XÂY DỰNG QUY TRÌNH MUTIPLEX PCR PHÁT HIỆN PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2, HAEMONPHILUS PARASUIS ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE GÂY BỆNH HÔ HẤP PHỨC HỢP TRÊN HEO

Quy trình multiplex – PCR sau khi tối ưu hóa đã được ứng dụng khả thi trên mẫu thực địa, tuy nhiên chưa đạt được kết quả mong muốn trong việc phát hiện PCV2 nên cần có sự điều chỉnh nhỏ

Ngành Sinh vi Khóa

BỘ GIÁO D

ỌC NÔNG MÔN CÔN

háng 6/201

ĐÀO TẠO HÀNH PHỐ

ẫn khoa họ

YỄN TẤT TIẾN DUY

BỘ GIÁO D

ỌC NÔNG MÔN CÔN

Em xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng toàn thể quý thầy cô đã tận tâm tạo điều kiện thuận lợi nhất và truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như thực hiện khóa luận

Em xin chân thành biết ơn:

TS Nguyễn Tất Toàn và ThS Đỗ Tiến Duy đã hết lòng hướng dẫn, động viên

em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

BSTY Lê Thị Hạnh Dung và BSTY Nguyễn Phạm Huỳnh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực tập tốt nghiệp

Xin cảm ơn:

Ban quản lý Bệnh Viện Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM

Các anh chị đang công tác và cùng làm đề tài tốt nghiệp tại Bệnh Viện Thú Y

đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian thực tập

Tập thể lớp DH09SH đã quan tâm, giúp đỡ, động viên chia sẻ những vui buồn cùng tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận

Xin chân thành cảm ơn ĐOÀN THỊ NHUNG

Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình Multiplex-PCR phát hiện đồng thời 3

mầm bệnh chính như Porcine circovirus type 2 (PCV2), Haemophilus parasuis (HP),

Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) chính xác và hiệu quả Các kết quả nghiên

cứu đạt được gồm: (1) kiểm tra cả ba quy trình s-PCR phát hiện riêng lẻ PCV2, APP,

HP là hoàn toàn đặc hiệu; (2) quy trình m-PCR có nồng độ mồi tối ưu HPF-cysS, HPR-cysS; APPF-cpxA, APPR-cpxA; PCV2F-ORF2, PCV2R-ORF2 lần lượt là 0,5

µM, 0,5 µM; 0,5 µM, 0,5 µM; 1 µM,1 µM; (3) chu trình luân nhiệt của phản ứng PCR tối ưu như sau: tiền biến tính ở 95oC trong 5 phút; biến tính ở 94oC trong 30 giây; bắt cặp ở 56oC trong 1 phút; kéo dài ở 72oC trong 1 phút; giai đoạn kéo dài cuối cùng

m-ở 72oC trong 7 phút

Quy trình multiplex – PCR sau khi tối ưu hóa đã được ứng dụng khả thi trên mẫu thực địa, tuy nhiên chưa đạt được kết quả mong muốn trong việc phát hiện PCV2 nên cần có sự điều chỉnh nhỏ để ứng dụng khả thi hơn ngoài thực tiễn

SUMMARY

The study entitled "Development of multiplex-PCR to detect the porcine

Circovirus type 2 (PCV2), Haemophilus parasuis (HP), and Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) causes complex respiratory disease in swine" carried out

from 15/12/2012 to 30/06/2013 in molecular biology - the cell laboratory of Veterinary Hospital, Faculty of Animal Husbandry and Veterinary Sciences, Ho Chi Minh city Agriculture and Forestry University

This study aimed to develop a procedure of Multiplex-PCR for simultaneous

detection of three major pathogens such as porcine Circovirus type 2 (PCV2),

Haemophilus parasuis (HP), Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) accurately and

efficiently The research results achieved include (1) all three individual s-PCRs detected PCV2, APP, and HP were completely specific, (2) the m-PCR primer concentrations optimized HPF-cysS, HPR-cysS; APPF-cpxA, appr-cpxA; PCV2F-ORF2, PCV2R-ORF2 were 0.5 uM, 0.5 uM; 0.5 uM, 0.5 uM; 1 uM, 1 uM, respectively (3) m-PCR thermal cycling reaction optimized as follows: pre-denaturation at 95 °C for 5 minutes, denaturation at 94oC for 30 seconds, and annealing temperature at 56 °C in one minute, then extension at 72oC for 1 minute; final phase of last elongation for 7 minutes at 72oC This multiplex-PCR procedure after optimization was possible applications in field samples, however, a bit have not achieved the desired results in the detection of PCV2 then still need a minor adjustment to external applications more feasible in pratice

Keywords: multiplex PCR, Porcine circovirus type 2, Haemophilus parasuis,

Actinobacillus pleuropneumoniae, swine

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề: 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về bệnh do virut Porcine circovirus type 2 (PCV2) 3

2.1.1 Đặc điểm của Porcine circovirus type 2 (PCV2) 3

2.1.2 Dịch tễ học của Porcine circovirus type 2 (PCV2) 4

2.1.3 Bệnh liên quan đến Porcine circovirus type 2 (PCV2) 5

2.2 Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 5

2.2.1 Đặc điểm của Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 5

2.2.2 Dịch tễ học của Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 6

2.2.3 Cơ chế sinh bệnh của Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 6

2.2.4 Triệu chứng bệnh do Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 7

2.3 Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Haemophilus parasuis (HP) 7

2.3.1 Đặc điểm của Haemophilus parasuis (HP) 7

2.3.2 Dịch tễ học của Haemophilus parasuis (HP) 8

2.3.3 Cơ chế sinh bệnh của Haemophilus parasuis (HP) 8

2.3.4 Triệu chứng bệnh do Haemophilus parasuis (HP) 8

2.4 Tổng quan về bệnh hô hấp phức hợp 9

2.5 Polymerase chain reaction (PCR) 10

2.5.1 Định nghĩa phản ứng PCR 10

2.5.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR 10

2.5.3 Các thành phần của phản ứng PCR 11

2.5.4 Đọc kết quả phản ứng PCR 11

2.5.5 Ứng dụng của kỹ thuật PCR 12

2.5.6 Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật PCR 12

2.6 Phản ứng Multiplex – PCR 13

2.7 Quy trình ly trích DNA 14

2.8 Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ quang 15

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Vật liệu 17

3.2.1 Nguyên liệu 17

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 17

3.2.3 Hóa chất 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Kiểm tra độ đặc hiệu của các mồi 19

3.3.2 Phản ứng s-PCR phát hiện Haemophilus parasuis (HP) 19

3.3.3 Phản ứng s-PCR phát hiện Porcine circovirus type 2 (PCV2) 20

3.3.4 Phản ứng s-PCR phát hiện Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 20

3.3.5 Xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện PCV2, APP, HP 21

3.3.5.1 Kiểm tra khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp giữa các mồi 21

3.3.5.2 Đánh giá khả năng hoạt động của mồi 21

3.3.5.3 Xác định nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng m-PCR 22

3.3.5.4 Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng m-PCR 23

3.3.5.5 Xác định nồng độ DNA tối thiểu phát hiện bởi phản ứng m-PCR 24

3.3.5.6 Ứng dụng quy trình m-PCR đã tối ưu trên mẫu thực địa 24

3.3.5.7 Điện di sản phẩm PCR 25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của các mồi 26

4.2 Kết quả thực hiện phản ứng s-PCR phát hiện HP 28

4.3 Kết quả thực hiện phản ứng s-PCR phát hiện PCV2 30

4.4 Kết quả thực hiện phản ứng s-PCR phát hiện APP 31

4.5 Kết quả xây dựng quy trình m-PCR phát hiện đồng thời PCV2, APP, HP 32

4.5.1 Kết quả kiểm tra khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp giữa các mồi 32

4.5.2 Kết quả đánh giá khả năng hoạt động của mồi 33

4.5.3 Kết quả xác định nồng độ mồi tối ưu 34

4.5.4 Kết quả xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 35

4.5.5 Kết quả xác định nồng độ DNA tối thiểu phát hiện bởi phản ứng m-PCR 36

4.5.6 Kết quả áp dụng quy trình m-PCR trên mẫu bệnh 36

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

5.1 Kết luận 39

5.2 Đề nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APP Actinobacillus pleuropneumoniae

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetate

HP Haemophilus parasuis

m-PCR Multiplex polymerase chain reaction

PCR polymerase chain reaction

PCV2 Porcine circovirus type 2

PMWS Post – Weaning Wasting Syndrome

s-PCR Single polymerase chain reaction

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng s-PCR và m-PCR 18

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng s-PCR phát hiện HP 19

Bảng 3.3 Chu trình luân nhiệt phản ứng s-PCR phát hiện HP 19

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng s-PCR phát hiện PCV2 20

Bảng 3.5 Chu trình luân nhiệt phản ứng s-PCR phát hiện PCV2 20 

Bảng 3.6 Thành phần phản ứng s-PCR phát hiện APP 21

Bảng 3.7 Chu trình luân nhiệt phản ứng s-PCR phát hiện APP 21

Bảng 3.8 Thành phần phản ứng m-PCR đánh giá khả năng hoạt động của mồi 22

Bảng 3.9 Chu trình luân nhiệt m-PCR đánh giá khả năng hoạt động của mồi 22

Bảng 3.10 Thành phần phản ứng m-PCR xác định nồng độ mồi 23

Bảng 3.11 Thành phần phản ứng m-PCR xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 23

Bảng 3.12 Chu trình luân nhiệt xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 24

Bảng 3.13 Nồng độ DNA với các lần pha loãng 24

Bảng 4.1 Các đặc tính cơ bản của các cặp mồi 26

Bảng 4.2 Các cấu trúc thứ cấp mang năng lượng tự do thấp nhất 27

Bảng 4.3 Các cấu trúc thứ cấp giữa các mồi mang năng lượng tự do thấp nhất 32

Bảng 4.4 Kết quả phản ứng m-PCR và s-PCR trên các mẫu thực địa 37

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Phản ứng multiplex PCR 13

Hình 3.1 Bố trí khảo sát 18

Hình 4.1 Kết quả s-PCR của HP 28

Hình 4.2 Kết quả BLAS sản phẩm của phản ứng s-PCR phát hiện HP 29

Hình 4.3 Kết quả s-PCR của PCV2 30

Hình 4.4 Kết quả BLAS sản phẩm của phản ứng s-PCR phát hiện PCV2 31

Hình 4.5 Kết quả s-PCR của APP 31

Hình 4.6 Kết quả đánh giá khả năng hoạt động của mồi 33

Hình 4.7 Kết quả xác định nồng độ mồi tối ưu 34

Hình 4.8 Kết quả xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 35

Hình 4.9 Kết quả xác định nồng độ DNA tối thiểu phát hiện bởi phản ứng m-PCR36 Hình 4.10 Kết quả áp dụng quy trình m-PCR trên các mẫu bệnh học 37

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngành chăn nuôi heo chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu, đặc biệt ngành chăn nuôi heo ở nước ta là một trong những ngành chăn nuôi chủ chốt, chiếm 58% GDP nông nghiệp hằng năm (FAO, 2012) Hiện nay ngành chăn nuôi đang đối mặt với nhiều dịch bệnh nguy hiểm ảnh hưởng đến năng suất đàn heo, gây tổn thất

kinh tế nặng nề Trong đó, viêm phổi đa màng thanh dịch do Haemophilus parasuis (HP), hội chứng còi cọc trên heo cai sữa (PMWS) do Porcine circovirus type 2 (PCV2) và viêm phổi, viêm màng phổi do Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)

được xem là những bệnh phổ biến nhất trên heo

Theo Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2006) cho biết tỉ lệ huyết thanh dương tính với PCV2 ở một số tỉnh thành phía nam Việt Nam tăng dần qua các năm: 38,97 (2000); 84,90% (2003-2004) 90,26% (2005) Lê Tiến Dũng (2006) khảo sát trên 22 trại chăn nuôi tại địa bàn Tp Hồ Chí Minh thì có đến 17 trại phát hiện dương tính với PCV2 Ở nước ngoài, theo kết quả phân tích 219 mẫu phổi lấy từ lò mổ ở Slovakia, có 14,2% dương tính APP và 0,91% dương tính với HP (Hicinova , 2010)

Việc chẩn đoán các mầm bệnh bằng kỹ thuật PCR cho kết quả nhanh chóng, chính xác, đặc hiệu, ít tốn kém và phù hợp với điều kiện nghiên cứu và ứng dụng ở nước ta Các nghiên cứu trước đây chỉ nghiên cứu quy trình PCR thường quy để phát hiện một loại mầm bệnh Việc phát triển kỹ thuật Multiplex PCR là hết sức cần thiết

để chẩn đoán nhanh cùng lúc nhiều mầm bệnh với độ đặc hiệu cao Xuất phát từ thực tiễn trên, được sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và Khoa Chăn Nuôi – Thú

Y và dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Tất Toàn và ThS Đỗ Tiến Duy, chúng tôi

thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện Porcine circovirus type

2 , Actinobacillus pleuropneumoniae , Haemophilus parasuis gây hô hấp phức hợp

trên heo”

1.2 Yêu cầu của đề tài

Tìm ra quy trình multiplex PCR có tính ưu việt để phát hiện đồng thời ba mầm bệnh PCV2, APP, HP để phục vụ cho nhu cầu chẩn đoán các mầm bệnh này ở phòng xét nghiệm

1.3 Nội dung thực hiện

Thực hiện quy trình s-PCR thường quy cho việc phát hiện từng mầm bệnh là PCV2, APP, HP

Đánh giá khả năng hoạt động giữa các mồi đặc hiệu cho PCV2, APP, HP Xác định nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng m-PCR phát hiện HP, APP, PCV2 Xác định chu trình luân nhiệt tối ưu cho quy trình m-PCR phát hiện HP, APP, PCV2

Áp dụng quy trình m-PCR phát hiện HP, APP, PCV2 trên những mẫu thu thập

từ thực địa

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về bệnh do virut Porcine circovirus type 2 (PCV2)

Porcine circovirus type 2 - PCV2 được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1991 trên

đàn heo phía tây Canada, kháng thể chống PCV2 đã được phát hiện trong huyết thanh

Từ những nghiên cứu cho thấy PCV2 khi gây nhiễm trên heo, heo có một số biểu hiện tổn thương đặc trưng của hội chứng còi cọc trên heo cai sữa (Postweaning multisystemic Wasting Syndrome – PMWS) (Allan và ctv, 1998; Chea, 2004) PCV2

là nhân tố sơ khởi nhưng không phải là duy nhất gây ra PMWS mà nguyên nhân gây

bệnh là do sự nhiễm thứ cấp của một số vi khuẩn và virut như Porcine parvovirus, procine reproductive and respiratory syndrome - PRRSV, Mycoplasma hyopneumonia

Ngoài ra, PCV2 cũng có thể được phát hiện trên heo khỏe, do đó việc chuẩn đoán PMWS phải đảm bảo 3 yêu cầu: dấu hiệu bệnh lâm sàng đặc trưng trên heo, bệnh tích

vi thể đặc trưng và PCV2 có hiện diện trong mẫu bệnh phẩm từ heo đó (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Một số nghiên cứu còn cho thấy việc nhiễm PCV2 cũng liên quan đến hội chứng viêm da thận (PDNS – Porcine Dermatitis And Nephropathy Syndrome), hội chứng hôi hấp phức hợp trên heo (PRDC – Porcine Respiratory Disease Complex) (Gresham và ctv, 2000)

2.1.1 Đặc điểm của Porcine circovirus type 2 (PCV2)

Bộ gen của PCV2 có kích thước là 1767 – 1768 bp (Mahe và ctv, 2000), có 6 khung đọc mở, trong đó có hai khung đọc mở lớn nhất là: ORF1 và ORF2 Đây là vùng được xem là cần thiết cho sự nhân lên của virut PCV tái bản thông qua dạng mạch kép trung gian (Meehan và ctv, 1998) Các chủng phân lập của PCV2 có nhiều kiểu gen khác nhau và được xếp vào 4 nhóm: PCV2a, PCV2b, PCV2c, PCV2d (Guo

và ctv, 2010)

Gen ORF1 của PCV2 có kích thước là 942 bp và mã hóa cho protein liên quan đến sự nhân lên của virut, sản phẩm protein mã hóa có kích thước 35,7 kDa (Mandezt

và ctv, 1998) Gen ORF1 còn được gọi là rep gene

Gen ORF2 của PCV2 có kích thước khoảng 702 bp, mã hóa protein vỏ capsid, còn được gọi là protein vỏ cap với kích thước 30 kDa (Hamel và ctv, 1998; Nawagitgul và ctv, 2000) Khi giải mã trình tự gen ORF2 của vỏ capsid virut, những

phân lập gen ORF2 ở các nơi trên thế giới có độ tương đồng cao (Larochelle và ctv, 2002; Kamstrup và ctv, 2004) Mặc dù có một số khác biệt về gen ORF2 nhưng vùng gen mã hóa đầu N cuối (N-terminal region) của ORF2 gần như không thay đổi ở các chủng phân lập virut trên thế giới (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Theo các nghiên cứu, protein cap kích thích sự hình thành khác thể trung hòa có trong huyết thanh (Nawagitgul và ctv, 2000) Do đó protein này là một protein triển vọng trong việc phát triển các vaccine tái tổ hợp (Blanchard và ctv, 2003; Kamstrup và ctv, 2004) hay dùng làm kháng nguyên trong các phản ứng huyết thanh học (Nawagitgul và ctv, 2002; Blanchard và ctv, 2003; Liu và ctv, 2004; Shang và ctv, 2008)

Ngoài ra ORF3 cũng được nghiên cứu gần đây Gen ORF3 có kích thước 315bp, mã hóa protein có kích thước 11,8 kDa (Liu và ctv, 2005) Gen ORF3 không cần thiết cho sự tái bản của virut nhưng có vai trò trong sự lan truyền của PCV2 Gen ORF3 liên quan đến hiện tượng apoptosis và là tác nhân virut gây bệnh trên chuột (Liu

và ctv, 2005; trích dẫn Phạm Thanh Hồng, 2012)

2.1.2 Dịch tễ học của Porcine circovirus type 2 (PCV2)

Người ta đã chứng minh có sự lây truyền ngang PCV2 qua tiếp xúc trực tiếp miệng - mũi của những heo còn nhỏ Các chuồng lân cận có thể lan truyền virus PCV2 qua khí dung Thực nghiệm đã cho thấy, trộn lẫn heo khỏe với heo bệnh PMWS hoặc nuôi trong những ô chồng cạnh nhau chỉ sau 3 - 4 tuần đã phát hiện những heo khỏe đều mắc bệnh PMWS (Kristensen và ctv, 2006) Hình thức lan truyền ngang xảy ra ngay cả khi heo nhiễm PCV2 không biểu hiện triệu chứng lâm sàng và bệnh tích liên quan

Truyền dọc được chứng minh trên những cá thể nái trong tự nhiên cũng như trong thí nghiệm (Johnson và ctv, 2002) West và ctv (1999) và Meehan và ctv (2001) nhận thấy rằng có sự lây nhiễm từ heo mẹ bị nhiễm qua heo con ngay sau khi sinh bằng cách phân lập PCV2 từ mẫu mô thai chết PCV2 cũng được phát hiện trong tinh dịch những heo đực nhiễm bệnh và sẽ truyền lây khi giao phối (Kim và ctv, 2001)

Ngoài ra, PMWS còn có thể truyền lây thông qua động vật trung gian như chim, chuột (Kackinnon, 2000), qua thức ăn có chứa sản phẩm heo nhiễm PCV2 chưa được làm chín (Opriessnig, 2006) Trong các trại chăn nuôi, PMWS có thể tồn tại rất dai dẳng từ 4 - 18 tháng Virut PCV2 có thể tồn tại trong heo mang trùng từ 5 - 6 tháng (trích dẫn Phạm Thanh Hồng, 2012)

2.1.3 Bệnh liên quan đến Porcine circovirus type 2 (PCV2)

Biểu hiện lâm sàng thường xảy ra trên heo từ 1 - 2 tuần cai sữa với diễn biến chậm và có thể kéo dài trong vài tháng (Harding, 1997) Heo mắc PMWS thường gặp nhất là còi cọc và viêm phổi mãn tính (thở gấp, khó thở) Heo đang bình thường trở nên xanh xao, gầy ốm nhanh trong vòng 3 - 7 ngày và xuất hiện những con gầy nhất đàn Một số heo ho nhẹ, sốt, biếng ăn, khó thở, hoàng dản, rối loạn thần kinh trug ương, viêm kết mạc và tiêu chảy nhẹ Heo bệnh có thể chết nhưng không chết ngay, số còn lại trong đàn khỏe mạnh và phát triển bình thường, tỉ lệ heo bệnh trong đàn có thể

từ 3 - 50 %, tỉ lệ chết có thể lên đến 80 % trong số những heo nhiễm

Ngoài triệu chứng gây còi, heo trong những trại bị PMWS có biểu hiện đặc chưng khác là viêm da Những đốm đỏ hồng thường xuất hiện không đều ở chân trước, vùng chậu, vùng mông và bụng nếu bênh kéo dài da trở nên cứng những heo bệnh có

tỉ lệ chết cao do tổn thương thận nặng những heo qua khỏi thường biểu hiện suy nhược, đây là dấu hiệu của việc viêm da sưng thận cũng do PCV2 gây ra (trích dẫn Bùi Thị Kim Hằng, 2010)

2.2 Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)

Vào năm 1902, Ligniere và Spritz đã mô tả căn bệnh nhưng chưa hề đề cập ở nước ta Hiện nay, APP đã xuất hiện ở Việt Nam và trong nền chăn nuôi công nghiệp

Úc, APP được xem là nguyên nhân chính gây viêm màng phổi trên Heo (Mireya, 2004; trích dẫn Phạm Đức Hiền, 2005) Heo là ký chủ tự nhiên duy nhất của bệnh này,

có mức độ truyền lan bệnh rất cao từ đàn này sang đàn khác qua các phương tiện vận chuyển MasInnes và Rosendal, (1988) Triệu chứng do APP rất thay đổi, có thể gây chết hoặc mãn tính hoặc không có triệu chứng

APP gây bệnh trên đường hô hấp của heo là vi khuẩn Gram âm, hình que có vỏ bọc, trực khuẩn có capsule, không di động, không lông rung, không nha bào, kị khí tùy nghi APP biovar 1 chia thành 12 loại serovar Serovar 5 chia thành 2 type 5A và 5B tính đặc hiệu của huyết thanh được xác định bởi lớp vỏ polysaccharide và lipopolysaccaride của màng tế bào (trích dẫn Lê Kim Sơn, 2004)

2.2.1 Đặc điểm của Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)

Yếu tố quan trọng tạo nên độc lực của vi khuẩn APP là ngoại độc tố, lipopolysaccharide và capsule Chúng đóng vai trò bảo vệ và nhận diện kháng nguyên APP Các yếu tố độc lực được tóm tắt như sau:

Ngoại độc tố: liên quan đến dấu hiệu lâm sàng (Rosedal và ctv, 1980) dịch huyền phù từ APP có thể gây hoại tử và xuất huyết kết hợp với viêm màng phổi Ở nồng độ cao, độc tố APP là cytolysin có khả năng phân giải hồng cầu và giết chết các

tế bào lympho, tế bào biểu mô, lympho T và đại thực bào (Macinnes và Smart, 1993, trích dẫn Quách Thanh Sinh, 2005)

Lipopolysaccharide (LPS) là thành phần chủ yếu cấu tạo nên màng bên ngoài của APP và có khả năng gây hư hại mô LPS tinh khiết có khả năng gây hư hại phổi khác với những tổn thương do xuất huyết và hoại tử do nhiễm APP (Udeze và cs, 1987) Sự tương tác giữa LPS và ngoại độc tố làm tăng độc lực của APP (Izana, 1991)

Vỏ capsule của APP đóng vai trò quan trọng trong việc phòng thủ chống lại hệ thống miễn dịch của vật chủ (Macinnes và Smart, 1993) Capsule APP có tính kháng nguyên yếu (Fenwick và Osburn, 1986; Inzana và Mathison, 1987), vai trò chính là bảo vệ vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi bổ thể trong trường hợp có và không có kháng thể capsule đặc hiệu (Inzana và ctv, 1988) Các serovar có capsule lớn thì có độc lực cao hơn (IJensen và Bertran, 1986)

2.2.2 Dịch tễ học của Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)

APP không tồn tại lâu trong môi trường xung quanh, đăc biệt trong môi trường khô ráo APP có thể truyền trực tiếp từ heo bệnh sang heo nhạy cảm (Wilson và ctv, 1987) hay truyền qua các dụng cụ chăn nuôi, và phương tiện đã bị nhiễm chất tiết của heo bệnh (Nicolet, 1992) Thời gian ủ bệnh rất thay đổi, trong thực nghiện thời gian từ lúc biểu hiện bệnh đến khi chết khoảng giờ đến vài ngày Bệnh xảy ra ở nhiều lứa tuổi nhưng nhạy cảm nhất là heo choai Trong heo nhiễm bệnh APP trú ẩn ở hạch hạnh nhân, xoang mũi và vùng phổi bị tổn thương ( trích dẫn Phạm Đức Hiền, 2005)

2.2.3 Cơ chế sinh bệnh của Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)

Gây bệnh thực nghiệm chỉ ra rằng vi khuẩn sinh sống ở hạch hạnh nhân và định

cư vào biểu mô phế nang Trong tự nhiên vi khuẩn kết bám nhờ fimbriae Trong phổi,

A pleuropneumoniae bị thực bào nhanh chóng bởi các đại thực bào phế nang và sản

sinh độc tố ApxI, ApxII và ApxIII Tất cả các độc tố đó đều độc tiềm tàng cho đại thực bào, tế bào nội mô, tế bào biểu mô của phế nang và tế bào nội bì của mao mạch ở thành phế nang Vi khuẩn được bảo vệ bởi hiện tượng đại thực bào nhờ lớp vỏ của chúng và cũng đề kháng với hoạt động của bổ thể (Rycroft và Cullen, 1990) Cảm nhiễm đi cùng với các cytokine chẳng hạn như interleukin-1β và IL-8 trong dịch phế

nang, và các yếu tố hoại tử bướu (TNF) cũng xuất hiện trong mô bệnh tích rất sớm (Baarsch và ctv,1995, trích dẫn Ngô Phương Nghi, 2003)

2.2.4 Triệu chứng bệnh do Actinobacillus pleuropneumoniae (APP)

Triệu chứng thay đổi theo thú, tình trạng miễn nhiễm của chúng, điều kiện môi trường và mức độ bộc phát của yếu tố gây bệnh Bệnh có thể chia làm 3 dạng quá cấp, cấp tính, mãn tính

Trong thể quá cấp, một hay nhiều heo trong bầy hoặc khác bầy đột ngột yếu ớt với thân nhiệt cao 41,5oC, có thời kỳ ói mửa tiêu chảy, chảy máu mũi, miệng Thú bệnh nằm dẹp không có triệu chứng hô hấp nhưng tim và tuần hoàn yếu Thú chết trong vòng 24 - 36 giờ, trước khi chết trong miệng có nhiều dịch tiết lẫn bọt máu

Trong thể cấp tính, thân nhiệt tăng 40,5 - 41oC Thú khó chịu và hôn mê, triệu chứng hô hấp trầm trọng với khó thở, ho và đôi khi há miệng để thở, tuần hoàn và tim yếu, tụ máu ở các phần thấp

Trong thể bán cấp và mãn tính, thú sốt hoặc ho liên tục hoặc ngắt quãng với cường độ khác nhau, thú ít ăn, giảm tăng trọng, thể mãn tính thường chỉ phát hiện lúc giết mổ với bệnh tích đặc trưng của phổi Bệnh mãn tính là nguyên nhân lây lan mần bệnh giữa các đàn (Taylor, 1999; trích dẫn Phạm Đức Hiền, 2005)

2.3 Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Haemophilus parasuis (HP)

Haemophilus parasuis là vi trùng gây bệnh truyền nhiễm trên đường hô hấp với

đặc điểm là ho, khó thở, thở ngồi kiểu chó ngồi, viêm đa khớp, viêm phổi dính sườn, viêm tràn dịch, viem màng não và có thể dẫn đến chết căn bênh được Glasser phát hiện đầu tiên vào năm 1910, trên những heo viêm đa khớp – viêm thanh dịch, căn bệnh

đã được Hiare và Wramby nghiên cứu năm 1943 và đặt tên haemophilus suis Bệnh xảy ra ở hầu hết đàn heo trên thế giới, tỉ lệ mắc bệnh từ 30 – 100 %, tỉ lệ chết có thể là

5 – 10 % (Trần Thanh Phong, 1996)

2.3.1 Đặc điểm của Haemophilus parasuis (HP)

Haemophilus parasuis là vi khuẩn có hình trực khuẩn, gram âm, có tiêu mao và

giáp mô, hiếu khí hay hiếm khí tùy nghi, nhiệt độ thích hợp là 37oC và pH 7,4 - 7,8

Vi khuẩn có sức đề kháng kém, dễ bị tiêu diệt bởi các chất sát trùng thông thường, nhạy cảm với sự khô hạn và ánh sáng mặt trời Những yếu tố stress như thay đổi thời tiết, thức ăn, cai sữa,.thường là yếu tố mở đường cho sự phát triển của bệnh Tính sinh

bệnh của HP liên quan tới protein 39 Kda của màng ngoài, độc tố dung giải tế bào (Cytotoxin) đã được đề cập nhưng chưa được xác định (Trần Thanh Phong, 1996)

2.3.2 Dịch tễ học của Haemophilus parasuis (HP)

Heamophilus parasuis gây viêm màng phổi, viêm phế quản phổi, viêm đa thanh

dịch trên heo, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức sống và sức tăng trọng của heo Việc lây truyền có thể qua tiếp xúc trực tiếp, qua những giọt khí dung và cũng có thể lây truyền gián tiếp qua công nhân trong trại Bệnh cấp tính có thể xảy ra ở nhiều ô chuồng, do khí dung và không khí chuyển động làm lan truyền mầm bệnh, chỉ cần một

lượng nhỏ Heamophilus parasuis khoảng 102 - 104 cũng đủ để gây nhiễm

Miễn dịch từ mẹ truyền giảm sau 2 - 4 tuần, vì vậy thời kỳ này bệnh có thể xảy

ra trên heo 2 - 15 tuần, nhưng heo thời kỳ cai sữa 5 - 8 tuần tuổi thường mắc phải, tỉ lệ

tử vong là 5 – 10 % và có thể lên tới 50 % Có nhiều hơn một serotype có thể gây bệnh cho một đàn và có nhiều serovars không độc lực ở mũi heo Miễn dịch thường chỉ chống với serovars nhiễm, đối với serovars khác thì kém (Trần Thanh Phong, 1996)

2.3.3 Cơ chế sinh bệnh của Haemophilus parasuis (HP)

Các yếu tố gây stress như thay đổi thời tiết, vân chuyển, thay đổi thức ăn, cai sữa, là yếu tố mở đường cho bệnh phát triển nhanh Sau khi xâm nhập qua đường hô

hấp vào phổi, vi khuẩn cư trú và nhân lên ở phế nang, sau 12 giờ ủ bệnh Heamophilus

parasuis vào máu và gây bại huyết (septicemia) và hậu quả là gây viêm thanh lịch,

viêm đa khớp, viêm màng não có mủ, khi cảm nhiễm qua đường phế quản có thể gây

viêm khí quản phổi, Haemophilus parasuis nhân lên ở niêm mạc phế quản hơn là tế

bào có tiêm mao đường hô hấp Triệu chứng bệnh xuất hiện rất sớm sau khi nhiễm với biểu hiện sốt và suy hô hấp ở trường hợp phổi bị cấp tính phổi bị phù và xuất huyết, biểu hiện rõ viêm màng phổi nhiều sợi huyết (Nguyễn Trung Ngoan, 2005)

2.3.4 Triệu chứng bệnh do Haemophilus parasuis (HP)

Triệu chứng bệnh có thể thay đổi tùy theo sức khỏe và khả năng miễn nhiễm của thú, môi trường và mức độ bộc phát của của yếu tố gây bệnh

Ở thể cấp tính bệnh có thể xảy ra trên heo 3 - 6 tuần tuổi, ở một hay nhiều heo trong cùng một bầy hoặc khác bầy thú đột nhiên yếu ớt, sốt với thân nhiệt 40 - 41,5oC Heo bỏ ăn, có triệu chứng hô hấp, ho, khó thở, thở thể bụng, đặc biệt heo bị khập khiễng hoặc ngồi kiểu chó ngồi, hầu hết các khớp đều sưng phồng và đau đớn, có thể

thấy thủy thũng ở mi mắt, ở tai và mặt Thú sẽ chết trong vòng 2 - 5 ngày, hiếm khi có heo chết mà không có heo chết mà không có đỏ đến tím xanh trên da

Ở thể mãn tính sẽ phát triển khi biểu hiện bệnh cấp tính biến mất sau 5 ngày, những heo sống sót sẽ chuyển qua viêm khớp mãn tính, viêm nội tâm mạc, viêm dính ruột, viêm màng não Heo mãn tính có thể chết đột ngột (Nguyễn Trung Ngoan, 2005)

2.4 Tổng quan về bệnh hô hấp phức hợp

Thuật ngữ bệnh hô hấp phức hợp được sử dụng để mô tả viêm phổi do nhiều nguyên nhân trên heo phổ biến ở giai đoạn15 đến 20 tuần tuổi, các tác nhân gây bệnh chính là các tác nhân vi - rút như PRRSV, SIV, PRV, PRCV, PCV2 và các tác nhân vi

khuẩn như Mycoplasma hyopneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus

pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis, Streptococcus suisvà Arcanobacterium pyogenes Ngoài các tác nhân gây bệnh đã biết từ lâu, một số

tác nhân gây bệnh mới nổi cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của bệnh

hô hấp phức hợp Sự xuất hiện của PRRSV vào cuối những năm 1980 dẫn đến những thay đổi đáng kể trong tình trạng sức khỏe của heo trên khắp thế giới Ngoài PRRSV, còn có PCV2, PRCV và những sub - type mới của SIV (H3N2) cũng góp phần làm cho bệnh hô hấp trở nên ngày càng phức tạp (Bùi Thị Hương Linh, 2013)

Cơ chế gây bệnh cụ thể của bệnh hô hấp phức hợp chưa thực sự rõ ràng Yếu tố độc lực của vi khuẩn và vi - rút giúp chúng vượt qua hàng rào bảo vệ tự nhiên ở đường

hô hấp và gây bệnh cho vật nuôi Cơ chế làm thay đổi cấu tạo của hệ thống bảo vệ đường hô hấp do các tác nhân gây bệnh chính chưa được hiểu một cách cặn kẽ mà qua bệnh lý mô học cho thấy sự hư hại tế bào biểu mô hoặc mô phổi, thay đổi chức năng của các đại thực bào phổi, tăng tiết adhesins mà có thể được sử dụng bởi các vi khuẩn khác đểtấn công tế bào biểu mô đường hô hấp Một số tác nhân gây bệnh có thể kết hợp với nhau để phá vỡ hệ thống phòng thủ làm cho đường hô hấp nhạy cảm với các

vi sinh vật gây bệnh khác (Susan và ctv, 2002)

Phân loại mầm bệnh theo tác nhân gây bệnh chính và tác nhân gây bệnh cơ hội (Susan và ctv, 2002) Tác nhân gây bệnh chính có khả năng phá vỡ cơ chế bảo vệ và tạo sự nhiễm trùng trên cơ thể vật chủ Các tác nhân gây bệnh cơ hội xâm nhập và gây bệnh khi cơ thể bị giảm sức đề kháng bởi tác nhân gây bệnh chính Một vài tác nhân vi khuẩn có thể hoạt động với vai trò vừa là nguyên nhân chính vừa là cơ hội tùy thuộc vào từng tình huống

Ngoài ra, bệnh hô hấp phức hợp còn là hậu quả của các tác nhân không nhiễm trùng Nguyên nhân không nhiễm trùng (quản lý và các yếu tố môi trường) góp phầngia tăng bệnh trên đường hô hấp, bằng cách làm tăng sự lây lan của các mầm bệnh, tạo ra “stress” cho heo do điều kiện sống không thuận lợi Trong 30 năm qua, ngành chăn nuôi đã phát triển với quy mô đàn lớn hơn với mật độ nuôi nhốt caovà hệ thống thông gió không phù hợp có thể dẫn đến quá nóng hoặc lạnh, tăng stress và tăng nồng độ amoniac và bụi, gây tác động tiêu cực đối vớihàng rào phòng thủ củahệ hô hấp Trong các trại, sự pha trộn heo từ nhiều nguồn và nhóm tuổi khác nhau cũng đóng góp vào sự lây lan của bệnh (Susan, 2002; trích dẫn Bùi Thị Hương Linh, 2013)

2.5 Polymerase chain reaction (PCR)

2.5.1 Định nghĩa phản ứng PCR

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzym DNA polymerase và một cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA này Nhờ enzym DNA polymerase xúc tác trên các mạch khuôn DNA tổng hợp nên các mạch đơn mới Các mạch đơn mới được tổng hợp lại được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp mạch mới của chu kỳ tiếp theo Sự tổng hợp mạch đơn DNA mới cần có sự tham gia của các primer tạo các nhóm 3’ OH tự do Các nucleotid được gắn ở vị trí nhóm OH kéo dài tạo thành mạch đơn mới (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

2.5.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính, nhiệt độ được nâng lên 95oC ở nhiệt độ này, tất cả các đoạn soắn kép của DNA đều được tách ra Có thể biến động trong khoảng từ

93 - 100oC

Giai đoạn 2: là giai đoạn lai, hạ nhiệt độ phản ứng xuống (thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được sử dụng 3 - 5oC) cho phép các mồi bắt cặp với DNA khuân mẫu mức dao động vào khoảng 40 - 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

Giai đoạn 3: là giai đoạn kéo dài, nâng nhiệt độ lên 72oC ở nhiệt độ này

Taq-polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất để kéo dài các mạch DNA Đoạn DNA nằm giữa 2 mồi được tổng hợp.thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, thường kéo dài từ 1 giây đến nhiều phút

Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi Đây là sự nhân bản theo cấp số nhân Như vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n chu kỳ sẽ tạo thành 2n bản sao phân tử DNA

2.5.3 Các thành phần của phản ứng PCR

Primer (mồi): mồi là những đoạn DNA ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản

ứng dây truyền tổng hợp DNA Chúng bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi

(F: forward primer) và một mồi ngược (R: reverse primer) Thiết kế mồi cần tuân thủ

một số nguyên tắc nhất định: dài khoảng 18 - 24 base, Tm của mồi gần nhau, thành phần nucleotic của các mồi cần trách các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần, mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không hình thành primer dimer, không phải là

trình tự lặp lại

DNA bản mẫu: hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất ức chế phản ứng: SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, heparin…) PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ tế bào hay những mẫu DNA không được bảo quản tốt

Nồng độ MgCl2: cần cho hoạt động của Taq-polymerase, hàm lượng quá cao sẽ

tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme

Nồng độ tối ưu phải được xác định cho phản ứng qua nhiều thử nghiệm

dNTP: thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng, sự mất cân bằng làm tăng các lỗi sao chép của polymerase; hàm lượng thường không đổi tùy điều kiện thực tế

Taq-polymerase: là DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi

khuẩn suối nước nóng có tên Thermus aquaticus do nhà vi sinh vật học Thomas Brock

phát hiện Tap-polymerase xúc tác sự tổng hợp theo chiều 5’- 3’ và hoạt động tốt nhất ở

70 - 72oC (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

2.5.4 Đọc kết quả phản ứng PCR

Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di Nguyên tắc của phương pháp điện di được dựa trên đặc tính cấu trúc DNA DNA là các đại phân tử điện tích âm, DNA sẽ di chuyển về điện cực dương của từ trường Dưới tác động của điện trường, sự di chuyển của các phân tử trong bản gel phụ thuộc vào khối lượng phân tử (số nucleotide) và nồng độ các chất cấu thành gel, điện thế của điện trường Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc thẳng đứng, để nhận

biết phân tử DNA di chuyển đến đâu trong bản gel, người ta có thể sử dụng một dung dịch có màu (loading dye) được nhuộm chung với sản phẩm PCR khi cho chúng vào những lỗ nhỏ trên gel Trong một số dung dịch đệm vẫn có thể có màu, khi đó không cần dùng đến loading dye Trong quá trình điện di, phân tử có màu này sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử DNA và ta có thể nhìn thấy một vạch dài có màu này Sau khi điện

di, bản gel sẽ được nhuộm với dung dịch ethidium bromide ethidium bromide có khả năng gắn xen giữa các base của nucleic Chất này sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV (bước song λ=300 nm) tạo thành vạch đỏ da cam (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005) Để ước lượng kích thước phân tử DNA trên gel agasore, người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker – MWM) Đây là một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước đã biết (DNA ladder)

2.5.5 Ứng dụng của kỹ thuật PCR

Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phẩn tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nông nghiệp… Trong y khoa và thú y, PCR được sử dụng nhằm chẩn đoán các mầm bệnh, các gen ảnh hưởng đến phẩm chất thịt, chọn giống vật nuôi, phát hiện đột biến… Trong trong trồng trọt và công nghiệp thực phẩm, PCR được sử dụng để phát hiện các sản phẩm mang gen đột biến, chẩn đoán các bệnh trên cây trồng, tạo ra các giống cây đột biến có năng xuất cao, kháng sâu bệnh mang lại hiệu quả kinh tế cao… Trong sinh học, PCR sử dụng để phát hiện đột biến, phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm, lựa chọn các cặp cha

mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn, nghiên cứu tiến hóa phân tử, xác định các loài mới, các loài đặc hữu bằng phương pháp di truyền phân tử Trong y khoa, PCR sử dụng chẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền, xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm…

2.5.6 Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật PCR

Ưu điểm: độ nhạy cao, thời gian thực hiện nhanh, thao tác đơn giản, yêu cầu về

độ tinh sạch của mẫu không cao, lượng mẫu cần ít

Nhược điểm: bên cạnh những ưu điểm đáng kể trên, để thực hiện phương pháp PCR cần có DNA mồi đặc chưng cho DNA cần khuếch đại, để có đoạn mồi này cần phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb, cần thận trọng đặc biệt trong thao tác tiến hành dễ dẫn đến ngoại nhiễm

2.6 Phản ứng Multiplex – PCR

Phản ứng multiplex PCR là một dạng khác của phản ứng PCR thông thường, ở

đó hai hoặc hơn hai locus được nhân lên đồng thời trong cùng một phản ứng Phương pháp này được thử nghiệm thành công vào năm 1988 và được áp dụng thành công trong nhiều nghiên cứu gồm có phân tích mất đoạn, đột biến, đa hình hoặc trong các phương pháp định lượng và kỹ thuật PCR sao chép ngược (RT-PCR) Cho đến nay chưa có nguyên tắc chung hay thành phần chuẩn nào cho việc tối ưu hóa phản ứng multiplex-PCR Do đó, ứng với mỗi phản ứng cần phải điều chỉnh cho phù hợp với mục đích mong muốn

Có 2 dạng m-PCR là phản ứng dùng cùng một khuân mẫu nhưng có thể dùng nhiều cặp mồi và phản ứng m-PCR trong đó dùng nhiều khuân mẫu và nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng

Các thông số quyết định trong phản ứng multiplex PCR (Henegariu,1994): Mồi và nồng độ mồi: Việc lựa chọn mồi tuân theo các quy tắc đơn giản sau: chiều dài mồi khoảng 18 – 24 bp hoặc hơn và phần trăm GC chiếm 35 % - 60 %, do vậy, nhiệt độ gắn mồi vào khoảng 55 – 58oC hoặc cao hơn Những mồi dài hơn cho phép phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ gắn mồi cao hơn và thu được ít sản phẩm không đặc hiệu hơn Việc kết hợp nhiều mồi trong các hỗn hợp phản ứng khác nhau và

Hình 2.1 Phản ứng multiplex

PCR.( http://www.sinhhoc.edu.vn)

nhân lên đồng thời nhiều locus đòi hỏi sự thay đổi và tối ưu các thông số của phản ứng Lần đầu khi thực hiện phản ứng multiplex PCR, nên sử dụng các mồi với một đương lượng gram tương đương nhau (cùng nồng độ) Kết quả này sẽ cho ta thấy những nồng độ mồi nào hay các thông số nào cần phải thay đổi từ đó tăng nồng độ mồi đối với các locus “yếu” và giảm lượng mồi đối với các locus “mạnh” Nồng độ cuối cùng của các mồi thay đổi đáng kể giữa các locus và được tính toán tuỳ theo kinh nghiệm

Nhiệt độ gắn mồi: đối với các locus được nhân lên riêng biệt, thời gian gắn mồi (30 – 120 giây) và thời gian kéo dài (30 – 150 giây) không ảnh hưởng rõ rệt tới kết quả, nhưng tính đặc hiệu của sản phẩm PCR tăng lên hoặc giảm đi phụ thuộc rất nhiều vào sự thay đổi nhiệt độ gắn mồi Thấy rằng việc hạ thấp nhiệt độ gắn mồi từ 4-6oC là cần thiết đối với các locus được nhân lên đồng thời trong phản ứng multiplex PCR

Nồng độ Mg2+ và dNTP: Nồng độ Mg2+ yêu cầu cho một phản ứng PCR chuẩn

là 1.5mM và nồng độ dNTP vào khoảng 200µM mỗi loại Ở nồng độ Mg2+ phù hợp việc khuếch đại trở nên đặc hiệu hơn, các sản phẩm thu được có độ tập trung cao, và nồng độ Mg2+ cao phản ứng bị ức chế, sản phẩm trở nên khó có thể quan sát dNTP với nồng độ cao làm cho việc khuếch đại tức thời bị ức chế, nồng độ dNTP thấp hơn cho phép khuếch đại phản ứng PCR nhưng với lượng sản phẩm ít hơn Để làm việc một cách có hiệu quả, Taq ADN polymerase đòi hỏi phải có Mg2+ tự do, Đây có thể là

lý do việc gia tăng nồng độ dNTP có thể ức chế tức thời phản ứng PCR, ngược lại việc tăng nồng độ Mg2+ thường mang lại hiệu quả rõ rệt

Nồng độ DNA khuân và enzyme: ở lượng ADN khuôn vào khoảng 30 và 500ng/25 µl phản ứng, tuy nhiên, dưới 30 ng, sản lượng của một vài sản phẩm PCR bị giảm xuống Khi lượng ADN khuôn rất nhỏ (tính bằng pg), việc khuyếch đại đặc hiệu

và có hiệu quả vẫn có thể thu được bằng cách hạ thấp hơn nữa nhiệt độ gắn mồi, đôi khi xuống từ 10 - 12oC Nồng độ enzyme hiệu quả nhất vào khoảng 0.4 ul hoặc 2U/25µl thể tích phản ứng

2.7 Quy trình ly trích DNA

Bước 1: Phá vỡ màng tế bào: thông thường tế bào hoặc mô được nghiền trong hỗn hợp dung dịch chiết gồm Tris – HCl 1M (pH 7,5), NaCl 5M, EDTA 0,5M, sodium dodecyl sulfat 10% (SDS) Hỗn hợp này phá vỡ tế bào và màng nhân, giải phóng DNA

ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA, ngoài ra trong thành

phần ly trích còn có mercaptoethanol có tác dụng bảo vệ DNA không bị tiêu hủy bởi các protease trong tế bào

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn chủ yếu là protein: loại bỏ protein và phức hợp CTAB – polysaccharide – protein bằng hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25: 24: 1) Phenol và chloroform sẽ làm biến tính protein Ngoài ra chloroform còn làm cho pha nước và pha hữu cơ dễ tách rời nhau, isoamyl alcohol hạn chế sự nổi bọt trong suốt quá trình ly trích Sử dụng thêm chloroform sẽ giúp loại bỏ tất cả các dấu vết còn sót lại của phenol trong nucleic acid Protein bị biến tính sẽ không hòa tan trong nước có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm

sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha hữu cơ, pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại

Bước 3: Tủa nucleic acid trong isopropanol: các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa nên có thể loại bỏ chúng bằng tủa trong isopropanol Acid nucleic sẽ được thu nhận lại trong ly tâm Sau đó cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70 % để loại bỏ muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại (Phạm Văn Trường, 2009)

2.8 Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ quang

Nguyên tắc dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tia tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260

nm – Optical Density 260 nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu dựa vào tương quan sau:

Một đơn vị OD260 nm tương ứng với một nồng độ là:

- 50 µg/ml cho một lượng dung dịch DNA sợi đôi

- 40 µg/ml cho một lượng dung dịch DNA hay RNA sợi đơn

Hàm lượng DNA được xác định bằng công thức: [DNA] = OD260 x 50 x X (µg)

Trong đó X là số lần pha loãng từ dung dịch DNA gốc ban đầu

Phương pháp này đơn giản, nhanh, nhưng có hạn chế là giá trị đọc được về độ hấp thụ có thể bị ảnh hưởng khi trong mẫu chứa RNA và protein Vì vậy, trong thực tế phương pháp này thường được dùng để định lượng các mẫu DNA tinh khiết