THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG NGUỒN SÁNG LÀ ĐÈN LED ĐỎ VÀ XANH VỚI CÁC TỈ LỆ KHÁC NHAU CHIẾU SÁNG CHO CÂY Paulownia fortunei NHÂN GIỐNG IN VITRO TRONG HỆ THỐNG BIOREACTOR

Đề tài nghiên cứu ảnh hưởng của các tỷ lệ đèn LED xanh và đỏ lên sự tăng trưởng của cây Paulownia fortunei nuôi cấy in vitro trong hệ thống Bioreactor ngập chìm cách quãng nhằm mục đích

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG NGUỒN SÁNG LÀ ĐÈN LED

ĐỎ VÀ XANH VỚI CÁC TỈ LỆ KHÁC NHAU CHIẾU SÁNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG NGUỒN SÁNG LÀ ĐÈN LED

ĐỎ VÀ XANH VỚI TỶ LỆ KHÁC NHAU CHIẾU SÁNG

TRONG HỆ THỐNG BIOREACTOR

KS NGUYỄN ĐỨC MINH HÙNG

Tháng 12 năm 2013

Viện Sinh học Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh, các cơ quan chức năng, các trung tâm, các phòng ban, cùng các cơ sở sản xuất liên quan, đã nhiệt tình hỗ trợ

và giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt các nội dung đã đề ra trong khóa luận

ThS Mai Trường đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi có thể hoàn thành đề tài tốt nghiệp này

Thầy Nguyễn Đức Minh Hùng – người Thầy đã hết lòng giúp đỡ, tận tình truyền đạt những kiến thức chuyên môn, đóng góp nhiều ý kiến quý giá, cung cấp nhiều tài liệu và sách quan trọng, chỉ dạy, hướng dẫn trong quá trình thực hiện và thu thập số liệu để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này

Cô Lương Thanh Hồng đã nhiệt tình truyền dạy nhiều kinh nghiệm làm việc quý báu và luôn tạo một không khí thoải mái, thân thiết trong thời gian tôi thực hiện khóa luận

Toàn thể lớp LT11SH đã luôn gắn bó và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường cũng như lúc thực hiện khóa luận Cùng với những người chị, những người bạn đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều

Sau cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến ba, mẹ, những người thân trong gia đình đã luôn tin tưởng, động viên, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập và trưởng thành như ngày hôm nay

Sinh viên thực hiện

TÓM TẮT

Đèn LED là một nguồn năng lượng điện hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy và nâng cao khả năng tăng trưởng của thực vật nuôi cấy mô Sử dụng hệ thống phát sáng bằng đèn LED là một nguồn sáng cho cây trồng là một ý tưởng được cân nhắc và được chú ý đặc biệt trong những năm gần đây Đề tài nghiên cứu ảnh hưởng của các tỷ lệ

đèn LED xanh và đỏ lên sự tăng trưởng của cây Paulownia fortunei nuôi cấy in vitro

trong hệ thống Bioreactor ngập chìm cách quãng nhằm mục đích khảo sát tỷ lệ của đèn

LED xanh và đỏ đến sự phát triển của cây Paulownia, đồng thời thử nghiệm nuôi cấy trên môi trường có và không đường dưới ánh sáng đèn LED

Các thí nghiê ̣m trong được bố trí trong giai đoa ̣n phát sinh chồi, phát triển tạo rễ

cho cây Paulownia sử dụng môi trường MS Các đoạn thân cây cấy mô có chứa 2 mắt

mầm đối xứng đươ ̣c nuôi cấy trong hệ thống Bioreactor bố trí ngẫu nhiên với 4 nghiê ̣m thức đèn LED theo tỷ lê ̣ xanh và đỏ là : 10% LED xanh + 90% LED đỏ; 15% LED xanh + 85% LED đỏ; 20% LED xanh + 80% LED đỏ; 30% LED xanh + 70% LED đỏ, đă ̣t trong dàn sáng đã được cách ly với ánh sáng bên ngoài Cườ ng đô ̣ ánh sáng là 50 µmol/s m2 Đối chứ ng là cây đươ ̣c nuôi cấy dưới ánh sáng huỳnh quang Đối với môi trường không đường thì bổ sung khí CO2 Sau 5 tuần tiến hành đo đạt các chỉ tiêu và chlorophyll tổng số

Các thí nghiệm so sánh đã cho thấy sự kết hợp 15% đèn LED xanh và 85% đèn LED đỏ là tốt nhất Trong khi kết quả nuôi cây trên môi trường có bổ sung khí CO2 thì cho thấy sự kết hợp 20% LED xanh và 80% LED đỏ cây phát triển tốt, các khác biệt không có ý nghĩa Tuy nhiên kết quả này cũng cho thấy bioreactor ngập chìm cách quãng có thể được sử dụng để nuôi cây trên môi trường MS không đường với sự bổ sung CO2 thích hợp Việc sử dụng đèn LED với các tỉ lệ màu chiếu sáng thích hợp có

thể ứng dụng được cho vi nhân giống cây Paulownia Cây con Paulownia nuôi cấy

dưới ánh đèn LED đã cho thấy hiệu quả của hệ thống LED đỏ và xanh đối với quang hợp Nghiên cứu cũng đã chỉ ra ảnh hưởng của ánh đèn LED lên sự tăng trưởng của

cây con trong điều kiện in vitro

Từ khóa: đi ốt phát quang, hệ thống nuôi cấy ngập chìm cách quãng, cây hông,

nuôi cấy mô thực vật

SUMMARY

LED is a promising source of electrical power for culture room and enhance the growth of plant tissue culture Use LED light as a light source for plants is an idea to

be considered and special attention in recent years The study of the influence of the

ratio of blue and red LEDs on the growth of Paulownia fortunei plantlets in vitro using

Temporary Immersion System, aims survey ratio of blue and red LEDs to the Paulownia development, test and culture on the environment has sugar and without sugar under the light LEDs

The experiments were arranged in the period incurred play, rooting for the development of Paulownia plantlets on MS basal media Plantlets were cultured in Bioreactor system randomly assigned with 4 treatments LED with the ratio of blue and red proportionate is: 10% blue LEDs + 90% red LEDs, 15% blue LEDs + 85% red LEDs, 20% blue LEDs + 80% red LEDs, 30% blue LEDs + 70% red LEDs, has been set in the chambers to be isolated from external light Light intensity was 50 μmol/s.m2

The control plants were grown under normal fluorescent lighting For MS without sugar, added with CO2 After 5 weeks conducting measure achieve targets and chlorophyll content of leaf

Experiments comparing showed the combination 15 % blue LEDs and 85 % red LEDs was the most effective The culture of plantlets on MS basal media added with

CO2, showed the combination 20 % blue LEDs and 80 % red LEDs was effective on the growth of plantlets, the difference was not significant However, the results also showed Temporary Immersion System can be used culture plantlets on MS basal media without sugar with the appropriate additional CO2 The use of LED lights with appropriate color ratio can be applied to the propagation of Paulownia trees Paulownia plantlets grown under LED lights showed the effectiveness of red and blue LED systems for photosynthesis The study also showed the influence of LED lights

on the growth of plantlets in vitro

Key words: light emitting diode, bioreactor Plantima, Paulownia fortunei, plant

tissue culture

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh mục các chữ viết tắt ix

Danh mục các bảng x

Danh mục các hình xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cây paulownia 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.2 Phân loại thực vật 3

2.1.3 Đặc điểm thực vật 4

2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển 6

2.1.5 Giá trị của cây hông 7

2.1.6 Tình hình nghiên cứu và phát triển 8

2.1.6.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển trên thế giới 8

2.1.6.2 Tình hình nghiên cứu và phát triển tại Việt Nam 8

2.2 Tầm quan trọng của ánh sáng lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật nuôi cấy in vitro 9

2.2.1 Vai trò của ánh sáng trong quang hợp ở thực vật 9

2.2.2 Sắc tố quang hợp 10

2.2.3 Ảnh hưởng của ánh sáng đến quang hợp 12

2.2.3.1 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sự quang hợp ở thực vật 12

2.2.3.2 Ảnh hưởng của chất lượng ánh sáng lên sự quang hợp ở thực vật 13

2.2.4 Tầm quan trọng của nhân tố ánh sáng trong vi nhân giống 13

2.2.5 Các nguồn sáng nhân tạo được sử dụng trong nhân giống in vitro 14

2.3 Tổng quan về đèn led 14

2.3.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển 14

2.3.2 Cấu tạo đèn LED 15

2.3.3 Ứng dụng của đèn LED 16

2.3.4 Tình hình nghiên cứu 17

2.3.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17

2.3.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 17

2.3.5 Cơ sở của viê ̣c sử du ̣ng đèn LED trong nuôi cấy mô tế bào thực vâ ̣t 17

2.4 Giới thiệu về hệ thống bioreactor 18

2.4.1 Giới thiệu chung 18

2.4.2 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản 20

2.4.3 Hệ thống Plantima® 20

2.4.4 Ưu và khuyết điểm của hệ thống bioreactor 22

2.4.4.1 Ưu điểm 22

2.4.4.2 Khuyết điểm 22

2.4.4 Một số thành tựu trong hệ thống bioreactor 23

2.4.5 Thuận lợi và khó khăn của việc nuôi cấy trong bioreactor 24

2.4.5.1 Thuận lợi 24

2.4.5.2 Khó khăn 24

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 25

3.1.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 25

3.1.3 Môi trường thí nghiệm 26

3.1.4 Thiết bị và dụng cụ 26

3.2 Phương pháp nghiên cứu 27

3.2.1 Cách bố trí thí nghiệm 27

3.2.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu thời gian ngập cách quãng nuôi cấy cây hông trên môi trường ra rễ bằng Bioreactor Plantima 27

3.2.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng chồi cây hông dùng nguồn sáng đèn LED trên Bioreactor ngập cách quãng 27

3.2.1.3 Thí nghiệm 3: Nuôi cây hông hoàn chỉnh dùng nguồn sáng đèn LED trên Bioreactor 28 3.2.1.4 Thí nghiệm 4: So sánh nuôi cây hông hoàn chỉnh dưới đèn LED bằng Bioreactor trên môi trường MS không đường 28 3.2.1.5 Thí nghiệm 5: Nuôi cây hông hoàn chỉnh dưới đèn LED bằng Bioreactor trên môi trường không đường có bổ sung khí CO2 28 3.2.2 Xử lý số liệu 29 3.2.3 Đo hàm lượng chlorophyll tổng số 29 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả 31 4.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu thời gian ngập cách quãng nuôi cấy cây hông trên môi trường ra rễ bằng Bioreactor Plantima 31

4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng chồi cây hông dùng nguồn sáng đèn LED trên

Bioreactor ngập cách quãng 31 4.1.3 Thí nghiệm 3: Nuôi cây hông hoàn chỉnh dùng nguồn sáng đèn LED trên Bioreactor 32 4.1.4 Thí nghiệm 4: So sánh nuôi cây hông hoàn chỉnh dưới đèn LED bằng Bioreactor trên môi trường MS không đường 34 4.1.5 Thí nghiệm 5: Nuôi cây hông hoàn chỉnh dưới đèn LED bằng Bioreactor trên môi trường không đường có bổ sung khí CO2 34 4.2 Thảo luận 36 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận 38 5.2 Đề nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MS Murashige và Skoog (1962) TIS Temporary Imersion System LED Light Emitting Diode

NAA α-naphthaleneacetic acid IAA Indole-3-acetic acid IBA Indole-3-butyric acid

BAB 6-benzylaminopurine EDTA Ethylene Diamin Tetra Acetat PLB Protocom Like Body

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 4.1Kết quả thí nghiệm so sánh thời gian ngập cách quãng 31

Bảng 4.2Kết quả thí nghiê ̣m phát sinh chồi 32

Bảng 4.3Kết quả thí nghiê ̣m so sánh nuôi cây Paulownia 33

Bảng 4.4Kết quả phân tích Chlorophyll tổng số 34

Bảng 4.5 Kết quả thí nghiê ̣m nuôi cây Paulownia trên môi trường không đường có bổ sung khí CO2 ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau 35

Bảng 4.6 Kết quả phân tích Chlorophyll tổng số lá cây Paulownia nuôi cấy dưới đèn LED trên môi trường MS không đường có bổ sung CO2 36

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cây hông 4 tháng tuổi trồng tại Đồng Bằng sông Cửu Long 4

Hình 2.2Hình thái hoa hông 5

Hình 2.3Quang phổ hấp thu ̣ của các chất diê ̣p lu ̣c a và b 11

Hình 2.4Một số loại đèn LED 15

Hình 2.5Cấu tạo của một bóng đèn LED 16

Hình 2.6 Các bộ phân của hệ thống Plantima® 21

Hình 2.7Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập 21

Hình 3.1Bản mạch dùng trong thí nghiệm 25

Hình 3.2Máy đo độ hấp thụ chlorophyll và tủ cấy 26

Hình 3.3Hệ thống bioreactor Plantima dùng trong thí nghiêm 27

Hình 3.4 Các nghiệm thức thí nghiệm đèn LED oval trên bình Bioreactor 29

Hình 4.1 Thí nghiệm so sánh thời gian ngập cách quãng cây Paulownia 31

Hình 4.2 Thí nghiệm phát sinh chồi Paulownia trên Bioreactor 32

Hình 4.3 Thí nghiệm nuôi cây Paulownia hoàn chỉnh trên Bioreactor 33

Hình 4.4 Thí nghiệm nuôi Paulownia trên Bioreactor 34

Hình 4.5 Thí nghiê ̣m so sánh nuôi cây Paulownia trên môi trường không đường có bổ sung khí CO2 35

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nhân giống in vitro thực vật hiện là ngành công nghiệp đem lại nguồn lợi

nhuận to lớn được thực hiện trong hàng ngàn vườn ươm cây và các phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học lớn nhỏ trên khắp thế giới Ở các phòng nuôi cấy mô thương mại này, nguồn ánh sáng bức xạ được dùng thông dụng nhất cho vi nhân giống trong các phòng nuôi cấy với điều kiện môi trường được kiểm soát là đèn huỳnh quang Mặc dù một số đèn huỳnh quang thích hợp cho sự tăng trưởng thực vật nhưng tất cả các đèn huỳnh quang này đều tỏa nhiệt do vậy cần phải có các hệ thống làm mát được sử dụng

để làm ổn định nhiệt trong phòng nuôi Điều này làm tiêu tốn thêm chi phí cho lượng điện để làm giảm nhiệt độ này Ước tính chi phí điện năng khoảng 65% dùng cho thắp sáng trong phòng nuôi cấy và 25% để làm mát phòng nuôi Do đó, sự phát triển các nguồn sáng nhân tạo khác hiệu quả hơn được sử dụng trong các phòng nuôi cấy mô sẽ

đem lại nguồn lợi đáng kể, giảm chi phí sản xuất nhân giống in vitro

Hiện nay trên thế giới đèn LED (Light Emitting Diode hay điốt phát quang) đã

có rất nhiều ứng dụng thực tiễn Việc áp dụng đèn LED trong nông nghiệp đã rút ngắn được thời gian cần thiết để đưa một giống mới có khả năng cho năng suất cao, ổn định phẩm chất vào trồng ở quy mô lớn Với ưu thế khai thác ở điện thế thấp và không phụ thuộc vào lưới điện, tiết kiệm tối đa năng lượng đầu vào và cho năng suất cây trồng cao Đèn LED đã trở thành thế hệ chiếu sáng nông nghiệp mới cho cả cây trồng trong nhà lẫn ngoài vườn Nhiều trong số các nghiên cứu ứng dụng đèn LED là của các nhà khoa học Việt Nam thực hiện ở trong nước cũng như nước ngoài, nhằm cải thiện chất lượng nông sản cho xuất khẩu, gia tăng năng suất cây trồng

Việc sử dụng TIS (Temporary Imersion System) bioreactor thuận lợi trong việc cung cấp khí thường xuyên cho cây nuôi cấy, do vậy thử nghiệm việc nuôi cấy trên môi trường không đường nhằm giảm nhiễm trong nuôi cấy và dễ dàng hơn trong việc đưa cây ra vườn ươm

Từ những lý do trên đề tài “Thử nghiệm sử dụng nguồn sáng là đèn LED đỏ và

xanh với tỷ lệ khác nhau chiếu sáng cho cây Paulownia fortunei nuôi cấy in vitro trong

hệ thống Bioreactor ngập chìm cách quãng trong điều kiện có và không có đường được

thực hiện”

1.2 Yêu cầu của đề tài

Khảo sát được tỷ lệ của đèn LED xanh và đỏ trong giai đoạn phát sinh chồi,

phát triển, tạo rễ cho cây Paulownia và thử nghiệm nuôi cấy trên môi trường MS có và

không đường dưới ánh sáng đèn LED làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo

1.3 Nội dung thực hiện

Đề tài thực hiện khảo sát thời gian ngập chìm cách quãng thích hợp để nuôi cấy cây Paulownia trong Bioreactor sử dụng môi trường MS Sau đó sử dụng kết quả này

để nuôi cây trong các thí nghiệm tiếp theo

Tiến hành bố trí các thí nghiệm chiếu sáng bằng ánh sáng đèn LED với tỷ lệ

khác nhau giữa xanh và đỏ để nuôi cấy mô cây Paulownia fortunei trong giai đoạn

phát sinh chồi và phát triển tạo rễ trên hệ thống Bioreactor ngập chìm cách quãng trong môi trường MS Theo dõi các đặc tính sinh trưởng rồi rút ra tỷ lệ đèn LED thích hợp có thể dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Thử nghiệm nuôi cấy mô cây Paulownia fortunei hoàn chỉnh trên hệ thống

Bioreactor ngập chìm cách quãng trong môi trường MS không đường và chiếu sáng bằng ánh sáng đèn LED với tỷ lệ khác nhau giữa xanh và đỏ Theo dõi các đặc tính sinh trưởng của cây trong quá trình nuôi cấy

Tiếp tục bố trí các thí nghiệm chiếu sáng bằng ánh sáng đèn LED với tỷ lệ khác

nhau giữa xanh và đỏ để nuôi cấy mô cây Paulownia fortunei hoàn chỉnh trên hệ thống

Bioreactor ngập chìm cách quãng trong môi trường MS không đường và bổ sung khí

CO2 Tiến hành theo dõi các đặc tính sinh trưởng rồi rút ra tỷ lệ đèn LED thích hợp có thể dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Đồng thời đánh giá được khả năng phát triển của cây trong điều kiện môi trường MS không đường và có bổ sung khí CO2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây Paulownia

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Cây Paulownia spp thuộc họ Scrophulariaceae còn gọi là cây bao đồng, cây

hông, có nguồn gốc từ Á Châu và được biết đến trên 2000 năm ở Trung Hoa Một

bách khoa toàn thư viết vào thế kỉ thứ 3 trước công nguyên đã đề cập đến Paulownia

dưới cái tên gốc là T’ung Những tài liệu cổ ở Trung Hoa viết vào năm 1049 đã viết về

kỹ thuật nhân giống, nuôi trồng và đặc tính quần thể Paulownia

Paulownia được di thực vào Nhật Bản, Triều Tiên hơn 1000 năm trước

Khoảng giữa thế kỉ 19, Paulownia được du nhập vào châu Âu, Nam Mỹ sau đó là Bắc

Mỹ, Úc và New Zealand Paulownia được đưa vào Mỹ như một loài cây cảnh vào năm

1844 vì chúng có hoa màu tím rất đẹp cùng với tán cây mát Loài cây này rất thích hợp cho việc tái trồng rừng và đã trồng rất thành công tại New Zealand, Úc, Trung Quốc

Diện tích trồng cây Paulownia của Trung Quốc đến 8/2013 đã lên hơn 5 triệu ha Chương trình phục hồi rừng bằng cây Paulownia của Trung Quốc được sự hỗ trợ của

tổ chức Phát triển Liên hiệp quốc (UNDP) Trung Quốc đã xuất khẩu cây Paulownia

thành phẩm và cả cây giống

Ở miền Bắc Việt Nam, cây Paulownia phân bố tự nhiên ở một số vùng có độ

cao từ 300 đến 1000m như Sơn La, Lạng Sơn, Lai Châu…trong dân gian loài cây này được gọi là cây phao đồng, cây ngô đồng hay là cây hông Theo một tài liệu, do đồng bào một số tỉnh miền núi phía Bắc sử dụng gỗ cây này để làm chõ hong xôi nên cây có cái tên được gọi trại ra (www.nongsinh.com, www.paulownia.vn)

2.1.2 Phân loại thực vật

Chi hông hay chi bao đồng (phao đồng, bào đồng), danh pháp khoa học là

Paulownia là một chi của khoảng 6 - 17 loài thực vật trong họ của một chi gọi là họ

Hông (Paulowniaceae), có họ hàng gần và đôi khi được đặt trong họ Huyền Sâm (Scrophulariaceae) Tên gọi khoa học của chi này được đặt theo tên của nữ hoàng

Anna Pavlovna của Hà Lan (1795 - 1865)

Về phân loại khoa học thì Paulownia thuộc giới Plantae, nằm trong ngành Angiosperme, được chia theo lớp Eudicots với phân lớp Asterids, thuộc bộ Lamiales

và họ Paulowniaceae, được xếp vào chi Paulownia

Paulownia fortunei và Paulownia elongate được trồng nhiều nhất vì những đặc

tính ưu việt của chúng (www.nongsinh.com)

2.1.3 Đặc điểm thực vật

Giống hông có rễ phân bố sâu 80 - 300 cm dưới mặt đất nên ít cạnh tranh với

các loại cây ngắn ngày, ít cong vênh, là nguyên liệu tốt cho công nghiệp gỗ ván nhân tạo và đồ dùng nội thất Thân cây có vỏ màu xám hoặc đen, tán lá thưa, vòm lá có hình

dù hoặc xoắn ốc Trên mọi phần của cây, trừ những cành già được phủ một lớp lông tuyến nhầy, lông hình cây hoặc hình sao Hầu hết các giống hông đều có sự phân đôi

cành giả vì chồi bên ngoài cùng sẽ bị khô đi sau mùa đông Riêng loài Paulownia

fortunei vẫn phát triển chồi ngoài cùng này thành nhánh mới

Hình 2.1 Cây hông 4 tháng tuổi trồng tại Đồng Bằng sông Cửu Long

(www.vidon.com.vn)

Lá cây hông hình ô van hoặc hình trứng, đầu nhọn, lá có thể chia thành ba thùy,

mặt dưới lá có nhiều lông tơ Ở cây non có một giai đoạn ấu niên, khi đó, lá rất lớn với cuống lá dài, mép lá răng cưa, mọc đối hoặc đôi khi mọc thành vòng Ở cây trưởng thành, lá nhỏ hơn, mép thẳng hoặc lượn sóng Lá hông có thể rộng tới 40 - 50 cm, dài

50 - 60 cm, lá hông có hàm lượng đạm cao, dùng làm thức ăn gia súc vào loại tốt nhất Cây hông 10 tuổi hàng năm có thể cho 30 kg lá khô và 400 kg cành non, đó cũng là nguồn phân hữu cơ lớn bổ sung cho đất

Ở Việt Nam, hoa hông nở hoa màu trắng và đậu trái vào sau Tết, hoa hông

lưỡng tính, hình quả chuông, cánh hoa có thể là màu tím xanh rất đẹp, hương thơm dễ chịu Chùm hoa có 2 - 3 bông, có hoặc không có cuống Chúng được tạo ra từ những nách lá bé xíu vào mùa hè hoặc mùa thu, hoa có cuống và có đốt ở đầu ngọn Đài hoa nhiều thịt, hình chuông và có 5 thùy hình tam giác không bằng nhau, có nhiều lông bao phủ Thông thường, những lông nhỏ này rụng khi hoa nở Tràng hoa lớn, màu từ tím đến trắng, cánh hoa trên chia 2 thùy, cánh hoa dưới chia 3 thùy dài Ống hoa hình chuông, thường cong về phía trước khoảng 5 mm tính từ đáy hoa sau đó mở rộng dần Gần lá đài, cánh hoa trên hướng xuống làm tràng hoa trông phẳng Bên trong tràng hoa

có nhiều điểm hoặc sọc màu tím hoặc màu vàng Nhị hoa dài bằng khoảng một nửa chiều dài tràng hoa Nhụy dài bằng hoặc hơn nhị Noãn có hai ngăn

Hình 2.2 Hình thái hoa hông

(www.nongsinh.com) Cây trong tự nhiên phát tán giống bằng hạt, quả hông hình trứng hoặc hình elip, được chia ngăn, dài từ 3 - 4,6 cm, mỗi buồng quả có thể cho 2000 trái nhỏ, mỗi quả chứa khoảng 3000 hạt Vỏ quả biến đổi từ dầy đến mỏng, đôi khi hóa gỗ Mặt bên trong vỏ có thể sần sùi hoặc trơn láng Có rất nhiều hạt dạng elip, rất nhỏ, có màng và

có những cánh Vỏ bao hạt gồm hai lớp tế bào, lớp trong là những tế bào hoá gỗ có vách dầy và lớp ngoài trong suốt Hạt có nội nhũ Mỗi cây trưởng thành có thể sinh vài kilogram hạt mỗi năm và mỗi kilogram chứa từ 3 - 4 triệu hạt

Hình thái cây hông thường thay đổi trong quá trình sinh trưởng rất nhanh của chúng Do đó chỉ có thể dựa vào một vài đặc điểm hình thái ổn định như chiều dài cụm hoa, độ sâu của thùy đài hoa, hình dạng của tràng hoa, các ngăn trong noãn, độ dày của

vỏ qua để xác định loài cho chúng Các cây cùng giống nhưng có nguồn gốc khác nhau cũng có thể có hình thái khác nhau Hông là cây thụ phấn chéo nhờ côn trùng, do

đó dễ thu nhận được các giống lai vì vậy cây có nhiều hình thái khác nhau (www.nongsinh.com)

2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây hông

Cây hông sinh trưởng tốt ở nơi dư thừa ánh sáng, ưa nước nhưng không được ngập úng Hông không đòi hỏi đất mặt phải màu mỡ nhưng là cây trồng rừng, rễ ăn rất sâu nên thích tầng đất dày Nhìn chung đất cát pha, thoát nước trồng thích hợp cho cây

có củ như khoai sắn thì cũng thích hợp cho cây hông Giá trị pH có thể từ 5,5 - 7 nhưng pH = 6,0 là thích hợp nhất, độ sườn đồi 10 – 35o

Trong điều kiện bình thường, mỗi năm cây có thể tăng trưởng 3 - 4 cm đường kính và thể tích tăng 0,04 - 0,05 m3 Trong điều kiện tối ưu, cây có khả năng tăng trưởng 8 - 9 cm/năm và thể tích tăng 0,15 - 1,2 m3/năm Một số cây trồng tại vườn quốc gia Xuân Sơn, chỉ sau 18 tháng, đường kính đã đạt 16 - 22 cm, cao 7 - 8 m So với các loài được xem là tăng trưởng nhanh nhất hiện nay như bạch đàn, keo lai thì cây hông có mức độ tăng trưởng vượt xa

Khi cây đạt 2 - 3 năm tuổi đã cao 12 - 14 m, đường kính thân cây 0,24 - 0,26 m

và có thể khai thác làm bột giấy cao cấp (nguyên liệu làm giấy chất lượng cao) Khi cây đạt 8 - 12 năm tuổi đã cao 18 - 20 m, đường kính thân cây 0,5 - 0,6 m khai thác làm gỗ cứng quý

Tùy theo giống và tuổi, gỗ hông có màu vàng nhạt hay màu vàng sậm Gỗ hông thuộc loại nhẹ nhất nhưng lại rất chịu lực, trọng lượng riêng của gỗ từ 0,23 - 0,3, trung bình là 0,28 Gỗ thông gió, cách nhiệt, giữ ẩm, không bị biến dạng khi thời tiết thay đổi Điểm bắt lửa của gỗ hông cao tới trên 400oC Gỗ có thể khô tự nhiên từ 30 - 60 ngày hay có thể sấy khô trong vòng 24 - 48 giờ mà không bị rạn nứt (www.nongsinh.com)

2.1.5 Giá trị của cây hông

Trên thế giới, cây hông được mệnh danh là loài cây "chiến lược" của thế kỷ 21, một loài cây dễ trồng, dễ sống, lớn nhanh, thân thiện với môi trường và có giá trị kinh

tế cao Việt Nam có những điều kiện về đất đai, khí hậu, thổ nhưỡng phong phú để phát triển loài cây đa dụng này Việc đầu tư phát triển cây hông có thể mang lại giá trị kinh tế lớn cho các doanh nghiệp và người dân Việt Nam, nếu biết ứng dụng khoa học

kỹ thuật hiện đại trong quá trình gieo trồng, chăm sóc, khai thác và chế biến gỗ hông một cách hiệu quả

Việc trồng thâm canh cây hông có ý nghĩa rất lớn, do cây hông lớn nhanh, tạo rừng nhanh nên phủ xanh đất trống đồi trọc, hạn chế tác hại của lũ lụt Gỗ hông quý hơn gỗ Pơ-mu do đặc tính của gỗ hông rất cứng và nhẹ, chịu lực cao, không bị cong vênh, cháy chậm nên được dùng ở những nơi mà tính trọng lượng nhẹ là một yếu tố vô cùng quan trọng như làm đồ nội thất cao cấp bên trong máy bay, tàu thuyền, xe cộ Ở Nhật Bản gỗ hông được sử dụng để làm nhà Gỗ hông còn được sử dụng để làm hộp đàn cao cấp như hộp đàn Piano, Guitar, Koto…cho âm thanh ổn định, tiếng ấm, khỏe, không ảnh hưởng bởi thời tiết, nhiệt độ

Ngoài ra cây hông còn có hàm lượng Cellulose cao 46 - 69%, hemicellulose 22

- 25%, lignin 21 - 23%, rất thích hợp để làm nguyên liệu cho một số ngành công

nghiệp quan trọng như sản xuất cồn công nghiệp, làm bột giấy in tiền (Ayan et al.,

2003; Woods, 2008)

Ngoài gỗ, lá cây hông có hàm lượng đạm cao và các nguyên tố vi lượng khác được dùng làm thức ăn cho gia súc Hoa hông được dùng để nuôi ong và làm thuốc chữa bệnh Hoa có màu trắng tím rất đẹp có thể trồng làm tăng thêm vẻ đẹp của cảnh quan đền chùa, khu du lịch, tạo vùng sinh thái mát mẻ Vỏ cây chế thuốc nhuộm, than đốt từ gỗ hông sử dụng làm than hoạt tính, sử dụng làm bột pháo hoa, bột chì màu

Về mặt lợi ích xã hội, việc trồng rừng sẽ tạo ra một nguồn nhân lực lớn cho công tác trồng, chăm sóc và bảo vệ Chính vì thế sẽ đảm bảo cung cấp việc làm tại chỗ cho các cư dân tại địa phương, giúp cho sự phát triển về nguồn lao động trong xã hội

Cây hông mọc nhanh, tạo rừng nhanh phủ xanh đất trống đồi trọc nên nhanh chóng phát huy tác dụng phòng hộ trong công tác bảo vệ rừng Việc nhân rộng trồng rừng bằng cây hông là giúp ngăn chặn dòng nước lũ, giảm tác hại của lũ lụt vì vậy sẽ giảm bớt thiệt hại cho cư dân quanh vùng

Lá cây hông có bản rộng, nhiều lông sẽ hữu ích cho việc lọc sạch bụi và khói, giảm thiểu ô nhiễm môi trường Ngoài ra, lá hông có chứa thành phần protein cao, nên khi lá rụng sẽ cung cấp một phần lớn chất dinh dưỡng cho đất, phục hồi các vùng đất cằn cỗi, hoang hóa, cành rơi lá rụng có tác dụng cải tạo và nâng cao độ phì đất

Gỗ hông có khả năng chống cháy, nhiệt độ cháy thông thường của gỗ từ 223 -

2570C, điểm cháy của gỗ hông ở nhiệt độ trên 4000C, dựa vào đặc điểm này người ta trồng cây hông làm đường băng xanh cản lửa, phòng chống cháy rừng

2.1.6 Tình hình nghiên cứu và phát triển cây hông trên thế giới và tại Việt Nam

2.1.6.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển trồng cây hông trên thế giới

Từ lâu cây hông đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm như Trung Quốc, Hoa Kỳ, vài thập niên trở lại đây có Australia và nhiều nước khác Nhờ có sự góp sức của công nghệ sinh học trong những năm gần đây các nhà khoa học đã lai tạo và tuyển chọn nhiều giống và dòng hông mới với nhiều đặc tính ưu việt

2.1.6.2 Tình hình nghiên cứu và phát triển trồng cây hông tại Việt Nam

Thực hiện dự án trồng mới 5 triệu hecta rừng từ năm 1998 đến 2010, bình quân mỗi năm phải trồng 360.000 ha rừng tập trung, do đó đòi hỏi một lượng cây giống vô cùng lớn Tuy nhiên việc trồng rừng không chỉ dừng ở mức phủ xanh đất trống đồi trọc hay trồng những loài cây mà gỗ của chúng chỉ dùng để làm nguyên liệu giấy, trong khi đó nhu cầu gỗ làm đồ gia dụng và đồ cao cấp ở Việt Nam và trên thế giới ngày càng tăng Vào tháng 12 năm 1998, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã xây dựng chương trình “Nâng cao chất lượng giống cây trồng lâm nghiệp thời kỳ 1999

- 2005” Trong chương trình này, Bộ đã đề cập đến việc phát triển cây hông trên cơ sở ứng dựng những tiến bộ của công nghệ sinh học, nhằm đảm bảo số lượng cũng như chất lượng cây giống

Để đưa những tiến bộ của Công nghệ sinh học vào chương trình trồng 5 triệu hecta rừng, được sự quan tâm, đầu tư kinh phí của Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, năm 1998 phòng Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hông bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào Đến nay, về cơ bản quy trình đã được hoàn thiện Từ năm

1999 đến nay đã có hàng trăm ngàn cây hông giống cung cấp cho nông dân và các chủ trang trại để trồng thử nghiệm trên các vùng sinh thái và đất đai khác nhau bước đầu

đã thu được nhiều kết quả đáng khích lệ Trong một hai năm đầu, cây hông sinh trưởng

không kém gì so với chỉ tiêu ở nước ngoài

Đã có một số mô hình trồng cây hông nhận được sự chú ý nhưng trồng cây hông xen canh với cây cà phê ở huyện Đak Hà, tỉnh Đak Nông với diện tích khoảng 32

ha Hay như mô hình trồng thử nghiệm ở một số điểm thuộc huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ cũng cho kết quả tốt với tỷ lệ sống 90%, khả năng sinh trưởng rất nhanh Có thể nói cây hông là cây lâm nghiệp có triển vọng, vừa có giá trị kinh tế cao, vừa có chức năng phòng hộ nhanh Có thể trồng phân tán, trồng thành rừng tập trung hoặc trồng theo phương thức nông lâm kết hợp (www.nongsinh.com)

2.2 Tầm quan trọng của ánh sáng lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

nuôi cấy in vitro

2.2.1 Vai trò của ánh sáng trong quang hợp ở thực vật

Sự sống trên trái đất phụ thuộc vào ánh sáng mặt trời, nguồn năng lượng ngoài trái đất được xem như vô tận Ánh sáng là điều kiện cho quá trình quang hợp xảy ra Mọi sự sống trên trái đất không thể tách rời quá trình này

Quang hợp là quá trình thu nhận năng lượng ánh sáng mặt trời của thực vật, tảo

và một số vi khuẩn để tạo ra các chất hữu cơ phục vụ bản thân cũng như làm nguồn thức ăn cho hầu hết các sinh vật trên trái đất Ở thực vật quang hợp chủ yếu được thực hiện nhờ diệp lục tố (chlorophyll) Sắc tố này thường chứa trong các bào quan gọi là lục lạp Mặc dù hầu hết các phần của nhiều loài thực vật đều có màu xanh, năng lượng của quá trình quang hợp chủ yếu được thu nhận từ lá

Phương trình tổng quát của quang hợp ở thực vật được biểu diễn như sau:

2.2.2 Sắc tố quang hợp

Trong lu ̣c la ̣p có 3 nhóm sắc tố chính là chlorophyll, calotenoid và phicobilin Ở thực vâ ̣t bâ ̣c cao có c hlorophyll, carotenoid, còn ở thực vật bậc thấp có thêm nhóm phicobilin

 Sắc tố quang hơ ̣p Chlorophyll

Năm 1913, Winstater đã xác đi ̣nh được cấu ta ̣o của phân tử chlorophyll Cấu trúc cơ bản của chlorophyll là nhân porphyrin Nhân porphyrin do 4 vòng pyrol nối với nhau bằng các cầu metyl tạo thành vòng khép kín Giữa nhân có nguyên tử Mg tạo nên cấu trúc dạng hem Bên cạnh các vòng pyrol còn có vòng phụ thứ 5 Điều đặc biệt quan trọng là trên nhân porphyrin hình thành 10 nối đôi cách là cơ sở của hoạt tính quang hoá của chlorophyll Từ nhân porphyrin có hai gốc rượu là metol (CH3OH) và fytol (C20H39OH) nối vào tại C10 và C7

Có nhiều loại phân tử chlorophyll Các loại chlorophyll đều có phần cấu trúc giống nhau, đó là nhân porphyrin và 2 gốc - OH Mỗi loại chlorophyll được đặc trưng riêng bởi các nhóm bên khác nhau tạo nên một số tính chất khác nhau Chlorophyll là chất có hoạt tính hoá học cao, vừa có tính axit, vừa có tính kiềm Đặc biệt chlorophyll

có những tính chất lý học quan trọng giúp cho chúng thực hiện chức năng quang hợp

Tính chất lý học quan trọng nhất là chlorophyll có khả năng hấp thụ năng lượng áng sáng chọn lọc Quang phổ hấp thụ cực đại của chlorophyll vùng tia xanh (λ: 430 -

460 nm) và vùng ánh sáng đỏ (λ: 620 - 700 nm) Nhờ khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nên chlorophyll có hoạt tính quang hoá Khi hấp thụ năng lượng từ các lượng tử ánh sáng, năng lượng của các lượng tử đã làm biến đổi cấu trúc của chlorophyll làm cho phân tử chlorophyll trở thành trạng thái giàu năng lượng - trạng thái kích động điện tử

Ở trạng thái đó phân tử chlorophyll thực hiện các phản ứng quang hoá tiếp theo Một tính chất quan trọng khác của chlorophyll là có khả năng huỳnh quang Nhờ này mà năng lượng được truyền qua các hệ sắc tố để tập trung vào hai tâm quang hợp

Nhờ những tính chất trên nên chlorophyll là sắc tố có vai trò quan trọng trong quang hợp Chlorophyll tiếp nhận năng lượng ánh sáng truyền năng lượng đó thành năng lượng điện tử của chlorophyll để rồi biến đổi năng lượng điện tử thành năng lượng hoá học tích trữ trong ATP cung cấp cho quá trình tổng hợp chất hữu cơ

Hình 2.3 Quang phổ hấp thu ̣ của các chất diê ̣p lu ̣c a và b

(en.wikipedia.org/wiki)

 Sắc tố quang hơ ̣p Carrotenoid

Carrotenoid là nhóm sắc tố phụ tạo nên các loại màu sắc của cây xanh Carotenoid gồm 2 nhóm có thành phần khác nhau: carroten và xanthophyll

+ Carroten: có công thức tổng quát C40H56

+ Xanthophyll:có công thức tổng quát C40HnOm (trong đó: n = 52¸ 58; m = 1¸ 6)

Carotenoid cũng có khả năng hấp thụ ánh sáng chọn lọc Quang phổ hấp thụ cực đại của nhóm sắc tố này nằm ở khoảng 420 - 500 nm Như vậy nhóm này hấp thụ ánh sáng có bước sóng ngắn Nhóm carrotenoid hấp thụ khoảng 10-20% tổng năng lượng ánh sáng và hấp thụ 30 - 50% tổng bức xạ sóng ngắn chiếu vào lá

Carotenoic cũng có khả năng truyền năng lượng ánh sáng sang cho chlorophyll

để chuyển đến 2 tâm quang hợp Chức năng chính của nhóm sắc tố này là hấp thụ năng lượng ánh sáng rồi truyền sang cho chlorophyll

Một chức năng rất quan trọng khác của carotenoic là bảo vệ chlorophyll Có thể xem carotenoic là cái lọc ánh sáng thu bớt năng lượng của các tia bức xạ có năng lượng lớn, nhờ đó bảo vệ cho chlorophyll tránh bị phân huỷ khi chịu tác động của các tia bức xạ có năng lượng lớn

 Sắc tố quang hơ ̣p Ficobilin

Ficobilin là nhóm sắc tố phụ phổ biến ở thực vật bậc thấp Ficobilin cũng có 2 nhóm khác nhau: Ficocyanin và Ficoerytrin Cấu trúc Ficobilin gồm 4 vòng pyrol nối với nhau bằng cầu metyl tạo nên dạng mạch thẳng Ficobilin hấp thụ ánh sáng ở vùng

có bước sóng trung bình (λ = 540 - 620 nm) (Nguyễn Bá Lô ̣c và ctv, 2006)

2.2.3 Ảnh hưởng của ánh sáng đến quang hợp

2.2.3.1 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sự quang hợp ở thực vật

Biên độ ánh sáng tác động đến quang hợp khá rộng Quang hợp có thể tiến hành ngay ở điều kiện ánh sáng có cường độ thấp như áng sáng trắng, ánh sáng đèn dầu Tuy nhiên ở điều kiện ánh sáng yếu thì quang hợp xảy ra rất yếu, sản phẩm tạo ra không đủ bù cho lượng chất hữu cơ bị hô hấp phân hủy Ở điều kiện ánh sáng này quang hợp biểu kiến có trị số âm

Khi cường độ ánh sáng tăng, cường độ quang hợp tăng lên đến mức bằng cường

độ hô hấp thì quang hợp biểu kiến đạt trị số không Trị số ánh sáng mà quang hợp biểu kiến bằng không là điểm bù ánh sáng Tuỳ nhóm thực vật mà điểm bù ánh sáng thay đổi từ 25 - 85 Kcalo/dm2/giờ, cường độ hô hấp bằng cường độ quang hợp và đạt 1 - 3 mg/CO2/dm2/giờ

Cường độ quang hợp tiếp tục tăng tỷ lệ thuận với cường độ ánh sáng cho đến khi ánh sáng đạt đến điểm no ánh sáng Điểm no ánh sáng là cường độ ánh sáng mà khi vượt qua điểm đó cường độ quang hợp không thay đổi hoặc có chiều hướng giảm xuống mặc dù cường độ ánh sáng tiếp tục tăng

Tùy nhóm cây mà điểm no ánh sáng dao động khoảng 2000 -6000 Kcalo/dm2/h Đối với thực vật C4 hầu như không có điểm no ánh sáng vì ở nhóm thực vật này cường độ ánh sáng tăng, cường độ quang hợp tăng liên tục mà không có điểm dừng Đối với thực vật C3 khi ánh sáng có cường độ quá mạnh làm giảm quá trình quang hợp Quang hợp giảm do ánh sáng có cường độ mạnh làm phá huỷ cấu trúc bộ máy quang hợp, có ảnh hưởng xấu đến quá trình oxi hoá của sắc tố, làm giảm hoạt tính enzym quang hợp

Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến quang hợp còn phụ thuộc vào nhiều yếu

tố khác Trước hết, thành phần loài khác nhau có nhu cầu ánh sáng khác nhau Các loài

ưa sáng có nhu cầu ánh sáng mạnh hơn các loài ưa bóng Sự thích nghi với chế độ chiếu sáng của các nhóm cây một phần liên quan đến hàm lượng sắc tố và tỷ lệ các

loại sắc tố trong lá Cây ưa sáng có hàm lượng sắc tố thấp, tỷ lệ chla/chlb cao hơn cây

ưa bóng

Ảnh hưởng của ánh sáng đến quang hợp còn liên quan đến tỷ lệ các tia sáng, tỷ

lệ tia sáng lại phụ thuộc kiểu chiếu sáng Ánh sáng trực xạ có tỷ lệ tia sinh lý thấp hơn ánh sáng tán xạ nên Ánh sáng tán xạ có ảnh hưởng đến quang hợp tốt hơn ánh sáng trực xạ Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến quang hợp còn liên quan đến các yếu

tố khác như hàm lượng CO2 trong môi trường, nhiệt độ, độ ẩm, chất dinh dưỡng (Nguyễn Bá Lô ̣c và ctv, 2006)

2.2.3.2 Ảnh hưởng của chất lượng ánh sáng lên sự quang hợp ở thực vật

Các loại tia sáng khác nhau có tác dụng lên quang hợp không giống nhau Tuy nhiên hiệu quả quang hợp sẽ tăng lên, nếu sử dụng phối hợp hợp lý giữa các tia Theo nghiên cứu của Emerson (1957) nếu chiếu xen kẽ giữa tia sáng có λ > 680 nm (tia đỏ) với tia sáng có λ < 650 nm sẽ làm nâng cao hiệu suất quang hợp rõ rệt, dó là "hiệu ứng Emerson" Hiệu ứng khác nhau của các tia sáng khác nhau đến quang hợp chỉ xảy ra trường hợp cường độ ánh sáng dưới điểm no Khi cường độ đạt đến điểm no thì giá trị tia sáng với quang hợp như nhau

Thành phần ánh sáng không chỉ ảnh hưởng đến cường độ quang hợp mà còn thay đổi sản phẩm quang hợp Với ánh sáng có bước sóng ngắn, sản phẩm tạo ra trong quang hợp chứa nhiều axit amin, protein hơn so với ánh sáng bước sóng dài Ngược lại ánh sáng bước sóng dài lại tạo ra nhiều gluxit hơn ánh sáng bước sóng ngắn

Ánh sáng có hưởng hưởng sâu sắc đến quang hợp như vậy nên trong thực tiễn sản xuất việc áp dụng các biện pháp thích hợp để bảo đảm nhu cầu ánh sáng cho cây trồng có ý nghĩa quyết định đến năng suất và phẩn chất cây trồng (Nguyễn Bá Lô ̣c và ctv, 2006)

2.2.4 Tầm quan trọng của nhân tố ánh sáng trong vi nhân giống

Sự phân phối phổ ánh sáng, quang kỳ và hướng chiếu sáng cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của thực vật nuôi cấy mô Ánh sáng là một yếu

tố ảnh hưởng lên quá trình tạo rễ và chồi bất định của đoạn cắt Chỉ cần cường độ ánh sáng thấp cho quá trình tạo rễ, vì cường độ ánh sáng cao sẽ ngăn cản sự tạo rễ Đối với một số loài, quang kỳ có thể ảnh hưởng đến sự ra rễ Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự ra rễ Ánh sáng đỏ, cam thích hợp cho sự ra rễ hơn xanh da trời

Sự phát sinh hình thái thực vật bị ảnh hưởng bởi các nhân tố của môi trường

như nhiệt độ, CO2, chất dinh dưỡng, chất lượng ánh sáng, thời gian và cường độ chiếu sáng Những nhân tố này ảnh hưởng đến sự tăng trưởng chồi và phát sinh hình thái bên cạnh vai trò của nó trong quang hợp Cường độ chiếu sáng bên cạnh tác dụng điều hòa kích thước lá và thân cũng như con đường phát sinh hình thái, nó còn có ảnh hưởng

đến sự hình thành sắc tố của cây con in vitro Chất lượng ánh sáng có ảnh hưởng quan

trọng đến một số đặc tính hình thái như sự kéo dài ở cây cúc và cây cà chua, sự hình thành chồi bất định của cây Nho, sự phát sinh rễ giả ở cây Lê Ánh sáng là nguồn năng lượng cho quang hợp và điều hòa nhiều nhân tố cần thiết cho sự phát triển của thực vật Vì vậy khi trồng cây, khoảng cách, sự kiểm soát và cung cấp đủ ánh sáng là rất cần thiết (Dương Tấn Nhựt, 2009)

2.2.5 Các nguồn sáng nhân tạo được sử dụng trong nhân giống in vitro

Việc sử dụng ánh sáng nhân tạo trong nhân giống in vitro đòi hỏi phải cân bằng

giữa các quá trình sinh lý của thực vật và các vấn đề về kinh tế của người trồng Ánh sáng khác nhau về chất lượng, cường độ và thời gian chiếu sáng Mỗi đặc tính này đều

có ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật Tổng lượng ánh sáng mà cây thu nhận trong suốt quá trình chiếu sáng có tác động trực tiếp lên quang hợp, sự tăng trưởng và năng suất cây Sự tác động này có thể đo được dựa trên sự tăng trưởng kích thước cây

Hiện nay ánh sáng trắng (400 - 700 nm) của đèn huỳnh quang được sử dụng phổ biến nhất trong các phòng nuôi cấy mô Ánh sáng đơn sắc từ đèn LEDs (đi ốt phát quang) cũng đã và đang được nghiên cứu làm nguồn sáng trong nhân giống thực vật

Sử dụng ánh sáng đơn sắc đỏ (600 - 700 nm) hoặc đỏ xa (700 -800 nm) hoặc kết hợp

với xanh lam của đèn LEDs làm cây in vitro tăng trưởng rất tốt, để tiết kiệm điện năng

hơn so với dùng đèn huỳnh quang (Dương Tấn Nhựt, 2009)

2.3 Tổng quan về đèn LED

2.3.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển

LED (Light Emitting Diode hay đi ốt phát quang) là những đi ốt có khả năng phát ra ánh sáng hay tia hồng ngoại Cũng giống như đi ốt LED được cấu tạo từ một khối bán dẫn loại p ghép với một khối bán dẫn loại n

Bắt đầu xuất hiện vào những năm đầu thiên niên kỷ, đèn LED (Light Emitting Diode) vốn là sản phẩm từ linh kiện bán dẫn phát sáng, giống như đèn neon nhưng tuổi thọ cao hơn đèn neon gấp 50 - 100 lần, hiệu suất phát sáng lên đến gần cả trăm lumens/watt Do tiêu hao nhiệt rất ít nên đèn LED không gây nóng môi trường xung

quanh, không phát ra tia cực tím

Từ năm 1974 đến tháng 10/2009 có 2.272 sáng chế về LED Nhìn bản đồ sáng chế của LED qua các năm, có thể nhận thấy con đường phát triển của công nghệ LED chia làm 2 chặng rõ rệt Từ những năm 2000 trở về trước, sáng chế LED chỉ dừng ở con số hàng chục thì từ năm 2000 đến nay, số lượng sáng chế về LED tăng vọt, đạt đến con số hàng trăm Các công ty sở hữu các sáng chế LED chính là các công ty điện tử có bề dày phát triển và có thế mạnh trên thị trường Dẫn đầu là tập đoàn chiếu sáng số 1 Philips với 164 sáng chế, thứ hai là Cree Inc với 33 sáng chế, một số tập đoàn điện tử khác cũng đã ghi tên mình trên bản đồ sáng chế là Gelcore LLC (28), Osram (27), Siemens (23), Samsung (20), LG (17), Univ (15)

(ledviet.com.vn)

Hình 2.4 Một số loại đèn LED

(ledviet.com.vn)

2.3.2 Cấu tạo đèn LED

Quy trình chế tạo đèn LED trải qua hai giai đoạn chính là chế tạo tim đèn rồi gắn với hai điện cực tạo thành bóng đèn Hai điện cực này có độ dài khác nhau, chân dài là anod (điện cực dương), ngắn hơn là catod (điện cực âm) Tim đèn là phần nối giữa hai điện cực, gọi là LED chip, được làm bằng vật liệu bán dẫn Dòng điện một chiều đi qua làm chuyển động khuếch tán các điện tích âm và dương giữa hai điện cực,

và giải phóng năng lượng dưới dạng ánh sáng Tùy vào loại vật liệu bán dẫn dùng để

chế tạo LED chip mà cho ra các đèn LED với màu sắc khác nhau Aluminum gallium arsenide (AlGaAs) tạo ra LED đỏ, aluminum gallium phosphide (AlGaP) cho ra LED xanh lá, indium gallium nitride (InGaN) cho ra LED xanh biển, GaP cho ra LED vàng…Đèn LED trắng là sự kết hợp của đèn LED đỏ, xanh lá và xanh biển Cách thứ hai để tạo ra đèn LED trắng là phủ một lớp phosphor vàng vào đèn LED xanh biển

Tùy theo mức năng lượng giải phóng cao hay thấp mà bước sóng ánh sáng phát ra khác nhau (tức màu sắc của LED sẽ khác nhau) Mức năng lượng (và màu sắc của LED) hoàn toàn phụ thuộc vào cấu trúc năng lượng của các nguyên tử chất bán dẫn (ledviet.com.vn)

Hình 2.5 Cấu tạo của một bóng đèn LED

(ledviet.com.vn)

2.3.3 Ứng dụng của đèn LED

Các LED phát ra tia hồng ngoại được dùng trong các thiết bị điều khiển từ xa cho đồ điện tử dân dụng Đèn LED trắng nói riêng và đèn LED nói chung có nhiều ứng dụng rộng rãi mà đèn huỳnh quang không làm được như đèn xe, đèn đường, đèn hầm mỏ, đèn chiếu hậu cho màn hình của điện thoại cầm tay, đèn chiếu hậu cho màn hình tinh thể lỏng (LCD), in ấn kỹ thuật số, làm linh kiện cho các sản phẩm điện tử cầm tay…Làm đèn báo hiệu trong giao thông Trong ngành quảng cáo đèn LED được ứng dụng rộng rãi để làm các bảng điện tử tại các nơi công cộng như: sân bay, ngân hàng, các trung tâm thương mại, siêu thị…

Một đặc điểm khác của đèn LED là ít tiêu hao năng lượng và không nóng Bóng đèn truyền thống, đèn neon, đèn halogen đều cần từ 110 - 220 V mới cháy

được, trong khi đèn LED trắng chỉ cần từ 3 - 24 V để phát sáng Do ít tiêu hao năng lượng nên đèn LED có thể sử dụng ở vùng sâu vùng xa mà không cần nhà máy điện công suất cao (ledviet.com.vn)

2.3.4 Tình hình nghiên cứu

2.3.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Một số nước như Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Hàn Quốc cũng đã và đang sử dụng đèn LED xanh và đỏ với nhiều tỷ lệ để chiếu sáng cho từng giai đoạn phát triển của cây trong ống nghiệm Một vài cây trồng đã được báo cáo là đã trồng thành công dưới

hệ thống LED bao gồm: Cây Tiêu, Dưa, Lúa Mì, Bó Xôi (Bula và cộng sự.1991; Hoenecke.1992; Brown và Schuerger.1993, 1994; Yanagi và Okamoto.1994) Cây Khoai Tây nuôi cấy trong ống nghiệm (Miyashita và cộng sự 1995) Cây Tsuru-rindo

(Tripterospermum japonicum) (Moon và cộng sự 2006)

2.3.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Từ năm 1996 đến năm 2007, Dương Tấn Nhựt cùng các cộng sự đã ứng dụng thành công hệ thống phát sáng LED trên một số loại cây trồng như cây Dâu Tây, cây Bạch Đàn, cây Địa Lan, cây Hồ Điệp, cây Chuối, cây Lan Ý, cây Lily, cây Cúc và cây Lan Hài Những cây trồng nuôi cấy dưới hệ thống đèn LED không những sinh trưởng

và phát triển tốt ở điều kiện in vitro, mà còn cả ở điều kiện ex vitro Những nghiên cứu

về giải phẫu học, quang hợp cũng chứng minh rằng những cây nuôi cấy mô dưới hệ thống LED thì tốt hơn khi so sánh với hệ thống chiếu sáng bằng đèn neon

2.3.5 Cơ sở của viê ̣c sử du ̣ng đèn LED trong nuôi cấy mô tế bào thực vâ ̣t

LED có những đă ̣c tính tốt hơn so với các nguồn ánh sáng khác như : đèn huỳnh quang, đèn hơi kim loa ̣i , đèn natri cao áp Bước sóng của nó phát ra rất đă ̣c biê ̣t , chiều

rô ̣ng của va ̣ch quang phổ ngắn như ánh sáng đơn sắc đỏ (600 - 700 nm) hoặc đỏ xa (700 -800 nm) trong khi đèn huỳnh quang (400 – 700 nm), do vậy hiê ̣n nay LED đươ ̣c sử du ̣ng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu về quang sinh ho ̣c như là : sự tổng hơ ̣p chlorophyll (Tripathy và Brown , 1995), quang hơ ̣p (Tennessen và cô ̣ng sự , 1994) và phát sinh hình thái (Hoenecke và cô ̣ng sự, 1992; Robin và cô ̣ng sự, 1994)

Các đi ốt phát sáng LED là một nguồn năng lượng điện hứa hẹn cho cá c phòng nuôi cấy mô Gần đây, Hahn và cô ̣ng sự (2000) đã báo cáo rằng tốc đô ̣ quang hợp của

cây Rehmannia glutinose nuôi cấy in vitro là rất cao dưới hệ thống đèn LED hỗn hợp

(50% LED xanh và 50% LED đỏ) hoă ̣c dưới ánh đèn huỳnh quang Trong khi đó, cây

con nuôi cấy dưới hê ̣ thống LED xanh hoă ̣c LED đỏ có tốc đô ̣ q uang hợp thực rất thấp Cường đô ̣ photon cao của LED xanh và LED đỏ và đô ̣ dài bước đă ̣c trưng của chúng làm cho hệ thống đèn mới này mang lại nhiều thuâ ̣n lợi

Dưới ánh sáng LED đỏ, lá của cây con được kéo dài và lượng chlorophyll giảm

đi Trước đó người ta đã biết rằng đèn LED đỏ có tác du ̣ng kéo dài thân và mở rô ̣ng lá (Hoenecke và cô ̣ng sự , 1992) Trong nghiên cứu của ho ̣, trọng lượng tươi và khô của cây con dưới hê ̣ thống LED đỏ giảm ít hơn dưới hê ̣ thống đèn LED xanh Có sự giảm

đă ̣c biê ̣t tro ̣ng lượng rễ dưới hê ̣ thống đèn chỉ có LED đỏ hoă ̣c chỉ có LED xanh Những cây con có thân được kéo dài dưới hê ̣ thống LED đỏ có thân mảnh, lá hơi vàng,

có lượng chlorophyll, tốc đô ̣ quang hợp, trọng lượng tươi của đỉnh và rễ cũng thấp hơn

so với những cây được nuôi dưới hê ̣ thống kết hợp đỏ và xanh

Phản ứng của cây con đươ ̣c nuôi cấy dưới tỷ lê ̣ ánh sáng đỏ và xanh khác nhau tùy thuộc vào loài thực vật Công viê ̣c đóng vai trò quyết đi ̣nh chính là xác đi ̣nh được

tỷ lệ ánh sáng xanh và đỏ thích hợp cho sự phát triển của cây Hahn và cô ̣ng sự (2000) đã nhâ ̣n thấy rằng chiều dài chồi dưới điều kiê ̣n đèn LED xanh hoă ̣c đỏ đều lớn hơn dưới điều kiê ̣n ánh sáng LED hỗn hợp hay đèn huỳnh quang , cây tăng trưởng vượt bâ ̣c nhưng yếu ớt Dưới ánh sáng LED hỗn hợp hay đèn huỳnh quang , thân cây không cao bằng so với dưới điều kiê ̣n đèn LED xanh hoă ̣c đỏ nhưng khỏe ma ̣nh Mô ̣t số kết quả thu đươ ̣c trong các nghiên cứu này cho tỷ lê ̣ đỏ xanh tối ưu của mô ̣t số loài thực vâ ̣t khi nuôi cấy dưới hê ̣ thống đèn LED như : Cây Dâu Tây tăng trưởng khỏe ma ̣nh khi đươ ̣c nuôi cấy dưới nhiều tỷ lê ̣ ánh sáng xanh đỏ khác nhau nhưng chúng tăng trưởng tốt nhất ở điều kiê ̣n 70% ánh sáng LED đỏ và 30% ánh sáng LED xanh Cây Ba ̣ch Đàn, cây Địa Lan, cây Hồ Điê ̣p , cây Chuối và cây Lan Ý tăng trưởng tốt dưới điều kiê ̣n 80% ánh sáng LED đỏ và 20% ánh sáng LED xanh Các kết quả này cũng cho thấy sự tăng trưởng của cây con được nuôi cấy dưới hê ̣ thống đèn LED đỏ và xa nh đều chịu ảnh hưởng bởi LED xanh (Dương Tấn Nhựt, 2009)

2.4 Giới thiệu về hệ thống bioreactor trong nuôi cấy mô

2.4.1 Giới thiệu chung

Ngày nay, việc nghiên cứu cải thiện các quy trình nhân giống thực vật nhất là cây hoa cảnh trong ống nghiệm rất được quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên khắp thế giới Để ứng dụng của hệ thống vi nhân giống thông thường trên môi trường thạch vào quy mô công nghiệp nhằm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh, giảm chi phí giá thành,

tăng hệ số nhân giống Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp nuôi cấy trong môi trường lỏng có hay không có lắc Kỹ thuật này cho phép đạt được hệ số nhân chồi, tạo phôi soma, PLB (protocom-like body: thể giống protocom) nhiều hơn so với trên môi trường thạch

Tuy nhiên khi nuôi cấy trên môi trường lỏng, mẫu cấy bị trương nước và bị hiện tượng thủy tinh thể do ngập nước quá lâu trong môi trường, ngoài ra mẫu còn

bị những tổn thương do quá trình lắc Vì vậy để kết hợp những ưu điểm của hệ thống nuôi cấy trên thạch với nuôi cấy lỏng, vào năm 1983, Harris và Mason đã thiết kế hai hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời là hệ thống nuôi cấy nghiêng và

hệ thống Rocker Ít lâu sau, vào năm 1985, Tisserat và Vandercook đã thiết kế một

hệ thống nuôi cấy tự động APCS, đây là hệ thống có thể thay thế được môi trường

và có thể sử dụng nuôi cấy trong một thời gian dài mà không cần cấy chuyền Ngoài

ra còn có một số hệ thống ngập chìm tạm thời một phần hay toàn phần được điều khiển tự động bằng máy tính hay bán tự động Hiện nay đáng chú ý là hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA của hãng Cirad, Pháp; BIT Twin Flask của Cuba

đã được khảo sát và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau Bioreactor từng được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp vi sinh, sản xuất các hoạt chất sinh học có nguồn gốc từ động vật và thực vật Việc sử dụng bioreactor cho nhân giống thực vật được báo cáo đầu tiên vào năm 1981 với nghiên cứu của tác giả Takayama trên đối tượng là cây Begonia (Takayama và Miasawa, 1981) Về sau hệ thống này còn được ứng dụng có hiệu quả trên nhiều loài thực vật khác (Takayama, 1994)

Sử dụng một bioreactor cỡ nhỏ (từ 4 - 10 lít) trong khoảng 1 - 2 tháng có thể tạo ra đến 4.000 - 20.000 cây con Điều này cho thấy khả năng và triển vọng to lớn của việc áp dụng hệ thống bioreactor trong vi nhân giống thương mại, đồng thời mở

ra một hướng mới trong sản xuất các sản phẩm có hoạt tính sinh học có nguồn gốc

từ thực vật (Takayama, 1994) Nuôi cấy lỏng lắc là bước đầu tiên đơn giản nhất trong nu6i cấy lỏng thoáng khí Về sau để đáp ứng với quy mô công nghiệp ngày càng lớn cũng như nhằm tạo sự điều khiển tự động trong nuôi cấy thực vật, hệ thống bioreactor đã ra đời Mục đích của nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor là tăng nhanh số lượng lớn sinh khối, nuôi cấy huyền phù tế bào nhằm chiết xuất các hoạt chất sinh học thứ cấp và đồng thời giúp giảm chi phí trong nhân giống thực vật

Bioreactor được mô tả là một bình phản ứng có những tính chất sau: nuôi cấy

trong điều kiện vô trùng, nuôi cấy trong môi trường lỏng, số lượng mẫu cấy nhiều,

có khả năng tự động hóa, vi tinh hóa thông qua vi điều khiển các yếu tố môi trường như mức độ khuấy trộn, thoáng khí, nhiệt độ, oxy, pH, (Peak và cộng sự, 2005)

2.4.2 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản của hệ thống bioreactor

Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi Teisson và cộng sự năm 1999: Thứ nhất, tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy Thứ hai, cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ, cung cấp sự hòa trộn đầy đủ Thứ ba là có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động Cuối cùng là hạn chế sự nhiễm, giá thành hạ

Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm đều phải tuân theo một nguyên tắc là phải có khả năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo chu kỳ xác định Các hệ thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với hệ thống mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển Các mẫu cấy thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa polypropylene thành một cụm, điều này giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuôi cấy thông thường

Tóm lại hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ phận chủ yếu sau: Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để hút môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại Hệ thống cài đặt thời gian dùng để điều khiển chu kỳ ngập Hệ thống ống dẫn và van điều khiển Các màng lọc Bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý

để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời, nhiều nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các

hệ thống ngập khác nhau, tùy vào mục đích nuôi cấy (Peak và cộng sự, 2005)

2.4.3 Hệ thống Plantima®

Hệ thống này được thiết kế tổng thể là một bình chứa 1 L gồm có hai phần, phần trên chứa mẫu cấy và phần dưới chứa môi trường Một áp suất vượt mức tác động vào môi trường lỏng chứa trong phần dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì Trong suốt thời gian ngập, không khí được sục vào trong môi trường lỏng, môi trường được chuyển động làm cho mẫu cấy xoay trở được các mặt tiếp xúc với bề mặt môi trường, áp suất vượt mức sau đó được thoát ra bên ngoài nhờ một ngõ

ra phía trên đầu hệ thống

Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi Công ty A-tech Bioscientific tại đảo Ðài Loan Cấu tạo và phương pháp vận hành cơ bản (Hình 2.6, Hình 2.7):

Hình 2.6 Các bộ phận của hệ thống Plantima

(www.hcmbiotech.com.vn)

Hệ thống Plantima® hoạt động theo chu kỳ gồm 4 pha như sau:

- Pha 1: mô không ngập trong môi trường

- Pha 2: hiện tượng ngập được hoạt hóa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy môi trường lỏng lên ngập mô cấy

- Pha 3: sự trao đổi khí trong hệ thống Plantima®

- Pha 4: chu kỳ kết thúc, các van đóng lại và môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới

Hình 2.7 Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập

(www.hcmbiotech.com.vn)

2.4.4 Ưu điểm và khuyết điểm của hệ thống bioreactor

2.4.4.1 Ưu điểm

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System, TIS) có tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh phôi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi của cây được nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời luôn cao hơn so với những cây nuôi cấy trong hệ thống thông thường trên môi trường rắn hay trong những hệ thống bioreactor thông thường Cây tái sinh và phôi soma thu được trong

hệ thống này luôn có chất lượng tốt hơn Từ đó cây có nguồn gốc từ hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời có tỷ lệ sống sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh

Có thể nói hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã kết hợp thành công những ưu điểm của hệ thống nuôi cấy rắn thoáng khí và hệ thống nuôi cấy lỏng giúp cây tránh được những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên môi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng Chu kỳ và tần số ngập chìm là những chỉ số chủ yếu ảnh hưởng đến sự phát triển của mẫu cấy cũng như toàn bộ quy trình nhân giống Khi những chỉ số này được tối ưu hóa, sản lượng sẽ được gia tăng, quá trình kiểm soát

sự phát sinh hình thái tốt hơn và còn có khả năng hạn chế tối đa hiện tượng thủy tinh thể Ðây là ưu điểm lớn nhất của hệ thống TIS so với hệ thống bioreactor thông thường

Hệ thống TIS tiết kiệm được công lao động và không gian phòng nuôi cấy và giảm được chi phí sản xuất Những quá trình nhân nhanh phôi soma, tái sinh nhiều chồi, tạo củ bi có khả năng được tối ưu hoá trên nhiều đối tượng cây trồng từ đó giảm được chi phí sản xuất một cách đáng kể (Dương Tấn Nhựt, 2009)

2.4.4.2 Khuyết điểm

Mật độ nuôi cấy là một yếu tố không kém phần quan trọng nhưng hiện nay

vẫn chưa được khảo sát một cách sâu rộng Thời gian ngập tối ưu phải được khảo sát và xác định chính xác cho từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây cũng như thời gian giữa các lần cấy chuyền đối với những hệ thống không thể bổ sung môi trường mới, cuối cùng là phải khảo sát tối ưu hóa thành phần môi trường cho từng giai đoạn nuôi

Hiện nay, nhiều nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy

ngập chìm tạm thời về mặt vật lý là rất cần thiết để có thể tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trong những hệ thống này Một ưu điểm khác của hệ thống này trong việc giảm được hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết

ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy của mẫu cấy vẫn chưa được đánh giá chính xác

Trong điều kiện Việt Nam hiện nay, giá thành của những hệ thống nuôi cấy TIS tương đối cao do phải nhập từ nước ngoài như Pháp, Cuba, Đài Loan do đó nếu muốn ứng dụng rộng rãi thì những hệ thống này nhất thiết phải được nghiên cứu thiết kế ngay trong nước để giảm giá thành Ngoài ra, những thông số kỹ thuật của

hệ thống này cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây, có được những điều kiện như vậy thì mới có khả năng áp dụng hệ thống TIS rộng rãi trong sản xuất cây giống (Dương Tấn Nhựt, 2009)

2.4.5 Một số thành tựu trong hệ thống bioreactor

Môi trường lỏng là môi trường đã sử dụng trong nuôi cấy tế bào, phôi soma hay cơ quan thực vật kể cả trong nuôi cấy tĩnh hay các kiểu bioreactor khác nhau Mặc dù trước đây bioreactor chủ yếu được sử dụng trực tiếp cho nuôi cấy huyền phù tế bào và sản xuất sản phẩm thứ cấp, nhưng gần đây cũng có nhiều bioreactor được cải tiến để tạo phôi soma trên một số giống cây Việc nuôi cấy trong môi trường lỏng bằng hệ thống huyền phù tạm thời với các tần suất khác nhau của huyền phù đã được báo cáo là cải thiện chất lượng cây trồng và tốc độ nhân giống của chuối, cà phê, cao su Bioreactor cũng được sử dụng cho nuôi cấy tế bào rễ bằng hệ thống tạo rễ thứ cấp Việc sử dụng bioreactor giúp cho việc tạo rễ và phát sinh chồi cây hoa cẩm chướng đã được báo cáo là cải thiện quá trình tăng sinh khối (Chatterjee và cộng sự, 1997)

Bioreactor hiện nay đã và đang được sử dụng trong việc vi nhân giống thương mại ở Mỹ, Nhật, Hàn Quốc, Cuba, Rica, Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Pháp trên cây cảnh và cây cho củ như dứa, cây lâm nghiệp Một số báo cáo gần đây của Takayama và Akita (1998) nói về một vài kỹ thuật sử dụng bioreactor trong nhân giống tạo số lượng lớn các giống cây khoai tây, hoa lay-ơn, hoa Lily, dâu tây, lan dạ

hương, loa kèn đỏ và một số giống Areceae (Dương Tấn Nhựt, 2009)

2.4.6 Thuận lợi và khó khăn trong nuôi cấy khi sử dụng hệ thống bioreactor 2.4.6.1 Thuận lợi

Nuôi cấy được các mẫu ngập chìm và phân bố theo không gian 3 chiều nên tiết kiệm được không gian, tăng cường được sự khoáng khí nên kích thích mẫu phát triển nhanh Khi nuôi cấy ngập chìm và được di chuyển tự do trong môi trường, hiệu ứng ưu thế ngọn bị biến mất và các chồi phát triển tương đối đồng đều nhau

Có sự tiếp xúc tốt hơn giữa sinh khối thực vật với môi trường, không có sự hạn chế về trao đổi khí, có thể điều khiển sinh khối thực vật tùy theo thể tích môi trường, tiết kiệm được thời gian và nhân công trong việc nuôi cấy chuyền, dễ dàng cho nhân giống số lượng lớn tạo nhiều sinh khối, dễ dàng điều khiển được thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy, tốc độ sinh trưởng và phát triển tăng hơn nếu được tăng cường không khí, mẫu cần tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên tốc độ sinh trưởng và phát triển được tăng nhanh, nhờ việc liên tục di chuyển trong môi trường cấy nên ít xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ cảu chồi biến mất và kết quả tạo được nhiều chồi hơn (Takayama và cộng sự, 1994)

2.4.6.2 Khó khăn

Tùy vào đối tượng mà thiết kế một kiểu bioreactor thích hợp, khó áp dụng đồng loạt cho nhiều giống khac nhau, thường gặp hiện tượng bất thường về phát sinh hình thái như hiện tượng thủy tinh thể, hiện tượng bất thường của phôi, hiện tượng stress tế bào Những hiện tượng trên làm giảm hiệu suất nhân giống và sàn xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp

Trong nuôi cấy môi trường lỏng rất dễ bị nhiễm vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, nấm mốc) Đây là nguyên nhân chủ yếu gây mất nguồn mẫu thực vật trong các phòng thí nghiệm thương mại Vì là môi trường lòng nên sự lây nhiễm vi sinh vật sẽ xảy ra rất nhanh và gây hậu quả nghiêm trong ơn so với các môi trường khác (rắn, bán rắn) Sự lây nhiễm có thể xuất phát từ các giai đoạn thao tác chuẩn bị và điều khiển thiết bị Trong một số phòng thí nghiệm để hạn chế nguy cơ bị nhiễm thì người ta thường tạo một không gian vô trùng trong phòng cấy bằng dòng khí tạo áp lực dương (Ziv, 1999)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật (PILOT thực nghiệm) ở Viện Sinh học Nhiệt Đới thuộc trung tâm khoa học và công nghệ Quốc gia tại thành phố Hồ Chí Minh trong khoảng thời gian từ 01/06/2013 đến 30/11/2013

3.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên đối tượng là cây Paulownia fortunei Giống

được lấy từ phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật thuộc Viện Sinh hoc Nhiệt đới

Đèn LED được sử dụng trong thí nghiệm là loại đèn LED oval đường kính 5mm của hãng Kirin (Trung Quốc) sản xuất Thí nghiệm sử dụng đèn LED màu đỏ có bước sóng 640 – 660 nm và đèn LED màu xanh dương có bước sóng 451 – 460 nm

Đèn LED oval trong thí nghiệm cho bình Bioreactor ngập chìm cách quãng được thiết kế thành các bản mạch đôi có kích thước 2 x 65 x 140 mm Trên mỗi bản mạch có lắp 120 đèn LED với các tỷ lệ giữa đỏ và xanh là: 90% đỏ + 10% xanh; 85%

đỏ + 15% xanh, 80% đỏ + 20% xanh; 70% đỏ + 30% xanh Đèn được lắp đặt với khoảng cách đạt được độ chiếu sáng 50 µmol/s m2

Hình 3.1 Bản mạch dùng trong thí nghiệm

3.1.3 Môi trường thí nghiệm

Môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường MS thay đổi có bổ sung chất kích thích sinh trưởng gồm:

- Môi trường chồi: MS + 1mg/l BA + 20g/l succrose + 10% nước dừa

- Môi trường ra rễ: MS + 0,5 mg/l IBA + 25g/l succrose + 10% nước dừa

- Môi trường tạo rễ không đường: MS + 0,5 mg/l IBA

Giá trị pH trong môi trường MS là 5,7

3.1.4 Thiết bị và dụng cụ

Phòng cấy vô trùng với các thiết bị như: tủ cấy, các dụng cụ sử dụng trong quá trình cấy (đèn cồn, kéo, đĩa petri vô trùng, bình erlen, dao cấy, kẹp ) Kệ đựng bình mẫu và môi trường

Phòng đặt mẫu cấy với các thiết bị gồm: máy điều hòa nhiệt độ đèn chiếu sáng, thiết bị chiếu sáng, thiết bị điều khiển chế độ chiếu sáng thích hợp, các kệ đựng mẫu

CO2 có thể điều chỉnh được lượng khí CO2 hòa vào bình nuôi cây

Máy đo độ hấp thụ chlorophyll Spectro Direct, máy đo cường độ ánh sáng LI – 250A Light Meter

Hình 3.2 Máy đo độ hấp thụ chlorophyll và tủ cấy