Sử dụng kỹ thuật PCR nhằm rút ngắn thời gian tìm kiếm các chủng Bacillus subtilis có khả năng ức chế hình thành aflatoxin.

Từ thực tiễn đó đề tài “ Sử dụng PCR phát hiện nhanh các chủng Bacillus subtilis có khả năng ức chế hình thành aflatoxin” được thực hiện.. Thí nghiệm định lượng khả năng ức chế hình thà

BỘ GIÁO HỌC NÔNG

Th

DỤC VÀ Đ

G LÂM TH ÔNG NGHỆ

ẬN TỐ

T HIỆN N

CÓ KHẢ ÀNH AF

CÔNG n: LÊ HO

2010 –

háng 12/201

ĐÀO TẠO HÀNH PHỐ

Ệ SINH HỌ

ỐT NG

NHANH

Ả NĂNG LATOX

G NGHỆ SI OÀNG THÁ

Í MINH

P HỦNG

Ế

ẬN TỐ

T HIỆN N

CÓ KHẢ ÀNH AF

HẢI

Tháng 12/2

ĐÀO TẠO HÀNH PHỐ

Ệ SINH HỌ

ỐT NG

NHANH

Ả NĂNG LATOX

S L

LỜI CẢM ƠN

Con mãi khắc ghi công ơn sinh thành, dưỡng dục của ba, mẹ và nội những người luôn cho con hạnh phúc, niềm vui, là chỗ dựa tinh thần vững chắc và luôn tạo mọi điều kiện cho con học tập

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại trường

Em xin chân thành biết ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hướng dẫn và tạo những điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin cảm ơn:

Thầy Võ Khánh Hưng, cô Tôn Bảo Linh, thầy Huỳnh Văn Biết đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt thời gian học tập

Hai chị, cảm ơn những người bạn thân yêu ở phòng trọ 2/55 và anh cảm ơn

em đã luôn quan tâm, động viên anh những lúc khó khăn

Chị Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, chị Nguyễn Ngọc Ánh, anh Võ Tấn Hùng đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dẫn em Đặc biệt em xin cảm ơn chị Vương Thị Thúy Vi đã động viên và cho em nhiều ý kiến hay trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Các bạn lớp DH10SH nhất là các bạn kí túc xá phòng 16C, bạn Lê Thị Ân, Đỗ Khắc Sáng, Nguyễn Thị Thu Hà và Trương Hồng Tâm đã luôn an ủi, chia sẻ cùng em những lúc khó khăn

Tp Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013

Lê Hoàng Thái

TÓM TẮT

Aflatoxin là độc tố quan trọng nhất trong nhóm độc tố mycotoxin do nấm tạo

ra Tác hại của aflatoxin đã được ghi nhận khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở những nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam Trước đây, việc tìm kiếm, sàng lọc các

chủng Bacillus subtilis có khả năng ức chế hình thành aflatoxin thường mất nhiều

thời gian và độ tin cậy không cao Do đó, rất cần một biện pháp với độ tin cậy cao có

khả năng sàng lọc nhanh các chủng B subtilis có khả năng ức chế hình thành aflatoxin Từ thực tiễn đó đề tài “ Sử dụng PCR phát hiện nhanh các chủng Bacillus

subtilis có khả năng ức chế hình thành aflatoxin” được thực hiện

Vi khuẩn B subtilis trong đất được phân lập trên môi trường NA Sau đó, thí

nghiệm định tính khả năng ức chế aflatoxin trên môi trường thạch nước cốt dừa được thực hiện Các chủng thể hiện khả năng ức chế aflatoxin ở thí nghiệm định tính sẽ

được chọn để thực hiện PCR định danh B subtilis Các chủng là B subtilis và các chủng không phải B subtilis nhưng thể hiện tốt khả năng ức chế aflatoxin ở thí nghiệm định tính được sử dụng để thực hiện PCR khuếch đại hai gen ituD và lpa-14

Các gen được giải trình tự, so sánh và phân tích Thí nghiệm định lượng khả năng ức chế hình thành aflatoxin của các chủng vi khuẩn mang gen mục tiêu trên môi trường bắp được thực hiện

Kết quả đạt được từ nghiên cứu: phân lập được vi khuẩn Bacillus subtilis trong đất; phát hiện gen sản sinh iturin A (lpa-14, ituD) liên quan đến khả năng ức chế hình thành aflatoxin ở một số chủng Bacillus subtilis bằng PCR; trình tự nucleotide của các gen lpa-14, ituD và các chuỗi amino acid được mã hóa tương ứng

ở các chủng vi khuẩn phân lập được có độ tương đồng cao so với các trình tự tham khảo; không phát hiện thấy sự biến đổi nghiêm trọng trong chuỗi amino acid được

mã hóa từ các gen lpa-14 và ituD ở các chủng vi khuẩn phân lập được; bước đầu xác

nhận các chủng vi khuẩn được phát hiện mang gen sản sinh iturin A thể hiện khả năng ức chế sự hình thành độc tố aflatoxin qua thí nghiệm phân tích hàm lượng aflatoxin trong bắp Kết quả của đề tải cho thấy có thể sử dụng PCR để phát hiện

nhanh Bacillus subtilis có khả năng ức chế hình thành aflatoxin

Từ khóa: Bacillus subtilis, iturin A, aflatoxin, Polymerase chain reaction

SUMMARY

Aflatoxins are recognized as the most important mycotoxins produced by fungi The harmful effects of aflatoxin have been recorded around the world, especially in developing countries, including Viet Nam Previous researches to find

and screen Bacillus subtilis strains capable of inhibiting aflatoxin formation often

time consuming and lack of reliable We need a measure with high reliability capable

of rapid screening of B subtilis strains capable of inhibiting afaltoxin formation So, the study “ Using PCR to rapid detection Bacillus subtilis strains capable of

inhibiting afaltoxin formation” was carried out

In this study, B subtilis from soil samples were isolated on NA medium

Then, qualitative test aflatoxin inhibition were conducted on coconut agar The isolated strains showed inhibition of aflatoxin in qualitative experiments will be

selected to carry out PCR to identify B subtilis Strains of B subtilis or non - B subtilis but showed good ability to inhibit aflatoxin in qualitative experiments were chosen to carry out PCR amplification of two genes ituD and

lpa-14 Genes were sequenced and then compare and analyze Quantitative

experiment about inhibition of aflatoxin formation of isolated strains containing target genes was performed on maize

The results obtained from study showed that: Bacillus subtilis was sucessfully isolated in soil; Bacillus subtilis strains which potential of producing iturin A could

be detected by PCR using specific primers for ituD and lpa-14 amplification; the

lpa-14 and ituD gene of the isolated strains showed high homology with the

corresponding genes of iturin operon of Bacillus subtilis RB14; sequences of amino acid encoded by lpa-14 and ituD of the isolated strains showed high homology with those encoded by lpa-14 and ituD of Bacillus subtilis RB14; there is not serious changes in amino acid sequences encoded by lpa-14 and ituD; the isolated strains

having the gen of iturin A are capable of inhibiting of the aflatoxin formation through experiment analysis of aflatoxin level in maize So, PCR can be used for rapid

detection of Bacillus subtilis capable of inhibiting of aflatoxin formation

Keywords: Bacillus subtilis, iturin A, aflatoxin, Polymerase chain reaction

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về aflatoxin 3

2.1.1 Khái quát về aflatoxin 3

2.1.2 Lịch sử phát hiện aflatoxin 3

2.1.3 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa của aflatoxin 3

2.1.4.Các loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin 4

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của Aspergillus và sản sinh độc tố aflatoxin 5

2.1.6.Tác hại của aflatoxin 7

2.1.7 Hiện trạng nhiễm aflatoxin trên thế giới và trong nước 11

2.1.8 Các phương pháp phát hiện aflatoxin trong thực phẩm 12

2.1.9 Các phương pháp phân hủy aflatoxin 13

2.2 Tổng quan về Bacillus subtilis 14

2.2.1 Lịch sử phát hiện và phân loại 14

2.2.2 Đặc điểm của Bacillus subtilis 15

2.2.2.1 Đặc điểm sinh thái và phân bố trong tự nhiên 15

2.2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 15

2.2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 16

2.2.2.4 Đặc điểm bào tử 16

2.2.3 Bộ gen của Bacillus subtilis và phương pháp PCR định danh B subtilis 17

2.2.4 Khả năng sản sinh kháng sinh của Bacillus subtilis 18

2.2.5 Iturin A và tiềm năng ứng dụng trong ức chế hình thành độc tố aflatoxin 18

2.2.5.1 Công thức cấu tạo của iturin A 18

2.2.5.2 Tính chất hóa lý và cơ chế diệt nấm của iturin A 19

2.2.5.3 Tiềm năng ứng dụng iturin A trong ức chế hình thành độc tố aflatoxin 20

2.2.5.4 Đặc tính vùng gen mã hóa iturin A 21

2.3 Tính kị nước của các amino acid theo thang Rose (Rose scale) 23

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

3.2 Vật liệu và hóa chất 24

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 24

3.2.2 Hóa chất và thiết bị 24

3.2.2.1 Hóa chất và thiết bị dùng trong nuôi cấy vi sinh vật 24

3.2.2.2 Hóa chất và thiết bị dùng trong PCR 25

3.3 Phương pháp nghiên cứu 26

3.3.1 Phân lập Bacillus subtilis trong đất 26

3.3.1.1 Cách lấy mẫu đất 26

3.3.1.2 Phân lập Bacillus subtilis 27

3.3.2 Thí nghiệm định tính khả năng ức chế aflatoxin của các chủng vi khuẩn

nghi ngờ là Bacillus subtilis 27

3.3.2.1 Hoạt hóa chủng Aspergillus flavus trên môi trường khoai tây tự nhiên 27

3.3.2.2 Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế hình thành aflatoxin của các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis 27

3.3.3 PCR định danh vi khuẩn Bacillus subtilis và khuếch đại hai gen mục tiêu

ituD và lpa-14 28

3.3.3.1 Ly trích DNA vi khuẩn 28

3.3.3.2 Thực hiện các phản ứng PCR 29

3.3.3.3 Điện di sản phẩm PCR 30

3.3.4 Giải và phân tích trình tự 31

3.3.5 Thí nghiệm định lượng khả năng ức chế hình thành aflatoxin của các chủng

vi khuẩn mang gen mục tiêu (kể cả B subtilis và không phải B subtilis) 31

3.3.5.1 Phương pháp xác định số lượng bào tử Aspergillus flavus 31

3.3.5.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 32

3.3.5.3 Bố trí thí nghiệm 32

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Tìm kiếm phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong đất 33

4.2 Thí nghiệm định tính khả năng ức chế hình thành aflatoxin của các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis 33

4.2.1 Hoạt hóa Aspergillus flavus và kiểm tra khả năng sinh aflatoxin 33

4.2.2 Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế hình thành aflatoxin của các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis 34

4.3 PCR định danh Bacillus subtilis và khuếch đại hai gen ituD và lpa-14 35

4.4 Giải và phân tích trình tự 38

4.4.1 Phân tích trình tự gen ytcP 38

4.4.2 So sánh, phân tích trình tự gen lpa-14 và trình tự amino acid được mã hóa 39

4.4.3 So sánh, phân tích trình tự gen ituD và trình tự amino acid được mã hóa 45

4.5 Thí nghiệm định lượng khả năng ức chế hình thành AF của các chủng vi khuẩn mang gen mục tiêu (kể cả B subtilis và không phải B subtilis) trên bắp 51

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Kiến nghị 59

Tài liệu tham khảo 60

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AF: Aflatoxin

BGYF: Bright Greenish-yellow Fluorescence

CMI: Cell-mediated Immunity

ctv: cộng tác viên

DNA: Deoxyribonucleic acid

ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

FDA: Food and Drug Administration

HBV: Hepatitis B virus

HCV: Hepatitis C virus

HPLC: High-performance Liquid Chromatography

ORF: Open Reading Frame

PCR: Polymerase Chain Reaction

ppb: part per billion

TSA: Trypticase Soya Agar

UV: Ultraviolet

WHO: World Health Organization

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin 5

Bảng 2.2 Giới hạn các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển, sản sinh độc tố aflatoxin của A flavus và A parasiticus 6

Bảng 2.3 Qui định của Bộ y tế về giới hạn hàm lượng AF trong thực phẩm 10

Bảng 2.4 Qui định giới hạn AFB1 và AF tổng số trong hỗn hợp thức ăn cho gia súc gia cầm 11

Bảng 2.5 Quy định của FDA về giới hạn aflatoxin 11

Bảng 2.6 Khả năng ức chế aflatoxin của iturin A trên ngô và thức ăn gia súc 21

Bảng 3.1 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR 30

Bảng 4.1 Kết quả xác định gen lpa-14 và ituD của các chủng B subtilis và không phải B subtilis 37

Bảng 4.2 Kết quả PCR định danh B subtilis và khuếch đại hai gen mục tiêu 38

Bảng 4.3 Tỉ lệ tương đồng giữa các chủng vi khuẩn dựa trên gen lpa-14 43

Bảng 4.4 Tỉ lệ tương đồng giữa các chủng dựa trên trình tự amino acid được mã hóa từ gen lpa-14 44

Bảng 4.5 Tỉ lệ tương đồng giữa các chủng vi khuẩn dựa trên gen ituD 49

Bảng 4.6 Tỉ lệ tương đồng giữa các chủng dựa trên trình tự amino acid được mã hóa từ gen ituD 50

Bảng 4.7 So sánh mức độ màu sắc của bắp sau 5 ngày thí nghiệm 52

Bảng 4.8 Hàm lượng aflatoxin sau khi phân tích HPLC 53

Bảng 4.9 Hàm lượng AF B2 và AF B1 trung bình 56

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Công thức hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 4

Hình 2.2 Cơ chế ảnh hưởng của aflatoxin đến sức khỏe con người 8

Hình 2.3 Cấu tạo Iturin A 19

Hình 2.4 Operon tổng hợp iturin A ở Bacillus subtilis RB14 22

Hình 3.1 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 26

Hình 4.1 Khuẩn lạc nghi nhờ là Bacillus subtilis trên môi trường NA 33

Hình 4.2 Khuẩn lạc A flavus dưới tia UV bước sóng 365 nm sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch nước cốt dừa 34

Hình 4.3 Sự phát triển của vi khuẩn làm khuẩn lạc nấm mốc bị khuyết vào 34

Hình 4.4 Vòng sáng độc tố aflatoxin bị mờ ở vị trí khuẩn lạc nấm mốc tiếp xúc với khuẩn lạc vi khuẩn 35

Hinh 4.5 Điện di sản phẩm PCR định danh vi khuẩn Bacillus subtilis 36

Hình 4.6 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen ituD 36

Hình 4.7 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen lpa-14 37

Hình 4.8 Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng bằng công cụ BLAST đối với chủng T7/str.7 39

Hình 4.9 Kết quả môi trường bắp sau 5 ngày thí nghiệm 52

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.3 Đặt vấn đề

Aflatoxin là độc tố quan trọng nhất trong nhóm độc tố mycotoxin do nấm tạo ra Nó gây ra những hậu quả vô cùng nặng nề đối với sức khỏe con người và tổn thất to lớn về kinh tế Tác hại của aflatoxin đã được ghi nhận khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở những nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam

Nước ta nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa với đặc thù khí hậu là nóng và

độ ẩm cao đó là điều kiện thích hợp cho nhiều loại nấm hại phát triển, trong đó

có Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, hai chủng nấm mốc có khả năng

sinh aflatoxin cao Những nghiên cứu gần đây cho thấy lượng aflatoxin có trên mẫu ngô, lạc vượt quá giới hạn cho phép sử dụng của tiêu chuẩn quốc tế Ngoài ra, Việt Nam còn được ghi nhận là nước có tỷ lệ nhiễm virus viêm gan siêu vi B (Hepatitis B Virus - HBV) cao hàng đầu thế giới, điều này sẽ càng làm cho tác hại của aflatoxin thêm nặng nề hơn

Việc xử lý các vấn đề liên quan đến aflatoxin trước đây chỉ dừng lại ở việc dùng hóa chất diệt nấm mốc hay xử lý nhiệt, tuy nhiên những biện pháp này có thể làm giảm giá trị dinh dưỡng, không an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng và gây ô nhiễm môi trường Do đó, tìm kiếm, sử dụng vi sinh vật có thể ức chế sự phát triển

và hình thành aflatoxin từ nấm mốc được ưu tiên nghiên cứu Có nhiều chủng

vi sinh vật đã được nghiên cứu và ứng dụng, trong đó Bacillus subtilis nổi lên

như một ứng viên hàng đầu vì nó vừa có khả năng ức chế hình thành aflatoxin vừa là một tác nhân sinh học an toàn Tuy nhiên, không phải bất kỳ chủng

Bacillus subtilis nào cũng có khả năng ức chế hình thành aflatoxin, do đó phải

tiến hành phân lập và nghiên cứu khả năng kháng sự phát triển của nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin Quá trình này thường mất nhiều thời gian và độ tin cậy không cao Do đó, rất cần một biện pháp với độ tin cậy cao có khả năng sàng lọc

nhanh các chủng Bacillus subtilis ức chế hình thành aflatoxin Vì tính cấp thiết ấy, đề tài “Sử dụng PCR phát hiện nhanh Bacillus subtilis có khả năng ức chế hình thành

aflatoxin” đã được thực hiện

1.4 Yêu cầu đề tài

Sử dụng kỹ thuật PCR nhằm rút ngắn thời gian tìm kiếm các chủng

Bacillus subtilis có khả năng ức chế hình thành aflatoxin

1.5 Nội dung thực hiện

Phân lập Bacillus subtilis từ đất

Hoạt hóa giống Aspergillus flavus có khả năng sinh aflatoxin do phòng

thí nghiệm thực hành vi sinh, khoa Chăn nuôi - Thú y trường Đại học Nông Lâm Tp

Hồ Chí Minh cung cấp

Thử nghiệm định tính khả năng ức chế độc tố aflatoxin của các chủng vi khuẩn phân lập được

PCR định danh vi khuẩn Bacillus subtilis và khuếch đại 2 gen ituD và lpa-14

Giải và xử lý các trình các trình tự gen bằng phần mềm tin sinh học, so sánh

và phân tích

Thực hiện thí nghiệm định lượng khả năng làm giảm độc tố aflatoxin

của các chủng Bacillus subtilis có một trong hai gen và có cả 2 gen và các chủng không phải là Bacillus subtilis nhưng có cả 2 gen mục tiêu

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về aflatoxin

2.1.1 Khái quát về aflatoxin

Mycotoxin hay độc tố nấm mốc là một trong những nhóm độc chất tự nhiên

do các loài nấm mốc sản sinh ra trong quá trình phát triển trên các cơ chất, đặc biệt là lương thực, thực phẩm dành cho người và gia súc Trong đó, độc tố aflatoxin (AF),

do nấm Aspergillus (chủ yếu là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sinh ra)

là độc tố quan trọng nhất và được nghiên cứu nhiều nhất AF có thể hình thành ngay trong quá trình canh tác hoặc sau thu hoạch và chế biến nếu sản phẩm không được phơi khô hay có độ ẩm cao Tiêu thụ thực phẩm nhiễm AF thường xuyên

có thể gây ra những hậu nặng nề về sức khỏe thậm chí có thể tử vong

2.1.2 Lịch sử phát hiện aflatoxin

Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là bệnh “X” ở gà tây (Turkey “X” disease) Sau đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà cũng bị nhiễm bệnh và tử vong rất nhiều Qua điều tra, người ta xác định được bệnh có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra Năm 1961 người ta đã tìm ra bản chất hoá học của độc

chất này là aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus tạo ra

Từ đó trở đi có rất nhiều công trình nghiên cứu về độc tố AF và tác hại của nó cũng như các nghiên cứu về cách ức chế và giảm khả năng hình thành AF trong thực phẩm

2.1.3 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa của aflatoxin

Aflatoxin gồm 4 loại là B1, B2, G1, G2 lần lượt ký hiệu là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, có công thức phân tử là:

Ngoài 4 loại trên, aflatoxin còn có thêm hai sản phẩm trao đổi chất là aflatoxin M1 và aflatoxin M2 M1 là 4-hydroxy aflatoxin B1 và aflatoxin M2 là 4-dihydroxy aflatoxin B2

Hình 2.1 Công thức cấu tạo hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2

(Nguồn: Williams và ctv, 2004)

Tính chất lý học của các loại aflatoxin :

AFB1: có điểm nóng chảy 268 - 2690C, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang AFB2: có điểm nóng chảy 286 - 2890C, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang

AFG1: có điểm nóng chảy 244 - 2460C, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang

AFG2: có điểm nóng chảy 229 - 2310C, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang

2.1.4 Các loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin

Nấm mốc là vi sinh vật (vi nấm) có cấu tạo gần giống với thực vật, sống ký sinh hay hoại sinh trên nhiều loại cơ chất khác nhau, đặc biệt là các chất hữu cơ đơn giản, nhất là hydratcacbon Nấm mốc không chứa diệp lục tố, cấu tạo dạng sợi có vách ngăn hoặc không có vách ngăn Những sợi nấm này phân nhánh, hình thành từng đám chằng chịt gọi là hệ sợi nấm Có 2 loại sợi: sợi nấm dinh dưỡng nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm; sợi nấm khí sinh

thường nhô lên trên môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào tử)

Aflatoxin là một nhóm độc tố chủ yếu do nấm mốc Aspergillus flavus

và Aspergillus parasiticus sản sinh ra, được tìm thấy đầu tiên từ bánh dầu phộng

nhập từ Brazil Ngoài ra còn có một số nấm mốc khác có khả năng sinh aflatoxin (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Một số loài nấm mốc có khả năng sản sinh aflatoxin

(Phạm Hoàng Thái, 2007)

Gần đây người ta phát hiện thêm vài loài nữa có khả năng sinh AF như:

A tamarii (Goto và ctv, 1997), A pseudotamarii (Ito và ctv 2001) Trong các loại

độc tố AF thì độc tố AFB1 chủ yếu do loài Aspergillus flavus sinh ra, là độc tố AF

phổ biến nhất trong thực phẩm và là độc tố nguy hiểm nhất đối với sức khỏe người tiêu dùng

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của Aspergillus và sản sinh độc tố

aflatoxin

Sự phát triển và sản sinh độc tố aflatoxin của Aspergillus phụ thuộc vào

các yếu tố trong môi trường mà nó phát triển (nhiệt độ, pH, hoạt độ nước, thành phần

có trong thực phẩm…) cũng như các yếu tố bên ngoài như độ ẩm môi trường xung quanh, nhiệt độ trong kho bảo quản, các vi sinh vật cạnh tranh,… (Zinedine

và Mañes, 2009)

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus có điều kiện sinh trưởng

và sản sinh aflatoxin khá tương đồng, được thể hiện qua bảng 2.2

Loài nấm mốc Aflatoxin Tác giả

B1 B2 G1 G2

Aspergillus flavus + + Sargeant và ctv, 1961

Aspergillus parasiticus + + + + Coduer và ctv,1963

Aspergillus nomius + + + + Kurzman và ctv, 1987

Aspergillus oryzae + Basappa và ctv, 1967

Aspergillus niger + Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus wentii + Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus ruber + Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus ostianus + + Scot và ctv, 1968

Aspergillus ochraceus + Van Walbeck và ctv,1968

Penicillium puberulum + + + + Kulik và Holaday, 1967

Bảng 2.2 Giới hạn các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển, sản sinh độc tố

của A flavus và A parasiticus

Sự

phát triển

A flavus A parasiticus A flavus A parasiticus A flavus A parasiticus

Tối thiểu Tối ưu Cao nhất Nhiệt độ( 0C) 10 - 12 12 33 32 43 42 Hoạt độ nước 0,8 0,8 – 0,83 0,98 0,99 > 0,99 > 0,99

pH 2 2 5 - 8 5 - 8 >11 >11

Sản sinh AF A flavus A parasiticus A flavus A parasiticus A flavus A.parasiticus

Tối thiểu Tối ưu Cao nhất Nhiệt độ( 0C) 13 12 16 - 31 25 31- 37 40 Hoạt độ nước 0,82 0,86 – 0,87 0,95 – 0,99 0,95 > 0,99 > 0,99

(ICMSF, 1996)

Mặc dù các điều kiện được mô tả có đôi chút biến đổi tùy thuộc vào nguồn

tài liệu, nhưng nhìn chung nhiều báo cáo cho thấy A flavus và A parasiticus phát triển

ở nhiệt độ trung bình 10-12 (mức thấp nhất) đến 42-430C, nhiệt độ tối ưu là 32- 330C Chúng có thể phát triển trong giới hạn pH rộng (2,1 - 11,2), tối ưu là từ 3,5 - 8 Hoạt độ nước (aw), thấp nhất là từ 0,8 – 0,83 và tối ưu là 0,99 (Sweeney và Dobson, 1998)

Ở nhiệt độ 12-400C, A flavus và A parasiticus có khả năng sinh độc tố,

nhiệt độ tối ưu để lượng độc tố tạo ra cao nhất là từ 25 - 300C Đối với A parasiticus,

ở nhiệt độ cao thì lượng độc tố aflatoxin B tạo ra cao hơn aflatoxin G (ICMSF, 1996)

Quá trình sản sinh AF của A parasiticus diễn ra ở pH giao động từ 3,5 - 8, và tối ưu

ở pH là 6 Hoạt độ nước thấp nhất mà A flavus có thể tạo aflatoxin là 0,82 (Sweeney

và Dobson, 1998), tối ưu là 0,99 (Cousin và ctv, 2005)

Vùng khí hậu nhiệt đới với các đặc tính nhiệt độ và độ ẩm cao là điều kiện

lý tưởng cho cho sự phát triển và sản sinh độc tố aflatoxin (tối ưu là từ 25 - 300C) (Sweeney và Dobson, 1998) Một số nước ở vùng khí hậu này, như trường hợp

ở Ma-Rốc, có tỷ lệ người mắc bệnh ung thư gan cao cũng như các bệnh lý không rõ nguyên nhân mà người ta tin rằng có thể có liên quan đến aflatoxin (Zinedine

và Mañes, 2009)

Trong môi trường giàu carbohydrate thì quá trình sản sinh aflatoxin sẽ mạnh mẽ hơn, ngoài ra một số cơ chất giàu chất béo và protein (điển hình là đậu phộng) cũng là

cơ chất lý tưởng cho sự sản sinh aflatoxin Trong một số trường hợp sự hiện diện của một số loài nấm khác sẽ làm giảm khả năng tổng hợp aflatoxin, ngoài ra, một số thành phần có trong thực phẩm cũng có thể làm giảm sự sản sinh aflatoxin Ví dụ, oleuropein (một phenolic iridoid) trong dầu ô liu có khả năng làm giảm khả năng sinh aflatoxin

của Aspergillus flavus và A parasiticus Caffeine ức chế sự phát triển và khả năng sinh độc tố aflatoxin của nấm Aspergillus (CAST, 1998) Còn có một số báo cáo cho thấy

một số vitamin, ví dụ như vitamin K5 ngoài hoạt tính kháng khuẩn, nó còn làm chậm

quá trình tăng trưởng cũng như sản sinh aflatoxin của các chủng Aspergillus (Miranda

và ctv, 2011) Ngoài ra sự hiện diện và khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi

khuẩn cũng có thể ức chế sự phát triển cũng như sản sinh aflatoxin, điều này sẽ được

đề cập ở các phần sau

2.1.6 Tác hại của aflatoxin

Tác hại đầu tiên của aflatoxin phải kể đến đó là ung thư gan Trong các trường hợp chết do ung thư thì ung thư gan là bệnh có số người chết cao thứ ba trên thế giới, với khoảng 550.000 - 600.000 trường hợp mỗi năm (WHO, 2008) 83% các trường hợp chết vì ung thư gan xảy ra ở các nước Đông Nam Á và các nước

ở cận Sahara - Châu Phi (Kirk và ctv, 2006) Theo Wu và Khlangwiset (2010) thì các enzyme P450 đặc biệt (CYP1A2, 3A4, 3A5, 3A7) trong gan sẽ chuyển hóa độc tố aflatoxin thành aflatoxin -8,9-epoxide, sản phẩm này gắn kết vào các protein gan gây ngộ độc cấp tính (aflatoxicosis), hoặc chúng sẽ đính vào DNA và gây ra ung thư gan

Cơ chế ảnh hưởng của aflatoxin đến sức khỏe con người được mô tả ở hình 2.2

Hình 2.2 Cơ chế ảnh hưởng của aflatoxin đến sức khỏe con người (Wu, 2010).

Các mũi tên màu đỏ biểu thị các mối liên hệ đã biết rõ cơ chế, trong khi đó các mũi tên màu xanh biểu thị các mối liên hệ chưa được hiểu rõ Cây trồng bị stress (do hạn hán, mưa lũ, côn trùng tấn công,…) sẽ dễ bị nhiễm nấm có khả năng sinh độc

tố ngay trên đồng ruộng, hoặc sau khi thu hoạch, các điều kiện bảo quản không đảm bảo (độ ẩm cao, nông sản không được phơi khô, ) aflatoxin sẽ tích lũy trong nông sản Khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm aflatoxin, gan sẽ chuyển aflatoxin thành aflatoxin -8,9-epoxide, sản phẩm này sẽ đính vào các protein gan gây ngộ độc cấp tính (aflatoxicosis), hoặc chúng sẽ đính vào DNA và gây ra ung thư gan Aflatoxin sau khi chuyển hóa thành aflatoxin -8,9-epoxide sẽ hiệp đồng tác dụng với virus HBV gây ung thư gan (cơ chế chưa được hiểu rõ) Tiêu thụ thực phẩm nhiễm aflatoxin làm thay đổi tính toàn vẹn của đường ruột, dẫn đến tình trạng chậm phát triển ở trẻ

và ức chế miễn dịch (cơ chế chưa được hiểu rõ) Ngoài ra sử dụng thực phẩm nhiễm aflatoxin sẽ dẫn đến điều biến sự biểu hiện cytokine, từ đó cũng có thể gây

ức chế miễn dịch và gây ra tình trạng chậm phát triển ở trẻ em

Ngộ độc cấp tính

Thay đổi tính toàn

vẹn của đường ruột

Chậm phát triển ở trẻ

em

Điều biến sự biểu hiện cytokine

Ức chế miễn dịch

AF-8,9-epoxide gắn vào DNA

Hiệp đồng tác dụng với HBV

Ung thư gan

Gan chuyển hóa thành aflatoxin -8,9-epoxide

Nhiều bằng chứng dịch tể học cho thấy thường xuyên tiêu thụ thực phẩm nhiễm aflatoxin và cơ thể bị nhiễm virus HBV hoặc HCV mãn tính sẽ tăng nguy cơ dẫn đến ung thư gan Theo Qian và ctv (1994) thì những người bị ung thư gan do

sử dụng thực phẩm nhiễm aflatoxin thời gian dài phần lớn là những người bị nhiễm HBV mạn tính Nguy cơ ung thư gan tăng gấp 30 lần đối với trường hợp bị nhiễm HBV mạn tính và sử dụng thực phẩm nhiễm aflatoxin so với các trường hợp chỉ dương tính với HBV hoặc sử dụng thực phẩm nhiễm aflatoxin (Groopman và ctv, 2008) Không may là cả hai yếu tố aflatoxin và HBV (hay HCV) lại rất phổ biến

ở các nước đang phát triển, đặc biệt là các nước châu Phi và châu Á, trong đó

có Việt Nam

Ngoài ung thư gan, aflatoxin được ghi nhận có khả năng liên quan đến rối loạn

hệ thống miễn dịch, tuy nhiên cơ chế chưa được hiểu rõ Turner và ctv (2003) tiến hành nghiên cứu để xác định tác hại của việc phơi nhiễm aflatoxin trong chế độ ăn thông qua các thông số miễn dịch của trẻ em từ 6 - 9 tuổi ở Gambia Các thông số miễn dịch khảo sát bao gồm secretory IgA (sIgA) ở nước bọt, CMI,…Kết quả cho thấy rằng trẻ em vùng nông thôn Gambia phơi nhiễm aflatoxin hàm lượng cao và sIgA trong nước bọt giảm, đồng thời đáp ứng của kháng thể cũng yếu đi Nhiều nghiên cứu được tiến hành trên gia cầm, lợn và chuột cho thấy rằng sử dụng thực phẩm nhiễm aflatoxin có thể ức chế đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (Williams và ctv, 2004) Aflatoxin còn được ghi nhận liên quan đến tình trạng chậm phát triển ở trẻ

em, ví dụ, aflatoxin được ghi nhận liên quan tới còi xương ở trẻ em Nigeria (Khlangwiset, 2011)

Trong nước, theo Dương Thanh Liêm (2002) thì aflatoxin gây ra nhiều tác hại như thận bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó khăn, từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng; bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng trong thức ăn; đôi khi cũng thấy tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn; làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể Do đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thường, có thể gây tử vong cho thú Ngoài ra aflatoxin còn làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản, giảm tính

ngon miệng đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mất mùi thức ăn, làm

hư hại các chất dinh dưỡng trong thức ăn (glucid, protein, vitamin, )

Trên vật nuôi, sự mẫn cảm của aflatoxin đối với từng loài rất khác nhau và

được chia làm ba nhóm Mẫn cảm nhất bao gồm vịt và gà tây, chỉ với hàm lượng

aflatoxin nhỏ hơn 1ppm trong thức ăn hàng ngày đã gây ngộ độc Mẫn cảm vừa gồm

bò, lợn và gia cầm khác, hàm lượng aflatoxin xấp xỉ 10 ppm trong thức ăn hàng ngày

sẽ gây ngộ độc Mẫn cảm ít có cừu, hàm lượng aflatoxin lớn hơn 10 ppm trong thức ăn

hàng ngày mới gây ngộ độc

Gia súc non rất dễ bị ngộ độc do bú sữa, ví dụ, bê chỉ cần hàm lượng 2 ppm đã

gây ngộ độc

Ngộ độc aflatoxin được chia làm hai thể: thể cấp tính với các biểu hiện như gan

biến đổi, màu nhạt, hoại tử, xuất huyết, viêm cầu thận nặng; thể mạn tính với các biểu

hiện: con vật bỏ ăn, chậm lớn, gầy yếu, lông xơ xác, mổ khám thấy gan biến đổi nặng

nhất như xơ gan, có các khối u hoặc gan nhiễm mỡ, thoái hóa, xuất huyết, hoại tử

Không có phương pháp điều trị đặc hiệu cho gia súc, gia cầm bị ngộ độc aflatoxin do

đó điều quan trọng nhất là cần loại bỏ thức ăn bị mốc có chứa aflatoxin

Vì những mối nguy hại ấy mà việc kiểm soát aflatoxin trong thực phẩm hết sức

gắt gao Tại Việt Nam một số qui định về quản lí aflatoxin được thể hiện trong bảng

2.3 và 2.4 Ở Mỹ, FDA thiết lập quy định giới hạn hàm lượng aflatoxin trong thức ăn

dành cho người và động vật được trình bày ở bảng 2.5

Bảng 2.3 Qui định của Bộ y tế về hàm lượng aflatoxin tối đa trong thực phẩm

Quyết định 46/2007/QĐ-BYT, ngày 19/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế về quy định giới hạn

tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm

Loại thực phẩm Tên độc tố vi nấm Giới hạn tối đa

(µg/kg) Thực phẩm ( chung cho các loại thực phẩm) Aflatoxin B1 5

Thực phẩm (chung cho các loại thực phẩm) Aflatoxin tổng số 15

Bảng 2.4 Qui định giới hạn AFB1 và AF tổng số trong hỗn hợp thức ăn cho gia súc

gia cầm

Quyết định số 104/2001/QĐ/BNN, ký ngày 31/10/2001, của Bộ nông nghiệp và phát triển

nông thôn về giới hạn độc tố aflatoxin B1và aflatoxin tổng số.

Bảng 2.5 Quy định của FDA về giới hạn aflatoxin

(igrow.org)

2.1.7 Hiện trạng nhiễm aflatoxin trên thế giới và trong nước

Aflatoxin thường xuất hiện trong các sản phẩm nông nghiệp trên cánh đồng

trước khi thu hoạch hoặc sau khi thu hoạch nếu sản phẩm không được phơi khô ngay

hay ẩm độ trong sản phẩm cao tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển Đôi khi sữa,

trứng, thịt cũng bị phát hiện có aflatoxin do động vật đã ăn những loại thức ăn

bị nhiễm aflatoxin, vấn đề này gây ra những hậu quả khôn lường và thiệt hại nặng nề

cho người chăn nuôi Theo Wu và Khlangwiset (2010) nhu cầu tiêu thụ ngô

và đậu phộng trên thế giới rất cao, tuy nhiên đây là hai loại sản phẩm rất mẫn cảm

với aflatoxin, do đó đây là hai nguồn chủ yếu gây nhiễm aflatoxin cho con người

Ở Indonesia, các mẫu đậu phộng thu thập từ động ruộng, nhà kho bảo quản

của nông dân, chợ có tỉ lệ nhiễm nấm A flavus là từ 60 - 80%, trong đó lượng

aflatoxin dao động từ 40 - 4100 ppb, các sản phẩm đậu phộng như đậu phộng chiên,

Thức ăn dành cho người hoặc động vật Lượng aflatoxin tối đa cho phép, ppb

Thức ăn dành cho người 20

Thức ăn giành cho vỗ béo bò thịt 300

Thức ăn trong chăn nuôi gia súc, lợn, gia

cầm trưởng thành

100

Thức ăn cho động vật chưa trưởng thành 20

Thức ăn trong chăn nuôi động vật lấy sữa

bột đậu phộng lượng aflatoxin nhiễm trên 1000 ppb (Sudjadi và ctv, 1999) Ở Ai Cập, 32% số ngũ cốc và 6% số loại bột cá đem kiểm nghiệm bị nhiễm aflatoxin

từ 1- 50 ppb; 8% số ngũ cốc và 16% số loại bột cá bị nhiễm từ 201 - 2000 ppb (Hagazy, 1988, trích dẫn bởi Diab và ctv, 2000) Theo Bhatti và ctv (2001) trong 3320 mẫu nguyên liệu có nguồn gốc động, thực vật ở Pakistan được kiểm nghiệm đều có chứa AFB1với hàm lượng thấp nhất là 13 ppb và cao nhất là

78 ppb Hầu hết các mẫu cám gạo, cám lúa mì, bột bắp, bột cá, bột hướng dương, bột đậu nành và bột hạt bông đều có hàm lượng AFB1cao hơn mức khuyến cáo (20 ppb) của tổ chức FDA Aflatoxin cũng có thể hiện diện trong các loại thực phẩm chế biến, đặc biệt là các sản phẩm từ bắp

Ở Việt Nam, đã có một số tác giả nghiên cứu về mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô, đậu phộng Đậu Ngọc Hào (1992) xác định tỷ lệ nhiễm AFB1 trong 168 mẫu nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi, tỷ lệ nhiễm trên ngô hạt là 33%, ngô bột là 74,2%, đậu phộng là 84,7% Theo Nguyễn Thùy Châu (1997)

đã nghiên cứu và thấy rằng mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô Việt Nam, kết quả cho thấy các loại nấm mốc nhiễm bên trong hat ngô miền miền Bắc thường là

loài A flavus, với tỷ lệ dao động 20 - 90% Sau đó là loài A parasiticus, ngô

ở ngoại thành Hà Nội, ngô của Hà Bắc nhiễm cả A flavus và A parasiticus Ngô

ở Sơn La, Hòa Bình, Nghệ An có mức nhiễm A flavus cao hơn hẳn lần lượt là là 50%, 90% và 34% Đối với ngô miền Nam, A flavus cũng là loài có tần suất cao nhất trong các loài của Aspergillus nhiễm trên các mẫu, dao động từ 50 - 60%

2.1.8 Các phương pháp phát hiện aflatoxin trong thực phẩm

Có thể dùng các kỹ thuật đơn giản và không đắt tiền như phương pháp "black light" hay còn gọi là phương pháp BGYF Phương pháp này dựa trên màu huỳnh quang màu vàng xanh sáng quan sát được dưới tia UV bước sóng 366nm Huỳnh quang màu vàng xanh sáng được tạo ra từ phản ứng của acid kojic (acid này được tạo ra do cùng một loại nấm sản sinh aflatoxin) Phương pháp này

là phương pháp nhanh nhất để phát hiện aflatoxin tuy nhiên độ tin cậy không cao

và không dùng để phát hiện aflatoxin trong hạt đã qua xử lý nhiệt

Phương pháp huyết thanh học: phát hiện aflatoxin thông qua những phương tiện phát hiện nhanh, dễ thực hiện theo nguyên tắc: sử dụng kháng thể để "bắt" (có lựa chọn) độc tố đặc biệt đã được tách chiết từ hạt hay các thành phần của thức ăn

Sau khi tách chiết, sẽ sử dụng bộ kiểm tra và thêm chất chỉ định màu Cường độ màu sắc sẽ chỉ định có độc tố hay không và có thể định lượng được lượng độc tố

Ví dụ phương pháp ELISA

Sắc ký (sắc ký bản mỏng, sắc ký khí hay sắc ký lỏng cao áp): phương pháp đáng tin cậy để phát hiện các độc tố, được sử dụng nhiều trong các phòng nghiên cứu của các công ty thương mại Ở Việt Nam, Đoàn Thị Khang và ctv (2007) đã xây dựng được quy trình tối ưu cho phương pháp xác định độc chất aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong các loại nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi bằng HPLC

2.1.9 Các phương pháp phân hủy aflatoxin

Phương pháp hóa học

Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa - khử như natrihypochlorit (NaOCl), oxy già (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính của aflatoxin Tuy nhiên

sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt

và biến chất các acid amin Khí ozon (O3) cũng được thử nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng

là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin

Phương pháp sử dụng các chất kiềm: hydroxit amon (NH4OH) và hyroxit natri (NaOH) là 2 chất kiềm thường được sử dụng làm vô hoạt aflatoxin Các chất này đều

có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin

Phương pháp sử dụng khí NH3: nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5% và nhiệt độ bên ngoài là 250C, thì sau 14 ngày lượng độc tố từ 200 bbp xuống còn 10 ppb (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: các chất hấp phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: than hoạt tính, một số polymer hữu,

vô cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, mốt số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone) (Charmley, 1994; trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Phương pháp vật lý học

Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn Quá trình này phá hủy nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin Rehana (1979) (trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 1200C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68% Ở đậu phộng có độ ẩm10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 1200C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin

Phương pháp sinh vật học

Hai phương pháp vật lý và hóa học có thể giảm lượng aflatoxin, tuy nhiên hạn chế lớn nhất của 2 phương án này đó là làm giảm giá trị dinh dưỡng, giá trị cảm quan, gây ô nhiễm môi trường cũng như chi phí đầu tư lớn Do đó, hiện nay người ta rất chú trọng sử dụng các tác nhân vi sinh để xử lý độc tố aflatoxin Trên thế giới cũng như trong nước có rất nhiều nghiên cứu sử dụng vi sinh vật để ức

chế sự phát triển của A flavus và A parasiticus cũng như giảm độc tố aflatoxin do chúng sinh ra Lactobacillus casei được nghiên cứu sử dụng kháng aflatoxin (Gourama

và ctv, 1997) Các chủng Enterococcus faecium, Rhodococcus erythropolis được

nghiên cứu sử dụng để giải độc tố AFB1(Ali và ctv, 2010; Alberts và ctv, 2006)

Rhizopus stolonifer phân hủy được aflatoxin G1 Rhizopus arrhizus có thể làm giảm

tính gây độc của aflatoxin B1 Một số chủng Aspergillus parasiticus cũng có thể tác động lên aflatoxin qua hệ thống men của hệ sợi nấm Một số chủng Saccharomyces

cerevisiae có tác dụng hạn chế ảnh hưởng xấu của aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi,

ngoài ra còn giúp tăng trọng và giảm bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi (theo Đậu Ngọc

Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) Bacillus subtilis đã được nghiên cứu rất nhiều

và có tiềm năng to lớn để ức chế tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc Aspergillus flavus

và Aspergillus parasiticus

2.2 Tổng quan về Bacillus subtilis

2.2.1 Lịch sử phát hiện và phân loại

Ban đầu vi khuẩn được đặt tên là Vibrio subtilis, sau đó Cohn mới đổi thành

Bacillus subtilis Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941

bởi tổ chức y học Nazi của Đức Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Việc ứng dụng điều trị phải đợi tới những năm 1949 - 1957 khi Henrry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết

của Bacillus subtilis Từ đó “Subtilis therapy”có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các

chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hóa Ngày nay,

vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi, y học, thực phẩm…

Theo đặc điểm phân loại của Bergey vào năm 1994, vi khuẩn Bacillus subtilis

thuộc giới Bacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae, chi

Bacillus, loài Bacillus subtilis

2.2.2 Đặc điểm của Bacillus subtilis

2.2.2.1 Đặc điểm sinh thái và phân bố trong tự nhiên

Bacillus subtilis là trực khuẩn hình que, hiếu khí hay kỵ khí không nghiêm ngặt,

phân bố hầu hết trong tự nhiên như đất, nước, không khí, thực vật bị phân huỷ,

hệ tiêu hóa người và động vật Sự phát triển của Bacillus subtilis có thể có mối quan hệ mật thiết với bề mặt rễ cây Người ta nhận thấy rằng Bacillus subtilis phát triển mạnh trên rễ Arabidopsis thaliana, hình thành màng sinh học (biofilm) (Rudrappa, 2007) Ngoài ra, cũng giống như những thành viên khác trong chi Bacillus,

Bacillus subtilis có khả năng sinh nội bào tử để chống chịu lại nhiều điều kiện

khắc nghiệt của môi trường, tình trạng thiếu dinh dưỡng…Bào tử của Bacillus subtilis

rất bền và dễ dàng phát tán đi xa nhờ gió (Merrill và ctv, 2006) Bên cạnh đó, khi tiến hành phân lập vi sinh vật từ vùng rễ của nhiều loại cây trồng, người ta

thấy rằng Bacillus subtilis được phân lập với số lượng lớn hơn nhiều so với

các vi sinh vật có khả năng sinh bào tử khác (Cazorla và ctv, 2007) Ngoài ra

Bacillus subtilis còn được phân lập trong các sản phẩm lên men có trên thị trường,

ví dụ như sản phẩm đậu nành lên men ở miền bắc Thái Lan hay Bacillus subtilis natto, một chủng Bacillus subtilis được phân lập từ Natto - sản phẩm đậu nành lên men truyền thống của Nhật Bản

2.2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa

Về đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis là trực khuẩn bắt màu Gram

dương, có dạng hình que, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,5 - 3 µm, thường đứng đơn lẻ hoặc tạo thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có từ 8 - 12 chiên mao,

sinh nội bào tử nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0,9 - 0,6 µm Vị trí của bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo một nguyên tắc chặt chẽ nào, có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm (Nguyễn Lân Dũng, 1983, trích dẫn bởi Phạm

Hoàng Thái, 2007) Trên môi trường agar thích hợp, khuẩn lạc Bacillus subtilis thường

có dạng tròn hay không theo quy luật, bề mặt khuẩn lạc trở nên dày và nhăn nheo, màu sắc có thể trắng sữa hay nâu Đặc điểm màu sắc khuẩn lạc phụ thuộc lớn vào thành

phần môi trường nuôi cấy Trên môi trường TSA khuẩn lạc Bacillus subtilis có dạng

tròn, rìa răng cưa không đều, nằm sát trên bề mặt thạch, đường kính 3 – 5 mm, khuẩn lạc có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng sám Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi sẩm

Bacillus subtilis có các đặc điểm sinh hóa: lên men không sinh hơi các loại

đường: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose, arabinose Indol (-), nitrate (-), MR-VP (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+) Một số dòng gây dung huyết trên thạch máu ngựa và thỏ

do tác động của hemolysine

2.2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy

B subtilis có thể nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 370C, pH = 7 - 7,4, trong chế độ nuôi cấy lắc

Bacillus subtillis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi trường

thiếu oxy

Trên môi trường thạch đĩa TSA khuẩn lạc B Subtilis dạng tròn, rìa răng cưa không

đều, có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng sám, đường kính 3 – 5 mm Sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi sẩm

Trên môi trường canh TSB Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng

nhăn trên bề mặt môi trường canh, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc

Về dinh dưỡng Bacillus subtilis cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác

2.2.2.4 Đặc điểm bào tử

Bào tử vi khuẩn không phải là một bộ phận làm chức năng sinh sản mà chỉ là một thể biến đổi của tế bào nhằm bảo tồn, đổi mới và nâng cao sức sống của vi khuẩn Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, có sự đề kháng cao với các nhân tố bất lợi của ngoại cảnh

Theo Nguyễn Xuân Thành và ctv (2005) thì sự tồn tại lâu dài của bào tử

là do chúng có các đặc tính: nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ; trong bào tử có một lượng lớn ion Ca++ và acid dipicolinic; protein trong bào tử kết hợp với dipicolinat canxi tạo thành một phức chất có tính ổn định cao đối với nhiệt độ; các enzyme và các họat chất sinh học khác trong bào tử đều tồn tại dưới dạng không hoạt động làm hạn chế sự trao đổi chất của bào tử với môi trường bên ngoài; sự có mặt của các acid amin chứa lưu huỳnh, đặc biệt là cysteine giúp bào tử đề kháng với tia cực tím; cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng, làm cho các chất hóa học và các chất sát trùng khó có thể tác động đến bào tử Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế bào mới có sức sống mạnh mẽ hơn

2.2.3 Bộ gen của Bacillus subtilis và PCR định danh Bacillus subtilis

Bacillus subtilis đã được nghiên cứu rất nhiều và bộ gen của nó đã được

giải trình tự hoàn chỉnh vào năm 1997 bởi Kunst và ctv Theo Kunst và ctv,

Bacillus subtilis mang những đặc tính đặc trưng nhất của vi khuẩn Gram dương

Bộ gen của Bacillus subtilis có kích thước 4.214.810 bp, trong đó có 4.100 gen mã hóa

protein Nhiều gen mã hóa “degradative enzyme” (ví dụ như lipase, protease, carbohydrase, ) 4% bộ gen mã hóa các hợp chất thứ cấp, trong số đó có nhiều hợp chất kháng khuẩn và nấm mạnh

Việc xác định B subtilis trước đây có thể được tiến hành bằng phương pháp

nhuộn Gram, thử sinh hóa Tuy nhiên, phương pháp này có độ tin cậy không cao

PCR là phương pháp định danh B subtilis có độ tin cậy cao và được áp dụng rộng rãi

Gen 16S rRNA được sử dụng như là một khung cho phân loại vi khuẩn trong đó có

chi Bacillus (Ki và ctv, 2009) Gen 16S rRNA được sử dụng phổ biến vì gen này

tồn tại trong hầu hết tất cả các loài vi khuẩn; chức năng của gen 16S rRNA ít thay đổi theo thời gian; gen 16S rRNA có kích thước khoảng 1500 bp do đó nó đủ lớn để cung cấp các thông tin cho phân tích Tuy nhiên, vì là một gen phổ biến và ít biến đổi nên hạn chế của việc sử dụng gen 16S rRNA là không phân biệt được các nhóm loài

có mối quan hệ gần gũi

Trong nghiên cứu của Kwon và ctv (2009) khi thực hiện PCR khuếch đại

và giải trình tự gen 16S rRNA thì không thể phân biệt được các chủng B subtilis với các chủng có mối quan hệ gần với nó như B amyloliquefaciens

hay B licheniformis Kwon và ctv (2009) đã nghiên cứu thiết kế cặp primer khuếch đại một phần gen ytcP ở B subtilis mà không khuếch đại gen này ở các các chủng

có mối quan hệ gần với B subtilis Gen ytcP mã hóa protein tương tự như

một ABC- một kiểu hình thức vận chuyển quan trong trong bộ máy vận chuyển của tế

bào vi khuẩn Khi sử dụng cặp primer này thì chỉ có các chủng B subtilis được phát

hiện

2.2.4 Khả năng sản sinh kháng sinh của Bacillus subtilis

Bacillus subtilis có khả năng sản xuất nhiều loại kháng sinh với chức năng

và cấu trúc đa dạng Sản xuất kháng sinh với hoạt tính kháng khuẩn là một yếu tố quyết định để kiểm soát các tác nhân gây bệnh ở thực vật (Silo và ctv, 1994) Các kháng sinh có thể được tổng hợp bằng ribosome chẳng hạn như subtilin, subtilosin, TasA và sublancin Rất nhiều lipopeptide nhỏ được tổng hợp không bằng ribosome, bao gồm họ surfactin: surfactin và lichenysins; họ iturin: iturin A, C, D

và E, bacillomycin D, F và L và mycosubtilin; họ fengycin: fengicins và plipastatins Surfactin và iturin là những hợp chất lipoheptapeptide dạng vòng, trong đó surfactin

có một acid béo β-hydroxy, còn iturin có một acid béo β-amino; fengycin

là một lipodecapeptide trong đó có một acid béo β-hydroxy (Grover và ctv, 2010) Những lipopeptide thuộc họ iturin có khả năng kháng nấm mạnh tuy nhiên khả năng kháng khuẩn bị giới hạn (Maget-Dana và Peypoux, 1994), fengycin thể hiện đặc tính đặc biệt là kháng nấm sợi và ức chế phospholipase A2 (Nishikiori và ctv, 1986) Surfactin là kháng sinh kháng khuẩn được tiềm hiểu kỹ nhất,với hoạt tính kháng khuẩn mạnh ngoài ra còn có khả năng kháng virus và khối u và Mycoplasma

2.2.5 Iturin A và tiềm năng ứng dụng trong ức chế hình thành độc tố aflatoxin 2.2.5.1 Công thức cấu tạo của iturin A

Iturin A là một lipopeptide dạng vòng gồm 7 amino acid L-Pro-D-Asn-L-Ser) và một β-amino acid (Isogai và ctv, 1982; Hourdou

(L-Asn-D-Tyr-D-Asn-L-Gln-và ctv, 1989)

Theo Boller và ctv (1999) (trích dẫn bởi Nguyễn Thùy Châu, 2000) iturin A

có cấu tạo như hình 2.3

Hình 2.3 Cấu tạo Iturin A

Asn: asparagin; Tyr: tyrosine; Ser: serin; Gln: glutamin; Pro: prolin; A.A: amino acid; R đại diện cho sáu thành phần của chuỗi aliphatic từ A đến F

Sáu thành phần của chuỗi aliphatic từ A đến F:

Qua phân tích sắc ký lỏng cao áp, các chuỗi aliphatic từ A đến F trong iturin được xác định xấp xỉ có 40% thành phần A, 16% thành phần B, 20% thành phần C, 14% thành phần D, 7% thành phần E và 2% thành phần F Tỷ lệ các amino acid glutamin, serin, prolin, tyrosine, β-amino acid, asparagin lần lượt là 1:1:1:1:1:3 Đặc biệt cấu trúc đặc hiệu của chuỗi β-amino acid có tác động trực tiếp lên khả năng kháng nấm của iturin A

2.2.5.2 Tính chất hóa lý và cơ chế diệt nấm của iturin A

Theo Nguyễn Thùy Châu (2000) iturin A bị thủy phân bởi acid HCl thành các

acid amin và bền ở nhiệt độ cao khi đã là chế phẩm, 15 giờ ở nhiệt độ 1000C hay 15 phút ở 1210C Iturin A còn tan trong nước, tan trong ethanol, methanol tuyệt đối, ít tan

trong hexan, ổn định ở pH 1 - 11 và hút ẩm khi ở điều kiện bình thường

β-AA

R(CH)2CHCH2CO-

GlnPro

AsSer

Về cơ chế diệt nấm của iturin A, theo Hsieh và ctv (2008) bằng tương tác chủ yếu với các phân tử cholesterol, iturin A cắt màng tế bào chất của nấm, tạo các kênh xuyên màng làm cho các ion quan trọng, chẳng hạn như K+, giải phóng ra bên ngoài

làm mất cân bằng ion từ đó làm tế bào nấm chết Theo Nguyễn Thùy Châu (2000)

iturin A xâm nhập vào tế bào nấm, phá vỡ màng nguyên sinh chất và tương tác với màng nhân dẫn đến sự ngừng trệ trong tổng hợp các acid nucleic nên nấm không phát

triển được

2.2.5.3 Tiềm năng ứng dụng iturin A trong ức chế hình thành độc tố aflatoxin

Bacillus subtilis đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi, nó được xem như

là một tác nhân sinh học an toàn (Bass và ctv, 1995) Khả năng kháng A.flavus

và A.parasiticus của Bacillus subtilis đã được ghi nhận trong rất nhiều nghiên cứu Kimura và Hirano (1988) phân lập được chủng B subtilis NK-330 có khả năng ức chế

sự phát triển và sản sinh độc tố aflatoxin từ A flavus; Gao và ctv (2011) đã phát hiện B subtilis ANSB060 có khả năng phân hủy mạnh độc tố, trong đó tỉ lệ

aflatoxin B1, M1 và G1 giảm lần lượt là 81,5%, 60% và 80,7%

Những năm gần đây các nhà khoa học chú trọng nghiên cứu chế phẩm sinh học

có khả năng ức chế sự phát triển của A flavus và A parasiticus và đã chứng minh được iturin A từ Bacillus subtilis có hoạt tính ức chế rất mạnh mẽ lên sự phát triển

của nấm mốc và đặc biệt nấm mốc sinh độc tố aflatoxin và cả sản phẩm aflatoxin

của chúng Các nhà khoa học Hàn Quốc (Bok và ctv, 1992) đã tìm ra chủng Bacillus

subtilis subspecies krictiensis (ATCC55079) và dạng đột biến của nó là Bacillus subtilis krictiensis M 18-91 (ATCC55078) là chủng có khả năng tạo kháng sinh kháng

nấm (trích dẫn bởi Nguyễn Thùy Châu, 2000) Chất này được đặt tên là KRF_001 với cấu tạo và bản chất thực sự là iturin A

Trong nước, Nguyễn Thùy Châu (2000) đã tiến hành nghiên cứu và sản xuất iturin A để diệt mốc và ức chế aflatoxin với một số kết quả rất khả quan được trình bày

ở các bảng 2.6 Với những kết quả đó iturin A thực sự được xác nhận là chất kháng nấm hiệu quả và có tiềm năng sử dụng để ức chế sự hình thành aflatoxin

Bảng 2.6 Khả năng ức chế aflatoxin của iturin A trên ngô và thức ăn gia súc

2.2.5.4 Đặc tính vùng gen mã hóa iturin A

Để có thể hiểu rõ hơn về iturin A và mở ra khả năng sàng lọc nhanh

các chủng Bacillus subtilis có khả năng tạo lipopeptide này, nhiều công trình khoa học

đã nghiên cứu về vùng gen mã hóa iturin A Theo Tsuge và ctv (2001) operon iturin A

là một vùng gen dài hơn 38kb, bao gồm bốn ORF là ituD, ituA, ituB và ituC

Gen ituD mã hóa Malonyl coenzyme A transacylase Ở E.coli, malonyl

coenzyme A transacylase tham gia tổng hợp acid béo, ngoài ra ở một số chủng

Streptomyces malonyl coenzyme A transacylase không chỉ tham gia tổng hợp acid béo

mà còn tổng hợp kháng sinh polyketide tuýp II Khi nghiên cứu làm mất gen ituD,

Tsuge và ctv thấy rằng chủng biến đổi mất khả năng tổng hợp iturin A, do đó họ kết

luận ituD đặc biệt cần thiết trong tổng hợp iturin A

Loại

sản phẩm

Công thức thí nghiệm

Nồng độ xử lý iturin A (%)

Phần trăm hạt nhiễm mốc (%)

Hàm lượng aflatoxin (ppb)

10

0

KPHĐ KPHĐ

15

5

10 KPHĐ

KPHD: Không phát hiện được (Nguyễn Thùy Châu, 2000)

en lpa-14 đ

14 được ch

Huang và cheteinyl tranturin A

iturin A ở Bcủa Hiraok

n này cho actin và iturđược khôi phứng minh ctv (1993);

nsferase, cầ

ứu nêu trên

subtilis có k

ọc kiểm soáđộng kiểm

in A Các c

ự tổng hợp cứu của Hs

nh được rằn

g Bacillus s

Bacillus sub

ka và ctv (chỉ cho prin A khôngphục lại T

là đồng qLambalot v

ần thiết ch

đều được khả năng s

át các mầmsoát sinh hcông trình titurin A

sieh và ctv

ng có thể s

subtilis có ti

btilis RB14 (1992) khi phép tổng h

g được tổngTrong nghiêquy định si

và ctv (199

ho sự hoàn

tiến hành trsinh đồng t

(Tsuge và c

phá hủy ghợp surfact

g hợp, khả

ên cứu của inh tổng hợ96), thì gen thiện của

rên Bacillu

thời iturin goài ra, ng

cillus subtil

o thấy rằng

Grover và c

R khuếch đinh iturin A

ctv, 2001)

gen lpa-14

tin ở chủnnăng này đHuang và

lis RB14 có ituD và lp

A và

ã hóa zyme

RB14 actin,

2.3 Tính kị nước của các amino acid theo thang Rose (Rose scale)

Tính kị nước của các amino acid theo thang Rose được xây dựng theo nghiên cứu của Rose và ctv (1985) Các amino acid được phân thành các mức độ

kị nước khác nhau dựa theo đặc điểm cấu trúc của protein Các amino acid vùi sâu bên trong cấu trúc protein hình cầu thì có độ kị nước cao, những amino acid bên ngoài cấu trúc, tiếp xúc với dung môi thì độ kị càng giảm Ví dụ Cystein trong cấu trúc protein hình cầu nó vùi bên trong phân tử và tạo cầu nối disulfide góp xác định nếp gấp và ổn định cấu trúc protein do đo nó được coi là amino acid có tính kị nước cao nhất

Mức độ kị nước của các amino acid theo thang Rose như sau:

- Nhóm amino acid kị nước nhất: Cystein (C)

- Nhóm amino acid kị nước thứ hai: Phenylalanine (F); Isoleucine (I); Valine (V); Leucine (L); Methionine (M); Tryptophan (W)

- Nhóm amino acid kị nước thứ ba: Histidine (H), Tyrosine ( Y), Alanine (A), Glycine (G), Threonine (T)

- Nhóm amino acid kị nước thứ tư: Serine (S), Proline (P), Arginine (R), Glutamine (Q), Asparagine (N), Aspartic acid (D), Glutamic acid (E)

- Nhóm kị nước kém nhất: Lysine (K)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 07/2013 đến tháng 12/2013 tại phòng thực hành

vi sinh, khoa Chăn Nuôi – Thú Y trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM và phòng xét nghiệm chẩn đoán thú y Hàn - Việt

3.2 Vật liệu và hóa chất

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Các chủng Bacillus subtilis được phân lập từ đất lấy ở nhiều nơi khác nhau

Chủng nấm mốc Aspergillus flavus do phòng thực hành vi sinh cung cấp

3.2.2 Hóa chất và thiết bị

3.2.2.1 Hóa chất và thiết bị dùng trong nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường tổng hợp

NA (Nutrient Agar): môi trường phân lập, giữ giống và đếm số lượng khuẩn lạc

NB (Nutrient Broth): môi trường tăng sinh vi khuẩn

PDA (Potato Dextrose Agar): môi trường giữ giống nấm mốc

Môi trường tự nhiên

Môi trường khoai tây tự nhiên: hoạt hóa nấm mốc

Môi trường thạch nước cốt dừa: thử định tính khả năng ức chế độc tố aflatoxin của các chủng vi khuẩn phân lập được

Môi trường bắp: thử định lượng khả năng làm giảm hàm lượng độc tố aflatoxin của các chủng vi khuẩn

(Thành phần các loại môi trường và cách làm môi trường được trình bày ở phụ lục 1)

Thiết bị và dụng cụ: tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), máy cất nước,

máy lắc, tủ ấm, tủ lạnh, lò vi sóng, đèn UV, máy vortex, cân điện tử, que cấy (que cấy trang, que cấy vòng, …), ống nghiệm, đĩa petri, ống đong, micropipet, đầu tuýp… Tất cả các dụng cụ đều được tiệt trùng trước khi sử dụng: dụng cụ bằng thủy tinh được sấy ở 1700C trong 2 giờ, dụng cụ bằng nhựa được hấp tiệt trùng bằng autoclave ở

1210C trong 15 phút

3.2.2.2 Hóa chất và thiết bị dùng trong PCR

Hóa chất dùng trong ly trích DNA tổng số:

Bộ kitWizard® Genomic DNA Purification Kit của Promega gồm: Nuclei lysis solution, protein precipitation solution, DNA rehydration solutin

Hóa chất dùng trong phản ứng PCR:

Bộ kit GoTaq Green Master Mix (Promega) gồm: Nuclease-Free Water, GoTaq Green Master Mix 2X

Hóa chất dùng trong điện di gel TAE:

Dung dịch đệm TAE 1X (Noble Bio) Dung dịch ethidium bromide

Loading dye (Promega)

Thiết bị và dụng cụ sử dụng:

Tủ cấy vô trùng HB-402SM và HB-405H Máy ủ nhiệt ALB64

Máy luân nhiệt AB Applied Biosystems 2720 Tủ mát, tủ âm (-200C)

Micropipet, đầu tip, eppendorf

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Hình 3.1 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập Bacillus subtilis trong đất

3.3.1.1 Cách lấy mẫu đất

Tiến hành lấy mẫu đất từ các ruộng cây trồng ở nhiều nơi khác nhau Cách lấy mẫu như sau: lấy đất xung quanh vùng rễ, đầu tiên gạt bỏ lớp đất bề mặt sau đó lấy khoảng 100 - 200 gram đất, bỏ vào túi đựng mẫu, bảo quản lạnh đem về phòng

thí nghiệm, tiến hành phân lập Bacillus subtilis ngay hoặc bảo quản mẫu ở 40C sau đó tiến hành phân lập

3.3.1.2 Phân lập Bacillus subtilis

Cân 25 gram mẫu cho vào bình tam giác có 225 ml nước muối sinh lý (0,85%)

vô trùng, lắc đều, ta được mẫu có độ pha loãng mẫu là 10-1 Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống 9ml dung dịch nước muối sinh lý (0.85%) vô trùng, đánh số từ 1 - 4 Hút 1ml dịch mẫu từ độ pha loãng 10-1 cho vào ống 1, vortex, ta được nồng độ pha loãng 10-2,

cứ như vậy tiếp tục làm đến ống có độ pha loãng là 10-5 Xử lý nhiệt các ống có nồng độ pha loãng là 10-3, 10-4, 10-5 ở 700C trong 15 phút Sau khi xử lý nhiệt,

để nguội ở nhiệt độ phòng, hút 0,1ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa NA, dùng que cấy trang vô trùng dàn đều dịch mẫu trên bề mặt thạch cho đến khi khô giọt dịch mẫu Để đĩa NA ở 370C/24 giờ trong tủ ấm Quan sát các khuẩn lạc hình thành

trên đĩa NA, chọn khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis rồi dùng que cấy vòng

vô trùng bắt khuẩn lạc cấy chuyển sang ống thạch NA nghiêng

3.3.2 Thí nghiệm định tính khả năng ức chế aflatoxin của các chủng vi khuẩn

nghi ngờ là Bacillus subtilis

3.3.2.1 Hoạt hóa chủng Aspergillus flavus trên môi trường khoai tây tự nhiên

Chủng nấm mốc do phòng thí nghiệm cung cấp được bảo quản lâu trong tủ lạnh

do đó cần được hoạt hóa trong môi trường khoai tây tự nhiên Lấy một ít nấm mốc từ ống giống cấy sang bình tam giác có môi trường khoai tây tự nhiên, lắc đều liên tục trong máy lắc suốt 48 giờ Sau đó dùng que cấy mốc lấy một ít sợi nấm cấy một chấm vào giữa đĩa thạch nước cốt dừa Để đĩa ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày, đặt đĩa dưới tia

UV bước sóng 365 nm, nếu xung quanh khuẩn lạc nấm mốc màu huỳnh quang càng sáng thì chứng tỏ chủng nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin càng mạnh

3.3.2.2 Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế hình thành aflatoxin của các chủng vi

khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis

Dùng que cấy mốc lấy một ít sợi nấm mốc trong ống giống (chủng Aspergillus

flavus đã được hoạt hóa) cấy vào giữa đĩa thạch nước cốt dừa, để đĩa ở nhiệt độ phòng

hai ngày Các chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis được cấy chuyền sang

các ống thạch nghiêng NA và đặt ở 370C/24 giờ trong tủ ấm Cấy các chủng vi khuẩn vào các góc đĩa thạch nước cốt dừa đã cấy nấm mốc, mỗi đĩa 4 chủng, để ở nhiệt độ phòng Sau 2 ngày nuôi cấy chung, đặt các đĩa dưới đèn UV có bước sóng 365 nm để quan sát Chọn tất cả các chủng có khả năng ức chế độc tố aflatoxin từ thí nghiệm này

để thực hiện thí nghiệm tiếp theo

3.3.3 PCR định danh vi khuẩn Bacillus subtilis và khuếch đại hai gen mục tiêu ituD và lpa-14

Bước 1: Hút 1ml dịch khuẩn cho vào tube 1,5 ml

Bước 2: Ly tâm ở 13000–16000 × g trong 2 phút để thu cặn tế bào Loại bỏ dịch nổi Bước 3: Hòa tan cặn trong 480 μl EDTA 50 mM

Bước 4: Thêm khoảng 120 μl Lysozyme 10 mg/ml

Bước 5: Ủ mẫu ở 370C trong 30 – 60 phút Ly tâm trong 2 phút ở 13000–16000 × g và loại bỏ dịch nổi

Bước 6: Thêm 600 μl Nuclei Lysis Solution Pipet nhẹ để đảo trộn

Bước 7: Ủ ở 800C trong 5 phút, sau đó làm mát ở nhiệt độ phòng

Bước 8: Thêm 3 μl RNase Solution, đảo tube 2–5 lần để đảo trộn

Bước 9: Ủ ở 370C trong 15–60 phút sau đó để mẫu hạ xuống nhiệt độ phòng

Bước 10: Thêm 200 μl Protein Precipitation Solution vào dịch tan tế bào đã xử lý với RNase Vortex ở tốc độ cao trong 20 giây để trộn Protein Precipitation Solution với dịch tan tế bào

Bước 11: Ủ mẫu trên đá lạnh trong 5 phút

Bước 12: Ly tâm ở 13000–16000 × g trong 3 phút

Bước 13: Chuyển dịch nổi có chứa DNA vào một tube 1,5ml có chứa 600 μl isopropanol ở nhiệt độ phòng Hút trộn

Bước 14: Ly tâm ở 13000–16000 × g trong 2 phút

Bước 15: Loại bỏ dịch nổi và úp ngược tube trên giấy thấm Thêm 600 μl ethanol 70%

ở nhiệt độ phòng và đảo tube nhẹ vài lần

Bước 16: Ly tâm ở 13000–16000 × g trong 2 phút Đổ bỏ ethanol Úp ngược tube trên giấy thấm và phơi cặn trong 10–15 phút

Bước 17: Thêm 100 μl DNA Rehydration Solution vào tube và rehydrate DNA bằng cách ủ ở 650C trong 1 giờ Thỉnh thoảng búng nhẹ tube để trộn dung dịch Có thể rehydrate DNA bằng cách ủ dung dịch qua đêm ở 40C

3.3.3.2 Thực hiện các phản ứng PCR

PCR định danh vi khuẩn Bacillus subtilis

PCR định danh vi khuẩn Bacillus subtilis được tiến hành theo mô tả của Kwon và ctv (2009) nhằm khuếch đại một phần của gen ytcP ở Bacillus subtilis, mà không khuếch đại gen này ở các chủng có mối quan hệ gần với Bacillus subtilis như B

amyloliquefaciens, B licheniformis,… Phản ứng được thực hiện với bộ kit GoTaq

Green Master Mix

Trình tự của cặp primer được sử dụng (Kwon và ctv, 2009):

Mồi xuôi (ytcP-F): 5′-GCTTACGGGTTATCCCGC-3′

Mồi ngược (ytcP-R): 5′-CCGACCCCATTTCAGACATATC-3′

Sản phẩm khuếch đại có kích thước 460 bp

Tất cả các chủng được xác định là Bacillus subtilis sẽ được chọn để thực hiện phản ứng PCR khuếch đại 2 gen ituD và lpa-14 Ngoài ra, những chủng không phải là

Bacillus subtilis nhưng trong thí nghiệm định tính thể hiện khả năng ức chế tốt độc tố

aflatoxin cũng sẽ được chọn để tiến hành PCR khuếch đại 2 gen mục tiêu

PCR khuếch đại gen lpa-14

Phương pháp PCR được tiến hành theo mô tả của Hsieh và ctv (2008), theo đó cặp

primer sử dụng được thiết kế dựa trên trình tự gen lpa-14 của Bacillus subtilis RB14

(mã truy cập trên Genbank: D21876) Sản phẩm khuếch đại là đoạn gen có kích thước là 675 bp

Trình tự của cặp primer được sử dụng:

Mồi xuôi (lpa-14F): 5′-ATGAAAATTTACGGAGTATA-3′

Mồi ngược (lpa-14R): 5′-TTATAACAGCTCTTCATACG-3′

PCR khuếch đại gen ituD

Cặp primer sử dụng được thiết kế dựa trên trình tự gen ituD của Bacillus subtilis RB14

(mã truy cập trên Genbank: AB050629) Phản ứng được thực hiện theo mô tả của Hsieh và ctv( 2008) Sản phẩm khuếch đại có kích thước 1203 bp

Trình tự của cặp primer được sử dụng:

Mồi xuôi (ituD-F):): 5′-ATGAACAATCTTGCCTTTTTA-3′

Mồi ngược (ituD-R): 5′-TTATTTTAAAATCCGCAATT-3′