Phân lập nấm men Saccharomyces cerevisiae, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được

Hiện nay có nhiều phương pháp nhằm làm giảm và phân hủy aflatoxin, trong đó có phương pháp sinh vật học, do đó đề tài “Phân lập nấm men Saccharomyces cerevisiae, khảo sát khả năng ức chế

Ngàn Sinh Niên

ẬN TỐ

accharom

HẾ SẢN ỦNG PH

: CÔ hiện : DƯ : 200

ÔNG NGHỆ ƯƠNG NGÔ

09 - 2013

013

HỐ HỒ CH HỌC

ỌC

CH TRÂM

ÁT

M

HẢI

T

NG LÂM TH ÔNG NGH

ẬN TỐ

accharom

HẾ SẢN ỦNG PH

inh viên thự

ƯƠNG NG

013

HỐ HỒ CH HỌC

CH TRÂM

ÁT

LỜI CẢM ƠN

Mãi khắc ghi công ơn sinh thành, nuôi nấng, dạy dỗ của ba má và những người thân

trong gia đình Cảm ơn ba má đã luôn động viên và là chỗ dựa tinh thần cho con mỗi khi

gặp khó khăn

Chân thành cảm ơn

Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng quý thầy cô đã dạy bảo và truyền

đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tại trường

Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực

hiện đề tài

Thầy Trương Đình Bảo, cô Nguyễn Ngọc Thanh Xuân đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo

điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt khóa luận

Cảm ơn chị Ánh, chị Trang, chị Thư, chị Thu, chị Vi, anh Hùng, Đức cùng thực tập

TÓM TẮT

Độc tố aflatoxin là một loại độc tố nguy hiểm nhất, thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan, gây quái thai, đột biến thậm chí ở liều lượng cao có thể dẫn đến tử vong Việc làm ức chế sự sản sinh của nấm mốc và độc tố aflatoxin được coi là điều cần thiết nhằm làm hạn chế sự nhiễm aflatoxin trong nông sản, cũng như giảm thiểu tổn thất về kinh tế Hiện nay có nhiều phương pháp nhằm làm giảm và phân hủy aflatoxin, trong đó có phương pháp sinh vật

học, do đó đề tài “Phân lập nấm men Saccharomyces cerevisiae, khảo sát khả năng ức chế

sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được” được thực hiện, từ tháng 01 năm 2013 đến tháng 06 năm 2013 tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh khoa Chăn nuôi - Thú y trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM Những kết luận rút ra từ đề tài:

Có sự hiện diện của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong men, phân heo, phân

gà từ các nông hộ

Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Saccharomyces

cerevisiae: Sau 7 ngày nuôi cấy chung Aspergillus flavus và S cerevisiae trên môi trường

thạch nước cốt dừa, qua quan sát bên ngoài và quan sát dưới đèn UV, nhận thấy một số

chủng có khả năng ức chế sinh trưởng và sản sinh aflatoxin của nấm mốc A flavus Chọn

ra được 3 chủng nấm men có khả năng ức chế độc tố mạnh, đó là chủng số 76, chủng số

96 và chủng số 153

Khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng nấm men Saccharomyces

cerevisiae trong môi trường bắp: sau 5 ngày nuôi cấy bào tử nấm mốc và tế bào nấm men,

ghi nhận được sự thay đổi hàm lượng độc tố aflatoxin trên môi trường bắp so với mẫu đối

chứng dương chỉ có bào tử nấm mốc Aspergillus flavus và mẫu đối chứng âm không chứa

bào tử nấm mốc và nấm men

SUMMARY

Aflatoxin is a dangerous toxin, often infective on agricultural, poison to humans and animals, such as acute effects, liver damage, teratogenicity, mutation even at high doses can be fatal It inhibits the production of mold and aflatoxin is considered essential in order to limit aflatoxin contamination in agricultural products, as well as minimize the economic loss There are many methods to reduce aflatoxin and decomposition, including

biological methods, sothe thesis: "Isolation of Saccharomyces cerevisiae, survey their ability in inhibition of aflatoxin production by Aspergillus flavus on maize" was made

from 01/2013 to 06/2013 in Microbiology and Infections Diseases Department of Freulty

of Animal Sciences and Veterinary, Nong Lam University, Ho Chi Minh city Over the duration of the thesis, we have the following conclusions:

Isolation of Saccharomyces cerevisiae from various sources

After 7 days of culture common Aspergillus flavus and Saccharomyces cerevisiae on

coconut agar, by observers outside and observed under UV light, found that some strains

have the ability to inhibit growth and aflatoxin production of molds A flavus Pick 3 yeast

strains are capable of strongly inhibiting toxins, which are some 76 species, 96 species and 153 species

After 5 days of culture mold spores and yeast cells in corn environment, noting the change in the concentration of aflatoxin in environment compared with the positive

control sample only Aspergillus flavus mold spores and negative control sample did not

contain mold spores and yeast

Keywords: Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus flavus, aflatoxin, inhibition

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hình viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về nấm men 3

2.1.1 Đặc điểm chung của nấm men 3

2.1.2 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của nấm men 3

2.1.3 Tổng quan về Saccharomyces cerevisiae 4

2.1.4 Cơ chế kháng aflatoxin 5

2.1.5 Vai trò của nấm men 5

2.2 Sơ lược về aflatoxin 5

2.2.1 Cấu trúc và tính chất của aflatoxin 6

2.2.2 Cơ chế gây độc của aflatoxin 8

2.2.3 Tác hại của aflatoxin 9

2.2.4 Các phương pháp phân tích độc tố aflatoxin 12

2.2.5 Các quy định và tiêu chuẩn 13

2.3 Các nghiên cứu về khả năng ức chế độc tố aflatoxin của nấm men S cerevisiae 14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 15

3.2 Vật liệu và thiết bị 15

3.2.1 Đối tượng khảo sát 15

3.2.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 15

3.2.3 Môi trường nuôi cấy 15

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Phương pháp phân lập nấm men Saccharomyces cerevisiae 16

3.3.2 Phương pháp phát hiện nấm men S cerevisiae bằng phản ứng PCR 16

3.3.3 Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus flavus 18

3.3.4 Đánh giá khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của Saccharomyces cerevisiae 20

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Phân lập nấm men Saccharomyces cerevisiae 23

4.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc nghi ngờ là Saccharomyces cerevisiae 23

4.1.2 Đặc điểm hình thái của nấm men quan sát dưới KHV điện tử 23

4.2 Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus flavus 24

4.2.1 Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus flavus 24

4.2.2 Đánh giá khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng S cerevisiae 25

4.3 Phản ứng khuếch đại trình tự PCR 27

4.4 Đánh giá khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của Saccharomyces cerevisiae 28

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

5.1 Kết luận 31

5.2 Đề nghị 31

Tài liệu tham khảo 32 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Tính chất hóa - lý chủ yếu của các aflatoxin 8

Bảng 3.1 Thành phần tham gia phản ứng khuếch đại 17

Bảng 3.2 Trình tự và kích thước mồi xuôi - mồi ngược 17

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt 17

Bảng 4.1Hàm lượng aflatoxin sau khi phân tích HPLC 29

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Hình thái nấm men S cerevisiae dưới KHV điện tử 4

Hình 2.2Công thức hóa học của aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1, M2 7

Hình 3.1 Cách cấy nấm men và nấm mốc 19

Hình 3.2Nuôi cấy bào tử nấm mốc và tế bào nấm men trên môi trường bắp 21

Hình 4.1 Khuẩn lạc nghi ngờ S cerevisiae trên môi trường SA 23

Hình 4.2 Hình thái nấm men S cerevisiae dưới KHV điện tử 24

Hình 4.3 Khuẩn lạc Aspergillus flavus dưới ánh đèn UV 25

Hình 4.4 Sự ức chế của khuẩn lạc nấm men đối với khuẩn lạc nấm mốc 25

Hình 4.5 Vòng sáng aflatoxin bị mờ và khuyết 26

Hình 4.6 Kết quả điện di mẫu DNA nấm men S cerevisiae 27

Hình 4.7 Kết quả thử khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng nấm men 28

Chương 1MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong số 10.000 loại nấm mốc khác nhau được biết đến thì có khoảng 50 loại là có hại đối với gia súc, gia cầm và con người Các loại nấm này sản sinh ra các độc tố được gọi chung là mycotoxin Trong các loại độc tố thuộc nhóm mycotoxin thì nguy hiểm nhất

là độc tố aflatoxin do 2 loại nấm mốc điển hình Aspergillus flavus và Aspergillus

parasiticus sản sinh ra Trong đó, aflatoxin B1 là độc tố thường gặp và độc nhất

Sự nguy hiểm của aflatoxin B1 là ở chỗ nó có khả năng gây hại chỉ với liều lượng rất nhỏ, 1 kg thức ăn chỉ cần nhiễm 2 miligam (với lượng chỉ đủ dính trên đầu 1 móng tay) cũng đã đủ làm hỏng gan Độc chất này không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường, do vậy nó tồn tại trong thực phẩm mà không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng, đồng thời nó cũng rất bền với các men tiêu hóa Bên cạnh đó, việc chuyển hóa aflatoxin trong cơ thể bị nhiễm độc cũng khá nhanh Chỉ sau 48 giờ, phát hiện thấy 85% lượng aflatoxin được chuyển hóa trong sữa và bài tiết trong nước tiểu của động vật được cho ăn một liều duy nhất 0,50 mg/kg aflatoxin (Lê Ngọc Tú, 2006)

Aflatoxin gây ra nhiều tác hại cho vật nuôi và con người, làm giảm năng suất vật nuôi, cũng như ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người Trên vật nuôi, aflatoxin gây ra một loạt triệu chứng cấp tính và mãn tính Động vật nhiễm aflatoxin thường có biểu hiện hoại tử nhu mô gan, chảy máu ở gan, viêm cầu thận cấp và dẫn đến chết Động vật cũng

có những biểu hiện của triệu chứng mãn tính như ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu và hoại tử nhu mô Trên người, aflatoxin gây ngộ độc gián tiếp qua lương thực, thực phẩm bị nhiễm độc Theo nghiên cứu của Đại học Cornell (Hoa Kỳ), dù với hàm lượng cực thấp nhưng aflatoxin đã gây nên những ảnh hưởng bất lợi cho con người qua một thời gian dài tích tụ từ thực phẩm rồi dẫn đến ung thư gan Nhiễm aflatoxin cấp tính thường có các biểu hiện chủ yếu là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan Hiện nay đã có nhiều phương pháp nhằm làm giảm và phân hủy aflatoxin như phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp sinh vật học… Muñozvà ctv

(2010) đã nghiên cứu khả năng ức chế sản sinh độc tố của nấm mốc Aspergillus nomius

và nhận thấySaccharomyces cerevisiae có thể ức chế sản sinh độc tố của nấm mốc này

Vì thế,đề tài: “Phân lập nấm men Saccharomyces cerevisiae, khảo sát khả năng ức

chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được” được thực hiện

1.2 Yêu cầu của đề tài

Phân lập các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiaevàđánh giá khả năng ức chế

sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được trên môi trường bắp

1.3 Nội dung thực hiện

Đề tài gồm các nội dung sau:

 Phân lập Saccharomyces cerevisiae từ các nguồn mẫu: men bánh thu mua từ các

chợ, siêu thị, phân heo, phân gà thu từ các nông hộ

 Thực hiện phản ứng PCR nhằm phát hiện S cerevisiae

 Xác định các gốc S cerevisiae có khả năng ức chế sản sinh độc tố aflatoxin từ các

chủng phân lập được

 Đánh giá khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của S cerevisiae trên môi trường bắp

Chương 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về nấm men

2.1.1 Đặc điểm chung của nấm men

Nấm men là loại vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động và sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi Trong tự nhiên, nấm men tồn tại rất nhiều trong trái cây, nhất

là khi trái cây bị hư hỏng Nấm men có thể được phân lập từ môi trường sống như đất đai

Ở Việt Nam đã tìm thấy nấm men trong sữa, sữa đặc, đậu phộng, gạo, bắp, đường kính, mứt, kẹo, nước dừa, chè búp, thuốc lá (Nguyễn Phùng Tiến và Bùi Minh Đức, 2007)

Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau: hình cầu, hình ovan hoặc elip, hình quả chanh, hình trụ, hình chùy hoặc đôi khi còn kéo dài ra thành sợi Nấm men có thể thay đổi hình dáng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh.Nấm men là vi sinh vật có kích thước tương đối lớn Đường kính khoảng 1m, chiều dài 8 - 12 m

2.1.2 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của nấm men

Quá trình sống của nấm men gồm các quá trình dinh dưỡng, quá trình sinh trưởng với những đặc điểm di truyền để bảo tồn nòi và những quá trình sinh hóa trao đổi chất trong tế bào nhằm phục vụ cho sinh trưởng và tạo sinh khối

Dinh dưỡng nấm men được chia làm hai nguồn: dinh dưỡng nội bào và dinh dưỡng ngoại bào Chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng vào tế bào từ các chất ở môi trường nuôi cấy bên ngoài Khi tế bào ở trạng thái nghèo hoặc cạn chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ nội bào (lipit, tregaloza, glycogen…) sẽ được sử dụng, gọi là dinh dưỡng nội bào

Là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi, do đó nấm men hô hấp như một cơ thể hiếu khí bậc cao Khi môi trường hết oxy phân tử chúng chuyển sang hô hấp kỵ khí Quá trình này được gọi là quá trình lên men

Nấm men có hai hình thức sinh sản: sinh sản hữu tính (bằng bào tử) và sinh sản vô tính (bằng nảy chồi hoặc phân cắt tế bào) Nấm men sinh sản vô tính bằng nảy chồi hoặc

phân đôi tế bào, nhưng giữa quá trình này có thể sinh sản hữu tính xen kẽ hoặc ngược lại, nấm men đang sinh sản hữu tính có thể trở lại sinh sản vô tính

2.1.3 Tổng quan về Saccharomyces cerevisiae

(Meyen ex E.C Hansen, 1938)

Meyen mô tả vào năm 1938, tế bào S cerevisiae có dạng hình trứng, bầu dục…,

kích thước trung bình 3-6 x 5-12 µm, sinh sản bằng hình thức nảy chồi không theo qui luật, có thể xuất hiện từng cái một, từng đôi hoặc một chuỗi

Khuẩn lạc nấm men S cerevisiae có màu trắng nhạt, rìa tròn, lồi lên, bề mặt sáng lấp

lánh, đường kính 1-2 mm vào ngày thứ ba

Nấm men S cerevisiae phát triển tối ưu ở 33 - 35oC trong môi trường chứa 10 - 30% glucose Nhiệt độ tối thiểu là 4oC trong 10% glucose và 13oC trong 50% glucose, nhiệt độ tối đa là 38 - 39oC

Nấm men S.cerevisiae có khả năng lên men đường glucose, galactose, maltose,

saccharose, rafinose và dextrin đơn giản, không lên men lactose, mannitol, cellobise, xylose, không đồng hóa nitrate, không phân giải tinh bột Loài nấm men này có đặc điểm lên men đường từ tinh bột do chúng có thể lên men được những dextrin đơn giản (Lương Đức Phẩm, 2009)

Hình 2.1Hình thái nấm men S

cerevisiae dưới KHV quang học(http://en.wikipedia.org)

2.1.4 Cơ chế kháng aflatoxin

S cerevisiae làm giảm đáng kể sự nảy mầm của bào tử nấm A flavus, làm ức chế sự

phát triển của nấm mốc và làm giảm trọng lượng sợi nấm Điều này có thể là do sự hiện diện của các hợp chất thơm như axit hữu cơ, este, rượu, lactones và tecpen… được sản

xuất bởi S cerevisiaecó thể làm giảm quá trình lên men (Janssens và ctv, 1992; trích dẫn

bởi Al-Masri và ctv, 2011) Mặt khác,một nghiên cứu của Kusumaningtyas và ctv vào

năm 2006 đã chỉ ra rằng, khả năng làm giảm aflatoxin của S cerevisiae có thể do

mannanoligosaccharide trong vách tế bào hoặc sự hình thành các liên kết hydro và các tương tác Van der Waals giữa aflatoxin B1 và β-D-glucans Mannanoligosaccharide có thể liên kết chặt chẽ tới 88% aflatoxin

2.1.5 Vai trò của nấm men

Nhờ đặc tính không sinh ra các chất độc gây hại trong quá trình trao đổi chất nên nấm men được ứng dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm như sản xuất rượu, bia, nước giải khát có cồn, sản xuất men bánh mì, gây hương nước chấm, chế biến các thực phẩm sữa lên men cho người và làm thức ăn cho gia súc

Người ta còn sử dụng nấm men để sản xuất protein đơn bào, sản xuất vitamin,

enzyme… và đặc biệt loài Saccharomyces cerevisiae đang được sử dụng như một công cụ

đắc lực để mang các DNA tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của ngành công nghệ sinh học hiện đại

Tuy nhiên, một số nấm men dại có hại cho sản xuất, làm nhiễm các quá trình công nghệ và gây hư hỏng sản phẩm

2.2 Sơ lược về aflatoxin

Aflatoxin là hợp chất trao đổi thứ cấp, được tổng hợp từ các chủng nấm mốc chủ

yếu thuộc loài Aspergillus, tập trung chủ yếu vào 3 chủng Aspergillus flavus, A

parasiticus và A nomius Người ta đã xác định được rằng, sự tổng hợp các aflatoxin là sự

tác động qua lại của genotip của chủng nấm mốc và điều kiện môi trường ngoài

Aflatoxin là một loại độc tố nấm mốc được phát hiện đầu tiên vào năm 1960, khi gây bệnh trên gà Thổ Nhĩ Kỳ Trận dịch xảy ra làm chết hơn 10.000 gà con 3-6 tuần tuổi

ở miền Đông Nam nước Anh do thức ăn có chứa khô dầu lạc bị nấm mốc, với các triệu

chứng như biếng ăn, xả cánh, xù lông và chết sau 1 tuần, được đặt tên là bệnh X của gà Tiếp theo đó, hàng loạt các vật nuôi khác cũng được phát hiện là có thể bị nhiễm aflatoxin gồm heo, gà, khỉ, chó, trâu bò, ngựa Kết quả của các nghiên cứu chỉ ra rằng động vật được nuôi ở chế độ suy hoặc kém dinh dưỡng có khả năng nhiễm độc nhiều hơn động vật khỏe Ngoài ra, các công trình điều tra dịch tễ học ở các vùng khác nhau trên thế giới phát hiện, dân ở các vùng trong khẩu phần thức ăn hàng ngày có lạc có tỉ lệ dân số bị ung thư gan nhiều hơn các vùng khác Ngoài lạc, aflatoxin còn được tìm thấy trên nhiều loại lương thực, thực phẩm khác như gạo, bột, mì, ngô, đậu tương, hạt có dầu và sữa Theo Agag và ctv (2004), aflatoxin lây nhiễm cho người và động vật qua hai con đường chính: (1) ăn uống trực tiếp aflatoxin (chủ yếu là B1) trong các loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật như ngô, các loại hạt và các sản phẩm của nó bị nhiễm aflatoxin; (2) ăn uống aflatoxin có trong sữa và các sản phẩm của sữa, mô của động vật, trứng của gia cầm có tiêu thụ thức ăn bị ô nhiễm

Việc nhiễm aflatoxin không chỉ gây nhiễm độc chuỗi thực phẩm và những hậu quả nghiêm trọng trong sức khỏe người tiêu dùng, mà còn gây ra những tổn thất lớn về kinh tế

và thương mại

2.2.1 Cấu trúc và tính chất của aflatoxin

Năm 1962, Sargeant là người có công xác định các độc tố này, đó là một dạng dẫn xuất của difuranocoumarin Aflatoxin bao gồm 18 dạng hợp chất đa vòng bifuran như B1, B2, G1, G2, GM1, G2, G2a, M1, M2, M2a, GM2, P1, Q1, R0, RB1, RB2, AFL, FLH, AFLM và các dẫn xuất methoxy, ethoxy và acethoxy Phân tử aflatoxin gồm một gốc coumarin, 2 nhân furano và 1 vòng lacton (trích dẫn bởi Bùi Xuân Đồng, 2004)

Bốn loại aflatoxin chính thường gặp nhất là B1, B2, G1, G2 Các aflatoxin này có độc tính cao nhất, đồng thời cũng là các aflatoxin được tạo thành với số lượng nhiều nhất,

cả trong các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm cũng như môi trường lên men

Aflatoxin B1chứa một vòng lacton trong công thức phân tử, có màu huỳnh quang xanh da trời (blue), aflatoxin G1chứa hai vòng lacton trong công thức phân tử, có màu huỳnh quang xanh lá cây (green) Hai aflatoxin B2, G2 có công thức hóa học hoàn toàn giống aflatoxin B1, G1, chỉ khác là nối đôi trong vòng hidrofuran đã bị khử

Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hóa và gọi là aflatoxin M1 và aflatoxin M2 Aflatoxin M1 có huỳnh quang xanh tím, là hydroxy- 4 aflatoxin B1, aflatoxin M2 có

Rf thấp hơn và có huỳnh quang tím, là hydroxy- 4 aflatoxin B2

Các chủng A flavus thường sản xuất chỉ có hai aflatoxin B1 và B2, trong khi đó chủng A parasiticus có thể sản xuất tất cả các độc tố aflatoxin Aflatoxin M1 là chất

chuyển hóa của aflatoxin B1 trên người và động vật (trong sữa mẹ có thể phơi nhiễm tới mức ng) Aflatoxin M2 là chất chuyển hóa của aflatoxin B2 trong sữa của bò được cho ăn thức ăn nhiễm aflatoxin

Trong bốn loại aflatoxin thì aflatoxin B1 thường được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, tiếp theo là G1, trong khi đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn

không tan trong các dung môi hòa tan chất béo như n-hexan, ether ethylic, ether dầu hỏa Tính tan của aflatoxin trong nước dao động từ 10 - 20 mg/l

Các aflatoxin rất bền với nhiệt Chúng thường ít hoặc không bị phá hủy khi đun nấu thông thường Tuy nhiên, khi có độ ẩm và ở nhiệt độ cao vẫn có thể tiêu hủy aflatoxin trong một khoảng thời gian nhất định Aflatoxin dễ bị phá hủy bởi tia tử ngoại, đun trong nồi áp suất hoặc khi xử lý bằng các chất oxy hóa

Các aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài Điều này cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực kỳ thấp (khoảng 0,5 ng hay thấp hơn trên một vết ở sắc kí bản mỏng)

2.2.1.2 Tính chất hóa học của aflatoxin

Trong phân tử aflatoxin có vòng lacton nên dễ bị thủy phân khi có mặt của các base mạnh Tuy nhiên, khi acid hóa thì các aflatoxin lại được tái tạo.Đặc tính này là quan trọng trong quá trình chế biến thực phẩm, vì quá trình xử lý kiềm giúp làm giảm hàm lượng aflatoxin của các sản phẩm, mặc dù sự có mặt của protein, pH và thời gian xử lý có thể làm thay đổi kết quả Tuy nhiên, nếu chỉ xử lý kiềm nhẹ thì việc acid hóa sẽ làm phản ứng xảy ra theo hướng ngược lại

Nhiều tác nhân oxy hóa như hypochlorite natri, thuốc tím, chlorine, hydrogen peroxide, ozone và peborat natri phản ứng với aflatoxin và thay đổi các phân tử aflatoxin, một số phản ứng làm mất huỳnh quang

2.2.2 Cơ chế gây độc của aflatoxin

Aflatoxin B1 là phân tử ái lực mạnh với thành ruột, có trọng lượng phân tử thấp nên

dễ dàng hấp thu hoàn toàn sau khi ăn Khi đến ruột non, aflatoxin B1 sẽ nhanh chóng được hấp thu vào tĩnh mạch và ruột non, tá tràng

Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, aflatoxin tập trung vào gan nhiều nhất (chiếm khoảng 17% lượng aflatoxin của cơ thể), tiếp theo là ở thận, cơ, mô mỡ, tụy, lách và 80%

bị bài tiết ra ngoài trong khoảng một tuần và đáng chú ý là nó bài tiết qua tuyến sữa, gây bệnh cho thai nhi đang bú sữa mẹ Chu kì bán rã trong huyết tương là 36,5 phút, lượng phân phối là 14% trọng lượng cơ thể, giải phóng khỏi cơ thể là 1,25 L/kg/h Aflatoxin chủ yếu bài tiết trong vòng 48 giờ (Hendrickse, 1991; trích dẫn từ Verma, 2004)

Bảng 2.1Tính chất hóa – lý chủ yếu của các aflatoxin

Aflatoxin Công thức

Trọng lượng phân tử

Điểm nóng chảy (oC)

Độ quay cực quang học trong CHCl3

Màu huỳnh quang ở UV

Tác động lên sự tổng hợp acid nucleic: vòng α-, β-lacton không bão hòa trong phân

tử flatoxin gây ức chế tổng hợp DNA nhân tế bào, do đó nó làm rối loạn tăng trưởng bình thường của tế bào (Nexterin và Vixarinova, 1971; trích dẫn Dương Thanh Liêm và ctv, 2010) Ngoài ra, chính những vòng lacton này có hoạt tính gây ung thư

Tác động lên sự tổng hợp protein: tác động lên polysom làm ngăn sự kéo dài của chuỗi polypeptide hoặc kết thúc quá trình sao chép, dẫn đến giảm RNA ribosome và RNA thông tin (Clifford và ctv, 1967; trích dẫn Hồ Văn Út Hậu, 2010)

2.2.3 Tác hại của aflatoxin

Aflatoxin là chất độc nguy hiểm đối với các loài gia súc, gia cầm và con người Sự nhiễm độc aflatoxin được thể hiện qua hàng loạt các triệu chứng cấp tính hoặc mãn tính

Sự nhiễm độc mãn tính aflatoxin có tính di truyền theo ba kiểu: gây ung thư, quái thai và gây đột biến Tuy nhiên, mức độ độc hoàn toàn khác nhau, phụ thuộc vào giống loài, lứa

tuổi, giới tính,đường xâm nhập, trạng thái sức khỏe của cơ thể, tình trạng dinh dưỡng, mức và tần suất tiếp xúc

2.2.3.1 Ảnh hưởng của aflatoxin đối với thực vật

Aflatoxin xâm hại màng và chất gắn nội bào, làm biến mất ribosome, gia tăng các thể lưới và túi golgi, lưới nội chất cuốn lại, hình thành các thể tiểu bào, làm biến dạng các hạt và bản mỏng bên trong lục lạp

Tác dụng sinh lý học của aflatoxin lên thực vật bậc cao: ức chế sinh trưởng, ức chế

sự tổng hợp chất diệp lục Nếu như aflatoxin B1 ức chế sự sao chép DNA thể ty lạp thì

nó lại hầu như không làm biến đổi sự tổng hợp các protein trong mô thực vật bậc cao; nó không có tác dụng lên hoạt tính của peroxidaza

2.2.3.2 Ảnh hưởng của aflatoxin đối với động vật

Trong những điều kiện phù hợp, độc tố aflatoxin được sinh ra nhưng không đủ lượng để gây ngộ độc nặng Nó làm giảm khả năng hấp thụ dinh dưỡng, vật nuôi chậm tăng trưởng, còi cọc, làm tiêu tốn thức ăn, giảm khả năng miễn dịch, làm vật nuôi dễ mắc bệnh Độc tố còn gây hư hại tế bào gan, thận, gây ung thư làm tăng tỉ lệ chết ở thú non, suy giảm năng suất, sản lượng trứng.Trên các động vật thí nghiệm, nhiễm độc aflatoxin gây một loạt các triệu chứng cấp và mãn tính Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái chết của các động vật thí nghiệm, với các triệu chứng thường gặp như nhu mô gan, chảy máu gan, viêm cầu thận cấp Nhiễm độc mạn tính thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu và hoại tử nhu mô Loại mạn tính tác động tới yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến

Theo Osweiler (2005), hàm lượng rất thấp của aflatoxin có trong thức ăn, đôi khi ít hơn 1ppm, cũng có thể ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch, làm chảy máu và tổn thương gan Nếu độc tố ở liều cao hơn có thể gây chán ăn, lờ đờ, sốt xuất huyết, tiêu chảy và chết Tính nhạy cảm của động vật thay đổi theo loài và lứa tuổi Nhìn chung, động vật còn non (trước cai sữa) thường bị ảnh hưởng nhiều hơn động vật trưởng thành Cá hồi, vịt, gà tây

và lợn trước cai sữa là những loài nhạy cảm cao với độc tố aflatoxin, trong khi đó, gia súc, bò và cừu là những loài có khả năng kháng mạnh

Aflatoxin thường không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản hoặc không gây hư thai Tuy nhiên, động vật sơ sinh cũng có khả năng bị nhiễm do độc tố aflatoxin M1 được chuyển hóa từaflatoxin B1 có trong sữa của thú mẹ

2.2.3.3 Ảnh hưởng của aflatoxin đối với con người

Con người tiếp xúc với độc tố nấm mốc qua những nguồn khác nhau, có thể là sử dụng thực phẩm có nguồn gốc thực vật bị nhiễm độc tố hoặc các chất chuyển hóa của chúng (hiện diện trong sản phẩm động vật như sữa, thịt, trứng, cơ quan nội tạng) hay tiếp xúc với không khí, bụi có chứa độc tố Một hàm lượng nhỏ aflatoxin khi được con người tiêu thụ sẽ nhanh chóng hấp thụ trong đường tiêu hóa thông qua một quá trình thụ động

mà chưa tìm ra được cơ chế, sau đó nhanh chóng xuất hiện như là chất chuyển trong máu sau 15 phút và trong sữa 12 giờ sau khi ăn (Yiannikouris và Jouany, 2002; Moschini và ctv, 2006; trích dẫn bởi Lizarraga-Paulin và ctv, 2011)

Ngộ độc aflatoxin trên người thường được chia thành hai dạng: cấp tính và mãn tính Ngộ độc aflatoxin được xem là cấp tính khi hàm lượng aflatoxin được tiêu thụ ở mức cao Triệu chứng lâm sàng của ngộ độc cấp tính bao gồm nôn mửa, co giật và hôn

mê, hạ đường huyết, thoái hóa mỡ ở gan và thận, phù não, với tỉ lệ tử vong khoảng 25% Ngộ độc mãn tính thường xảy ra hơn, đó là khi tiêu thụ một lượng ít hoặc vừa phải aflatoxin Có nhiều nghiên cứu trước đó đã báo cáo rằng độc tố aflatoxin và các dẫn xuất của nó trong nước tiểu, máu và máu cuống rốn của con người có thể xâm nhập vào thai nhi (Denning và ctv, 1990; trích dẫn bởi Lizarraga-Paulin và ctv, 2011)

Gan là cơ quan đích của nhiễm độc aflatoxin Giai đoạn đầu, gan thoái hóa mỡ Trong tổ chức tế bào nhiễm nhiều hạt mỡ, tạo màu sắc vàng nhạt, mật sưng Sau đó gan sưng to lên, mật căng phồng và bắt đầu nổi các mụt nhỏ trên bề mặt gan, làm cho nó gồ ghề, đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng Cuối cùng gan trở nên bở, dễ bể do nhiễm khuẩn (Dương Thanh Liêm và ctv, 2002) Khi nhiễm độc thể mãn tính, thường xuất hiện các tế bào gan khổng lồ, nhân tế bào đột biến, phát triển dạng sợi trong nội ống và tăng sinh mô ống mật Do tế bào gan bị hư hại nên có sự gia tăng các enzyme SGOT, SGPT, sản sinh nhiều prothrobin làm giảm thời gian đông máu Hàm lượng albumin, globulin, cholesterol, ure trong máu cũng bị giảm (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

2.2.4 Các phương pháp phân tích độc tố aflatoxin

Có nhiều phương pháp vật lý, hóa học, sinh học để phát hiện aflatoxin trong thực phẩm.Tuy nhiên, do hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm rất thấp, nên để xác định chính xác hàm lượng độc tố aflatoxin cần phải chọn phương pháp phù hợp

Các phương pháp vật lý - hóa học chủ yếu dựa trên tính chất phát huỳnh quang ở bước sóng tử ngoại của aflatoxin Sắc ký là một trong những lĩnh vực quan trọng và hiện đại nhất của hóa học Aflatoxin có thể được phát hiện và định lượng bằng phương pháp sắc ký trên giấy với các hệ dung môi butanol - nước - acetic (20:1:19) hay chloroform - methanol (95:5) và sắc ký bản mỏng trên alumin, bột kieselguhl, bột cellulose với hệ dung môi chloroform - methanol (99:1 hay 93:7) hoặc chloroform - aceton (90:10 hay 85:15) Cũng có thể định lượng aflatoxin bằng sắc ký trên cột nhôm oxyd, cột silicagel với các dung dịch rửa là cloroform và hỗn hợp 5% methanol-cloroform Hiện nay, phương pháp phổ biến nhất cho phát hiện và định lượng aflatoxin với độ nhạy cao là sử dụng sắc

ký lỏng hiệu năng cao (High Pressure Liquid Chromatography -HPLC) với dung môi tách

là acetonitril

Bên cạnh đó, các phương pháp thử nghiệm sinh học cũng có khả năng phát hiện aflatoxin, bao gồm việc thử nghiệm trên vịt con một ngày tuổi, trên phôi gà, trên ấu trùng giáp xác, các loài thân mềm hoặc trên vi sinh vật để phát hiện độc tính của aflatoxin Trong số các đối tượng được áp dụng thì việc thử nghiệm trên vịt con một ngày tuổi được dùng nhiều nhất, vì vịt là một loài đặc biệt mẫn cảm với độc tố aflatoxin, do đó có thể phát hiện bằng phương pháp sinh học những lượng aflatoxin rất nhỏ Tuy nhiên, cách thử này cũng có một vài hạn chế: phải tổ chức nuôi vịt và con vật có thể nôn liều thuốc độc vừa được cho uống

Để hạn chế và kiểm soát aflatoxin trong công nghệ sau thu hoạch, nhiều biện pháp hạn chế hoặc giảm bớt hàm lượng aflatoxin cho nông sản bảo quản được áp dụng như xử

lý nhiệt với muối amoni, monomethylamin, natri hydroxyt, natri hypoclorit, H2O2 Bên cạnh đó, các biện pháp kiểm soát sinh học aflatoxin cũng rất hứa hẹn, bao gồm từ việc tạo giống cây trồng, vật nuôi kháng nấm, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật và kháng nấm trên đồng ruộng, và sau cùng là các biện pháp công nghệ gen nhằm vô hoạt gen sinh độc tố ở

nấm mốc Theo cách tiếp cận mới này, có thể phát triển việc sử dụng các chế phẩm enzym methyl transferase để phân giải tiền aflatoxin B1, tạo các giống nấm mốc cạnh tranh với nấm mốc sinh aflatoxin B1 bằng cách loại bỏ gen sinh độc tố của các chủng gốc và đưa chúng trở lại ổ sinh thái cạnh tranh với các chủng nấm hoang dại sinh độc tố, tạo vật nuôi, cây trồng với công nghệ tái tổ hợp DNA có gắn gen kháng nấm

2.2.5 Các quy định và tiêu chuẩn

Từ 1973, theo quy định của Cộng đồng chung Châu Âu và Mỹ, hàm lượng aflatoxin B1 cho phép trong các sản phẩm nông sản được kiểm soát ở mức 0,05 - 0,01 mg/kg cho các sản phẩm trung gian Năm 1988, quy định trên mở rộng cho nguyên liệu của ngành công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm, hàm lượng aflatoxin B1 không được vượt quá ngưỡng 0,2 mg/kg Quy định áp dụng cho các sản phẩm thực phẩm ở mức rất thấp: từ 0,01µg/kg (cho sữa trẻ em) đến 0,2 µg/kg (cho phomat) Trong khi đó, quy định về ngưỡng của aflatoxin B1 ở các nước châu Á và châu Phi nhìn chung ở mức 5 - 20 µg/kg quy định cho đa số các nông sản

Ở Việt Nam, theo Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia do Cục Chăn nuôi biên soạn năm

2009, quy định hàm lượng tối đa độc tố nấm mốc aflatoxin B1 trong thức ăn cho bê (dưới

6 tháng tuổi) là 50 µg/kg, cho bò thịt (trên 6 tháng tuổi) là 100 µg/kg; đối với lợn con từ 1

- 28 ngày tuổi là 10 µg/kg, nhóm lợn còn lại là 50 µg/kg; đối với gà con từ 1 - 28 ngày tuổi là 10 µg/kg, nhóm gà còn lại là 30 µg/kg Bên cạnh đó, hàm lượng tổng số các aflatoxin B1 + B2 + G1 + G2 theo quy định chỉ được cho phép trong khoảng 200 - 500 µg/kg đối với bò, trong khoảng 30 – 100 µg/kg đối với lợn và trong khoảng 30 - 50 µg/kg đối với gà Cũng theo Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về các chỉ tiêu vệ sinh an toàn và mức giới hạn tối đa trong một số nguyên liệu thức ăn chăn nuôi ban hành năm 2011 quy định, hàm lượng tổng số aflatoxin trong ngô không lớn hơn 200 µg/kg, trong thóc, tấm không lớn hơn 50 µg/kg, trong cám gạo các loại không lớn hơn 50 µg/kg, trong lúa mì và sản phẩm lúa mì không lớn hơn 100 µg/kg

Đối với các loại thực phẩm, Bộ Y tế cũng công báo thông tư về việc ban hành các Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm hóa học trong thực phẩm năm

2011 Quy chuẩn này nêu rõ, giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong các loại thực phẩm như ngũ