Ứng dụng kỹ thuật metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của việt nam

Mục tiêu nghiên cứu - Xác định được thành phần giới, họ, chi, loài của các mẫunghiên cứu - So sánh sự giống và khác nhau của các mẫu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu - Phân lập DNA tổng số

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

1

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN

SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HỒ MẠNH TƯỜNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT METAGENOMICS TRONG NGHIÊN CỨU HỆ VI SINH VẬT

VÙNG RỄ CÂY DÓ BẦU TẠI MỘT SỐ TỈNH CỦA VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

HÀ NỘI, 2015

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN

SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HỒ MẠNH TƯỜNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

Mã số: 60 42 01 14

Người hướng dẫn: PGS.TS LÊ VĂN SƠN Đơn vị: Viện Công nghệ sinh học

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

3

Hà Nội, 2015

MỞ ĐẦUMetagenomics là một nghành nghiên cứu mới, độc đáo và có thể áp dụng rộng rãitrong lĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học Công nghệ metagenomics kết hợp với kỹthuật gen, kỹ thuật protein sẽ cung cấp các hiểu biết sâu sắc về các vấn đề trong tiến hóagen hoặc thông tin về các sinh vật mà hiện nay vẫn đang là bí ẩn vì chúng khó có thể đượcnuôi cấy trong các phòng thí nghiệm

Môi trường đất rất phức tạp khi nghiên cứu số lương và sự đa dạng các loàitrong hệ vi sinh vật Dựa trên việc phân lập DNA từ một vài mẫu đất khác nhau, số lượngcác sinh vật nhân sơ được xác định từ khoảng 2000 đến 18000 bộ gen trên một gramđất Số lượng này là rất thấp bởi vì các bộ gen của các loài hiếm và chưa được biết đến

đã bị loại ra trong quá trình phân tích Do đó, số

lượng và sự đa dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1 gram đất phải lớn hơn rất nhiều.Trong khi đó, phương pháp nuôi cấy trực tiếp hoặc không trực tiếp để khám phá và khaithác sự đa dạng của hệ vi sinh vật có trong đất Nuôi cấy và phân lập DNA của vi sinhvật là phương pháp phổ biến nhưng chỉ được từ 0,1 đến 1% vi sinh vật là có thể đượcnuôi cấy sử dụng các phương pháp tiêu chuẩn, vì vậy sự đa dạng của hệ vi sinh vật vẫnchưa được khám phá hết

Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm họ Trầm, bộ Bông là lớp Cây gỗ lớn

thuộc ngành Mộc Lan Chi Trầm có tất cả 25 loài khác nhau phân bố chủ yếu ở khu vựcnhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á và miền Nam Trung Quốc

Tại Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đới thường xanh, rừng

ẩm nguyên sinh Trầm hương được sử dụng để chữa một số bệnh hiểm nghèo, có tácdụng kháng khuẩn, có tính kháng sinh Giá trị quan trọng nhất của cây dó bầu là nguồnvật liệu sinh trầm hương Trầm hương được coi là một loại lâm sản ngoài gỗ có giá trịthương mại quốc tế nhất Trên thế giới, Trầm hương được sử dụng để chưng cất tinh dầutrầm, một chất quan trọng cho ngành công nghiệp mỹ phẩm cao cấp Tinh dầu trầm

có giá trị đặc biệt, được dùng trong công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loạinước hoa cao cấp, giá trị

Hệ vi sinh vật vùng rễ đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và pháttriển của cây dó bầu Tuy nhiên, vai trò của chúng chưa được nghiên cứu kỹ cũng nhưchưa có một nghiên cứu nào về sự tác động của hệ vi sinh vật đến khả năng tạo trầm Vìvậy, nghiên cứu này tập trung vào sử dụng kỹ thuật mới metagenomic để nghiên cứu hệ

vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được thành phần giới, họ, chi, loài của các mẫunghiên cứu

- So sánh sự giống và khác nhau của các mẫu nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập DNA tổng số từ đất của các mẫu nghiên cứu

- Gắn adapter với mỗi mẫu nghiên cứu

- Xác định trình tự 16S của các mẫu nghiên cứu

- Xác định độ đa dạng của các mẫu nghiên cứu

- Xác định thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu

- So sánh thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

5

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây dó bầu và khả năng tạo trầm

1.1.1 Nguồn gốc, phân bố

Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm (Aquilaria), họ Trầm ( T h y m e l aeacea e ),

bộ Bông (M a l v a l e s ) , lớp Cây gỗ lớn thuộc ngành Mộc Lan Chi Trầm có tất cả 25 loài

khác nhau, tuy nhiên chỉ có 15 loài có khả năng cho trầm hương gồm: Aquilaria crassna; A.baillonii; A.sinensis hoặc A.chinesis; A.borneensis ; A.malaccensis ; A.gollocha ; A.hirta; A.rostrata; A.beccariana; A.cummingiana; A.filaria; A.khasiana; A.microcarpa; A.grandiflora; A.bancana; A.rugosa, trong đó loài A rugosa được Kiet và cộng sự phát hiện năm 2005 (Kiet et al., 2005).

Chi Trầm phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á vàmiền Nam Trung Quốc Tại Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đớithường xanh, rừng ẩm nguyên sinh thuộc các tỉnh Tuyên Quang, Thanh Hoá, Nghệ An,

Hà Tĩnh, đặc biệt là từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng,Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang

và đảo Phú Quốc (Hình 1, Danh lục các loài thực vật Việt Nam) Trầm hương phân bố tạiViệt nam có 4 loài là:

Trầm hương (A.crassna Pierre ex Lecomte); dó baillon (A baillonii Pierre ex Lecomte),

dó bana (A banaensae.Phamhoang.) (Phạm Hoàng Hộ 1992) và dó quả nhăn (A rugosa L.C Kiet & Krbler) (Lê Công Kiệt et al., 2005) Trong đó, cây dó bầu A crassna là loài

được trồng phổ biến nhất vì khả năng loại trầm tốt nhất thế giới (Hoàng Cảnh 2006) Các

loài dó baillon (A baillon), dó bana (A banaensae) và dó quả nhăn (A rugosa) đều là

đặc hữu có thể bắt gặp tại một vài địa điểm thuộc Quảng Trị, Thừa Thiên Huế và

Quảng Nam Trong kho đó, dó quả nhăn (A rugosa) là loài mới được phát hiện tại Kon

Tum

Hình 1.1 Phân bố dó bầu tại Việt NamHiện nay, các cá thể trưởng thành của trầm hương cơ bản bị tuyệt diệt trong tựnhiên Vùng trọng điểm gây trồng cây dó trầm hiện nay ở nước ta là Bán Trung Bộ,Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, và Tây Nam Bộ Trong đó, vùng Bắc Trung

Bộ tập trung chủ yếu tại Hà Tĩnh,vùng Nam Trung Bộ tập trung chủ yếu tại QuảngNam, vùng Tây Nguyên chủ yếu tập trung tại Kon Tum, Đông Nam Bộ tập trung chủ yếutại Bình Phước, Tây Nam Bộ tập trung chủ yếu tại Kiên Giang và An Giang

1.1.2 Giá trị kinh tế, dược liệu và sinh thái

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

7

Giá trị kinh tế: Giá trị quan trọng nhất của cây dó bầu là nguồn vật liệu sinh trầm

hương Trầm hương được coi là một loại lâm sản ngoài gỗ có giá trị thương mại quốc tếnhất Trên thế giới, Trầm hương được sử dụng để chưng cất tinh dầu trầm, một chấtquan trọng cho ngành công nghiệp mỹ phẩm cao cấp Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt,được dùng trong công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loại nước hoa cao cấp, giátrị Theo công ước về buôn bán quốc tế những loài động thực vật hoang dã nguy cấp,khối lượng mua bán trầm hương trên thị trường thế giới thời kỳ 1995 – 1997 khoảng1.350 tấn Giá mua bán Trầm hương được tính theo kg tùy thuộc vào chất lượng Giábán Trầm tại thị trường Dubai (Arabia Saudi) vào năm 1993 dao động từ 27 đô la

Mỹ/kg (loại thấp nhất) đến 10.000 đô la Mỹ/kg (loại tốt nhất) (Barden et al., 2000).

Giá trị dược liệu: Trong y học, trầm hương còn được sử dụng để chữa một số

bệnh hiểm nghèo, chữa các bệnh đau bụng, đau ngực, nôn mửa, hen suyển, lợi tiểu,giảm đau, trấn tĩnh, hạ sốt, cấm khẩu, thổ huyết, khó thở, kích dục… Trầm hương có tác

dụng kháng khuẩn, đặc biệt là với các loại khuẩn Mycobacterium tuberculosis và Shigella flexneri, có tính khánh sinh, tạo kháng thể mạnh (diệt khuẩn, làm lành vết

thương), có tác dụng chữa một số bệnh như bệnh về tim mạch (suy tim, đau ngực), bệnh

về hô hấp (hen suyễn), bệnh về thần kinh (an thần, mất ngủ, giảm đau, trấn tĩnh….),bệnh về tiêu hoá (đau bụng, buồn nôn, tiêu chảy), bệnh về tiết niệu (bí tiểu tiện) Đặcbiệt có thể dùng trầm hương để chữa ung thư tuyến giáp

Giá trị sinh thái: Đối với môi trường sinh thái và phát triển bền vững, việc đưa dó bầu (Aquilaria sp.) vào cơ cấu cây rừng với mục tiêu 5 triệu hecta rừng tại tỉnh Hà Tĩnh

nói riêng và trong cả nước nói chung đã góp phần thúc đẩy tăng độ che phủ của rừng,chống xói mòn đất và bảo vệ môi trường Cây gió bầu góp phần bảo tồn và phát triển loàicây đặc hữu, qúy hiếm, có giá trị về khoa học và

kinh tế của nước ta, đây còn là giải pháp phù hợp với quy luật sản xuất đi đôi với bảo

vệ môi trường, kết hợp lợi ích trước mắt với lợi ích lâu dài, làm giàu trên cơ sở khaithác và tái tạo lợi thế đặc hữu, ưu việt của tài nguyên quốc gia Hơn nữa, cây dó bầu còn

có ý nghĩa tạo công ăn việc làm cho người lao động, mở ra hướng phát triển kinh tế bềnvững cho nông thôn, vùng sâu vùng xa (Thái Thành Lượm 2009)

1.1.3 Khả năng sinh trầm của dó bầu

Sự tạo trầm trong tự nhiên của cây dó bầu là sự biến đổi của các phần tử gỗ dotác động bệnh lý bởi vết nứt gãy, sự xâm nhập của các loài nấm…Có 3 giả thuyết tồn tạiđến sự tạo trầm liên quan đến các tác nhân bệnh lý, thương tích bệnh lý hoặc thương tíchkhông bệnh lý (Ng et al., 1997) Kết quả của nghiên cứu không cung cấp được bằngchứng thuyết phục là tác nhân nào trong số 3 tác nhân trên tác động đến sự tạo trầmcủa cây Ngoài ra, nghiên cứu của Oldfield et al (1998) cho rằng quá trình tạo trầm cóliên quan đến sự đáp ứng của cây với nấm Hơn nữa, Heuveling và Phillips (1999) chorằng nó liên quan đến đáp ứng với thương tích Nghiên cứu cho rằng sự xâm nhiễm củanấm có thể làm tăng sự tạo trầm cũng như sự đáp ứng của tế bào chủ với vết sự pháttriển của nấm xâm nhiễm Dó bầu có thể được xâm nhiễm tự nhiên bởi một vài các loại

nấm như: Aspergillus spp, Botryodyplodia spp, Diplodia spp, Fusarium bulbiferum, F laterium, F oxysporum , F solani, Penicillium spp, and Pythium spp (Anon

1998; Soehartono and Mardiastuti 1997; Wiriadinata 1995) Sự tương tác giữa tế bào chủvới nấm hay các tác nhân khác để tạo thành trầm vẫn chưa được nghiên cứu kỹ Sự tươngtác này xảy ra một cách tự nhiên năm này sang năm khác Căn cứ vào sự hóa nhựa nhiềuhay ít mà có những sản phẩm như: Tóc, Trầm hương và Kỳ nam Thực tế cho thấy nhữngcây dó bầu sau khi chết rục thì lượng Kỳ nam hoặc Trầm hương thường được phát hiện

ở phần gốc rễ, nơi thường tiếp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

những năm gần đây các nghiên cứu tạo các chromone invitro (thành phần chính trong

tinh dầu trầm) từ nuôi cấy huyền phù tế bào của dó bầu đã thu được các kết quả khả

quan ban đầu (Qi et al., 2005; Ito et al., 2005).

1.2 Ứng dụng Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật

1.2.1 Vai trò của hệ vi sinh vật đối với môi trường và cây trồng

Các vi sinh vật đóng vai trò to lớn đối với các sinh vật sống trên trái đất Sự đadạng của hệ vi sinh vật phản ánh sự phong phú về chức năng, cung cấp

các thành phần cần thiết cho tất cả các dạng sống tồn tại Các vi sinh vật tham giavào hầu hết các chu trình sinh, hóa học trên tái đất từ xử lý rác thải tới thúc đẩy sự tăngtrưởng và sinh sản của thực vật, động vật Hơn nữa, vi sinh vật cung cấp cho con ngườicác sản phẩm như: thuốc, các loại sản phẩm lên men và góp phần vào việc duy trì sứckhỏe Chỉ gần đây các nhà vi sinh vật học mới đánh giá chính xác sự đa dạng trong

hệ vi sinh vật do nhiều vi sinh vật không thể

được nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả dẫn đến các nhà vi

sinh vật rất khó để tìm hiểu về các hệ vi sinh vật không thể phát hiện bằng các phươngpháp truyền thống này Vai trò của các vi sinh vật có thể được khái quát như sau:

Microbial services: Các vi sinh vật là các sinh vật rất quan trọng trên trái đất

nhưng vai trò của chúng ít được biết đến do chúng không thể được phát hiện bằng mắtthường Vi sinh vật cung cấp cho con người không khí, thức ăn và thực hiện hầu hêtcác chức năng của cơ thể, trong khi đó rất ít người biết về vai trò của chúng với cuộcsống Có rất nhiều các ví dụ điển hình cho việc cung cấp các thành phần thiết yếu của visinh vật cho các sinh vật khác (Madigan and Martinko 2005)

Sự tạo thành oxi: Một bước quan trọng trong lịch sử sống trên trái đất là sự

chuyển từ hô hấp kỵ khí sang hiếu khí được tạo ra bởi vi sinh vật tự dưỡng Khi sự sốngtrên trái đất bắt đầu, môi trường sống là hô hấp kỵ khí hoặc không cần oxi Khoảng 1 tỷnăm trước đây, một vài vi sinh vật ngoài đại dương tiến hóa khả năng sử dụng nănglượng mặt trời để tham gia vào các phản ứng mà kết quả là giả phóng oxi Oxi trên tráiđất tích tụ lại tạo thành khí quyển cho đến khi

lượng của chúng đủ để hình thành và nuôi dưỡng các sinh vật hiếu khí Trong đó mộtdạng oxi phân tử cao được hình thành là O3 do các phân tử O2 va chạm với nhau Ozone

là một phân tử rất đặc biệt, không giống như oxi, nó có thể hấp thụ tia UV Do đó, sựsống trên bề mặt trái đất có thể phát triển vì tầng ozone đã lọc hết các tia UV và bảo vệtrái đất khỏi phóng xạ có thể phá hủy DNA và tế bào Ngay sau khi hình thành oxi vàtầng ozone ở tầng bình lưu, sự sống bắt đầu bùng Tầng oxi và ozone được hình thànhđầu tiên hoàn toàn do vi sinh vật và ngày nay được duy trì bởi các vi khuẩn tự dưỡng

và thực vật (Handelsman

2007)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

11

Sự chuyển hóa nito: Một trong những vai trò quan trọng khác của vi khuẩn

là cung cấp nito dưới dạng có thể hấp thu được đối với động vật và thực vật Một trongnhững điều thú vị là mặc dù khí quyển có tới 79% là nito, tuy nhiên hầu hết các sinh vật

đề không thể sử dụng chúng Nito trong khí quyển tồn tại dưới dạng bền N2 nên các sinhvật không thể bẻ gẫy các liên kết này để sử dụng được Thực tế vi khuẩn là sinh vật duynhất có thể bẻ gẫy các liên kết trong N2 và cố định chúng (Handelsman 2007)

Duy trì sức khỏe con người: Các hệ vi sinh vật sống trong, trên cơ thể con

người rất cần thiết cho sức khỏe của vật chủ Vi khuẩn trong hệ đường ruột bảo vệ conngười khỏi sự tấn công của các mần bệnh, khi mà sự cân bằng của hệ vi sinh vật đườngruột bị phá vỡ thì sẽ kéo theo sự xuất hiện của rất nhiều bệnh như: nhiễm trùngđường ruột, ung thư ruột, béo phì và tiểu đường những bệnh này không gây ra bởi mộtsinh vật riêng lẻ mà liên quan tới các quá trình của hệ vi sinh vật Trong một số khíacạnh các chức năng của hệ vi sinh vật như là một đơn vị trong đó mỗi vi sinh vật phụthuộc vào các vi sinh vật khác cần thiết cho cuộc sống và hiệu quả chức năng của hệthống phụ thuộc vào sự tương tác và hợp tác giã mỗi thoành viên trong cộng đồng Các

hệ vi sinh vật liên quan tới cơ thể con người là chủ đề của hai quá trình tiến hóa Đầutiên, chúng đồng tiến hóa với con người qua hàng ngàn năm cộng sinh, do đó gen củacon người đã được sự hỗ trợ và dựa vào những gen những vi sinh vật này Thứ hai, mỗi visinh vật trong hệ tiên hóa trong thời gian sống của chúng Tiến hóa của các hệ vi sinhvật với loài người cũng như với sinh vật khác tạo ra sự phụ thuộc và giao tiếp giữa chúng.Kết quả là cá vi sinh vật cần được nghiên cứu về cả hệ vi sinh vật mà không chỉ nuôi cấytrong phòng thí nghiệm (Handelsman 2007)

Tổng hợp kháng sinh: Các vi sinh vật là nguồn cung cấp hầu hết các kháng

sinh để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn Năm 1920, Alexander Fleming đã

tìm ra chất tiết penicillin của nấm có thể ngăn cản việc phát triển của vi khuẩn Pháthiện ra penicillin đã dẫn tới việc khám phá và thương mại hóa kháng sinh cho y học vànông nghiệp Rất nhiều vi khuẩn tiết ra kháng sinh với nhiều tính chất hóa học và chứcnăng khác nhau, cung cấp các loại thuốc chúng ta có ngày nay Nguyên nhân nấm và visinh vật sản sinh ra kháng sinh vẫn chưa được biết nhưng khả năng phổ biến là chúng rấtquan trọng trong đời sống của các sinh vật này Một giả thuyết được quan tâm là cácsinh vật này sử dụng để hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác; một giả thuyếtkhác là chúng sử dụng kháng sinh như là một tín hiệu để cảnh báo với các loàikhác trong khu hệ (Handelsman 2007).

Các vai trò khác: Vai trò của vi sinh vật với các quá trình sinh hóa và tự nhiên là

vô cung to lớn: tham gia vào các chu trình dinh dưỡng, hoặc cải tiến y học Ngoài ra,chúng còn tham gia vào các quá trình chuyển hóa thức ăn: lên men, cung cấp cácenzyme hay polymers, làm sạch các rác thải độc hại và bảo vệ sức khỏe của con người,thực vật và động vật mặc dù vi sinh vật thường liên quan tới các bệnh nhưng các tácnhân gây bệnh chỉ là một phần nhỏ của hệ vi sinh vật trên trái đất và các vi sinh vật cóích sẽ giúp kiểm soát các tác nhân gây bệnh (Handelsman 2007)

Ngoài ra, các hệ vi sinh vật tồn tại trên và xung quanh cây trồng đóng vai trò hếtsức quan trọng lên năng suất và chất lượng cây trồng Tuy nhiên, mới chỉ một số loài vikhuẩn có vai trò đã được biết đến Nhiều loài vi sinh vật khác có khả năng sử dụng cácchất từ xác động vật và thực vật phân hủy, hoặc chuyển hóa một số nguyên tố như sắt vàmangan, thành các hình thức mà thực vật có thể hấp thụ được Thực vật không thể tồntại và phát triển nếu thiếu hệ vi sinh vật đất Trên một số môi trường đất, cây trồng vẫnphát triển tốt ngay cả khi tồn tại các tác nhân gây bệnh ở mật độ cao Sau nhiều thập kỷnghiên cứu, các nhà bệnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

13

lý học thực vật phát hiện các hệ vi sinh vật cực kỳ phức tạp đóng vai trò ức chế tác nhângây bệnh, các nghiên cứu chỉ ra rằng các phức hệ vi sinh vật này có thể góp phần vôcùng hữu ích cho sản xuất nông nghiệp Không một vi sinh vật riêng lẻ nào đượcphân lập lại có khả năng tương tự, điều này cho thấy tác động qua lại, hỗ trợ nhau trongquá trình ức chế tác nhân gây bệnh của các thành viên trong hệ vi sinh vật đất Cácnghiên cứu trên cho thấy tiềm năng của hệ vi sinh vật đất là rất lớn và nghiên cứu thànhcông hệ vi sinh vật này hứa hẹn mang lại nhiều thành tựu to lớn trong lĩnh vực sản xuấtcác chế phẩm sinh học như phân bón vi sinh hay tác động đến hệ vi sinh vật đất nhằmcải thiện và nâng cao chất

lượng cây trồng Qua trên có thể thấy rằng Metagenomics là một bước cách mạnghóa ngành vi sinh vật vì nó đã mở ra một cửa sổ để nghiên cứu thế giới vi sinh vật khổng

lồ mà trước đây chưa được nghiên cứu

1.2.2 Giới thiệu về công nghệ metagenomics

Thuật ngữ "metagenomics" lần đầu tiên được đưa ra năm 1985 bởi nhóm

nghiên cứu của Handelsman (Handelsman et al., 1998) “Metagenomics” là phương

pháp phân tích hệ vi sinh vật các loài vi sinh vật trong các phức hệ vi sinh vật thutrực tiếp từ môi trường tự nhiên mà không cần nuôi cấy thông qua phương phápđọc trình tự (Handelsman et al., 1998; Handelsman and Sjoling, 2007, Chen and Patcher 2005; Riesenfeld et al.,

2004; Schloss et al., 2004; Susannah and Edwward 2005; Patrick et al., 2005) Đây là

một ngành khoa học mới nhằm cung cấp cho các nhà khoa học công cụ tiếp cận vớihầu hết các loài vi sinh vật khó nuôi cấy trên môi trường nhân tạo Do đó,metagenomics cho phép nghiên cứu sự đa dạng của hệ vi sinh vật mà chưa từng đượcnghiên cứu trước đây, vì vậy cung cấp một nhận thức hoàn toàn

mới về cấu trúc và chức năng của hệ sinh thái cúng như sự đa dạng của đại dương và

hệ tiêu hóa của con người Như đã biết, chỉ có khoảng 0,1 đến 10% trong tổng sốlượng các loài vi sinh vật đã được quan sát trong tự nhiên là có thể nuôi cấy trong điềukiện phòng thí nghiệm Những sinh vật không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạonày đôi khi là độc nhất và có những tiềm năng độc đáo như phân hủy rác thải hay tổnghợp các hợp chất có thể sử dụng như là thuốc hay kháng sinh Metagenomics là mộtcông cụ mạnh mẽ trong việc tiếp cận với các nguồn tài nguyên vi sinh vật mà chưađược khai thác về đa dạng sinh học trong các mẫu thu từ môi trường Metagenomicsđược sử dụng như một công cụ của hệ thống điều tra, phân loại và thao tác toàn bộ vậtliệu gen phân lập từ môi trường Quá trình đa bước này dựa vào 4 bước chính: (1) phânlập các vật liệu gen; (2) thao tác trên các vật liệu gen này; (3) xây dựng thư viện gen;(4) phân tích các vật liệu gen trong các thư viện metagenomic

Metagenomics là một nghành nghiên cứu mới và có thể áp dụng rộng rãi tronglĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học Mặc dù đã có những bước phát triển trong biểuhiện các gen khác nhau, xây dựng thư viện gen , nhưng việc thiết kế vector cần phải cảitiến hơn nữa Các kỹ thuật phân tử hiện nay đã được chứng minh là có đủ khả năng giảiquyết các vấn đề về sản phẩm như: khám phá ra các loại kháng sinh và các loại enzime

mới Các nghiên cứu gần đây về tảo biển (Sargasso Sea) (Venter et al., 2004), Acid mine drainage (AMD) (Tyson et al.,

2004), đất (Tringe et al., 2005) đã sử dụng phương pháp giải trình tự đoạn ngắn

(shotgun-sequencing) để phát hiện và thống kê các mẫu trong các mẫu môi trường khác nhau.Trong mỗi nghiên cứu, các mẫu môi trường được thu thập và DNA được tách chiết trực

tiếp từ các mẫu này, sau đó chúng được nhân dòng trong E.coli và các dòng nhân ngẫu

nhiên này được giả trình tự Tuy nhiên, những thư viện gen này không thể giả thích chứcnăng của các gen của mỗi sinh vật trong trong hệ vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

15

sinh vật Do đó, khi công nghệ metagenomics kết hợp với kỹ thuật gen , kỹ thuật protein,phân tích dựa vào sự biểu hiện và kính hiển vi sẽ cung cấp các nhận thức sâu sắc về cácvấn đề như: tiến hóa gen hay các sinh vật mà hiện nay vẫn đang là bí ẩn vì chúng khó có

thể được nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm (Allen et al.,

2005)

Những sự tiến bộ gần đây trong phân tích metagenomic bắt nguồn dựa vào phântích trình tự và chức năng của các mẫu từ nước, đất và liên quan với các tế bào vật chủ

Ý tưởng nhân dòng DNA trực tiếp từ các mẫu môi trường được đưa ra đầu tiên bởi Pace

(Pace et al., 1985), sau đó năm 1991 đã nhân dòng thành công vector phage (Schmidt et al., 1991) Các bước cải tiến tiếp theo đã được xây dựng một thư viện metagenomic với

DNA bắt nguồn từ hỗn hợp các sinh vật được nuôi trên cỏ khô trong phòng thí nghiệm

(Healy et al., 1995) Công việc của nhóm DeLong đã đưa tiếp nối các thành công của lĩnh

vực này khi nhóm đã thực hiện thành công việc lập thư viện từ các loài nhân sơ từ nước

biển (Stein et al., 1996) Mặt khác, một thách thức lớn để tiếp cận với việc phân tích

metagenomic là việc xác định các dòng gen chức năng Sự thành công yêu cầu sự phiên

mã và dịch mã chính xác gen bao gồm phân tích năng của gen để xác định các loại kháng

sinh mới (Courtois et al., 2003; Gillespie et al., 2003), các loại gen kháng kháng sinh (Diaz Torres et al., 2003; Riesenfeld et al., 2004), vẩn chuyển Na_Li/(H) (Majernik et al., 2001) và các loại enzyme phân hủy (Healy et al., 1995; Henne et al., 1999; 2000).

1.2.3 Ứng dụng công nghệ metagenomic trong nghiên cứu đa dạng của

các hệ vi sinh vật đất

Hình 1.2 Các bước thực hiện phân tích, đánh giá nguồn gen vi sinh vật bằng

công nghệ metagenomics

Hệ vi sinh vật trong môi trường đất: môi trường đất rất phức tạp khi nghiên

cứu số lương và sự đa dạng các loài trong hệ vi sinh vật Một ví dụ như: một gram củađất rừng có chứa khoảng 4x107 tế bào sinh vật nhân sơ, trong khi đó 1 gram của đấttrồng trọt và đồng cỏ có chứa khoảng 2x109 tế bào sinh vật nhân sơ Dựa trên việcphân lập DNA từ một vài mẫu đất khác nhau, số lượng các sinh vật nhân sơ được xácđịnh từ khoảng 2000 đến 18000 bộ gen trên một gram đất Số lượng này là rất thấp bởi

vì các bộ gen của các loài hiếm và chưa

được biết đến đã bị loại ra trong quá trình phân tích Do đó, số lượng và sự đa

dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1 gram đất phải lớn hơn rất nhiều (16177

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

sự ổn định của các phân tử đất sét, cát và phù sa thông qua sự tập hợp là các tính chấtcấu trúc nổi bật của hỗn hợp đất Các khu hệ vi sinh cho các vi sinh vất đất bao gồm bềmặt của các thành phần của đất và các cấu trúc lỗ phức tạp có trong đất

Trong khi đó, phương pháp nuôi cấy trực tiếp hoặc không trực tiếp để khám phá

và khai thác sự đa dạng của hệ vi sinh vật có trong đất

Kỹ thuật độc lập với nuôi cấy: Để vượt qua các hạn chế trong phương pháp

nuôi cấy trực tiếp vi sinh vật đất, một phương pháp phân tử dựa trên sự phân lập vàphân tích các nucleic acid trong đó chủ yếu là DNA từ các mẫu đất mà không cần nuôicấy trong phòng thí nghiệm đã được phát triển Các khảo sát phát sinh loài vẫn tiếp tụcvới việc sử dụng phương pháp PCR với ở gen 16S rRNA của vi sinh vật đất sử dụng cáccặp mồi phổ biến cho vi khuẩn và cổ khuẩn Những khảo sát này cho phép liệt kê và sosánh sự đa dạng trong các môi trường sống khác nhau, phân tích sự thay đổi trong cấutrúc hệ sinh thái do sự thay đổi của các tác nhân Các gen chỉ thị khác được sử dụng

để nghiên cứu sự đa dạng hệ vi sinh vật bao gồm dnaK (HSP-70-type molecularchaperone) và amoA (ammonia monooxygenase) Tuy nhiên, các nghiên cứu về sự đadạng của môi trường đất vẫn chỉ mới bắt đầu

Xây dựng thư viện gen DNA: Mặc dù việc lập thư viện gen của vi sinh vật đất là

phụ thuộc vào kích cỡ của metagenome vi sinh vật đất và số lượng lớn các dòng gen vàyêu cầu hiểu biết đầy đủ về chúng là một nhiện vụ phức tạp và khó

khăn Việc nghiên cứu metagenomic ở vi sinh vật đất phải thông qua việc xây dựng thưviện DNA và xác định chức năng của các gen có trong thư viện này Những năm gần đây,các tiến bộ mới trong phương pháp đọc trình tự đã mang đến bước đột phá mới trongviệc xây dựng thư viện gen, giảm bớt đáng kể các

bước thực hiện trong công nghệ metagenomics (Metzker 2010; Mardis 2008) Côngnghệ này đã góp phần xác định vai trò của các vi sinh vật khác nhau trong phức hệ visinh vật đất, nghiên cứu phân tích hệ vi sinh vật của các mẫu đất khác nhau và sản xuấtcác chế phẩm mới từ vi sinh vật đất Trong các nghiên cứu gần đây, nhiều gen mã hóacác enzyme có ích và kháng sinh đã được phát hiện nhờ nghiên cứu phân tích thư việngen của các vi sinh vật đất, việc xác định các gen mới này đã nói lên tiềm năng to lớncủa việc xây dựng và phân tích thư viện gen của các vi sinh vật đất (Hardeman and

Sjoling 2007; Lussier et al., 2011).

Như vậy mặc dù gặp phải những trở ngại khó khăn ban đầu như quá trình táchDNA khỏi các tạp chất, số lượng khổng lồ các vi sinh vật tồn tại trong môi trường đất,xây dựng thư viện metagenomic, xác định chức năng của các gen mới v.v… nhưngcùng với những bước phát triển đột phá trong phương pháp đọc trình tự và công cụtin sinh học công nghệ metagenomics hiện nay đã đạt

được những thành tựu đáng kể và ngày càng được quan tâm phát triển hơn Ứng dụngcông nghệ metagenomics đã xác định được phần lớn các vi sinh vật có mặt trong môitrường đất, so sánh mức độ đa dạng giữa các môi trường khác nhau, đánh giá sự thayđổi về cấu trúc thành phần của hệ vi sinh vật dưới tác động của các tác nhân khác nhaulên môi trường Ngày nay số lượng lớn dữ liệu thu được từ công nghệ metagenomics đãđược công bố rộng rãi, không những tạo điều kiện thuận lợi cho các nhà khoa họcnghiên cứu phân tích các gen mới mà còn mở ra những hướng mới góp phần cảithiện nâng cao sản xuất nông nghiệp, công nghiệp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

19

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật metagenomics và xây dựng thư viện metagenom chophép đánh giá đa dạng di truyền và phương pháp trao đổi chất của các vi sinh vật khôngthể nuôi cấy trong quần thể vi sinh vật (Handelsman

2004; Iqbal et al., 2012) Các vector tách dòng thích hợp cho nghiên cứu

metagenomics bao gồm BAC, cosmid và plasmid Phân tích các dòng vô tính ở các bướctiếp theo có thể thực hiện bằng cách đọc trình tự hoặc thông qua các công cụ sàng lọcchức năng Việc phân tích dựa trên kết quả đọc trình tự có thể tiến hành theo phươngpháp shotgun metagenome hoặc touchdown PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho các gen

quan tâm (Iqbal et al., 2012).

1.3 Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới trong nghiên cứu

metagenomics

1.3.1 Các thế hệ máy giải trình tự trên thế giới

Ngày nay, các công ty thương mại trên thế giới đã cho ra đời các thế hệ máy đọctrình tự dựa trên nhiều công nghệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) Các kỹthuật đọc trình tự gen đã trở nên đơn giản và nhanh hơn nhờ sự ứng dụng huỳnh quangphân tích tự động (Olsvik et al., 1993; Pettersson et al.,

2009) Các công nghệ đọc trình tự mới luôn hướng tới làm tăng dung lượng (throughput),làm giảm thời gian và giá thành (Schadt et al., 2010) Mặc dù vậy, phương pháp Sanger(dựa trên cơ sở kết hợp của các dideoxynucleotide (ddNTP) bằng DNA polymerasetrong quá trình khuếch đại DNA in vitro) được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm trướcđây vẫn được thực hiện xen kẽ khi cần thiết (Sanger et al., 1977)

Đọc trình tự được thực hiện sau phản ứng khuếch đại DNA (như ở phươngpháp Sanger) được thay thế bằng đọc trình tự thực hiện ngay trong giai

đoạn tổng hợp sợi DNA bổ sung cho sợi khuôn (phương pháp pyrosequencing) (Nyrén,2007; Ronaghi et al., 1996, 1998) Đây là công nghệ khởi đầu cho kỹ

thuật “đọc trình tự bằng tổng hợp”, nền tảng của kỹ thuật đọc trình tự bộ gen hay còngọi là kỹ thuật đọc trình tự thế hệ mới sau này Với ưu thế thời gian đọc nhanh, trình tựđọc được rất chính xác, cường độ phát quang định lượng được nên dù trình tự đọc đượckhông dài (<100 bases) nhưng pyrosequencing thể hiện rõ ưu thế hơn hẳn phươngpháp Sanger và trở thành một kỹ thuật không thể thiếu trong các phòng thí nghiệmsinh học phân tử (Poehlmann et al., 2007).

Nguyên lý đọc trình tự gen thế hệ mới: theo 2 nguyên lý chính bao gồm đọc trình

tự bằng tổng hợp (sequencing by synthesis, SBS) đã được các thế hệ máy Roche 454, IonTorrent và Illumina sử dụng SBS liên quan đến việc sử dụng một hỗn hợp các dNTPđược biến đổi tại vị trí 2’ bao gồm các dNTP bổ sung tự nhiên và có đánh dấu huỳnhquang Quá trình xác định trình tự sẽ diễn ra tương tự như phản ứng PCR Về mặt lýthuyết, độ dài đoạn được đọc bằng SBS có thể lên đến hàng trăm base Nguyên lý thứhai đó là đọc trình tự gắn nối (sequencing by ligation, SBL) được sử dụng ở máy SOLiD

do George Church phát minh SBL đã được sử dụng để xác định trình tự genome và lànền tảng cho các thiết bị đọc trình tự thế hệ mới SBL là một chu trình tuần hoàn gồm 4bước SBL hoạt động trong cả hai chiều: chiều xuôi (5 'đến 3') và chiều ngược (3 'đến5') (Margulies et al., 2005; Schuster, 2008; Rusk, 2011, Mardis, 2008, Valouev et al.,2008)

1.3.2 Công nghệ giải trình tự Illumina (Solexa) sequencing

Nguyên lý công nghệ

Công nghệ giải trình tự của Illumina sử dụng các array đơn dòng và công nghệkhóa dừng thuận nghịch cho việc giải trình tự trên diện rộng với độ chính các cao Hệthống giải trình tự linh hoạt, hiện đại cho phép thực hiện một loạt

các ứng dụng nghiên cứu genomics, transcriptomics, và epigenomics Các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

21

template giải trình tự được cố đình trên bề mặt một flow cell (1 loại chip DNA)

được thiết kế để tạo ra 1 dạng DNA hỗ trợ hoạt động các enzyme trong khi đảm bảo độbền của các template bám trên bề mặt và mức độ bám trên bề mặt và mức độ bámkhông đặc hiệu thấp của các nucleotide đánh dấu huỳnh quang Quá trình nhân bảntrên pha rắn tạo ra tới 1000 bản copy giống hệt nhau của mỗi template trong trạn tháiđứng sát nhai (trong đường kính < 1 µm) Vì quá trình này không bao gồm việc ghi ảnh,thực hiện thao tác cơ học, hay đặt các hạt bead vào các giếng, nên mật độ của cáccluster trên đơn vị diện tích được đảm bảo

Công nghệ giải trình tự bằng tổng hợp (SBS) sử dụng 4 nucleotide đánh dấuhuỳnh quang để giải trình tự hàng chục triệu cluster đồng thời trên bề mặt flow-cell.Trong mỗi chu trình giải trình tự, một deoxynucloside triphosphate đánh dấu (dNTP)được thêm vào chuỗi acid nucleic Nhãn huỳnh quang của nucleotide đóng vai trò nhưmột khóa dừng phản ứng polymer hóa, do đó sau khi mỗi dNTP được tích hợp, dyehuỳnh quang được ghi lại để xác định nucleotide và sau đó bị cắt bỏ để tổng hợpnucleotide tiếp theo Vì cả 4 loại dNTP gắn khóa dừng tổng hợp thuận nghịch có mặtđồng thời dưới dạng đơn phân tử, sự cạnh tranh ngẫu nhiên giúp giảm thiểu việc tổnghợp mất cân đối Việc xác định các base dựa trực tiếp vào cường độ tín hiệu đo đượctrong mỗi chu trình, từ đó giảm thiểu các sai số thô so với công nghệ khác

Ưu nhược điểm của hệ thống

Phương pháp giải trình tự của Illumina dựa trên số lượng cực lớn các

đoạn đọc trình tự đồng thời Khối lượng mẫu lớn và độ bao phủ đồng nhất được sử dụng

để tạo ra một tổng thể và một độ tin cậy cao được đảm bảo trong việc xác định cácbiến dị di truyền Khối lượng mẫu lớn cho phép sử dụng các công cụ thống kê và chođiểm, tương tự như các phương pháp truyền thống trong việc xác định thể đồng hợp, dịhợp và phân biệt các lỗi giải trình tự Mỗi base đọc thô

có một điểm số chất lượng do đó phần mềm có thể sử dụng một số công cụ định

lượng trong việc xác định sự sai khác và cho điểm số tin cậy

Phần mềm thu nhận dữ liệu của Illumina cho phép người dùng xếp các trình tựvào một vùng tham chiếu (mẫu) của các ứng dụng giải trình tự Được phát triển dựa trên

sự hợp tác của các nhà nghiên cứu, phần mềm bao gồm các module thu nhận dữ liệu, xử

lý và phân tích tạo thành một chuỗi thu nhận và xử lý dữ liệu với sự can thiệp ít nhất

từ người sử dụng Định dạng mở của phần mềm cho phép dễ dàng truy nhập dữ liệu tạinhiều giai đoạn của quá trình xử lý và phân tích dữ liệu sử dụng các giao duện chươngtrình đơn giản

Một quy trình một chiều, khả năng tự đông hóa cao yêu cầu thời gian thao tác ítnhất Với khả năng tạo ra hàng Gb dữ liệu DNA trong một lần chạy, ngay cả cácgenome lớn của các động vật có vú có thể giải trình tự trong một vài tuần thay vì mộtvài năm như trước kia Khả năng chạy nhiều mẫu trên 1 flow cell đồng nghĩa với việc

có thể thực hiện nhiều ứng dụng trong một lần chạy

Một nhược điểm của hệ thống máy giải trình tự của Illumina đó là việc sử dụngcác hóa chất và các thiết bị có giá thành ở mức cao Chính vì vậy, với nhưng nghiên cứu ởquy mô nhỏ với kinh phí thấp sẽ ít có cơ hội được thực hiện trên hệ thống này

Ứng dụng của công nghệ Illumina

Ứng dụng của hệ thống giải trình tự Illumina là rất đa dạng, hệ thống này chophép các nhà khoa học nghiên cứu nhiều lĩnh vực trong ngành khoa học sự sống.Illumina cho phép giải mã một hệ gen hoàn chỉnh trong thời gian ngắn, so sánh với cáccông nghệ trước đây Cụ thể trong việc giải mã một hệ gen người hoàn chỉnh, với cáccông nghệ trước đây chúng ta phải mất tới 10 năm, thì hiện nay với công nghệ Illuminachúng ta chỉ mất tới 4 ngày Công nghệ này cho phép ứng dụng trong lĩnh vực y tế vàbảo vệ sức khỏe cộng đồng, thông qua việc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

23

giải mã hệ gen của các vi sinh vật, các virus, các tác nhân gây bệnh; phân tích, pháthiện các điểm đột biến; phân tích các hệ gen phiên mã Bên cạnh đó, với các nghiêncứu về biểu hiện gen phục vụ công nghiệp dược đáp ứng thuốc, nghiên cứu sự tácđộng của thuốc tới tế bào, Ứng dụng của Illumina cho phép thay thế các công cụ trướcđây, cụ thể như microarray Ngoài ra các công nghệ hiện nay vẫn đang cải tiến liên tục,cho phép phát triển nhiều hơn nữa các ứng dụng phục vụ trong đa dạng các lĩnh vực(Ayman and Weinbrecht 2013)

1.4 Các nghiên cứu metagenomics trên thế giới và Việt Nam

Các nghiên cứu từ trước cho thấy rằng phần lớn các vi sinh vật tồn tại trongmôi trường xung quanh chúng ta không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo trongphòng thí nghiệm và do đó không thể xác định trình tự DNA cũng như nghiên cứu phân

tích (Amann et al., 1995) Những nghiên cứu đầu tiên về metagenomics đã tập trung

phân tích trình tự 16S rRNA, những trình tự này

thường ngắn, mang tính bảo thủ cao trong cùng một loài và khác nhau giữa các loài(Woese 1987; Beja et al., 2002) Các nhà khoa học đã phát hiện nhiều trình tự 16S rRNA

được tìm thấy không thuộc về bất kỳ loài nào đã được phân lập trước đây Điều này chothấy rằng đã có rất nhiều loài vi sinh vật bị bỏ sót không được nghiên cứu đến Phântích trình tự các đoạn 16S rRNA thu trực tiếp từ môi trường tự nhiên cho thấy rằng bằngphương pháp nuôi cấy truyền thống, chúng ta chỉ có thể nghiên cứu được khoảng 1% số

lượng các loài vi sinh vật tồn tại trong mẫu tự nhiên thu được (Hugenholz et al., 2002) Theo Amann et al (1995) bằng các phương pháp vi sinh truyền thông chỉ có thể nuôi

cấy khoảng

0.001–0.1% các loài vi sinh vật biển, 0.25% loài vi sinh vật nước ngọt, 0.25%

trong trầm tích và chỉ 0.3% sinh vật đất (Amann et al., 1995).

Công nghệ metagenomics ra đời đã khắc phục được những hạn chế của cácphương pháp truyền thống, hướng sự tập trung nghiên cứu vào các vi sinh vật chưa

được chú ý đến Bằng cách phân lập và nghiên cứu trực tiếp genome của toàn bộ các visinh vật tồn tại trong một môi trường nghiên cứu, ta có thể có thông tin di truyền của hệ

vi sinh vật ở đó mà không cần phải phân lập và nuôi cấy từng tế bào riêng lẻ

Người đầu tiên đưa ra ý tưởng nhân bản trực tiếp các mẫu DNA từ môi trường làPace và cộng sự, họ đã chứng minh sự tồn tại của một hệ sinh vật phức tạp chưa từng

được nghiên cứu đến (Pace et al., 1986) Năm 1991, Pace and Delong đã công bố nghiên

cứu phân lập các gen cấu trúc từ thư viện gen của hệ vi sinh vật phát triển trên cỏ khôtrong điều kiện phòng thí nghiệm (Pace and Delong 1991) Năm 2002, Breitbart et al.(2002) sử dụng công nghệ metagenomics cho thấy trong 200 lít nước biển chứa hơn 5000

loại virus khác nhau (Breitbart et al., 2002) Các nghiên cứu sau đó cho thấy rằng có hơn

một nghìn loài virus trong phân của con người và khoảng một triệu loại virus khác nhaucho mỗi kg trầm tích biển, bao gồm cả thể thực khuẩn (Torsvik et al.,

2002; Turnbaugh et al., 2007; Tringe et al., 2005 ; Rusch et al., 2007) Về cơ bản tất

cả các virus đã được phát hiện trong các nghiên cứu này đều là những loài chưa từngđược phát hiện Năm 2004, Tyson và các đồng nghiệp tại Đại học California, Berkeley đã

xác định trình tự DNA của hệ vi sinh vật có trong nước thải nhiễm acid (Tyson et al.,

2004) Đây là một bước tiến quan trọng xác định

được bộ gen hoàn chỉnh, hoặc gần như hoàn chỉnh của một số vi khuẩn mà trước

đây chưa nuôi cấy thành công (Hugenholz 2002)

Từ năm 2003, Venter đã đi vòng quanh trái đất bằng đường biển nhằm thu thậpcác mẫu và sử dụng công nghệ metagenomics với mục đích xác định các genome (vàtheo đó là các sinh vật) mới Dự án thí điểm, tiến hành trong vùng biển Sargasso, pháthiện DNA của gần 2000 loài khác nhau, trong đó có 148 loài vi khuẩn chưa bao giờ được

xác định trước đây (Venter et al., 2004) Phân tích

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

25

hệ sinh vật đất sử dụng công nghệ metagenomics xuất hiện chậm hơn so với nhữngnghiên cứu phân tích hệ sinh vật biển do trong đất thường tồn tại những hợp chất liênkết với DNA hoặc ức chế phản ứng PCR, gây khó khăn cho việc nhân bản các mẫu DNA

từ đất (Daniel, 2005) Tuy nhiên trong những năm gần đây những tiến bộ đáng kể trongnghiên cứu hệ vi sinh vật đất, xây dựng các thư viện gen của các vi sinh vật này đã giúp

các nhà khoa học hiểu rõ hơn về hệ sinh vật phức tạp này (Kakirde et al., 2010; Parachin

et al., 2011).

Các tiến bộ trong kỹ thuật đọc trình tự DNA đã mở ra phương pháp tiếp cận mớicho công nghệ metagenomics Năm 2006, các nhà khoa học tại Đại học Penn State đãcông bố các trình tự thu được từ một mẫu môi trường bằng phương pháppyrosequencing sử dụng kỹ thuật đọc trình tự 454 – kỹ thuật cho phép đọc tới 400-600

megabases DNA chỉ trong vòng 10 giờ (Poinar et al.,

2006) Kỹ thuật này ra đời cho phép đọc trình tự nucleotit của hệ sinh vật ở quy mô lớn

trong một thời gian ngắn (Edwards et al., 2006) Gần đây công nghệ sinh học đã thay đổi

cách tiếp cận trong việc xác định các gen mới, nghiên cứu chức năng của các gen, phântích thành phần loài và các hệ vi sinh vật Kỹ thuật metagenomics là một lĩnh vựcnghiên cứu mới, đang phát triển mạnh mẽ trong hơn một thập kỷ qua, đã giúp xác định

hệ gen của các vi sinh vật không thể nuôi cấy, một mặt hoàn thiện những hiểu biết củacon người về các loài vi sinh vật trên trái đất, mặt khác góp phần giải quyết nhu cầu

tìm kiếm các enzyme và hợp chất sinh học có ích (Schmeisser et al., 2007; Bomar et al.,

2011)

Các nghiên cứu phân tích thành phần và hoạt động của các hệ vi sinh vật tựnhiên cho thấy tiềm năng sản xuất từ các vi sinh vật này các hợp chất sinh học có giá trịcao sử dụng trong y tế như thuốc kháng sinh, các chất chống ung thư và ức chế miễn

dịch (Raaijmakers et al., 2002) Sử dụng kỹ thuật metagenomic để đánh giá tiềm năng

và hoạt tính sinh học của quần thể vi sinh vật không

thông qua nuôi cấy theo phương pháp cổ điển đã cho thấy tiềm năng ứng dụng kỹthuật metagenomic trong nghiên cứu khái thác đa dạng sinh học vi sinh vật là rất lớn

(Hochmuth et al., 2010; Nikolouli and Mossialos 2012).

Tại Việt Nam, Thi Huyen Do (2014) đã tiến hành đề tài nghiên cứu metagenomiccủa các gen phân hủy sinh khối của vi khuẩn sống trong ruột của mối với máy đọc trình

tự Illumina Kết quả của nghiên cứu đã thu được 5.6 Gb dữ liệu về gen trong ruột mối

Coptotermes gestroi Trong đó, có 5,4 Gb dẽ liệu có ích: 125,431 trình tự ORF chứa hơn

78 triệu bp và có hơn 80% dữ liệu của vi khuẩn Nghiên cứu cũng chỉ ra 12 loài vikhuẩn có mặt nhiều nhất và xác định

được hơn 1460 loài Ngoài ra, trong hơn 125 nghìn ORF, nghiên cứu đã xác địnhđược có khoảng 12 nghìn ORF liên quan đến chuyển hóa carbonhydrate Có khoảng

587 ORF mã hóa enzyme phân hủy cellulose, hemicelluloses và pectin, trong đó cókhoảng 316 ORF liên quan đến phân hủy cellulose

Việc áp dụng công nghệ metagenomics vào nghiên cứu hệ gen của vi sinh vật đất

đã, đang và sẽ đóng vai trò to lớn trong các nghiên cứu tiếp theo Tuy nhiên, tại ViệtNam chưa có nhiều các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật metagenomic trong nghiên cứu hệ

vi sinh vật đất nói chung cũng như hệ vi sinh vật rễ cây dó bầu nói riêng Vì vậy, nghiêncứu này tập trung vào đánh giá các hệ vi sinh vật ở các địa điểm trồng dó bầu khácnhau ứng dụng kỹ thuật metagenomic

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

27

II VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu – Hóa chất nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu: 3 mẫu đất rừng tại vùng rễ cây dó bầu được thu tại

Sơn Dương (Tuyên Quang); Nha Trang (Khánh Hòa); Phú Quốc (Kiên Giang)

được kí hiệu lần lượt là TQ, NT, PQ

Hình 2.1 Bản đồ vị trí thu mẫu đất tại 3 tỉnh

Hóa chất: Bộ Kit PowerSoil® DNA Isolation (MO BIO) cho quá trình táchDNA từ đất, Bộ kit KAPA2G Robust HotStart Ready Mix (Kapa Biosystems), AgencourtAMPure XP DNA purification kit (Beckman Coulter), Nextera XT index kit (Illumina) Hóachất dùng trong điện di DNA: agarose, TAE 1X (Tris - Acetic acide - EDTA), ethidiumbromide

Máy móc, thiết bị: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di

Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini- transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máychụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy vortex (Mimishaker, IKA,Đức), máy ly tâm, Qubit (Invitrogen; LifeTechnologies Europe BV, Monza, Italy),Agilent 2100

Bioanalyser (Agilent Technologies), cùng với các trang thiết bị khác của

phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu mẫu đất

Địa điểm thu mẫu được định vị tại vùng rễ của các cây Dó bầu khỏe mạnh từ 5đến 7 năm tuổi Các mẫu đất được thu thập vào cùng một thời điểm vào mùa khôtháng 8 năm 2013 Tại các vị trí lấy mẫu, phần đất bề mặt được loại bỏ Đất tại vùng rễđược thu thập bằng cách đào tại độ sâu khoảng 30 cm Tại mỗi khu vực lấy mẫu khoảng

25 m2 gồm khoảng 3 cây dó bầu, chúng tôi tiến hành lấy mẫu đất tại 9 vị trí như trênhình

Hình 2.2 Vị trí tiến hành thu mẫu tại một khu vực nghiên cứuSau khi loại bỏ toàn bộ các viên đá lớn, đất tại 9 vị trí trong 1 khu vực

được gộp làm một, trộn đều, và sau đó chuyển vào các ống corning 50 ml Mẫu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ht t p : / / w ww.lrc.tnu e du v n

29

đất được bảo quản trong điều kiện tối và ở -20oC tới khi tiến hành các thí

nghiệm tiếp theo

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Các mẫu đất thu tại các vùng trồng dó bầu được tiến hành tách chiết DNA bằng

bộ Kit PowerSoil® DNA Isolation DNA sau khi tách thành công được tiến hành do nồng

độ và độ tinh sach bằng máy Nano drop, kiểm tra bằng điện di trên agarose 1% vàbảo quản ở -20oC

B1: Thêm 0,25 gam mẫu đất vào ống PowerBead

B2: Lắc hoặc vortex để trộn đều mẫu

B3: Kiểm tra Giải dung dịch C1 Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60  C cho đến

khi tan trước khi sử dụng

B4: Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngược nhiều lần hoặc lắc thời gian ngắn.B5: vortex 5-10p tốc độ tối đa

B6: ly tâm 10.000g 30s ở nhiệt độ phòng, lưu ý nếu li tâm > 10.000g có

thể ống sẽ vỡ

B7: Chuyển nổi sang ống 2 ml, thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl B8:

Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây Ủ ở 4  C trong 5 phút B9: Ly tâm ở

nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g

B10: chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhưng không nhiều hơn 600 l

B11: Thêm 200 l đệm C3 và vortex một thời gian ngắn Ủ ở 4  C trong

5 phút

B12: Ly tâm các ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g

B13: chuyển dich nổi vào ống 2 ml không nhiều quá 750 l

B14: Lắc để trộn đệm C4 trước khi sử dụng Thêm 1200 l đệm C4, lắc hoặc vortex 5 giây

B15: cho 675 l vào bộ lọc Spin và ly tâm ở 10.000 xg trong 1 phút ở

nhiệt độ phòng, đổ dich qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch

B16: Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 30 giây ở

10.000 xg

B17: Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột

B18: Ly tâm một lần nữa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút ở 10.000 xg

B19: chuyển thận đặt bộ lọc sang ống 2 ml sạch

B20: Thêm 100 l đệm C6

B21: Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 30 giây ở 10.000 x g.

2.2.3 Phương pháp xác định trình tự vùng 16S RNA

Theo Zuckerkand and Pauling (1965) cho rằng các phân tử sinh học có thể là

“thước đo tiến hóa” và chúng có các đặc điểm sau: phân tử có mặt ở tất cả các sinh vật;phân tử không được truyền qua lại giữa các loài; trình tự của các phân tử này phải có độbảo tồn và biến động thích hợp với khoảng cách tiến hóa; phân tử phải có kích thước đử

lớn để chứa nhiều thông tin Một thập kỷ sau đó Woese et al (1977) đã xác định được

16S là phân tử thích hợp làm thước đo tiến hóa: 16S là phân tử cổ, chức năng khôngthay đổi, phân bố ở hầu hết các hệ thống sống và có độ bảo tồn vừa phải

Trình tự mồi: các mồi được sử dụng trong nghiên cứu để khuếch đại vùng

V3 và V4 của 16S rRNA với kích thước lý thuyết khoảng 550 bp

16S R

AGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC

Kích thước

4oC