Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng bacillus cereus phân lập tại việt nam

perfrigens vào tới ruột non, chúng sẽ sản sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với triệu chứng đau bụng dữ dội, tiêu chảy ra nước [59,60].. Nhưng trong số đó, vi khuẩn Bacillus cereus lại c

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐINH THỊ NGA

TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ TIÊU CHẢY VÀ ĐỘC

TỐ NÔN CỦA CHỦNG BACILLUS CEREUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐINH THỊ NGA

TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ TIÊU CHẢY VÀ ĐỘC

TỐ NÔN CỦA CHỦNG BACILLUS CEREUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn thạc sĩ tôi đãnhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu, nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơnsâu sắc tới những sự giúp đỡ này

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới TS Phùng Tôn Quyền là ngườithầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyềnđạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuậ n lợi cho tôi hoàn thành bản luận

án này.

Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôivượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian họctập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015

Học viên

Đinh Thị Nga

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quảcùng cộng tác với các đồng sự khác Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn làtrung thực

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015

Tác giả

Lời cảm ơn Lời

cam đoan Danh

mục hình

Danh mục bảng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 3

1.1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm (Food poisoning) 3

1.1.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 3

1.2 Tổng quan về Bacillus cereus 5

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu Bacillus cereus 5

1.2.2 Đặc điểm hình thái 7

1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 7

1.2.4 Đặc điểm sinh trưởng 8

1.2.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá 10

1.2.6 Đặc điểm huyết thanh học 11

1.2.7 Đặc điểm phân loại 12

1.3 Các nhân tố gây độc của Bacillus cereus 12

1.3.1 Các loại độc tố ruột (enterotoxin) 12

1.3.2 Độc tố gây nôn (cereulide) 16

1.3.3 Những bệnh gây ra bởi Bacillus cereus, không liên quan tới ngộ độc thực phẩm 18

1.4 Ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus 19

1.4.1 Nguồn gốc lây nhiễm B cereus 19

1.4.2 Cơ chế gây ngộ độc thực phẩm của Bacillus cereus 20

1.4.3 Liều lượng gây ngộ độc 21

1.4.4 Triệu chứng 22

1.5 Biện pháp phòng ngừa sự lây nhiễm và phát triển của Bacillus cereus trong thực phẩm 23

1.5.1 Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ cao 23

1.5.2 Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ thấp 24

1.5.3 Sử dụng chất bảo quản 25

1.5.4 Thực hiện điều kiện vệ sinh tốt GHP (good hygienic practices) và thực hành sản xuất tốt GMP (good manufacturing practices) [45] 25

1.6 Một số phương pháp nghiên cứu để nhận biết Bacillus cereus 26

1.6.1 Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 26

1.6.2 Phương pháp dựa trên đặc điểm huyết thanh học 28

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31

2.1 Vật liệu 31

2.1.1 Sinh phẩm 31

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.2.1 Phương pháp phân lập 34

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 34

2.2.3 Phương pháp tách DNA tổng số 34

2.2.4 Phương pháp tinh sạch plasmid của E coli 35

2.2.5 Phương pháp PCR khuếch đại gen 36

2.2.6.Phương pháp điện di trên gel agarose 36

2.2.7 Phương pháp tách dòng gen nhe, hblA, bcet 36

2.2.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng 37

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Phân lâp Bacillus cereus trên môi trương MYP 39

3.2 Phát hiện gen mã hóa độc tô cua Bacillus cereus băng phan ưng PCR 39

3.3 Tách dòng va đọc trình tự gen bceT, nhe và hblA 41

3.3.1 Tách dòng gen bceT, nhe va hblA 41

3.3.2 Đoc trinh tư gen ma hoa cac đôc tô 44

KẾT LUẬN 47

KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

STT Chư viết tắt Chư viết đầy đủ

3 CFU Colony Forming Unit

5 DNA Deoxyribonucleotide acid

6 dNTP deoxyribo Nucleotide 5’- Triphosphate

9 EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid

10 EtBr Ethidium Bromide

12 OD Optical density - mật độ quang học

13 PCR Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi

14 SDS Sodium dodecyl sulphate

17 X-gal 5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside

Danh mục hình

H

ì n h 1 1 : T ế b ào ( A ) v à b ào t ử (B) c ủ a B cer e u s 7

H ì n h 1 2 : K h u ẩ n l ạ c B ce r e u s t r ên m ô i tr ư ờ n g t h ạ c h h u y ế t 8

Hình 1.3 : Kháng nguyên tiêm mao của B cereus 11

Hình 1.4 Cấu trúc hoá học của cereulide [24] 17

Hình3.1 Hình thái khuẩn lạc Bcereus trên môi trương MYP sa1u2 giơ nuôi 39

Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại các gen độc tố cua gen bceT (0,7 bp), nhe (1.4 kb) và hblA (319 bp) 40

Hình 3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi Khuẩn E.coli DH5α 41

Hình 3.4 Điên di san phâm căt DNA plasmid cac dong khuân lac trăng trên gel 1% agarose 42

H ì nh 3 5 Đ i ê n di s a n ph â m PC R c u a ca c d o ng khu â n l a c t ră ng t rê n g e l 1 % agaros e 43

Hình 3.6 So sánh trình tự amino acid của protrein BCET vói trình tự BAA041341 trên ngân hàng gen quốc tế 44

Hình 3.7 So sánh trình tự amino acid của protrein NHE vói trình tự DQ153257.1 trên ngân hàng gen quốc tế 45

Hình 3.8 So sánh trình tự amino acid của protrein HBL vói trình tự EEK50059.1 trên ngân hàng gen quốc tế 46

MỞ ĐẦU

Bacillus cereus thuôc nhom 1 chi Bacillus là vi khuẩn hình que , Gram dương

va sinh bao tư B cereus thương xuât hiên trong đât , trong sưa nguyên liêu, trong cac san phâm tư sưa va trong cac loai ngu côc B cereus có khả năng liên quan

đên cac bênh vê đương ruôt như gây nôn va tiêu chay nhơ kha năng san sinh 4 loại entero toxin trong đo co 2 tô hơp hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein la enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K (Beecher,

Wong, 1994) Ngoài ra , B cereus còn có khả năng sản sinh một loại độc tố chịu

nhiệt n on-riposome peptide synthetase (NRPS-cereulide) (Agata et al., 1995)

Ở nước ta hiện nay theo báo cáo từ bộ y tế, chỉ có khoảng 38 trung tâm y tế cókhả năng kiểm nghiệm được loài vi khuẩn này, khoảng 60% các tình thành có nănglực kiểm nghiệm Tuy nhiên hiện nay phương pháp xét nghiệm vẫn dựa trên phươngpháp đếm tổng số khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng kết hợp với các xétnghiệm hóa sinh khác Phương pháp này có nhược điểm là thời gian lâu, có thể mấtnhiều ngày hoặc vài tuần và độ chính xác không cao.Trong những năm gần đây, cácphương pháp xét nghiệm vi sinh vật dựa trên nguyên tắc di truyền phân tử và miễndịch học đã được thiết lập như: lai phân tử, PCR (Polymerase Chain Reaction), Elisacho kết quả rất khả quan với độ chính xác cao, thời gian rút ngắn có thể xuồng vàigiờ, không đòi hỏi nhiều máy móc thiết bị do đó khả năng cơ động là rất cao Nhữngphương pháp trên đã mở ra cho ngành vi hóa sinh học nói riêng và cả ngànhcông nghệ thực phẩm hiện đại

xuất phát từ tính cấp thiết chúng tôi tiến hành đề tài: “Tách dòng và giải trình

tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam” Với mục đích tạo nguồn gen cho sản xuất nguyên liệu chế tạo kit phát hiện các độc tố của vi khuẩn B cereus sau này.

*/ Mục tiêu của nhiệm vụ:

- Tách dòng và đọc trình tự gen mã hóa độc tố gây nôn va tiêu chay nhơ khả

năng sản sinh 4 loại enterotoxin trong đó có 2 tô hơp hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein la enterotoxin T

(BCET) và cytotoxin K từ vi khuẩn B cereus.

*/ Nhiệm vu của đề tài:

- Phân lập vi khuẩn B.cereus tư các mẫu phẩm thu thập tại một số quán an vỉa

hè tại hà nội,

- Sàng lọc hệ gen mã hóa độc tố gây nôn va tiêu chay , trong đo co 2 tô hơphemolysi n BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein laenterotoxin T (BCET) và cytotoxin K

- Tách dòng và đọc trình tự các gen HBL, NHE, BCET và cytotoxin K từ một số

chủng vi khuẩn B cereus.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

1.1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm (Food poisoning)

Ngộ độc thực phẩm là thuật ngữ dùng để chỉ một hội chứng cấp tính, xảy rađột ngột, do ăn phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng những triệu trứng nôn mửa,tiêu chảy và những triệu chứng khác tuỳ theo đặc điểm của từng loại ngộ độc (tê liệtthần kinh, co giật, rối loạn hô hấp, tuần hoàn, vận động…) [3]

1.1.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

Hiện nay tại Việt Nam cũng như trên thế giới, ngộ độc thực phẩm xảy rathường xuyên với nhiều nguyên nhân khác nhau Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩmthường được chia thành tác nhân lây nhiễm và tác nhân độc tố Tác nhân lây nhiễmbao gồm các loại vi khuẩn, virut, ký sinh trùng… Còn tác nhân độc tố bao gồm cácđộc tố có sẵn trong thực phẩm, các loại hoá chất tồn dư trong thực phẩm như kim loạinặng, thuốc trừ sâu, các chất phụ gia hoá học…[60]

Trong các vụ ngộ độc thực phẩm hiện nay, nguyên nhân do vi sinh vật đặc biệt

là vi khuẩn chiếm tỉ lệ cao Có rất nhiều loại vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc

thực phẩm tuy nhiên khoảng 90% ca ngộ độc thực phẩm hiện nay là do Staphylococus aureus, Salmonella, Clostridium perfingens, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli và Bacillus cereus… [59] Do đó việc tìm hiểu các đặc

tính của chúng là vô cùng cần thiết để có thể đưa ra biện pháp kiểm soát hiệu quả.Dưới đây là đặc tính của một số chủng vi khuẩn có nguy cơ ngộ độc cao:

Salmonellae sp.

Salmonellae thường tồn tại trong các thực phẩm có hàm lượng protein cao như thịt, cá, trứng…Salmonellae có thể sinh trưởng trong thực phẩm, nhưng không sinh

độc tố, khi chúng vào trong ruột hoặc vào máu chúng mới sinh độc tố Bệnh ngộ độc

do Salmonellae có triệu chứng điển hình như buồn nôn, nôn, tiêu chảy và đau đầu

[59,60]

Clostridium perfrigens

C perfrigens thường xuất hiện trong đất, nước do đó chúng rất dễ

nhiễm vào thức ăn Khi xâm nhập vào cơ thể người và động vật, chúng thường

cư trú trong ruột non Nếu thực phẩm chứa một lượng lớn vi khuẩn này được tiêu

hoá thì khi C perfrigens vào tới ruột non, chúng sẽ sản sinh độc tố gây ngộ độc thực

phẩm với triệu chứng đau bụng dữ dội, tiêu chảy ra nước [59,60]

E coli là vi khuẩn sống chủ yếu trong ruột của người và động vật Nhiễm trực

khuẩn đường ruột này với số lượng lớn sẽ bị ngộ độc Triệu chứng bệnh chủ yếu

là đau bụng dữ dội, tiêu chảy, có thể nôn mửa [59,60]

Ngoài ra còn rất nhiều loại vi khuẩn khác có khả năng gây ngộ độc đã đượcnghiên cứu Trên đây chỉ là một vài ví dụ điển hình nhưng nhìn chung vi khuẩn có khảnăng gây ngộ độc thực phẩm ở 2 dạng: Ngộ độc do ăn phải thức ăn có độc tố của vi

khuẩn mà không cần có mặt tế bào của chúng (Staphylococus aureus) và ngộ độc do

ăn phải thức ăn nhiễm một số lượng

lớn tế bào hoặc bào tử vi khuẩn để khi vào tới ruột non chúng phát triển sinh độc tố

gây ngộ độc ( Salmonella) Nhưng trong số đó, vi khuẩn Bacillus cereus lại có

khả năng gây ngộ độc thực phẩm ở cả hai dạng trên với hai thể bệnh điển hình là nôn

và tiêu chảy

1.2 Tổng quan về Bacillus cereus

B cereus thuộc nhóm 1 chi Bacillus Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus có mặt ở

khắp mọi nơi trong môi trường sống, chúng mang đặc điểm chung là vi khuẩn Gramdương, tế bào có dạng hình que, hô hấp hiếu khí hay hiếu khí không bắt buộc, có khảnăng hình thành bào tử [43] Hiện nay, có khoảng trên

100 loài thuộc chi này đã được miêu tả, một số loài có ứng dụng trong công nghiệp(sản xuất emzym) hoặc trong nông nghiệp (sản xuất thuốc trừ sâu sinh học), một sốloài lại gây bệnh cho người và động vật Các loài gây bệnh quan trọng thường nằm

trong nhóm Bacillus cereus (nhóm 1 chi Bacillus) gồm Bacillus cereus, Bacillus myco¿des, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis, Bacillus megaterium và mới đây có thêm hai loài là Bacillus weihenstephanensis và Bacillus pseudomyco¿des được phát hiện [38] Các loài trong nhóm này có độ tương đồng

về trình tự 16S, 23S rất cao và chúng có % (G + C) tương đồng khoảng 31%-41%

Đây chính là những đặc điểm quan trọng để phân loại chúng thuộc nhóm Bacillus cereus [43].

Trong các loài thuộc nhóm B cereus có liên quan tới an toàn thực phẩm và sức khoẻ con người thì B thuringiensis được biết đến như là một loài vi khuẩn có khả năng hình thành protein tinh thể độc có khả năng sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học, B anthracis là tác nhân gây bệnh than Ngoài ra, B cereus, B thuringiensis, B weihenstephanensis thường được tìm thấy trong các sản phẩm lương thực, thực phẩm

bị hỏng [14] Trong số đó, B cereus là nguyên nhân chủ yếu và quan trọng nhất trong

các vụ ngộ độc thực phẩm

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu Bacillus cereus

B cereus được Frankland phân lập đầu tiên vào năm 1887 từ không khí tại một

chuồng bò [64] Năm 1906 ở Châu Âu, 300 người bệnh được đưa vào

bệnh viện với những triệu chứng của bệnh đường ruột do ăn phải món thịt băm bịnhiễm số lượng lớn một loại vi khuẩn hiếu khí, sinh bào tử, hình que được gọi tên là

Bacillus peptonificans Sau này nó được đổi tên là Bacillus cereus [61,64].

Từ năm 1926 đến năm 1929: Theo thông báo có hai vụ ngộ độc liên quan tới một

loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus hiếu khí có trong nước sốt vani và món thịt

đông.Từ năm 1936 đến năm 1943: Trong 367 vụ ngộ độc ở thành phố Stockholm

thì có 117 vụ nguyên nhân là do Bacillus spp Tuy nhiên do chưa có những hiểu biết

rõ ràng về B cereus nên chưa thể khẳng định rõ vai trò của chúng trong các vụ ngộ

độc trên [61]

Năm 1950, Steinar Hauge nhà khoa học người Na Uy với những thí nghiệm đặc

biệt đã khẳng định B cereus là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và là tác nhân gây bệnh cho con người Để cung cấp bằng chứng khẳng định B cereus là nguyên

nhân gây ra ngộ độc thực phẩm, Hauge đã chứng minh bằng cách uống môi trường

nuôi cấy B cereus Ông đã nuôi chúng tới mật độ 4.106 tế bào /g và uống 200ml Sau

13 giờ, ông cảm thấy đau bụng dữ dội và bị tiêu chảy ra nước Đó là những thí nghiệm

đầu tiên về loại B cereus gây tiêu chảy.

Năm 1954, một số cuộc thí nghiệm với những người tình nguyện ở Mỹ đã thất bạitrong việc xác nhận lại những thí nghiệm của Hauge Đến năm 1969, những vụ ngộ độc

thực phẩm do B cereus đầu tiên đã được công bố ở Mỹ [64].

Năm 1971, 20 năm sau khi B cereus được công nhận là tác nhân gây ra thể

bệnh tiêu chảy, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một loại ngộ độc khác gây ra bởi

B cereus được gọi là typ gây nôn Loại B cereus gây nôn được phát hiện sau 6 vụ

ngộ độc xảy ra ở Anh với các triệu chứng buồn nôn và nôn mửa sau khi ăn món cơmrang của một nhà hàng Trung Quốc [61,64] Từ đó đến nay rất nhiều viện nghiên cứu

của các nước trên thế giới đã và đang tiến hành nghiên cứu về B cereus cũng như

các độc tố của chúng nhằm tìm ra các

phương pháp phát hiện nhanh chính xác vi khuẩn này trong các loại thực phẩm, góp phần giảm thiểu các vụ ngộ độc thực phẩm do nó gây ra.

Ở Việt Nam hiện nay, chưa có những nghiên cứu cụ thể, chi tiết về B cereus mặc

dù một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus khác đã được nghiên cứu kỹ như

B thuringiensis, B antharcis…

1.2.2 Đặc điểm hình thái

B cereus thuộc chi Bacillus, là trực khuẩn Gram dương, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ

khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [43]

Về mặt tế bào, ngoài những đặc điểm chung của chi Bacillus thì Bacillus cereus còn có những đặc điểm riêng sau: Kích thước tế bào B cereus dài 3-5 ỡm, rộng 1- 1,2ỡm, tế bào hình que thẳng, hai đầu có thể tròn hoặc vuông Phần lớn tế bào B cereus thường có khả năng di động nhờ lông roi tuy nhiên cũng có một số chủng không có khả năng di động B cereus có khả năng hình thành nội bào tử Nội bào tử của B cereus nằm ở trung tâm tế bào, kích thước của bào tử khoảng 1-1,5ỡm, bào tử

nang không phồng Bào tử có dạng hình elip một số có dạng hình tròn hay hình khối(Hình 1.1) [61,64]

Hình 1.1: Tế bào (A) và bào tử (B) của B cereus 1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy

B cereus có thể sinh trưởng, phát triển ở dải nhiệt độ, pH rất rộng Chúng có thể

phát triển ở nhiệt độ 4-5ºC trong khi đó một số chủng lại có thể phát triển ở nhiệt độ

55ºC Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của B cereus là

30-37ºC Độ pH biến thiên từ 4,3-9,3; pH tối ưu là 7-7,2 Độ hoạt động của nước

> 0,92 B cereus có thể phát triển trên môi trường có nồng độ NaCl từ

7-7,5%, một số chủng còn có thể chịu được nồng độ 10% [23,37,61,64] B.

cereus phát triển tốt nhất trong điều kiện hiếu khí nhưng vẫn có thể phát triển trong

điều kiện kỵ khí Tuy nhiên, quá trình sản sinh độc tố đặc biệt là độc tố gây nôn sẽkhông xảy ra ở nhiệt độ <10ºC và >40ºC cũng như trong điều kiện kỵ khí [28,33,36]

Khi nuôi cấy B cereus trên môi trường phân lập MYP (manitol-yolk- polimyxin) trong điều kiện tối thích tº=37ºC, pH= 7-7,2 sau 1 ngày, khuẩn lạc B cereus có màu

hồng eosin (do không có quá trình lên men manitol), xung quanh khuẩn lạc có vùngkết tủa màu hồng (do có khả năng sinh enzym lecithinase) [22,23,37,63]

Trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn cơ bản MPA (meat- pepton-agar), khuẩn

lạc B cereus có đường kính khoảng 0,4-0,5cm, màu sắc khuẩn lạc từ trắng sữa đến

trắng đục, khuẩn lạc tròn có tâm lồi, bề mặt sần sùi, không dính ướt và có vành ở mép[14,43]

Hình 1.2: Khuẩn lạc B cereus trên môi trường thạch huyết

Trên môi trường thạch máu cừu, B cereus có khả năng sinh haemolysin làm tiêu huyết (Hình 1.2) Đây là một đặc điểm được sử dụng để phân biệt B cereus và B anthracis do B anthracis không có khả năng sinh haemolysin Haemolysin là một trong những độc tố quan trọng trong quá trình gây bệnh của B cereus [23,37].

1.2.4 Đặc điểm sinh trưởng

Đặc điểm quan trọng của chi Bacillus nói chung và B cereus nói riêng đó là khả năng hình thành bào tử Nhờ có đặc điểm này mà B cereus có thể

tồn tại phổ biến trong môi trường kể cả trong môi trường khắc nghiệt nhất Vì vậy,

khả năng lây nhiễm B cereus vào thực phẩm trở nên dễ dàng và nguy hiểm hơn.

Khi tế bào sinh dưỡng của B cereus gặp phải điều kiện bất lợi như nhiệt

độ quá cao hoặc quá thấp, pH cực đoan, tia tử ngoại hay môi trường thiếu chất

dinh dưỡng, khô hạn… B cereus sẽ sinh nội bào tử Nội bào tử nằm trong tế bào

mẹ, khi tế bào mẹ phân giải nội bào tử trở thành tự do Bào tử rất bền vững chúng cóthể tồn tại và phát triển độc lập trong khoảng thời gian dài Khi gặp điều kiện môitrường thuận lợi về chất dinh dưỡng, nhiệt độ, pH tối ưu …, bào tử sẽ nảy mầm vàphát triển thành tế bào sinh dưỡng Tế bào sinh dưỡng này sẽ tiếp tục sinh trưởngphát triển và tiến hành các hoạt động trao đổi chất Khi dinh dưỡng cạn kiệt, môitrường bất lợi nội bào tử lại được hình thành [2]

Bào tử của B cereus có khả năng chịu nhiệt hơn hẳn tế bào sinh dưỡng của chúng [62,64] Ở thể sinh dưỡng B cereus, dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ cao thì bào

tử của nó lại có khả năng kháng lại nhiệt độ cao Trong sữa, bào tử B cereus có thể

chịu đựng được nhiệt độ 100ºC trong 2-3 phút trong khi đó các quá trình thanhtrùng sữa thường chỉ xảy ra tại nhiệt độ 70-80ºC trong vài phút; trong thực phẩm có

nồng độ axít thấp (pH>4,5) B cereus có thể chịu được khoảng 5 phút [61] Đặc biệt, trong thực phẩm có hàm lượng lipit cao như trong dầu đậu nành thì bào tử B cereus

có thể chịu được nhiệt độ 121ºC trong 30 phút [62] Vì vậy, trong quá trình chế biến

thực phẩm khó có thể loại bỏ hết bào tử B cereus Ngoài ra, bào tử B cereus còn chịu

được tia bức xạ cao hơn tế bào sinh dưỡng Nếu ta có thể tiêu diệt được 90% tế

bào sinh dưỡng B cereus ở 0,17- 0,65 kGy thì để tiêu diệt được 90% bào tử B cereus thì cường độ bức xạ phải là 1,25- 4 kGy Đặc biệt, bào tử B cereus kỵ nước hơn bào tử của các loài Bacillus spp Do vậy, chúng có thể bám chặt vào bề mặt của những dụng

cụ, máy móc dùng cho quá trình chế biến thực phẩm

[12] Điều này chứng tỏ bào tử B cereus không chỉ nhiễm từ thực phẩm mà còn từ

những dụng cụ chế biến hay đựng thực phẩm và bất cứ lúc nào chúng cũng có thểgây nguy hiểm cho an toàn sức khoẻ con người

1.2.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá

B cereus có rất nhiều đặc điểm sinh lý, sinh hoá giống với một số loài thuộc nhóm Bacillus cereus Bảng 1 sau đây tóm tắt một số đặc điểm chính để phân biệt một số loài thuộc nhóm 1 chi Bacillus này:

Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus

Bảng 1 cho thấy 4 loài B cereus, B thuringiensis, B myco¿des, B anthracis có những đặc điểm sinh lý, sinh hoá rất giống nhau chỉ có B megaterium là có nhiều đặc điểm khác hơn cả Tuy nhiên, trong 4 loài đó thì mỗi loài vẫn có những đặc điểm riêng: B myco¿des có khả năng hình thành khuẩn lạc hình rễ cây trên môi trường dinh dưỡng cơ bản, trong khi đó B anthracis lại không có khả năng chuyển động và không sinh haemolysin Trên môi trường thạch huyết B anthracis vẫn có khả năng hình thành khuẩn lạc có kích thước 0,3-0,5cm nhưng không phân giải huyết, B thuringiensis có khả năng sinh protein tinh thể độc Trong khi đó,

B cereus lại có khả năng chuyển động và phân giải huyết rất mạnh, không hình thành

khuẩn lạc dạng rễ cây và không có khả năng sinh protein tinh thể độc [37]

1.2.6 Đặc điểm huyết thanh học

Hiện nay theo một số nghiên cứu, B cereus có 13 kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên O) và giống như B thuringiensis, B cereus cũng có kháng nguyên tiêm mao (kháng nguyên H) và 42 loại kháng nguyên H đã được sử dụng cho phân loại B cereus 23 trong 42 typ huyết thanh H có liên quan tới các thể bệnh gây ra bởi B cereus Các nghiên cứu đã cho thấy các typ huyết thanh 1,2,6,8,10,12 và 19 thường

liên quan tới các vụ ngộ độc thể bệnh tiêu chảy còn các nhóm huyết thanh 1,5,8,12,19

của B cereus lại liên quan tới những vụ ngộ độc thể nôn Trong đó, typ huyết thanh

H1 thường chiếm ưu thế và gây ra cả hai loại thể bệnh [23,61]

Hình 1.3 : Kháng nguyên tiêm mao của B cereus

1.2.7 Đặc điểm phân loại

Do B cereus là loại vi khuẩn có dải nhiệt độ phát triển khá rộng nên dựa vào nhiệt độ có thể phân chia các chủng B cereus như sau:

• Các chủng ưa nhiệt (Mesophilic) là những chủng B cereus có khả năng

sinh trưởng ở dải nhiệt độ 10ºC- 42ºC một số có thể phát triển ở

50ºC-55ºC, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 30ºC- 37ºC

• Các chủng ưa lạnh (Psychrophilic hay Psychorotrophic) là những chủng B cereus có khả năng sinh trưởng ở dưới 10ºC một số chủng có thể phát triển ở 4ºC,

nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 30ºC- 37ºC Các chủng này không sinh trưởng ở nhiệt độ

>42ºC [38]

1.3 Các nhân tố gây độc của Bacillus cereus

B cereus được biết đến là tác nhân gây ra những bệnh về đường tiêu hoá

cũng như một số bệnh không liên quan đến đường tiêu hoá Chúng có khả năng gâyngộ độc thực phẩm với hai thể bệnh điển hình là tiêu chảy và nôn Có rất nhiều loạiđộc tố tham gia vào quá trình gây ra hai thể bệnh này Thể bệnh nôn gây ra bởi mộtloại độc tố có khả năng kháng nhiệt cao được gọi là cereulide hay emetic toxin có mặttrong thực phẩm trước khi con người tiêu hoá Trong khi đó, thể bệnh tiêu chảy lại làkết quả của rất nhiều loại độc tố ruột (enterotoxin) khác nhau gây nên Chúng là

các sản phẩm trao đổi chất của tế bào B cereus sinh ra ở ruột non trong quá trình

phát triển [23,38]

1.3.1 Các loại độc tố ruột (enterotoxin)

1.3.1.1 Đặc điểm cấu trúc và cơ chế hoạt động

a Đặc điểm cấu trúc

Ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy là một loại thể bệnh phổ biến Hiện nay, cóbốn loại độc tố ruột được biết đến là enterotoxin-T, cytotoxin K, haemolysin BL (HBL)

và non-haemolytic enterotoxin (NHE) [7,39] Trong đó, ba loại được chứng minh là

có liên quan tới các vụ ngộ độc gây thể bệnh tiêu chảy là HBL, NHE và cytotoxin Kcòn enterotoxin-T được coi như là một enterotoxin vì nó có cấu trúc gần giống vớienterotoxin của vi khuẩn [7]

Bảng 1.2 Đặc điểm một số độc tố ruột của Bacillus cereus [17,34, 39]

Tên độc tố Đặc điểm Khối lƣợng phân tử

Khả năng gây ngộ độc thực phẩm

Haemolysin BL

(HBL)

Protein

3 thành phần

Có

Trong 3 loại độc tố nêu ở trên thì HBL và NHE là hai độc tố ruột quan trọng có

mặt trong hầu hết các vụ ngộ độc gây tiêu chảy do B cereus Hiện nay, đã có nhiều

nghiên cứu tập trung vào hai loại độc tố này [57]

HBL là một loại độc tố dung huyết có bản chất là một protein 3 thành phần B,L1, L2 Trong đó, B là nhân tố liên kết (Binding) còn L1 và L2 là 2 nhân tố phângiải (Lytic) [19] Độc tố HBL này đã được tinh chế và xác định đặc điểm Bằng các thí

nghiệm in vitro, các nhà khoa học đã chỉ ra độc tố này có hoạt tính hoại tử, tăng tính

thấm thành mạch máu cũng như khả năng gây tích tụ dịch trong ruột già [39] Trongprotein nhiều thành phần này, mỗi protein thành phần đều được mã hoá bởi một gen

Tiểu phần B được mã hoá bởi gen hblA còn gen hblC và hblD lần lượt mã hoá cho tiểu

phần L1, L2 Các gen này cùng nằm trên một operon Hoạt tính của độc tố nàymạnh nhất khi có đầy đủ cả 3 protein thành phần [57] Tuy nhiên, thành phần protein

tính cho B và L1 nên không phải tất cả HBL của các chủng B cereus đều sản xuất L2

[61]

NHE cũng là một protein 3 thành phần: A, B, C Trong đó NHEC là protein liênkết còn NHEA, NHEB là protein phân giải Giống như HBL, hoạt tính của NHE mạnh

nhất khi có đầy đủ cả 3 protein này Các gen nheA, nheB, nheC lần lượt mã hoá cho 3

protein NHEA, NHEB, NHEC, 3 gen này cũng cùng nằm trên một operon [39,57].Ngoài sự tương đồng về đặc điểm cấu tạo,

2 loại độc tố HBL và NHE còn có một đặc điểm chung là sự dịch mã operon tổng hợp

HBL, NHE đều được gen plcR điều hoà dương Gen plcR là gen điều hoà sự tổng hợp phospholipase C Nếu chủng B cereus có gen plcR điều hòa âm thì chủng đó không có khả năng sản xuất HBL hay NHE còn nếu plcR điều hoà dương thì chúng có

khả năng sinh HBL và NHE Lúc đó chúng có khả năng gây ngộ độc thực phẩm dạngtiêu chảy [6]

Enterotoxin- T được biết đến từ năm 1995 Độc tố này đã được nhân dòng và

tiến hành một loạt các thí nghiệm invitro Nó là một protein đơn mang một số

tính chất của một enterotoxin như khả năng gây độc tế bào, khả năng tăng tính thấmthành mạch máu, khả năng gây tích tụ dịch, gây chết chuột nhưng nó không cókhả năng phân giải huyết Nhưng hiện nay vẫn chưa tìm thấy sự có mặt của loại độc

tố này trong các vụ ngộ độc thực phẩm liên quan tới B cereus Protein độc tố này được mã hoá bởi gen bce-T [8].

Cytotoxin K là loại enterotoxin được biết đến muộn nhất nhưng nó lại có khảnăng gây tử vong cao Năm 2000, các nhà nghiên cứu đã phát hiện sự có mặt của độc

tố này sau một vụ ngộ độc xảy ra tại một gia đình người Pháp, tổng cộng có 44 người

bị ngộ độc trong đó 6 người bị tiêu chảy ra máu dẫn tới tử vong Cytotoxin K là mộtprotein đơn có hoạt tính dung huyết và gây hoại tử Nó bộc lộ tính độc rất cao trên tế

bào biểu mô của người Gen mã hoá cho độc tố này là cytK [57].

Ngoài B cereus thì B thuringiensis và B weihenstephanensis đều có khả năng tạo ra ít nhất một trong các độc tố gây tiêu chảy ở trên đặc biệt là B.

thuringiensis Một số chủng B thuringiensis được thông báo có liên quan tới một số

vụ ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy [29,32,34]

b Cơ chế hoạt động của độc tố ruột gây tiêu chảy

Hiện nay, cơ chế hoạt động của các độc tố ruột trên chưa được biết rõ nhưng

HBL và NHE đều là sản phẩm trao đổi chất trong quá trình phát triển của tế bào B cereus, được sinh ra ở pha phát triển luỹ thừa (pha log) và đạt được lượng lớn nhất ở cuối pha này [17] Qua các nghiên cứu invitro trên tế bào CaCo-2 (tế bào biểu mô

ruột non người), các nhà khoa học đã phỏng đoán có 2 cơ chế hoạt động của HBL[12] Thứ nhất, tiểu phần B liên kết vào màng tế bào trước sau đó tiểu phần L đi vàobên trong làm thay đổi các chức năng trao đổi chất của tế bào Thứ hai, tiểu phần Bliên kết vào màng tế bào và gây ra vết thương trên bề mặt màng tế bào khi có sự liênkết của cả hai thành phần B và L Cơ chế hoạt động của NHE cũng tương tựnhư vậy [17,39]

Enterotoxin- T đã được tách dòng và biểu hiện trong E coli Nhưng độc tố

này chưa được tìm thấy trong bất cứ một vụ ngộ độc nào Vì vậy, nếu nó có khảnăng gây độc thì hiện nay chưa có thông tin liên quan tới cơ chế hoạt động củaenterotoxin này [8]

Do cytotoxin K chỉ mới được phát hiện vào năm 2000 nên những nghiên

cứu về cơ chế gây độc của nó còn rất hạn chế Trong nghiên cứu invitro, các tác giả

đã chỉ ra độc tố này có khả năng hình thành lỗ rò trong tầng kép photpholipid.Điều đó chứng tỏ cơ chế hoạt động của cytotoxin K là khả năng hình thành lỗ ròtrên tế bào biểu mô ruột người gây ra quá trình thoát dịch và phá huỷ tế bào biểu

mô ruột dẫn đến hoại tử [57]

Các độc tố ruột có đặc điểm chung là chúng dễ dàng bị phá huỷ ở nhiệt độ cao,

pH cực đoan và bị phân huỷ bởi các enzym tiêu hoá như trypsin, pepsin… [64] Vì

vậy, nếu chúng được B cereus sinh ra trong thực phẩm trước khi được con người

tiêu hoá thì khi vào tới dạ dày chúng sẽ bị phá huỷ,

mất khả năng gây độc Chúng chỉ thực sự gây nguy hiểm khi được hình thành ở ruột

non của người trong quá trình trao đổi chất của B cereus [57].

1.3.1.2 Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố ruột

Hiện nay, theo cơ chế gây bệnh thì thể bệnh tiêu chảy có thể được chia ra làm

3 loại: kích thích bài tiết (sencreoty), loại xâm lấn vào màng nhầy của đường ruộtnhưng không gây hoại tử (invasive) và loại xâm nhập, gây hoại tử (penetrating) Trong

đó, loại tiêu chảy kích thích bài tiết là loại tiêu chảy ra dịch lỏng do quá trình mấtcân bằng nước và chất điện giải giữa 2 bên biểu mô của tế bào ruột non Nguyên

nhân thường là do các enterotoxin gây ra Giống như V cholerae, bệnh tiêu chảy do B cereus thuộc loại tiêu chảy này Sau khi con người ăn phải thực phẩm có chứa bào tử

B cereus, bào tử B cereus vào tới ruột non gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ nảy mầm phát triển thành tế bào sinh dưỡng Do tế bào B cereus có những sợi tiên mao nhỏ nên chúng có khả năng bám chắc vào tế bào biểu mô ruột [12] Tế bào B cereus tăng

nhanh về số lượng, tại pha sinh trưởng trong quá trình trao đổi chất chúng sảnsinh ra các độc tố ruột Các độc tố này được tạo ra trong tế bào vi khuẩn và được tiếtvào ruột non người Độc tố này liên kết với thụ thể đặc hiệu trên màng, truyền tínhiệu giữa màng và kích thích các thông tin nội bào, cuối cùng chúng gây ra mất cânbằng sự chuyển dịch nước và các chất điện giải Cụ thể, khi enterotoxin được giảiphóng chúng kích hoạt enzym adenylate cyclase (chuyển ATP → cAMP) làm tăngcAMP nội bào Quá trình

sản xuất quá mức cAMP kéo theo sự vận chuyển tích cực ion Cl- vào khoang

ruột non và ngăn cản quá trình hấp thụ ion Na+ gây ra mất cân bằng thẩm thấu làmcho một lượng lớn nước của cơ thể bị rút ra chuyển vào ruột non gây ra bệnh tiêuchảy [57]

1.3.2 Độc tố gây nôn (cereulide)

1.3.2.1 Cấu trúc và chức năng

Ngoài thể bệnh tiêu chảy, B cereus còn gây ngộ độc thực phẩm ở thể

bệnh nôn Tất cả các chủng B cereus gây nôn đều có sự đồng nhất về tính chất

kiểu hình vì vậy chúng là đại diện của một dòng riêng biệt Người ta gọi các chủng

này là các chủng B cereus gây nôn (emetic Bacillus cereus ) [24] Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng hầu hết các chủng B cereus gây nôn thường không có

khả năng thuỷ phân tinh bột Vì vậy, chúng thường có mặt trong các thực phẩm cóhàm lượng tinh bột cao như gạo, khoai tây…[38, 45, 51]

Các chủng B cereus gây nôn có khả năng sản sinh ra một loại độc tố dạng

vòng nhỏ có khối lượng phân tử là 1,2 kDa được đặt tên là cereulide [9] Độc tố này cókhả năng kháng lại nhiệt độ cao, nó có thể tồn tại ở 126ºC trong

90 phút, pH=2, không bị thuỷ phân bởi các enzym tiêu hoá trypsin, pepsin…và

có khả năng gây độc ở liều lượng thấp [61] Cereulide là một peptit dạng vòngdodecadepsipeptid gồm 36 vòng liên kết với nhau theo liên kết este và peptit (Hình1.4) [9,10,24]

[ L-o- Val-L- Val-D-o- Leu-D- Ala]3

Hình 1.4 Cấu trúc hoá học của cereulide [24]

Dựa vào cấu trúc hóa học của cereulide có thể phỏng đoán rằng nó đượctổng hợp nhờ một enzym tổng hợp peptit không cần riboxom (a nonribosomal pepdidesymthetase NRPS) Cấu trúc dạng vòng và sự có mặt của các D-axit amin trong chuỗipeptit thường là sản phẩm của cơ chế tổng hợp sinh học không cần riboxom [10,41,55] Cấu trúc hoá học của cereulide

gần giống với cấu trúc của valinomycin do Streptomyces griseus sinh ra

[9,52,53] Vì vậy cũng giống như valinomycin, cereulide cũng có vai trò như là mộtthể vận chuyển ion K+ (potassium ionphore) [9,42,48] Trong một nghiên cứu trên

tế bào tinh trùng lợn, người ta thấy độc tố nôn làm cho tinh trùng lợn di chuyển rấtchậm Nguyên nhân của hiện tượng này là do cereulide mang ion K+ gây độcđối với ty thể và ngăn cản quá trình phosphoryl hoá tổng hợp năng lượng ở đây[11] Ngoài ra, cereulide có khả năng ức chế tế bào giết tự nhiên (NK) của người, vìvậy nó có thể ảnh hưởng tới khả năng miễn dịch của con người [46,52,53]

1.3.2.2 Cơ chế gây nôn của độc tố nôn

Độc tố nôn (cereulide) được sinh ra từ cuối pha phát triển luỹ thừa cho tới pha

phát triển cân bằng (có thể kéo dài đến khi hình thành bào tử) của tế bào B cereus Nhiệt độ thích hợp để B cereus sinh cereulide là 25-30ºC còn nhiệt độ <10ºC hay

>40ºC B cereus đều không tạo ra độc tố nôn [23] Ngộ độc thực phẩm do B cereus

gây nôn là loại ngộ độc do ăn phải thực phẩm có nhiễm một lượng lớn độc tốcereulide Khi ăn phải thực phẩm này, do độc tố có khả năng kháng lại pH axít và sựthuỷ phân của enzym tiêu hoá trong dạ dày nên chúng không bị phá huỷ Trong dạdạy, chúng sẽ kết hợp với thụ thể

5-HT3 tác động đến hệ thần kinh phế vị gây kích thích cổ họng dẫn đến hiện tượngnôn [9,45,61]

1.3.3 Những bệnh gây ra bởi Bacillus cereus, không liên quan tới ngộ độc thực phẩm

Bên cạnh khả năng gây ngộ độc thực phẩm, B cereus còn được biết

đến như một tác nhân lây nhiễm cơ hội gây ra một số bệnh không liên quan tới

thực phẩm Sự lây nhiễm này là do B cereus phát triển bên ngoài đường ruột [23].

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, ngoài độc tố gây nôn và độc tố

ruột gây tiêu chảy, B cereus còn sản sinh nhiều loại enzym như

photpholipase, gelatinase, haemolysin…Vì vậy khi chúng lây nhiễm vào các vếtthương như vết bỏng, vết trầy xước… chúng sẽ sản xuất độc tố làm cho bệnh nặng

thêm [23] B cereus còn có thể lây nhiễm vào mắt thông qua các vật lạ, bụi gây ra các bệnh như viêm nội nhãn, viêm giác mạc [18,23,56,61] Nguy hiểm hơn là khi B cereus thông qua thuốc tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch hay qua dụng cụ y tế, băng gạc

chúng đi vào máu và gây ra một số bệnh nguy hiểm cho con người như nhiễm trùngmáu, viêm màng trong tim, viêm phổi, hoại thư và có thể ảnh hưởng tới cả hệ thầnkinh trung ương Đặc biệt, đối với trẻ sơ sinh, người bị suy giảm hệ thống miễn dịch

và những người dùng thuốc gây ức chế miễn dịch như những người bị bệnh AIDS, ungthư hay những người phải thay ghép nhân tạo, chỉnh hình, cấy ghép tuỷ sống… thì

nguy cơ nhiễm B cereus là rất lớn [16,23].

1.4 Ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus

1.4.1 Nguồn gốc lây nhiễm B cereus

Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên và khả năng hình thành bào tử mà B cereus có thể lây nhiễm vào thực phẩm bằng nhiều cách [45] Chúng có thể tồn tại

trong thực phẩm lâu dài cho dù thực phẩm đó đã trải qua các quá trình như xử lýnhiệt, sấy, thanh trùng…

B cereus có mặt ở khắp mọi nơi, có thể dễ dàng phân lập được chúng từ đất,

nước, bụi, không khí… đặc biệt là trong đất Đất có thể chứa từ 103

-105 bào tử B cereus/g [31] Vì vậy, đất chính là nguồn lây nhiễm chủ yếu bào

tử B cereus vào thực phẩm B cereus trong đất dễ nhiễm vào các loại cây như

lúa, rau màu, cây gia vị… [20,31] Các nghiên cứu cho thấy 100% các loại gạo đều

chứa bào tử B cereus Trong gạo và các thực phẩm giàu tinh bột như khoai tây, các loại ngũ cốc khác… phát hiện được chủ yếu là B cereus gây nôn Trong khi đó, các chủng B cereus gây tiêu chảy lại có thể phát triển ở phổ thực phẩm rộng hơn Nó có

thể tồn tại từ các loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật như các loại rau cho tớinhững thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt, sữa, cá…[45]

Ngoài khả năng lây nhiễm trực tiếp vào thực phẩm từ đất, nước, không khí…

B cereus còn có thể lây nhiễm vào thực phẩm bằng nhiều con đường khác như sự lây nhiễm của bào tử B cereus trong các loại gia vị dùng để ướp, chế biến các món ăn… [45] Đặc biệt, do bào tử B cereus có tính chất kỵ nước nên nó có khả năng bám rất

chắc vào bề mặt của các dụng cụ chế biến thực phẩm như xoong, nồi, chảo…hay cảcác dây truyền máy móc trong chế biến thực phẩm công nghiệp [12,13,54] Vì vậy,

nếu dụng cụ chế biến không được vệ sinh sạch sẽ thì bào tử B cereus rất dễ nhiễm vào thức ăn gây ngộ độc cho người sử dụng Bào tử B cereus còn được tìm thấy trong

nhà máy sản xuất giấy hay bao bì gói thực phẩm Do vậy, thực phẩm sau chế biến có

thể loại được B cereus nhưng đến tay người sử dụng vẫn có thể bị nhiễm do bao bì

của chúng [54] Như vậy, tuy chỉ có khả năng gây ngộ độc thực phẩm khi trong

thực phẩm có chứa một lượng nhất định tế bào nhưng B cereus vẫn là loại vi khuẩn

có nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm cao [45]

1.4.2 Cơ chế gây ngộ độc thực phẩm của Bacillus cereus

Khi con người ăn phải thực phẩm bị nhiễm B cereus thì nguy cơ bị ngộ độc là rất lớn Hầu hết các loại thực phẩm đều có khả năng lây nhiễm bào tử của B cereus Nếu môi trường thực phẩm đó không thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử thì

B cereus sẽ được tiêu hoá ở dạng bào tử Ngược lại, nếu điều kiện thực phẩm cho phép bào tử nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng thì B cereus sẽ được tiêu hoá ở dạng

tế bào [44] Đặc biệt nếu trong thực phẩm xuất hiện chủng B cereus có mang gen mã

hoá sản sinh độc tố cereulide thì khi con người ăn phải thực phẩm có độc tố đó sẽ bịngộ độc với thể bệnh nôn [21, 45]

Sau khi thực phẩm có nhiễm B cereus được tiêu hoá chúng sẽ được đưa tới

dạ dày Dạ dày là nơi có pH thấp và có sự hoạt động của các enzym tiêu hoá nhưpepsin, tripsin… Vì vậy, nếu trong thực phẩm chỉ chứa bào tử thì do tính kháng axít

và các enzym tiêu hoá nên chúng nhanh chóng được chuyển tới ruột non Cònnếu thực phẩm chứa cả hai loại bào tử, tế bào sinh

dưỡng thì phụ thuộc vào pH của dạ dày mà chỉ có bào tử hay cả bào tử và tế bào B cereus được chuyển qua ruột non Nếu pH của dạ dày quá thấp thì chỉ có bào tử được

chuyển qua còn nếu pH thuận lợi hơn sẽ tạo cơ hội cho cả tế bào sinh dưỡng được điqua Do pH của dạ dày còn phụ thuộc vào loại thực phẩm và cơ thể của từng người

Khi vào tới ruột non, bào tử B cereus sẽ nảy mầm, phát triển và sản sinh độc tố Nếu

lượng độc tố tích luỹ đủ thì sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy [45]

Trường hợp trong thực phẩm có chứa sẵn độc tố, nếu là độc tốcereulide thì khi vào tới dạ dày chúng sẽ liên kết vào thụ thể 5-HT3 trong dạ dày vàgây ra ngộ độc thể bệnh nôn [9] Còn nếu là độc tố gây tiêu chảy enterotoxins thì khivào tới dạ dày chúng sẽ bị các enzym tiêu hoá phá huỷ Như vậy, ngộ độc thực phẩmthể bệnh tiêu chảy chỉ xảy ra do quá trình tạo tích luỹ độc tố ruột trong ruột nonngười [57]

1.4.3 Liều lượng gây ngộ độc

Hầu hết tất cả các loại thực phẩm đều có thể bị nhiễm bào tử B cereus nhưng

khả năng gây ngộ độc còn phụ thuộc vào liều lượng lây nhiễm Ngộ độc thực phẩm

chỉ có thể xảy ra khi thực phẩm đó bị nhiễm một lượng bào tử, tế bào B cereus nhất

định [45] Năm 2000, trong một nghiên cứu về vụ ngộ độc xảy ra ở Hà Lan do ăn

phải món cơm chay nhiễm độc tố của B cereus Sau khoảng 2 giờ, 100 trong 120

người ăn đã có triệu chứng nôn và đau bụng dữ dội Trong mẫu thực phẩm đó người taxác định được nồng độ của độc tố nôn là khoảng 0,03-13,3ỡg/g thực phẩm Bằng các

thí nghiệm invitro, đã xác định trong thực phẩm có khoảng 105-108 tế bào B cereus có khả năng sinh độc tố nôn là có thể gây ra ngộ độc [45] Do tính kháng nhiệt cao của độc tố nôn cereulide nên dù tế bào B cereus có thể bị tiêu diệt bởi nhiệt

độ trước khi được tiêu hoá nhưng độc tố nôn thì vẫn còn tồn tại Điều đó giải thích vìsao có nhiều vụ ngộ độc xảy ra đã được thông báo là chỉ có nhiễm khoảng 103 tế

bào/g Do vậy, số lượng tế bào B cereus trong thực phẩm không phản ánh đúng sự

nguy hiểm của ngộ độc thể nôn [23, 30, 38]

Đối với ngộ độc thể bệnh tiêu chảy, do cơ chế gây bệnh của nó rất phức tạpnên dựa vào những số liệu về dịch tễ học cũng như những thí nghiệm trong

phòng thí nghiệm các nhà khoa học đã xác định được mật độ tế bào B cereus có thể gây ngộ độc thể tiêu chảy [45] Sau vụ ngộ độc gây tiêu chảy đầu tiên do B cereus

xảy ra ở Oslo, Hauge đã xác định được mật độ tế bào khoảng 8.108 tế bào là có thểgây ngộ độc thể tiêu chảy [35] Nhiều nghiên cứu sau đó về các vụ ngộ độc thực

phẩm có liên quan tới B cereus, đã xác định được số lượng B cereus có khả năng

gây ngộ độc dao động từ 104-1011 tế bào/g thực phẩm Lượng enterotoxin sinh ra

trong ruột non còn thay đổi phụ thuộc vào loại chủng B cereus khác nhau và nó còn

phụ thuộc vào sức khoẻ của mỗi người Đối với những người trẻ (< 19 tuổi) đặc biệt làtrẻ em và những người già (>60 tuổi) thì triệu chứng xảy ra có thể trầm trọng hơn lứa

tuổi khác dù cùng bị lây nhiễm một lượng B cereus nhất định thậm chí còn ít hơn

[45]

Nhìn chung, lượng tế bào hay bào tử B cereus biến đổi từ khoảng

105-108 tế bào/g thực phẩm có thể gây ra ngộ độc Liều lượng này rất quan trọngcho các nhà cung cấp thực phẩm cũng như các cơ quan có thể kiểm soát được về mức

độ an toàn cho thực phẩm khi cung cấp cho người tiêu dùng [30,

45, 61, 64]

1.4.4 Triệu chứng

B cereus gây ngộ độc thực phẩm với hai loại thể bệnh chính là nôn và tiêu

chảy Đối với thể bệnh tiêu chảy khi con người ăn phải thực phẩm nhiễm khoảng 105

-108 tế bào/g thực phẩm, sau khoảng 8-16 giờ (thường là 10-12 giờ) ủ bệnh (là

khoảng thời gian tính từ lúc thực phẩm được tiêu hoá, tế bào hay bào tử B cereus

được đi qua dạ dày chuyển đến ruột non, bào tử nảy mầm phát triển và sinh độc tốruột enterotoxin) thì xuất hiện những biểu hiện đầu tiên của thể bệnh [39,61,62,64].Người bệnh cảm thấy đau bụng dữ dội, tiêu chảy ra nước, một số trường hợp có thểxuất hiện nôn Những triệu chứng

lâm sàng này rất giống triệu chứng ngộ độc do Clostridium perfringens một loại trực

khuẩn Gram dương có khả năng tạo bào tử nhưng không có khả năng chuyển động [4,23,61,62,64]

Đối với thể bệnh gây nôn thì sau khoảng 0,5- 6 giờ ăn phải thực phẩm có chứađộc tố nôn cereulide, người bệnh sẽ cảm thấy buồn nôn, nôn mửa thỉnh thoảng có thể

bị tiêu chảy [38] Những triệu chứng lâm sàng này tương tự triệu chứng ngộ độc thực

phẩm do Staphylococcus aureus một loại cầu khuẩn không chuyển động, không tạo

bào tử, sinh sắc tố vàng trên môi trường nuôi cấy [4, 23,61,62,64]

Phần lớn các triệu chứng ngộ độc do B cereus thường nhẹ và sẽ kết thúc sau

khoảng 24 giờ [23,61,62,64] Tuy nhiên chỉ có một vài trường hợp tiêu chảy ra máu sẽgây nguy hiểm tới tính mạng cũng đã được thông báo [40] Nhìn chung, tất cả mọi

người đều dễ dàng ăn phải thực phẩm bị nhiễm B cereus nhưng triệu chứng lâm sàng

hay mức độ gây ngộ độc đối với mỗi người lại khác nhau, phụ thuộc vào sức khoẻ vàsức đề kháng của mỗi người [45]

1.5 Biện pháp phòng ngừa sự lây nhiễm và phát triển của Bacillus cereus

trong thực phẩm

B cereus phân bố khắp nơi trong đất, nước, không khí… nên việc ngăn ngừa chúng đặc biệt là bào tử B cereus vào thực phẩm là không dễ dàng [64] Vì vậy, biện pháp hữu hiệu nhất để phòng ngừa ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B cereus là tìm mọi

cách hạn chế tối đa sự nảy mầm của bào tử, ngăn ngừa sự nhân nhanh của các tế bào

sinh dưỡng trong thực phẩm để duy trì mật độ B cereus dưới mức nguy hiểm (<105

bào tử/g thực phẩm) [45]

1.5.1 Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ cao

Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ cao là phương pháp được sử dụng phổbiến hiện nay để tiêu diệt bào tử, tế bào vi khuẩn trong thực phẩm [4] Tuy nhiên

do bào tử của B cereus có khả năng kháng nhiệt cao nên các quá trình xử lý nhiệt

bình thường như quá trình nấu với nhiệt độ nhẹ nhàng hay

các quá trình thanh trùng không đủ khả năng giết chết tất cả bào tử B cereus mà chỉ

có thể tiêu diệt được tế bào sinh dưỡng [45] Vì vậy, khi chế biến thực phẩm phải chú

ý đun sôi ở nhiệt độ >100ºC trong vài phút sẽ hạn chế được bào tử B cereus [64].

Biện pháp xử lý bằng nhiệt độ cao có thể làm thay đổi trạng thái, cảm quan vàlàm giảm hay mất một số giá trị dinh dưỡng của thực phẩm [4] Vì vậy, tuỳ từng loạisản phẩm mà ta sẽ chọn các phương pháp thích hợp Hiện nay thường dùng 2 phươngpháp phổ biến là:

Phương pháp hấp thanh trùng (sterilization):

Đối với các loại thực phẩm đặc biệt là các thực phẩm đóng hộp thì phương

pháp này rất hiệu quả trong việc kiểm soát lượng bào tử B cereus Các sản phẩm

thực phẩm được khử trùng ở nhiệt độ 105ºC liên tục trong 3 phút có thể làm giảm

105 lượng B cereus còn nhiệt độ >105ºC có thể loại hết vi khuẩn này Như vậy với

nhiệt độ từ 105-130ºC nhờ thiết bị gia nhiệt bằng hơi nước bão hoà có thể loại được

một số loài vi khuẩn đặc biệt là B cereus ra khỏi thực phẩm [45].

Phương pháp hấp Pasteur (Pasteurisation):

Phương pháp này tiệt khuẩn ở nhiệt độ 63-65ºC cho các sản phẩm sữa, nước

quả, bia, rượu vang…Phương pháp này diệt được các tế bào sinh dưỡng của B cereus

mà vẫn đảm bảo về giá trị dinh dưỡng cũng như giá trị cảm quan của sản phẩm

Hạn chế của phương pháp này là không thể diệt hết được bào tử B cereus, tuy nhiên

có thể hấp Pasteur nhiều lần mỗi lần khoảng 30 phút sẽ nâng cao được hiệu quả củaphương pháp này [45]

1.5.2 Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ thấp

Nhiệt độ thấp sẽ ức chế quá trình phát triển của vi sinh vật, chúng sẽ khôngtăng lên về số lượng, không hoạt động hoặc hoạt động yếu [4] Thực phẩm sau khi chếbiến được làm lạnh nhanh xuống khoảng 10ºC sau đó đem bảo quản ở nhiệt độ <10ºC (lý tưởng là 4ºC) [45] Mục đích của việc bảo