch cũng gây ảnh hưởng xấu đến môi trường như khí thải gây hiệu ứng nhà kính, ô nhiễm không khí, mưa acid Vì vậy, các nhà khoa học đã đặt ra nhiều hướng nghiên cứu nhằm tìm kiếm những nguồn năng lượng thay thế Trong đó, nhiên liệu sinh học đang là một đề tài được quan tâm nhất hiện nay

Sản xuất ethanol từ các nguồn nguyên liệu có thể tái tạo, như từ sinh khối của lignocellulose, có thể đảm bảo an ninh năng lượng, giảm thiểu ô nhiễm không khí ở các khu đô thị và hạn chế sự tích tụ của khí carbon dioxide trong không khí Việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu bản địa (có bản chất là lignocellulose) góp phần mở rộng thêm thị trường cho ngành công và nông nghiệp, tạo thêm nhiều việc làm cho người lao động và góp phần làm tăng trưởng nền kinh tế nước nhà Một lợi ích khác của việc sản xuất ethanol từ lignocellulose là khả năng cạnh tranh cao với các nhiên liệu thông thường vì được sản xuất tại bản địa nên không phải chịu các loại thuế do nhập khẩu

Giá thành của ethanol và năng lượng sử dụng trong quá trình sản xuất ethanol trong nhà máy phụ thuộc vào công nghệ được sử dụng để chuyển đổi nguyên liệu Trong quy trình sản xuất ethanol sinh học từ lignocellulose, giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu nhằm mục đích giảm sự kết tinh cellulose, loại bỏ lignin (lignin là thành phần không thể chuyển đổi thành ethanol) Lignin có cấu trúc hóa học phức tạp, liên kết chặt chẽ với các thành phần khác trong lignocellulose làm cho lignocellulose có độ bền vật lý cao, rất khó xâm nhập đối với các vi sinh vật và enzyme, do vậy gây trở ngại cho quá trình phân giải lignin Nhóm enzyme phân giải lignin bao gồm ba enzyme chính, trong đó lignin peroxidase là enzyme quan trọng đối với sự phân giải lignin Tiền xử lý sinh học có thể được thực hiện bằng cách áp dụng LiP để phân giải

lignin từ lignocellulose Phương pháp này được coi là thân thiện với môi trường và tiết

kiệm năng lượng vì được thực hiện ở nhiệt độ thấp và không sử dụng hóa chất Tuy

nhiên, lượng lignin peroxidase do nấm tiết ra rất ít và chi phí sản xuất LiP ở quy mô

công nghiệp còn cao, chưa đạt hiệu quả về kinh tế Do vậy, đề tài “Thu nhận, nhân

dòng gen mã hóa enzyme lignin peroxidase H8 từ nấm mục trắng Phanerochaete

chrysosporium vào E coli” nhằm mục đích nghiên cứu nâng cao hiệu quả sản xuất

enzyme LiP để ứng dụng vào giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu trong quy trình sản xuất

ethanol sinh học

1.2 Yêu cầu của đề tài

- Thu nhận cDNA mã hóa enzyme LiPH8 của P chrysosporium

- Nhân dòng thành công gen mã hóa enzyme LiPH8 vào E coli

1.3 Nội dung thực hiện

Tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme LiP của hai dòng nấm mục trắng

P chrysosporium BKM-F 1767 và LG17 Tiếp tục kiểm tra sự hiện diện của gen mã

hóa enzyme LiPH8 trong bộ gen của hai dòng này cDNA mã hóa enzyme LiPH8

được thu nhận từ RNA tổng số của P chrysosporium và sau đó cDNA này được nối

vào vector biểu hiện pPIC9K, tạo thành plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa enzyme

LiPH8 Plasmid tái tổ hợp tiếp tục được biến nạp vào E coli DH5α Các dòng E coli

DH5α mang plasmid tái tổ hợp được chọn lọc trong môi trường LB có chứa kháng

sinh Ampicillin (50 μg/ml) và thực hiện phản ứng cắt để kiểm tra

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về lignocellulose và lignin

2.1.1 Cấu tạo và đặc điểm của lignocellulose

Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực vật

khác như cỏ, lúa, ngô… Trong tự nhiên, có thể tìm thấy lignocellulose ở thực vật hay

các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và các chất thải rắn trong thành phố Với tính

sẵn có, lignocellulose trở thành một nguồn năng lượng tái tạo dồi dào

Hình 2.1 Cấu tạo lignocellulose

Thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin Trong đó, cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 40 – 50% khối lượng khô thực vật,

hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 25 – 30% và 15 – 20% khối lượng khô

của cơ thể thực vật và một lượng rất nhỏ các thành phần khác Trong tự nhiên, ngoại

trừ sợi bông, các vi sợi cellulose được bao bọc bởi một mạng lưới các polymer có cấu

trúc khác nhau, chủ yếu là hemicellulose và lignin (Vishnu và Mala, 2012)

Bảng 2.1 Thành phần cellulose, hemicellulose và lignin trong một số thực vật (%)

Sợi bông 8 – 95 5 – 20 0

(Nguyễn Ánh Tuyết và ctv, 2012)

Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau, trong khi lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ phenylpropanoid Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này là khác nhau giữa các loài Hơn nữa, thành phần cấu tạo trong cùng một cây hay các cây khác nhau là khác nhau, dựa vào độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây và các điều kiện khác Cellulose

là một homopolymer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-D glucose-pryanose Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4 glucoside Hemicellulose được cấu tạo từ các loại đường khác nhau Vì thế tên gọi của chúng thường được đặt theo tên loại đường nào chiếm tỷ lệ lớn trong thành phần của hemicellulose Hemicellulose thường được cấu tạo từ 150 gốc đường Các gốc đường này liên kết với nhau bằng các liên kết β-1,4; β-1,3; β-1,6 glucoside Chúng thường những mạch ngắn, phân nhánh Cấu trúc của hemicellulose không bền, dễ bị phân hủy bởi acid loãng hoặc kiềm Khi bị phân hủy, hemicellulose tạo thành các monosaccharide (Nguyễn Ánh Tuyết và ctv, 2012)

Lượng lớn lignocellulose được thải ra từ các hoạt động lâm nghiệp, nông nghiệp và công nghiệp giấy gây ra ô nhiễm môi trường và thường được xử lý bằng cách đốt bỏ Tuy nhiên, sinh khối từ các chất thải này có thể được biến đổi thành các sản phẩm có giá trị khác nhau như nhiên liệu sinh học, hóa chất, nguồn năng lượng rẻ cho quá trình lên men… Thế nhưng, việc nghiên cứu và ứng dụng lượng sinh khối này vẫn chưa được quan tâm đúng mức (Howard và ctv, 2003)

2.1.2 Đặc điểm của lignin

2.1.2.1 Cấu tạo và vai trò của lignin

Lignin là một hợp chất cao phân tử, có nhiều ở thực vật bậc cao (cả thực vật hạt trần và thực vật hạt kín), có trong các cây dương xỉ Trong rong, tảo và địa y chưa thấy

có lignin (Nguyễn Ánh Tuyết và ctv, 2012)

Ở cây gỗ, lignin chiếm tới 20 – 30% Trong thành phần của lignin, carbon chiếm 69%, hydro chiếm 7% và oxy chiếm 24% Trong suốt quá trình phát triển của thực vật, lignin được tạo ra không bị biến đổi sinh lý Lignin có cấu trúc không gian ba chiều, vô định hình, không tan trong nước nhưng tan trong acid vô cơ Lignin bị phân

giải dưới tác dụng của kiềm bisulfit natri và acid sulfuric, tạo ra những hợp chất thơm (Nguyễn Ánh Tuyết và ctv, 2012)

Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: p-courmary alcohol, coniferyl alcohol,

và sinapyl alcohol

Hình 2.2 Các đơn vị cơ bản của lignin (a): p-cpumaryl alcohol, (b): conifery alcohol, (c): sinapyl

Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu trúc Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu Lignin trong tế bào thực vật bậc cao không có vùng vô định hình Các vòng phenyl trong lignin của gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào Ngoài ra, cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng polysaccharide

Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò là chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose, nó cũng giúp bảo vệ những polysaccharide này khỏi sự thủy phân sinh học Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn Lignin không phải là carbohydrate nhưng có liên kết chặt chẽ với nhóm này

để tạo nên màng tế bào giúp thực vật cứng chắc và giòn, có chức năng vận chuyển nước trong cơ thể thực vật (một phần là để làm bền thành tế bào và giữ cho cây không

bị đổ, một phần là điều chỉnh dòng chảy của nước), giúp cây phát triển và chống lại sự tấn công của côn trùng và mầm bệnh Lignin có khả năng chống lại hầu hết các hoạt động tấn công sinh học, hơn cả cellulose cũng như các cấu trúc polymer khác Trong điều kiện nuôi cấy, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng lignin và các chiết xuất từ lignin có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm, hoạt động như là một chất chống oxy

hóa, có khả năng hấp thụ bức xạ cực tím và có một số biểu hiện cho thấy khả năng chống cháy Thực vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn (Doherty và ctv, 2011)

2.1.2.2 Loại bỏ lignin trong sản xuất ethanol sinh học

Quy trình sản xuất ethanol sinh học từ lignocellulose gồm bốn bước: tiền xử lý nguyên liệu, thủy phân nguyên liệu, lên men dịch đường, thu nhận – tinh sạch ethanol Trong giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu, quá trình loại bỏ lignin gặp rất nhiều khó khăn

và đây cũng được xem như là một trong những bước tốn kém nhất Theo tính toán, giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu chiếm khoảng 18% tổng chi phí sản xuất, nhiều hơn so với bất kỳ giai đoạn nào khác Do đó, nâng cao hiệu quả của giai đoạn này sẽ là yếu tố quyết định cho sự thương mại hóa sản phẩm (Yang và Wyman, 2008)

Có nhiều phương pháp tiền xử lý khác nhau đã được đề xuất trong các thập kỷ vừa qua Chúng có thể được phân loại thành các phương pháp như tiền xử lý sinh học, vật lý, hóa học và hóa lý, hoặc kết hợp các phương pháp tùy theo đặc tính của nguồn nguyên liệu ban đầu (Parveen và ctv, 2009) Tuy nhiên, các phương pháp vật lý và hóa học thường đòi hỏi điều kiện nhiệt độ cao và phải kiểm soát áp suất liên tục, đồng thời việc sử dụng acid và kiềm có thể gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường Do vậy, quá trình tiền xử lý nguyên liệu bằng phương pháp sinh học bằng ligninase đã được chú trọng phát triển vì tính chất thân thiện với môi trường, không đòi hỏi điều kiện sản xuất khắt khe và tiêu thụ ít năng lượng

Tiền xử lí sinh học là phương pháp sử dụng các vi sinh vật có khả năng tiết ligninase để phân giải gỗ, bao gồm các loài nấm mục trắng, nấm mục nâu và nấm mục mềm để thay đổi thành phần hóa học và cấu trúc của lignocellulose Trong đó, nấm

mục trắng thuộc nhóm Basidiomycete là nhóm có khả năng phân giải lignocellulose

cao nhất trong tất cả các nhóm đã được nghiên cứu (Kirk và Farrell, 1987) Sự phân giải lignin bởi nấm mục trắng thông qua sự xúc tác của các enzyme phân giải lignin là một trong những phương pháp mang lại hiệu quả cao cho quá trình tiền xử lí lignocellulose bằng phương pháp sinh học (Yang và ctv, 2011)

2.2 Hệ enzyme phân giải lignin

Phân giải lignin đóng vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn carbon của Trái Đất, vì nó giúp tái tạo lại carbon từ lignin hoặc từ các chất được lignin bảo vệ nhờ enzyme có khả năng phân giải Những enzyme có khả năng phân giải lignin được phát hiện cho tới nay là những enzyme ngoại bào và không đặc hiệu, tham gia vào những

phản ứng oxi hoá khác nhau để làm đứt những liên kết trong vòng thơm lignin Những enzyme ngoại bào chính tham gia vào quá trình phân huỷ lignin là lignin peroxidase (ligninase, LiP, EC 1.11.1.14), manganese peroxidase (MnP, EC 1.11.1.13) và laccase chứa Cu (benzenediol, oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.2) (Annele, 2001)

2.2.1 Manganese peoxidase, MnP (EC 1.11.1.13)

Manganese peoxidase là một glycoprotein, có trọng lượng phân tử từ 38 – 62,5 kDa, trung bình khoảng 45 kDa Cho đến nay, MnP chỉ được tìm thấy ở một số thành viên thuộc nhóm Basidiomycete (Agaricales, Corticiales, Polyporales, Hymenochaetales) (Grzegorz và ctv, 2013)

MnP oxi hóa Mn2+ thành Mn3+ trong điều kiện bắt buộc phải có H2O2 Trong quá trình phản ứng, nấm tiết ra một phức nội là một acid dicarboxylic để ổn định sự hình thành Mn3+ MnP được tiết ra bởi Ceriporiopsis subvermispora còn có thể oxy

hóa oxalate và glycoxylate để tạo thành H2O2 Do đó, nếu như có sự hiện diện của acid hữu cơ trong môi trường, MnP không cần phải phụ thuộc vào H2O2 để thực hiện quá trình oxy hóa Gần đây, các nhà khoa học còn phát hiện ra rằng MnP có khả năng khoáng tổng hợp lignin theo CO2 và trong điều kiện thí nghiệm cùng với sự có mặt của một phức nội của acid hữu cơ và các chất béo không no, MnP còn có thể phân rã mùn cưa Như vậy, vai trò của acid dicarboxylic không chỉ giúp ổn định sự hình thành ion

Mn3+, mà còn là một chất nền giúp cho MnP hoạt động tạo thành các chất oxy hóa như

H2O2 (Hakalaa và ctv, 2005)

Một số vi sinh vật sản sinh được MnP gồm Phanerochaete chrysosporium,

Stropharia coronilla, Irpex lactues

2.2.2 Laccase (EC 1.10.3.2)

Laccase là một enzyme ngoại bào, trọng lượng phân tử 60 – 80 kDa, chứa nhiều ion Cu2+ và có khả năng oxy hóa Laccase được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên ở nhiều loài thực vật, côn trùng và nấm Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy sự hiện diện của laccase ở một số chi thuộc các nhóm như Ascomycete, Deuteromycete và chủ yếu

là thuộc nhóm Basidiomycete Laccase xúc tác quá trình oxy hóa của một loạt các chất hữu cơ và vô cơ (monophenolic, diphenolic và cả polyphenolic, các amino phenol, methyoxyphenol, các amin thơm) bằng cách khử đồng thời bốn điện tử của oxy để tạo thành nước Trong các loại enzyme, laccase đóng vai trò rất quan trọng vì có khả năng phân giải lignin và loại bỏ được các hợp chất độc hại Trong điều kiện nuôi cấy, có thể

kích thích khả năng sản sinh laccase bằng cách bổ sung vào môi trường các chất như acid ferulic, 2,5-xylidine, p-anisidine hay veratryl alcohol vì những chất này có cấu trúc phân tử tương tự lignin hoặc dẫn xuất của lignin Các nghiên cứu cho thấy rằng

Cu đóng vai trò quan trọng và nổi bật trong quá trình tổng hợp laccase của nấm (Grzegorz và ctv, 2013; Revankar và Lele, 2006)

2.2.3 Lignin peroxidase, LiP (EC 1.11.1.14)

Lignin peroxidase là một enzyme ngoại bào, hoạt động trong điều kiện có H2O2,được khám phá ra lần đầu tiên vào năm 1983 Enzyme này là một glycoprotein chứa

heme, có trọng lượng phân tử từ 38 – 42 kDa LiP được tổng hợp bởi Phanerochaete

chrysosporium trong quá trình chuyển hóa các hoạt chất thứ cấp và trong điều kiện

môi trường thiếu hụt nitrogen LiP xúc tác quá trình oxy hóa, các hợp chất có vòng phenol và không vòng phenol, như veratryl alcohol tạo thành veratryl aldehyde LiP xúc tác cho quá trình hydroxyl hóa các nhóm benzylic methylene, oxy hóa các các hợp chất có nhân thơm tạo thành các gốc ion aryl dương, rượu thơm, tạo thành nhóm aldehyde hay xeton và oxy hóa phenol LiP còn xúc tác cho phản ứng cắt mở vòng của thành phần non-phenolic (Gold và Maragaret, 1993; Grzegorz và ctv, 2013)

Cơ chế phản ứng: enzyme phản ứng với H2O2 để tạo chất trung gian bị oxy hoá mang hai điện tử, gọi là hợp chất I Hợp chất này lại bị oxy hoá cơ chất lignin để tạo một chất trung gian bị oxy hoá mang một điện tử, gọi là hợp chất II Hợp chất II trở về trạng thái ban đầu bằng cách oxy hoá một phân tử cơ chất thứ hai Trong trường hợp thừa H2O2, hợp chất II có thể không về trạng thái enzyme ban đầu mà chuyển thành dạng bất hoạt của enzyme (Deepak và Shulin, 2008; Gold và Maragaret, 1993)

LiP + H2O2 → LiPI + H2O LiPI + Ar → LiPII + Ar+

LiPII + Ar → LiP + Ar+ + H2O

Ar : hợp chất hữu cơ chứa vòng thơm

Ar+ : hợp chất hữu cơ chứa vòng thơm bị oxy hóa thành gốc cation tự do

2.3 Nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium

Việc loại bỏ lignin có trong gỗ và lignocellulose đóng vai trò quan trọng trong sản xuất giấy, chăn nuôi, hóa chất và nhiên liệu, do đó đã có nhiều nghiên cứu được thúc đẩy nhằm tìm hiểu về hệ enzyme phân giải lignin Hệ enzyme phân giải lignin được tìm thấy ở nhiều loài vi sinh vật và đặc biệt là ở các loài nấm Basidiomycete hay

nấm mục gỗ bao gồm nấm mục trắng, nấm mục nâu và nấm mục mềm Trong đó, nấm

mục trắng được biết đến như là sinh vật có hệ enzyme phân giải lignin hiệu quả nhất

và phân bố rộng rãi trong các đống lá rừng hay cây đổ Nấm mục trắng sản xuất hệ

enzyme ngoại bào phân giải lignin, bao gồm lignin peroxidase, manganese peroxidase

và laccase (Ruqayyah và ctv, 2011)

Sự biểu hiện các enzyme này phụ thuộc vào mức độ khác nhau của trạng thái

phân giải cơ chất và các điều kiện nuôi cấy Dựa vào khả năng tiết enzyme của các loài

nấm mục trắng, có ba hệ enzyme phân giải lignin được chú ý: nhóm lignin –

manganese peroxidase (như Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata), nhóm

manganese peroxidase – laccase (như Dichomitus squalens, Rigidoporus lignosus) và

nhóm lignin peroxidase – laccase (như Phlebia ochraceofulva and Junghuhnia

separabilima) Nhóm lignin – manganese peroxidase có khả năng phân giải lignin cao

nhất (Annele, 1994) Trong số các loài nấm mục trắng, Phanerochaete chrysosporium

là loài nấm được đánh giá có khả năng phân giải lignin tốt nhất bởi nó có khả năng

sinh ra hệ enzyme phân giải lignin hoàn thiện nhất (Deepak và Shulin, 2008)

P chrysosporium chứa ít nhất mười isozyme lignin peroxidase, năm isozyme

manganese peroxidase, ngoài ra còn có copper oxidase, estarases, cellulase và

Loài : Phanerochaete chrysosporium

P chrysosporium thuộc nhóm Basidiomycete có một vòng sinh trưởng bất

thường vì có giai đoạn sinh sản đơn bào Đầu tiên được biết đến dưới tên

Sporotrichum pulverulentum là loài nấm sinh sản vô tính Tuy nhiên sau khi phát hiện

trạng thái sinh sản hữu tính thì Phanerochaete chrysosporium là tên được sử dụng mặc

định cho loài (Deepak và Shulin, 2008)

Hình 2.3 Nấm mục trắng P chrysosporium

(a) và (b): hình thái khuẩn lạc trên môi trường MEA

(c): sợi nấm và bào tử P chrysosporium chụp ở vật kính 40X.

P chrysosporium được tìm thấy ở những khu rừng có khí hậu ôn hoà trải dài từ

Bắc Mỹ, Châu Âu, Châu Phi và kể cả Châu Á như Iran, Việt Nam Nhiệt độ sinh

trưởng tối ưu ở khoảng 40oC, có khả năng sản sinh rất nhiều bào tử vô tính

P chrysosporium có khả năng phân giải các hợp chất thơm có trong lignin

P chrysosporium tiết enzyme ngoại bào để phá vỡ cấu trúc ba chiều phức tạp của

lignin, biến đổi lignin thành các thành phần có thể sử dụng được trong quá trình trao

đổi chất của nó Các enzyme ngoại bào này là những chất oxy hóa không đặc hiệu

(hydrogen peroxide, các gốc hydroxyl), được sử dụng để phá vỡ các liên kết lignin

Trong quá trình trao đổi chất, P chrysosporium cũng có thể tiết ra nhiều hợp chất

chuyển hóa trung gian và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ khác nhau Tuy nhiên, các

nghiên cứu cho thấy sự phân giải lignin của P chrysosporium phụ thuộc vào nguồn

dinh dưỡng Sự phân giải lignin của P chrysosporium là một phần của hệ thống trao

đổi chất, chỉ xảy ra khi môi trường dinh dưỡng thiếu nguồn nitrogen (Deepak và

Shulin, 2008; Paul và ctv, 1987)

Do có khả năng phân giải lignin, P chrysosporium đã được chú trọng nghiên

cứu để áp dụng vào quá trình xử lý các chất gây ô nhiễm nhằm bảo vệ môi trường Vì

vậy, P chrysosporium là loài đầu tiên của nhóm Basidiomycete có bộ gen được xác

chỉnh hoàn chỉnh (Annele, 2001)

2.4 Hệ gen mã hóa enzyme lignin peroxidase của P chrysosporium

Hầu hết nấm mục trắng và các loài khác như Pleurotus ostreatus, Agaricus

bisporus đều sản xuất ra MnP và laccase, tuy nhiên chỉ có một số ít nấm mục trắng

mới có thể sản xuất LiP Trong khi chỉ enzyme này mới có thể tấn công các cấu trúc

non-phenolic của lignin Do vậy, P chrysosporium nổi bật là nhờ khả năng tiết LiP

(Annele, 2001)

2.4.1 Trình tự gen LIP

Các protein chứa các hợp chất mang Cu do P chrysosporium BKM-F 1767

tổng hợp được đánh số ngẫu nhiên từ H1, H2, H3,…, H10 Trong đó, protein H1, H2,

H6, H7, H8 và H10 đã được xác định là có hoạt tính của enzyme LiP trong khi các

enzyme còn lại có hoạt tính của enzyme MnP Các enzyme LiP do P chrysosporium

tổng hợp được mã hóa bởi mười gen LIP có cấu trúc khá tương đồng Mối liên hệ giữa

các gen LIP và sự mã hóa của những gen này cho các enzyme LiP riêng biệt thì không

được chỉ rõ, trừ trường hợp hai gen LIPA và LIPD lần lượt mã hóa cho hai isozyme

LiPH8 và LiPH2 (Philip và Daniel, 1999; Reddy, 1993)

Số lượng cũng như sự đa dạng của các gen LIP mã hóa cho các isozyme LiP

khác nhau của P chrysosporium phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy, quy trình tinh sạch

cũng như các chủng được sử dụng trong quá trình nghiên cứu Khi nuôi cấy

P chrysosporium BKM-F 1767 trong môi trường nuôi cấy có dung dịch đệm là acetat,

người ta xác định được hai isozyme LiPH2 và H6 có hàm lượng lớn, trong khi H8 và

H10 có hàm lượng vừa phải Ngược lại, nếu môi trường nuôi cấy tương tự nhưng có

dung dịch đệm là dimethyl succinate thì H8 được tổng hợp nhiều nhất, tiếp theo là H2,

còn H6 và H10 chỉ được tổng hợp với một lượng rất nhỏ Một số nghiên cứu khác

cũng cho thấy rằng, P chrysosporium tổng hợp một lượng lớn H2 và H8 trong điều

kiện môi trường thiếu hụt nitrogen và có dung dịch đệm là dimethyl succinate, trong

khi với cùng một điều kiện môi trường nuôi cấy nhưng thiếu hụt carbon thì chỉ có một

lượng lớn H2 được tổng hợp (Reddy, 1993)

2.4.2 Vùng mã hóa

Mỗi protein trưởng thành do gen LIP mã hóa có chứa từ 343 – 345 acid amin và

khoảng 27 – 28 acid amin ở trình tự mở đầu Theo tính toán, phần mã hóa cho mỗi

protein trưởng thành có trọng lượng phân tử từ 36360 – 36607 Da, trong khi trọng

lượng phân tử thật là 38000 – 43000 Da Điều đó cho thấy rằng khoảng 6 – 13% tổng

trọng lượng enzyme đã được sử dụng cho quá trình glycosyl hóa Tất cả các isozyme

LiP được xác định chứa khoảng 2,5 – 3 kDa carbohydrat tại vị trí liên kết

N-asparagine, bao gồm mannose 6-phosphate và carbohydrat tại liên kết O Tất cả các

gen LIP, ngoại trừ gen mã hóa cho H10, đều có một vị trí có khả năng N-glycosyl hóa,

có trình tự là Asn-X-Ther/Ser, còn gen mã hóa cho H10 thì lại có hai vị trí Tất cả các chuỗi đều có nhiều vị trí có khả năng O-glycosyl hóa Một số isozyme LiP có thể được

mã hóa bởi cùng một gen, nhưng vẫn có sự khác biệt trong quá trình biến đổi sau phiên mã, bao gồm cả thành phần và số lượng glycosyl hóa và phosphoryl hóa

Đầu C của tất cả các gen LIP, ngoại trừ gen LG2 mã hóa cho H8 của chủng

P chrysosporium OGC101 và gen CLG4 mã hóa cho H2 của chủng P chrysosporium

BKM-F 1767, đều giống hệt nhau và có trình tự chuỗi amino acid là IPPPPGA Gen

LG2 có trình tự chuỗi amino acid ở đầu C là IPPHKA, và gen CLG4 là IPPPPSPN

Vai trò của đầu C giàu proline vẫn chưa xác định được Các vùng mã hóa trên gen LIP

có thành phần G + C khoảng 60 – 65%, còn vùng không mã hóa thì G + C chiếm

khoảng 44 – 49% Gen LG2 mã hóa cho isozyme H8 của chủng OGC101 có tỉ lệ G +

C cao nhất trong các gen của P chrysosporium (Gold và Maragaret, 1993)

2.4.3 Trình tự mở đầu

Mỗi protein LiP trưởng thành chứa khoảng 27 hoặc 28 amino acid ở vùng trình

tự mở đầu LiP ban đầu được tổng hợp là một preproenzyme bao gồm prepeptide có 21 amino acid và theo sau là propeptide có 7 amino acid sẽ bị phân cắt bởi các peptidase Phía sau amino acid thứ 21 là Ala có chứa các tín hiệu để peptidase nhận diện và thực hiện sự phân cắt Propeptide có vai trò giúp cho peptidase nhận diện được chính xác protein mục tiêu, thực hiện quá trình gấp cuộn chuỗi polypeptide và duy trì trạng thái bất hoạt của các enzyme trong quá trình vận chuyển Có thể prepeptide được cắt trong quá trình vận chuyển vào mạng lưới nội chất, còn propeptide được cắt tại bộ máy Golgi (Gold và Maragaret, 1993)

2.4.4 Cấu trúc intron

Các gen LIP của P chrysosporium có khoảng tám hoặc chín intron khác nhau,

có kích thước từ 49 – 78 bp Vị trí nối giữa intron/exon có trình tự giống nhau ở tất cả các nấm sợi, hầu hết là GT tại đầu 5’ và AG tại đầu 3’ Sáu trong số các intron và các trình tự xung quanh các vị trí nối intron/exon thì giống nhau ở các loài nấm sợi Tất cả

các trình tự, ngoại trừ GLG1 mã hóa cho isozyme H2 ở P chrysosporium, có intron

đầu tiên chứa tín hiệu để cắt propeptide

Gen LIP ở P chrysosporium được chia thành bốn nhóm nhỏ dựa trên cấu trúc

intron/exon Nhóm I bao gồm các gen mã hóa H8 và các trình tự liên quan Nhóm II

bao gồm gen GLG2 mã hóa cho H10 và một allen biến thể của nó là GLG5 Nhóm III

gồm GLG6 Nhóm II và III giống hệt nhóm I ngoại trừ việc chèn thêm một intron vào

exon lớn nhất (exon 7) Nhóm IV bao gồm các trình tự GLG1 mã hóa cho H2, có tất cả

các intron của nhóm II và III, nhưng thiếu đi intron 1 và 4 có ở tất cả các nhóm còn lại

(Gold và Maragaret, 1993)

Hình 2.4 Vị trí của các intron trên gen LIP

Các gen LIP được sắp xếp theo các nhóm phụ đã được liệt

kê ở trên VLG1 là một gen LIP từ Trametes versicolor

2.4.5 Trình tự điều hòa

Đầu 5’ tại vùng không mã hóa của gen LIP chứa một trình tự TATA tại vị trí

-66 đến -88 bp và một trình tự CAAT tại giữa vị trí -107 đến -228 bp Có trình tự của

các yếu tố tương tự hoặc giống hệt protein nguyên tố gắn kết đáp ứng với phản ứng

cAMP và protein kích hoạt đáp ứng với phản ứng cAMP đã được tìm thấy tại vùng

promotor của nhiều gen LIP Trên gen LG2 mã hóa cho isozyme H8 từ chủng

P chrysosporium OGC101, các trình tự này lần lượt nằm tại vị trí -228 và -161bp, và

có liên quan đến codon khởi đầu dịch mã Các trình tự giống hệt các trình tự quy định

các yếu tố đáp ứng xenobiotic, là các yếu tố kích hoạt quá trình phiên mã các hợp chất

hydrocarbon thơm, cũng được phát hiện ở vùng promotor ở một số gen LIP Các

codon khởi đầu dịch mã ở hầu hết các gen LIP đều được bao bọc bởi trình tự bảo tồn

eukaryotic GNNATGG, hầu hết các trình tự là GACAATGG Tín hiệu polyadenyl hóa

ở đầu 3’ thì đa dạng hơn, đặc biệt là ở hệ gen của nấm cDNA của gen LG2 có trình tự

AATCAA trước vị trí -24 bp đuôi poly(A) Hai cDNA của gen LIP khác cũng có trình

tự AATAT/CA ở trước vị trí -14 bp của đuôi poly(A) (Gold và Maragaret, 1993)

2.4.6 Gen LIP ở các loài nấm khác

Các đoạn dò gen LIP ở P chrysosporium đã được sử dụng để lai với nhiều đoạn

gen khác nhau trong DNA của các loài nấm mục trắng khác Một dòng cDNA mã hóa

cho LiP ở Phlebia radiata đã được giải trình tự và giống khoảng 60% so với trình tự gen LIP ở P chrysosporium Tương tự, một trình tự gen mã hóa cho LiP ở Trametes

versicolor cũng giống từ 55 – 60% gen LIP ở P chrysosporium Các vị trí của bốn

trong số sáu intron của gen LIP ở P chrysosporium cũng được bảo tồn trên gen VLGJ

ở Trametes versicolor (Gold và Maragaret, 1993)

2.5 Ứng dụng của lignin peroxidase

Trong công nghiệp thực phẩm, LiP được sử dụng để sản xuất chất thơm tự

nhiên như là sản xuất vanillin LiP ở P chrysosporium có thể giải phóng các hợp chất

ở vách tế bào thực vật ở vỏ dừa xanh Vỏ dừa xanh sau khi phơi khô được sử dụng để

sản xuất vanillin bằng phương pháp lên men bề mặt Việc sử dụng P chrysosporium

trong quá trình lên men đã làm tăng 20% sản lượng vanillin (Barbosa và ctv, 2008; Maciel và ctv, 2010)

LiP cũng được ứng dụng để tẩy trắng bột giấy trong công nghệ sản xuất giấy Ở

giai đoạn làm trắng bột giấy, khi bổ sung P chrysosporium vào quy trình sản xuất,

hàm lượng lignin có trong bột giấy giảm 33,5% trong mười ngày và giảm khoảng 20 –

33% khi bổ sung Coriolus versicolor trong năm ngày (Onysko, 1993; Srebotnik và

Messner, 1990)

Trong xử lý sinh học, LiP cũng có tác dụng tẩy màu thuốc nhuộm, phẩm màu, loại bỏ các hợp chất phenol, các hợp chất đa vòng nhân thơm; phân giải các chất gây ô

nhiễm môi trường và thuốc trừ sâu P chrysosporium đã được sử dụng để tẩy màu

nước thải từ rỉ đường tại một nhà máy sản xuất ethanol Pha loãng nước thải rỉ đường

với tỉ lệ 10% v/v và bổ sung bào tử P chrysosporium có nồng độ 2,5 × 106 bào tử/ml, sau đó đem ủ, đến ngày thứ 5 nước thải đã được tẩy màu đến 75% Nghiên cứu cho thấy LiP hoạt động với hoạt tính là 185 U/l và MnP là 25 U/l (Maciel và ctv, 2010; Vahabzadeh và ctv, 2004)

Trong tẩy màu thuốc nhuộm, LiP được ủ trong điều kiện kéo dài có thể tẩy màu

tất cả thuốc nhuộm Ghasemi và ctv đã sử dụng P chrysosporium RB78 để xử lý thuốc

nhuộm azo dựa trên hệ enzyme của nấm là LiP và MnP Trong điều kiện tối ưu, thuận lợi cho khả năng biểu hiện, LiP có hoạt tính là 182 ± 2,5 U/l và MnP là 850 ± 41 U/l

sau 24 giờ thuốc nhuộm đã được tẩy màu 100% LiP của Kocuria rosea MTCC 1532

có khả năng tẩy được 11 loại thuốc nhuộm với mức độ khác nhau bao gồm azo, triphenylmethane, heterocyclic, polymeric và các phức hợp kim loại tại pH trung tính (Ghasemi và ctv, 2010; Parshetti và ctv, 2012)

Ngành công nghiệp dược phẩm cũng gây ra nhiều tác hại đến môi trường, đặc

biệt là tetracycline và oxytetracycline LiP của P chrysosporium có khả năng phân

giải tetracycline và oxytetracycline mạnh mẽ Với hàm lượng 50 mg/l tetracycline và oxytetracycline, cùng với enzyme có hoạt tính 40 U/l, thì sự phân giải tetracycline và oxytetracycline đạt 95% trong vòng 5 phút (Xianghua và ctv, 2009)

Hệ enzyme phân giải lignin của P chrysosporium cũng được sử dụng để phân

giải các hợp chất xenobiotic tồn tại dai dẳng trong môi trường Vào năm 2010, Cesare

và ctv đã thực hiện một loạt các thí nghiệm sử dụng các hạt nhựa sinh học có chứa

P chrysosporium bổ sung vào quá trình xử lý nước thải để loại bỏ bốn dược phẩm

Kết quả cho thấy rằng việc bổ sung những hạt nhựa sinh học này đã làm tăng đáng kể

sự phân giải các thuốc kháng virus (Tamiflu), các thuốc kháng sinh, erythromycin, sulfamethoxazol và ciprofloxacin

Nhờ vào khả năng tiết enzyme LiP, MnP…, làm mục gỗ cứng lẫn gỗ mềm,

P chrysosporium còn được ứng dụng vào quá trình tiền xử lý nguyên liệu nhằm loại

bỏ lignin trong quy trình sản xuất ethanol sinh học từ lignocellulose Một nghiên cứu

cho thấy trong quá trình tiền xử lý thân ngô, bổ sung P chrysosporium trong điều kiện

nuôi cấy tĩnh ở 29oC, sau 15 ngày thì hàm lượng lignin đã giảm 34,5%, còn

homocellulose thì giảm ít hơn 10% Tương tự, khi bổ sung P chrysosporium vào quá

trình tiền xử lý bông vải, sau 10 ngày, hàm lượng lignin giảm đạt cao nhất đến 33,9%

Đối với tiền xử lý rơm rạ, khi bổ sung P chrysosporium vào thì sau 3 tuần, tổng hàm

lượng lignin đã giảm 30% Việc sản xuất ethanol từ khoai mì, mía, ngũ cốc gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến an ninh lương thực thế giới Trong khi đó, chỉ riêng Việt Nam, khoảng 40 × 106 tấn rơm rạ/năm được thải ra gây ô nhiễm môi trường Nghiên

cứu, ứng dụng P chrysosporium vào sản xuất nhiên liệu sinh học không những giúp

bảo vệ môi trường mà còn đẩy mạnh sự phát triển của nền kinh tế (Deepak và ctv, 2011; Jian và ctv, 2009; Zhao và ctv, 2012)

2.6 Một số nghiên cứu về tạo dòng gen mã hóa enzyme lignin peroxidase

Năm 1989, sự phiên mã của gen LiP từ Phlebia radiata trên Trichoderma reesei

bằng plasmid pMS16 đã được phát hiện nhờ vào phương pháp Northern Blot Tuy

nhiên khi phân tích Western Blot sử dụng kháng thể đặc hiệu đã không phát hiện được

protein (Markku và ctv, 1989)

Năm 1990, Zemin và ctv đã tạo dòng gen LiP từ Streptomyces viridosporus

T7A vào Streptomyces lividans TK64 bằng plasmid pIJ702 Đây là lần đầu tiên việc

tạo dòng một gen phân giải lignin của vi khuẩn được công bố

Vào năm 1991, cDNA mã hóa cho LiP lần đầu tiên được biểu hiện thành công

trên hệ thống biểu hiện baculovirus bằng vector λML-1 Phân tích bằng điện di cho

thấy protein LiP có trọng lượng phân tử tương tự LiPH8 Sau đó tiếp tục phân tích cho

thấy λML-1 DNA mã hóa cho LiPH8 Sau đó, năm 1992, protein tái tổ hợp LiPH2

cũng đã được biểu hiện thành công trên hệ thống biểu hiện baculovirus bằng vector

λML-6 Tuy nhiên, hệ thống biểu hiện này có nhược điểm là lượng enzyme sản suất

thấp, chi phí cao nên không thích hợp để sản xuất với quy mô lớn (Deepak và Shulin,

2008; Todd và ctv, 1992; Todd và Joseph, 1991)

Năm 1999, Sami và ctv đã biểu hiện thành công gen mã hóa LiPH8 từ

P chrysosporium trên Aspergillus niger Phân tích bằng Western blot đã phát hiện

được protein tái tổ hợp với kích thước tương tự protein từ LiPH8, tuy nhiên hoạt tính

của LiP đo được thấp

Vào năm 1999, Maarten và ctv đã sử dụng promoter

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gpd) để điều khiển biểu hiện của gen LIP2, gen mã hóa cho

LiPH8, trong điều kiện nuôi cấy của P chrysosporium Vector biểu hiện pUGL, có

gen chỉ thị là Schizophyllum commune ura1 đã được sử dụng LiPH8 tái tổ hợp đã

được tiết ra sau khi biến nạp bốn ngày trong điều kiện nuôi cấy có nồng độ nitrogen và

carbon cao, đây là điều chưa từng xảy ra trước đây Nồng độ LiPH8 tái tổ hợp sau khi

tinh sạch khoảng 2 mg/l Phân tử khối, pI, quang phổ hấp thụ và một số đặc tính khác

của LiPH8 tái tổ hợp về cơ bản giống hệt LiPH8 ban đầu

Năm 2004, Haikuan và ctv đã biểu hiện thành công cDNA của LiPH8 ở

P chrysosporium trên Pichia methanolica Trên hệ thống biểu hiện P methanolica,

lượng protein được tổng hợp khi sử dụng promoter methanol AUG1 là 2500 mg/l Mặc

dù mức độ biểu hiện của LiPH8 trên vector biểu hiện pMETαA chỉ ở mức 100 mg/l,

nhưng có thể được cải thiện bằng cách thêm vào một số phương pháp như sử dụng

chủng P methanolica pMAD16 hay thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp heme

Vào năm 2009, Wei và Xianghua đã biểu hiện thành công LiPH2 trên hệ thống

biểu hiện của Pichia pastoris bằng vector biểu hiện pPICZα Nghiên cứu đã chỉ ra

rằng, hoạt tính của LiP đã được phát hiện khi có nhiều bản copy tái tổ hợp Số lượng copy thấp hay chỉ có một copy thì LiP không được biểu hiện Hoạt tính của LiP đã được phát hiện liên tục trong 84 giờ, hoạt tính tối đa đạt 15 U/l sau 12 giờ cảm ứng

Ở Việt Nam cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về tạo dòng gen mã hóa enzyme LiP được thực hiện

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ ngày 15/12/2012 đến ngày 25/6/2013 tại phòng Công nghệ Sinh học Vi sinh – Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh, địa chỉ: Km

1900, Quốc lộ 1A, phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Chủng vi sinh vật

- Chủng Phanerochaete chrysosporium BKM-F 1767 mua từ công ty DSMZ

(Nguyễn Ánh Tuyết và ctv, 2012) được dùng làm đối chứng dương

- Chủng Phanerochaete chrysosporium LG17 được phân lập từ vườn Quốc gia

Lò Gò – Xa Mát (Tây Ninh) Đây là chủng là hoạt tính phân giải lignin cao nhất trong

3.2.3 Kit phân tích mẫu

Các kit sử dụng trong quá trình nghiên cứu gồm: kit tách chiết DNA tổng số – DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen); kit tách chiết RNA tổng số – The RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen); kit tạo cDNA từ RNA – LongRange 2Step RT-PCR (Qiagen); kit tinh sạch DNA, plasmid, sản phẩm PCR và tinh sạch từ gel agarose – MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction System (Intron); kit tách chiết plasmid – DNA-spin Plasmid DNA Purification Kit (Intron)

3.2.4 Vector biến nạp vào E coli DH5α

Plasmid pPIC9K: là vector biểu hiện dùng cho Pichia pastoris có đặc điểm sau:

- Có trình tự gen kháng Ampicillin dùng để sàng lọc tế bào E coli tái tổ hợp

- Có gen kháng Kanamycin giúp Pichia kháng lại Kanamycin dùng để chọn lọc

tế bào Pichia tái tổ hợp đồng thời xác định tương đối số bản sao của gen được chèn

vào bộ gen của tế bào dựa vào nồng độ Kanamycin tế bào có khả năng kháng được (4 mg/ml tương ứng 7 – 12 copy)

- Có bốn vị trí enzyme cắt giới hạn: SnaBI, EcoRI, AvrII và NotI

- Có trình tự tiết nhân tố  hỗ trợ việc tiết protein mục tiêu ra ngoài môi trường nuôi cấy

- Có chứa trình tự gen HIS4 để chọn lọc thể biến nạp ở P pastoris khi sử dụng

các chủng khuyết dưỡng histidine

- Có trình tự promoter AOX1 tương đồng với trình tự của AOX1 trong bộ gen

của Pichia giúp chuyển trình tự gen mục tiêu vào bộ gen của tế bào

- Trình tự cắt duy nhất của SacI, SalI và BspEI (Kpn2I) dùng để làm thẳng vector

trước khi chuyển vào tế bào Pichia và tạo dạng tái tổ hợp Mut+ (sử dụng methanol mạnh nên tăng sinh tốt trên môi trường có methanol)

- Có chứa trình tự pBR322 ori cần thiết cho sự duy trì và sao chép plasmid trong

tế bào E coli

Hình 3.1 Bản đồ gen plasmid pPIC9K

3.2.5 Mồi dùng trong phản ứng PCR

Cặp mồi LipH8F và LipH8R được sử dụng để khuếch đại đoạn DNA và cDNA

mã hóa cho LiPH8 dựa trên trình tự gốc từ Genbank Hai đoạn mồi này được thiết kế thêm vị trí cắt của hai enzyme cắt giới hạn là NotI và SnaBI phù hợp với vị trí cắt của plasmid pPIC9K

Cặp mồi AOX1F và AOX1R được dùng để khuếch đại vùng trình tự có mang gen đã được nối vào của plasmid pPIC9K

Cặp mồi RiH8F và RiH8R đặc trưng được thiết kế để khuếch đại gen

TH-LIPH8 Gen TH-LIPH8 tổng hợp nhân tạo trên plasmid pIDTSmart đã được thay đổi

để phù hợp hơn khi được biểu hiện trên Pichia pastoris

Bảng 3.1 Các mồi sử dụng trong quá trình nghiên cứu

- Hóa chất đo hoạt tính enzyme: 600 μl veratryl alcohol 10 mM; 600 μl acid

d-tartaric 0,25 M pH 4,0; 240 μl H2O2 5 mM; 1560 μl dịch enzyme thô; Vtổng = 3000 μl

- Hoá chất để tiến hành điện di DNA: agarose; TAE 1X Tris acetate 40 mM, EDTA 0,1 mM pH 8,0; ethium bromide 10 mg/ml

- Dung dịch nạp mẫu: 0,25% bromophenol blue; 40% glycerol trong TAE 1X

3.2.7 Các thang chuẩn

Hình 3.2 Các thang chuẩn DNA

3.2.8 Môi trường

Môi trường MEA dùng tăng sinh nấm P chrysosporium: malt extract, 30 g;

pepton, 2 g; chloramphenicol, 0,1 g Thêm nước cất đủ 1 lít, chuẩn pH 7,0, hấp khử

trùng 121oC – 15 phút

Môi trường Raper dùng tăng sinh, thu bào tử P chrysosporium: pepton, 2 g; cao

nấm men, 2 g; MgSO4.7H2O, 0,5 g; K2HPO4, 1 g; KH2PO4, 0,46 g; glucose, 20 g;

agarose, 15 g Thêm nước cất đủ 1 lít, hấp khử trùng ở 121oC – 15 phút

Môi trường LB (Luria-Bertani) dùng tăng sinh E coli: cao nấm men, 5 g;

trypton, 10 g; NaCl, 15 g; agarose, 15 g Thêm nước cất đủ 1 lít, hấp khử trùng 121oC

– 15 phút Tùy theo mục đích nuôi cấy mà môi trường sẽ có hoặc không có agarose

Môi trường hạn chế nitrogen, tạo điều kiện biểu hiện enzyme LiPH8, nhằm thu

nhận enzyme phân giải lignin (Ming và Kent, 1988)

- Dung dịch stock

Dung dịch các nguyên tố vi lượng: MgSO4, 3 g; FeSO4.7H2O, 0,1 g; MnSO4,

0,5 g; ZnSO4.7H2O, 0,1 g; NaCl, 1 g; CoCl2, 0,1 g; H3BO3, 10 mg; CuSO4, 0,1 g;

AlK(SO4)2.12H2O, 10 mg; Na2MoO4.2H2O, 10 mg; Nitrilotriacetate, 1,5 g Thêm

nước cất đủ 1 lít

Basal III: KH2PO4, 20 g; MgSO4, 5 g; CaCl2, 1 g; dung dịch các nguyên tố vi

lượng, 100 ml Thêm nước cất đủ 1 lít

- Môi trường nuôi cấy

Dung dịch các nguyên tố vi lượng (lọc bằng màng lọc 2 μm) 60 ml

Thêm nước cất đủ 1 lít, các thành phần được hấp hay lọc tùy loại, sau đó trộn

chung với nhau Sục khí oxy vào để loại bỏ hết nitrogen trong môi trường nuôi cấy

3.3 Phương pháp thực hiện

3.3.1 Khảo sát hoạt tính enzyme LiP của P chrysosporium

Hai dòng P chrysosporium BKM-F 1767 và LG17 được nuôi cấy trong môi

trường đĩa thạch Raper từ 3 – 5 ngày ở 37oC để thu nhận bào tử Sau 3 – 5 ngày, cấy

chuyền P chrysosporium vào erlen chứa 30 ml môi trường hạn chế nitrogene, nuôi cấy

tĩnh trong 5 – 6 ngày ở 37oC Đo hoạt tính enyme LiP do nấm sản xuất ở 4 ngày liên tục, từ ngày thứ tư đến ngày thứ bảy trong quá trình nuôi cấy Trong 4 ngày này, mỗi ngày tiến hành thu dịch nổi và sinh khối riêng Dịch nổi được lọc qua giấy lọc Whatman để loại bỏ hoàn toàn sợi nấm, sau đó được ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC Thu phần dịch nổi phía trên đo hoạt tính enzyme Sinh khối của mỗi dòng được bảo quản riêng theo từng ngày ở -80oC

Cho dịch nổi enzyme cùng với hóa chất vào cuvete 3 ml, cho H2O2 vào cuối cùng Đo chỉ số hấp thụ OD ở bước sóng 310 nm, cứ mỗi 30 giây đo một lần cho đến khi chỉ số hấp thụ OD bắt đầu giảm xuống thì ngừng lại Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

với mỗi dòng P chrysosporium

Nguyên lý: LiP xúc tác quá trình oxy hóa veratryl alcohol bởi H2O2 và tạo thành veratryl aldehyde Rượu không hấp thụ ở bước sóng 310 nm, tuy nhiên aldehyde lại bị hấp thụ mạnh ở bước sóng này (hằng số tắt 9300 M-1 cm-1)

Hoạt tính enzyme LiP (U/lít) được tính bằng công thức sau (Silva và ctv, 2012)

Trong đó: ΔOD = ODđầu – ODcuối

ε : hằng số tắt, ở đây ε = 9300 M-1.cm-1

Vt : tổng thể tích cuvet (μl)

VE : thể tích enzyme cho vào cuvet (μl)

d : hệ số pha loãng

Δt : thời gian đo sự thay đổi

Từ kết quả thu được, chọn ngày enzyme có hoạt tính mạnh nhất, thu sinh khối

và tiến hành tách chiết RNA tổng số Sinh khối của những ngày còn lại được sử dụng

để tách DNA tổng số

- Xử lý số liệu (Nguyễn Ngọc Anh và ctv, 2008)

Các dữ liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm MS - Excel 2007

Trắc nghiệm z với phương sai biết trước (z-Test: Two Sample for Means) (dùng trong phân tích mối tương quan về hoạt độ trung bình giữa các hệ enzyme phân giải lignocellulose)

Đặt giả thuyết: H0: µ1 = µ2 (hoạt độ trung bình của hai enzyme là như nhau, hay hai enzyme có mối tương quan với nhau), H1: µ1 ≠ µ2 (hoạt độ trung bình của hai enzyme khác nhau, hay hai enzyme không có mối tương quan với nhau) Giá trị kiểm định Zα = Z0.05 = 1,960

Biện luận kết quả: Nếu Z nằm trong khoảng -1,96 đến +1,96 thì chấp nhận giả thuyết H0, bác bỏ H1 Ngược lại, nếu Nếu Z nằm ngoài khoảng -1,96 đến +1,96 thì chấp nhận giả thuyết H1, bác bỏ H0

3.3.2 Kiểm tra sự hiện diện của gen LIPH8 mã hóa cho enzyme LiPH8 trong hệ gen của hai dòng P chrysosporium BKM-F 1767 và LG17

Sau khi khảo sát hoạt tính enzyme của hai dòng BKM-F 1767 và LG17, nhận thấy có xuất hiện hoạt tính của enzyme LiP, tiến hành nuôi cấy lắc hai dòng này trong môi trường MEA lỏng Sau 5 ngày, thu nhận sinh khối bằng cách lọc qua giấy lọc Whatman Tách chiết DNA tổng số từ sinh khối thu được, sau đó chạy PCR với cặp

mồi LipH8F/LipH8R đặc hiệu để kiểm tra sự hiện diện của gen LIPH8 trong hệ gen

Quy trình tách chiết DNA tổng số theo DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen – Đức)

- Cho khoảng 100 mg sinh khối đã được nghiền mịn thành bột bằng nitơ lỏng vào eppendorf 1,5 ml Thêm 400 μl Buffer AP1 và 4 μl RNase A, vortex mạnh để hòa tan toàn bộ sinh khối

- Ủ hỗn hợp ở 65oC trong 10 phút để ly giải tế bào Trong quá trình ủ, cách 3 phút đảo eppendorf một lần

- Tủa protein và polysaccharide trong dịch ly giải bằng 130 μl Buffer P3, trộn đều và ủ 5 phút trong đá Ly tâm 14000 vòng/phút trong 5 phút, thu phần dịch ly giải phía trên, loại bỏ phần kết tủa

- Chuyển dịch ly giải qua màng lọc QIAshredder được đặt trong eppendorf, ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút để loại bỏ hoàn toàn kết tủa, thu dịch ly giải phía dưới chuyển vào eppendorf mới

- Rửa dịch ly giải bằng Buffer AW1 theo tỷ lệ dịch : Buffer là 2 : 3, trộn đều

- Hút 650 μl hỗn hợp cho vào màng lọc DNeasy được đặt trong eppendorf, ly tâm

10000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch bên dưới, thu phần trên màng Lặp lại bước

này một lần nữa với phần dung dịch còn lại

- Chuyển màng lọc vào eppendorf mới, thêm 500 μl Buffer AW2, ly tâm 10000

vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch bên dưới, thu phần trên màng Thêm 500 μl Buffer

AW2, ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút để làm khô màng

- Chuyển màng lọc vào eppendorf mới, hòa tan DNA bằng cách thêm 100 μl

Buffer AE vào giữa màng, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 10000 vòng/phút Thực

hiện hai lần để thu DNA tổng

DNA tổng số được dùng làm mạch khuôn cho phản ứng PCR để kiểm tra sự hiện

diện của gen LIPH8 trong bộ gen của hai dòng P chrysosporium

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen LIPH8 với cặp mồi

Chu trình nhiệt khuếch đại gen LIPH8 với cặp mồi đặc hiệu LipH8F/LipH8R

3.3.3 Thu nhận cDNA mã hóa cho LiPH8 của P chrysosporium

- Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)

94oC 5’

94oC 30’’

59oC 45’’

72oC 1’30’’

72oC 10’

4oC

∞

35 chu kỳ

RT-PCR là phương pháp tạo ra một đoạn cDNA từ mRNA Ban đầu, một primer oligodeoxynucleotide sẽ gắn vào mRNA và sau đó chúng sẽ được kéo dài nhờ một enzyme phiên mã ngược có hoạt tính polymerase để tạo thành mạch đôi RNA:DNA Tiếp theo, đoạn RNA sẽ được thay thế bằng DNA, tạo ra cDNA Sau đó, đoạn cDNA này sẽ được khuếch đại bằng phản ứng PCR Khi so sánh trình tự cDNA với trình tự DNA sẽ giúp xác định được vị trí mã hóa các intron trên DNA, vùng polyA (Quyền Đình Thi và Nông Văn Hải, 2008; Howe, 2007)

Tất cả các dụng cụ, hóa chất sử dụng đều được xử lý để loại bỏ enzyme phân hủy RNA là Rnase (RNase-free) bằng cách ngâm qua đêm trong DEPC 0,1% đã được hấp khử trùng 121oC – 15 phút

Sau khi đo hoạt tính enzyme, chọn những mẫu có hoạt tính cao nhất ở hai dòng, tiến hành tách chiết RNA từ sinh khối thu được

Quy trình tách chiết RNA tổng số theo The Rneasy Plant Mini Kit (Qiagen – Đức)

- Cho khoảng 100 mg sinh khối nấm đã được nghiền mịn bằng nitơ lỏng vào eppendorf 1,5 ml Thêm 450 μl Buffer RLT, vortex mạnh để hòa tan toàn bộ sinh khối

- Lọc dung dịch qua màng lọc QIAsherdder được đặt trong eppendorf, ly tâm

14000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ phần trên màng, thu phần dịch ly giải bên dưới

- Rửa dịch ly giải bằng ethanol (96 – 100%) theo tỉ lệ ethanol : dịch là 1 : 2, trộn đều bằng pipet Chuyển sang bước tiếp theo ngay lập tức

- Lọc toàn bộ dung dịch qua màng lọc RNeasy được đặt trong eppendorf, ly tâm

13000 vòng/phút trong 15 giây, loại bỏ phần dịch bên dưới, thu phần trên màng

- Rửa màng lọc bằng 700 μl Buffer RW1, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 15 giây, loại bỏ dịch bên dưới, thu phần trên màng

- Tiếp tục rửa màng lọc bằng 500 μl Buffer RPE, ly tâm 13000 vòng/phút trong

15 giây, loại bỏ dịch bên dưới, thu phần trên màng

- Tiếp tục rửa màng lọc bằng 500 μl Buffer RPE, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ dịch bên dưới, thu phần trên màng

- Làm khô màng bằng cách ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút

- Chuyển màng lọc vào eppendorf mới, hòa tan RNA bằng cách thêm 30 – 50 μl nước RNase-free vào giữa màng, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút Thực hiện hai lần để thu RNA RNA tổng được sử dụng làm mạch khuôn tạo cDNA

Quy trình tạo cDNA từ RNA theo kit LongRange 2Step RT-PCR (Qiagen – Đức)

- Rã đông RNA trên đá, biến tính RNA bằng cách ủ RNA ở 65oC trong 5 phút, sau đó chuyển ngay RNA vào đá lạnh

- Rã đông oligo-dT, RT buffer, dNTP và nước RNase-free ở nhiệt độ phòng (15 –

25oC), chuyển vào đá sau khi rã đông

Phản ứng phiên mã ngược được ủ ở 42oC trong 90 phút Bất hoạt enzyme ở

85oC trong 5 phút Sản phẩm phiên mã ngược được bảo quản ở -80oC và sử dụng làm mạch khuôn cho phản ứng PCR để khuếch đại số lượng cDNA Thành phần phản ứng

PCR và chu trình nhiệt để khuếch đại cDNA LIPH8 được thực hiện tương tự phản ứng PCR khuếch đại gen LIPH8 (bảng 3.2)

3.3.4 Tạo dòng cDNA LIPH8 mã hóa LiPH8 trong tế bào E coli DH5α

3.3.4.1 Tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-LIPH8

cDNA mã hóa cho LIPH8 thu nhận từ phản ứng PCR được tinh sạch qua cột,

sau đó cắt với hai enzyme là NotI và SnaBI Plasmid pPIC9K cũng được cắt với NotI

và SnaBI Sản phẩm cắt được tinh sạch rồi dùng enzyme T4 DNA ligase để nối đoạn

gen vào plasmid, tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-LIPH8

Quy trình tinh sạch gen và plasmid theo MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction System (Intron – Hàn Quốc)

- Cho mẫu vào eppendorf 1,5 ml Thêm BNL Buffer theo tỉ lệ Buffer : mẫu là 5 :

1, vortex để hòa tan toàn bộ mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút

- Chuyển mẫu vào màng lọc được đặt trong eppendorf mới, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng

- Thêm 700 μl Washing Buffer vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ

dịch nổi bên dưới, giữ lại phần trên màng, tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong 1

phút để làm khô màng Thực hiện bước này hai lần nếu sau đó sản phẩm được dùng

cho phản ứng nối

- Chuyển màng lọc vào eppendorf mới Thêm 400 μl Elution Buufer vào giữa

màng, để yên 1 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút thu sản phẩm tinh sạch

Sau khi được tinh sạch, gen LIPH8 và plasmid pPIC9K được cắt với hai

enzyme NotI và SnaBI

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme NotI và SnaBI

Phản ứng được ủ ở 37oC trong 3 giờ Bất hoạt enzyme ở 80oC trong 30 phút

Sản phẩm cắt được tinh sạch qua cột Sau đó, gen LIPH8 được nối vào plasmid biểu

hiện pPIC9K để tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K-LIPH8

Bảng 3.5 Thành phần phản ứng nối LIPH8 vào pPIC9K

Thành phần Nồng độ phản ứng Thể tích cho 1 phản ứng

(20,0 μl)

T4 DNA ligase 20000 unit/ μl 20000 unit 1,0 μl

Phản ứng nối được tiến hành ở 22oC trong 2 giờ Sản phẩm nối được hóa biến

nạp vào E coli DH5α

3.3.4.2 Biến nạp plasmid pPIC9K-LIPH8 vào tế bào E coli DH5α

Plasmid pPIC9K-LIPH8 được biến nạp vào tế bào E coli DH5α khả nạp bằng

phương pháp sốc nhiệt

Chuẩn bị tế bào E coli DH5α khả nạp

- Hoạt hóa một khuẩn lạc E coli DH5α trong 3 ml môi trường LB lỏng, lắc 200

vòng/phút ở 37oC qua đêm

- Hút 1 ml dịch tế bào E coli vào erlen chứa 100 ml môi trường LB lỏng, lắc 250

vòng/phút cho đến khi chỉ số OD590 đạt khoàng 0,375 (khoảng từ 0,3 – 0,4; nhưng không để OD590 quá 0,4)

- Chia dịch nuôi cấy vào hai ống falcon 50 ml và ủ trong đá 5 – 10 phút, sau đó

ly tâm 1600 xg ở 4oC trong 7 phút để thu sinh khối

- Loại bỏ phần dịch lỏng, hòa tan sinh khối kết tủa bằng 10 ml dung dịch CaCl2

lạnh, tiếp tục ly tâm 1100 xg ở 4oC trong 5 phút Loại bỏ phần dịch lỏng, hòa tan sinh khối kết tủa bằng 10 ml dung dịch CaCl2 lạnh, ủ đá trong 30 phút

- Ly tâm 1100 xg ở 4oC trong 5 phút, loại bỏ dịch lỏng, hòa tan sinh khối kết tủa bằng 1,5 ml dung dịch CaCl2 lạnh, thêm 0,75 ml glycerol 50% và trộn đều Chia đều

100 µl huyền phù tế bào khả nạp vào các eppendorf 1,5 ml trữ lạnh trước

Bảo quản tế bào khả nạp trong tủ -80oC, khi sử dụng rã đông các eppendorf chứa tế bào khả nạp trong bể đá

Quy trình biến nạp

- 20 µl plasmid pPIC9K-LIPH8 được trộn đều với 100 µl tế bào E coli DH5α

khả nạp Ủ trong đá 30 phút, sau đó sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây, tiếp tục ủ đá 10 phút Thêm vào 1 ml môi trường LB lỏng và tiến hành lắc 250 vòng/phút ở 37oC trong

30 phút để phục hồi các tế bào E coli DH5α

- Hút 100 µl dịch biến nạp trải trên đĩa petri chứa môi trường thạch LB có bổ sung kháng sinh Ampicillin nồng độ 50 µg/ml Ly tâm 900 µl dịch còn lại ở 4000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi, thêm vào 100 µl nước vào hòa tan phần sinh khối kết tủa

- Hút toàn bộ dịch hòa tan trải trên đĩa petri chứa môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicillin nồng độ 50 µg/ml Ủ đĩa ở 37oC trong 14 – 16 giờ

- Thí nghiệm được thực hiện song song với đối chứng âm là tế bào E coli DH5α

không mang plasmid tái tổ hợp các gen mục tiêu