NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT TINH SẠCH ENZYME COLLAGENASE TỪ NỘI TẠNG TÔM SÚ. KHẢO SÁT YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG HOẠT TÍNH TRƯỚC VÀ SAU SẮC KÝ

TÓM TẮTCollagenase có nhiều ứng dụng rộng rãi trong các nghành công nghiệp như: thực phẩm làm mềm thịt, cải thiện cảm quan của thịt, công nghiệp hóa chất, nghiên cứu khoa học và đặc biệt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT - TINH SẠCH ENZYME COLLAGENASE TỪ NỘI TẠNG TÔM SÚ KHẢO SÁT YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG HOẠT TÍNH

TRƯỚC VÀ SAU SẮC KÝ

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ PHƯƠNG OANH Niên Khóa: 2005 - 2009

Tháng 08 / 2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT - TINH SẠCH ENZYME COLLAGENASE TỪ NỘI TẠNG TÔM SÚ KHẢO SÁT YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG HOẠT TÍNH TRƯỚC VÀ

SAU SẮC KÝ

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG PHẠM THỊ PHƯƠNG OANH

CN ĐỖ THỊ TUYẾN

Tháng 08 / 2009

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập

Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ sinh học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy em trong suốt 4 năm học vừa qua

PGS.TS.Nguyễn Tiến Thắng và CN Đỗ Thị Tuyến đã tận tình chỉ dạy, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em được thực tập tại viện sinh học nhiệt đới

Toàn thể các bạn sinh viên cùng lớp và các bạn sinh viên cùng thực tập tại phòng Các chất có hoạt tính sinh học đã hết lòng giúp đỡ, động viên và cung cấp thêm nhiều kiến thức quan trọng trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Cuối cùng con xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn luôn đồng hành cùng con, động viên và đã tạo điều kiện tốt nhất cho con học tập và nghiên cứu

Tháng 07 năm 2009 Phạm Thị Phương Oanh

TÓM TẮT

Collagenase có nhiều ứng dụng rộng rãi trong các nghành công nghiệp như: thực phẩm (làm mềm thịt, cải thiện cảm quan của thịt), công nghiệp hóa chất, nghiên cứu khoa học và đặc biệt là trong y tế, dược phẩm, mỹ phẩm (làm vỏ thuốc, da nhân tạo) vì vậy việc nghiên cứu và xây dựng một quy trình ly trích, tinh sạch chế phẩm enzyme collagenase sẽ là một vấn đề nóng hổi và bức bách trong tương lai, đặc biệt là tại Việt Nam, nơi mà có rất ít nghiên cứu về enzyme collagenase

Ngành chế biến thủy sản trong nước và trên thế giới hàng năm thải ra một lượng lớn các phụ phế phẩm cần được xử lý hoặc chế biến tiếp Phụ phẩm thủy sản thường là nội tạng, đầu, xương, da

Để giải quyết một lượng lớn phụ phẩm như hiện nay, tại Việt Nam và trên thế giới đang có xu hướng tận thu phần phụ phẩm để chế biến thành các sản phẩm có giá trị gia tăng Một số phụ phẩm có giá trị dinh dưỡng cao dùng để chế biến thành bột cá, dầu cá Ngoài ra các sản phẩm như: chế phẩm enzyme, peptide có hoạt tính sinh học, màng sinh học được chế biến từ một số loại phụ phẩm thủy sản có thể mang lại những hiệu quả kinh tế rất lớn cho con người

Cũng với mục đích tận dụng nguồn phụ phẩm là nội tạng tôm sú để thu nhận chế phẩm enzyme collagenase ứng dụng cho các ngành công nghiệp khác, tôi đã thực hiện đề tài với mong muốn xây dựng được một quy trình tách chiết và tinh sạch enzyme collagenase từ nội tạng tôm sú, xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme collagenase từ đó tối ưu hóa quá trình sản xuất enzyme collagenase thương phẩm đạt hiệu quả kinh tế cao

Kết quả thu được của đề tài là quy trình tách chiết tinh sạch enzyme collagenase

từ nội tạng tôm sú, với các bước thu nhận enzyme collagenase bằng phương pháp tủa với 3 tác nhân: cồn (tỷ lệ 1/7), acetone (tỷ lệ 1/2) và muối amoni sulphate ( nồng độ 65%), sau đó thu enzyme collagenase thương phẩm bằng phương pháp sắc ký lọc gel, tạo tiền đề cho việc ứng dụng collagenase thương phẩm vào các ngành công nghiệp khác

Collagenase has extensive applications in industry such as food (as in meat, improving the understanding of meat), industrial chemicals, scientific research and especially in medical, pharmaceutical, cosmetics (disruptive drugs, artificial skin) so the research and build a extract process and purification, which product products enzyme collagenase is a interest problem and the immediate future, especially in

Vietnam, where there is a little research on enzyme collagenase

Seafood processing and the world annual waste a large amount of secondary waste products need to be treated or processed to Fisheries sub-products are usually viscera, head, bone, skin

Now resolve a large number of agricuttural residerest (by product), in Vietnam and on world trends are making extra income subject to the processing of the products value Some products have extra nutritional value to used into fish meal, fish oil v.v.In addition, products such as enzyme products, the peptide has biological activity, biological film, that made from some type of aquacultural residues products can bring the economic effect is for human kind

With the purpose of making the most use of secondary sources is su viscera shrimp to confess products collagenase enzyme applications for different industry, I've made this thesis with the desired developed a process and isolate graft clean collagenase enzyme from lobster viscera penaeus monodon, located these factors affect the active enzyme collagenase freedom optimize the enzyme collagenase production commodity reached high economic efficiency

Results obtained by thesis extraction process is crystal clear from the enzyme collagenase prawn viscera, with steps revenue received by the enzyme collagenase method radiate with three agents: insect (rate 1/7), acetone (billion rate 1/2 ) and ammonium sulphate salt (concentration 65%), and then collected by the enzyme collagenase commodity filter gel chromatography method, create prerequisites for the application collagenase commodity to other industries

MỤC LỤC

Trang

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Khái quát chung về Enzyme 3

2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme 3

2.1.2 Định nghĩa về enzyme 4

2.1.3 Cấu tạo phân tử 4

2.1.4 Danh pháp quốc tế và phân loại 4

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến họat độ enzyme 5

2.2 Khái quát enzyme colagenase 8

2.3 Ứng dụng của colagenase 8

2.3.1 Ứng dụng collagenase trong nghiên cứu collagen 8

2.3.2 Ứng dụng collagenase trong công nghiệp thực phẩm – làm mềm thịt 9

2.3.3 Ứng dụng collagenase trong việc làm giảm tính gây dị ứng 9

2.3.4 Ứng dụng collagenase trong y tế - dược phẩm – mỹ phẩm 9

2.3.5 Ứng dụng collagenase trong nhiều lĩnh vực khác 9

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 12

3.1.1 Thời gian 12

3.1.2 Địa điểm 12

3.2 Hóa chất 12

3.3 Thiết bị 12

3.4 Đối tượng thí nghiệm 9

3.5 Phương pháp nghiên cứu 13

3.5.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu 13

3.5.2 Thu nhận chế phẩm collagenase 13

3.5.3 Bố trí thí nghiệm 13

3.5.4 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 14

3.5.5 Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Ninhydrin của Rosen 16

3.5.6 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính collagenase của CPT .20

3.5.7 Phương pháp tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel 22

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Nghiên cứu quá trình tinh sạch enzyme collagenase 26

4.1.1 Khả năng tủa collagenase của cồn ở các tỷ lệ khác nhau 26

4.1.2 Khả tủa collagenase của acetone ở các nồng độ khác nhau 27

4.1.3 Khả tủa collagenase của muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ muối 28

4.1.4 So sánh khả năng thu tủa CPT của các tác nhân 29

4.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme collagenase của CPT 30

4.2.1 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme collagenase 30

4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme collagenase 32

4.2.3 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme collagenase 34

4.2.4 Ảnh hưởng của kim loại đến hoạt tính enzyme collagenase 35

4.2.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt tính enzyme collagenase 37

4.3 Tinh sạch collagenase bằng sắc ký kọc gel 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Bảng phân loại enzyme 5

Bảng 3.1 Sơ đồ phản ứng dựng đường chuẩn Albumin 15

Bảng 3.2 Sơ đồ phản ứng xác định hàm lượng protein trong mẫu 16

Bảng 3.3 Sơ đồ phản ứng dựng đường chuẩn L-Leucine 18

Bảng 3.4 Sơ đồ phản ứng xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Ninhydrin 19

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Quy trình tách chiết, tinh sạch và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 14

Hình 3.2 Đường chuẩn albumin 15

Hình 3.3 Cấu tạo hóa học phân tử Ninhydrin .17

Hình 3.4 Phương trình phản ứng Ninhydrin 17

Hình 3.5 Đường chuẩn l-leucine 18

Hình 3.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 20

Hình 3.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH 21

Hình 3.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ bền nhiệt 21

Hình 3.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số kim loại 22

Hình 3.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối .22

Đồ thị 4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ DC NT/cồn đến hoạt tính collagenase 27

Đồ thị 4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ DC NT/acetone đến hoạt tính collagenase 28

Đồ thị 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ phần trăm muối đến hoạt tính collagenase 29

Đồ thị 4.4 Ảnh hưởng của các tác nhân tủa đến hoạt tính collagenase của CPT .29

Đồ thị 4.5 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính collagenase của mẫu tủa cồn .31

Đồ thị 4.6 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính collagenase của mẫu tủa acetone 31

Đồ thị 4.7 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính collagenase của mẫu tủa muối 31

Đồ thị 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính collagenase của mẫu tủa cồn 32

Đồ thị 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính collagenase của mẫu tủa acetone 33 Đồ thị 4.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính collagenase của mẫu tủa muối 33

Đồ thị 4.11 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính collagenase mẫu tủa cồn 34

Đồ thị 4.12 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính collagenase mẫu tủa acetone 34 Đồ thị 4.13 Ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt tính collagenase mẫu tủa muối .35

Đồ thị 4.14 Ảnh hưởng của kim loại đến hoạt tính collagenase của mẫu tủa cồn 36

Đồ thị 4.15 Ảnh hưởng của kim loại đến hoạt tính collagenase mẫu tủa acetone 36

Đồ thị 4.16 Ảnh hưởng của kim loại đến hoạt tính collagenase của mẫu tủa muối 36

Đồ thị 4.17 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt tính collagenase mẫu tủa cồn .37

Đồ thị 4.18 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt tính collagenase (tủa acetone) .38

Đồ thị 4.19 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt tính collagenase mẫu tủa muối.38 Hình 4.1 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch enzyme collagenase của CPT tủa cồn từ DC 39 Hình 4.2 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch enzyme collagenase của CPT tủa acetone 40 Hình 4.3 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch enzyme collagenase của CPT tủa muối .40

Đồ thị 4.20 Tổng hoạt tính và hàm lượng sắc ký 41

Collagenase có nhiều ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như: thực phẩm (làm mềm thịt, cải thiện cảm quan của thịt…), công nghiệp hóa chất, nghiên cứu khoa học và đặc biệt là trong y tế, dược phẩm, mỹ phẩm (làm vỏ thuốc, da nhân tạo

…) vì vậy việc nghiên cứu và xây dựng một quy trình ly trích, tinh sạch chế phẩm enzyme collagenase sẽ là một vấn đề nóng hổi và bức bách trong tương lai, đặc biệt là tại Việt Nam, nơi mà có rất ít nghiên cứu về enzyme collagenase

Vấn đề đặt ra là chúng ta cần lấy nguồn nguyên vật liệu từ đâu để tăng tính hiệu quả kinh tế của quy trình?

Cho tới nay, nhiều vi sinh vật, chủ yếu là vi khuẩn được phát hiện là có khả năng tổng hợp collagenase Các nhà nghiên cứu đã phân lập được từ đất, nước biển và một số nguồn khác một số vi khuẩn có khả năng tổng hợp collagenase Tuy nhiên, đa

số các vi sinh vật sinh collagenase đã được phát hiện lại là các vi sinh vật gây bệnh hoặc sinh độc tố (Clostridium, Vibrio hay Pseudomonas) Điều này làm cho việc sử dụng collagenase bị hạn chế hoặc các chế phẩm enzyme nhất thiết phải hoàn toàn tinh khiết, vấn đề trở ngại chủ yếu cho sự ra đời của chế phẩm enzyme Việc tìm kiếm nguồn collagenase an toàn và khai thác sử dụng chúng là rất có ý nghĩa về mặt khoa học và ứng dụng

Ngành chế biến thủy sản trong nước và trên thế giới hàng năm thải ra một lượng lớn các phụ phẩm cần được xử lý hoặc chế biến tiếp Phụ phẩm thủy sản thường

là nội tạng, đầu, xương, da Để giải quyết một lượng lớn phụ phẩm như hiện nay, tại Việt Nam và trên thế giới đang có xu hướng tận thu phần phụ phẩm để chế biến thành

các sản phẩm có giá trị gia tăng Một số phụ phẩm có giá trị dinh dưỡng cao dùng để chế biến thành bột cá, dầu cá Ngoài ra các sản phẩm như: chế phẩm enzyme, peptide

có hoạt tính sinh học, màng sinh học được chế biến từ một số loại phụ phẩm thủy sản

có thể mang lại những hiệu quả kinh tế rất lớn cho con người

Trong quá trình nghiên cứu thăm dò, tôi đã quan sát thấy từ nguồn nguyên liệu phế phẩm thuộc dạng trên là nội tạng tôm sú, nó chứa một hàm lượng khá lớn collagenase Vì vậy, tận dụng nguồn phế phẩm này, vừa nhằm giải quyết vấn đề rác thải công nghiệp và thu được nguồn collagenase mong muốn tôi đã tiến hành nghiên cứu và xây dựng một quy trình tách chiết, tinh sạch collagenase từ nội tạng tôm sú, đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính trước và sau sắc ký với mong muốn xây dựng một quy trình hoàn thiện tách chiết và tinh sạch collagenase từ nội tạng tôm sú, xác định được những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính collagense để đưa vào quy trình công nghiệp thu hoạch thương phẩm enzyme collagenase ứng dụng cho đời sống

Kết quả thu được của đề tài là quy trình tách chiết tinh sạch enzyme collagenase

từ nội tạng tôm sú, với các bước thu nhận enzyme collagenase bằng phương pháp tủa với 3 tác nhân: cồn (tỷ lệ 1/7), acetone (tỷ lệ ½) và muối amoni sulphate ( nồng độ 65%), sau đó thu enzyme collagenase thương phẩm bằng phương pháp sắc ký lọc gel, tạo tiền đề cho việc ứng dụng collagenase thương phẩm vào các ngành công nghiệp khác

1.2 Yêu cầu của đề tài

 Tách chiết tinh sạch enzyme collagenase từ nội tạng tôm sú

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme collagenase

1.3 Nội dung thực hiện

 Xác định quy trình tách chiết enzyme collagenase từ nội tạng tôm sú

 Xác định tác nhân, tỷ lệ, nồng độ tủa thích hợp thu chế phẩm thô (CPT) enzyme collagenase có hàm lượng protein và hoạt tính collagenase cao

 Bước đầu tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel Bio P100

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme collagenase trước và sau khi tinh sạch: pH, nhiệt độ, độ bền nhiệt, nồng độ muối NaCl, kim loại

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát chung về Enzyme

2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme

Về sự phát triển của học thuyết enzyme, có thể chia thành 4 giai đoạn

Giai đoạn 1: Trước thế kỷ XVII

Trước thế kỷ XVII người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trong đời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi sinh vật Đó là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước chấm Ở thời kỳ này người

ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình lên men

Giai đoạn 2: Từ thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XIX

Ở giai đoạn này các nhà bác học đã tiến hành tìm hiểu bản chất của các quá trình lên men Thời kỳ này đã khái quát hiện tượng lên men như là hiện tượng phổ biến trong sự sống và enzyme là yếu tố gây nên sự chuyển hóa các chất trong quá trình lên men

Giai đoạn 3: Từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX

Giai đoạn từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX Ở giai đoạn này một số lượng rất lớn các enzyme dạng hòa tan đã được tách chiết

Giai đoạn 4: Từ những năm 30 của thế kỷ XX đến nay

Từ giữa thế kỷ thứ XX, nhất là thời gian gần đây enzyme học phát triển rất mạnh Nhờ ứng dụng các phương pháp mới, hiện đại như: điện di, sắc ký, quang phổ, đồng vị phóng xạ đã cho phép nghiên cứu cấu trúc chung như cơ chế tác dụng của nhiều enzyme, cơ chế của quá trình sinh tổng hợp enzyme và sự điều hòa hoạt động của enzyme trong tế bào

Trong mấy chục năm cuối của thế kỷ XX và đầu thế kỷ XXI, người ta đã chú trọng nghiên cứu việc ứng dụng enzyme người ta đã tận dụng các nguyên liệu giàu enzyme để tách enzyme, dùng chế phẩm enzyme này để chế biến các nguyên liệu khác nhau hoặc sử dụng vào mục đích khác nhau Ở nhiều nước đã hình thành ngành công nghệ enzyme, hàng năm đã sản xuất hàng trăm tấn chế phẩm enzyme để phục vụ cho các ngành sản xuất khác nhau và cho y học

2.1.2 Định nghĩa về enzyme

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp các quy luật của rất nhiều các phản ứng hóa học khác nhau Các phản ứng hóa học phức tạp này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau Enzyme là các hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống

Chúng có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa học

Enzyme ngày càng được sử dụng rộng rãi trong thực tế, trong công nghiệp… nên đã hình thành nên nhiều ngành liên quan đến enzyme như công nghệ sản xuất enzyme, công nghệ sản xuất các thiết bị có phần tử enzyme như biosensor (các thiết bị cảm biến sinh học)

2.1.3 Cấu tạo phân tử

Enzyme 1 cấu tử: Là enzyme trong thành phần cấu tạo chỉ có protein VD: pepsin , urease v.v

Enzyme 2 cấu tử: Là enzyme trong thành phần của nó ngoài protein còn có thành phần non-protein-nhóm ngoại Người ta gọi phần protein là “feron” hay

“apoenzyme” phần nhóm ngoại là “agon” hay “coenzyme” Thường nhóm ngoại là dẫn xuất của các vitamin, các nucleotide VD: catalase, xitocrom v.v

Trung tâm hoạt động: Chỉ có 1 phần rất nhỏ của enzyme tham gia phản ứng, phần này gọi là trung tâm hoạt động, số trung tâm hoạt động có thể lớn hơn 1

2.1.4 Danh pháp quốc tế và phân loại

Tên enzyme = Tên cơ chất + “ase”

Ví dụ: Enzyme thuỷ giải protein: protease

Enzyme phân huỷ nucleic : nuclease v.v

Enzyme tổng hợp DNA : DNA-polymerase

Bên cạnh đó còn có những tên thông thường (rất nhiều), ví dụ như ligase (enzyme nối trong quá trình tự sao DNA), amylase (enzyme thuỷ phân tinh bột có trong dịch ruột) v.v

Ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện, để thống nhất tên gọi enzyme người ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Bảng phân loại enzyme (Công nghệ Enzyme – Nguyễn Đức Lượng, 2004) Loại enzyme Loại phản ứng được xúc tác

Oxidoreductase

Các enzyme này xúc tác các phản ứng oxi-hoá khử có nghĩa là chúng vận chuyển các nguyên tử hydro hoặc điện tử của chúng từ cơ chất của chúng sang các phần

tử nhận

Transferase Các nhóm nhỏ các nguyên tử được vận chuyển từ cơ

chất này sang cơ chất khác

Hydrolase Các enzyme này làm gãy đứt các liên kết hoá học bằng

phản ứng thủy phân Lyase

Các enzyme này nối thêm 1 nhóm mới vào cơ chất bằng cách làm gãy nối đôi, ngược lại nó cũng có thể xúc tác để tạo nối đôi

Izomerase

Chúng xúc tác sự tái phân bố các nguyên tử trong cơ chất, tức là chúng tạo ra các đồng phân của cùng 1 hợp chất

Ligase

Các enzyme này tạo liên kết hoá học mới, năng lượng

từ ATP sẽ cần cho sự tạo các liên kết hoá học này, Ligase giúp cho sự tổng hợp nên Hydro carbon, protein và các đại phân tử khác

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến họat độ enzyme

Chú giải: E: enzyme; S: cơ chất; ES: phức chất giữa enzyme và cơ chất; P: sản phẩm của phản ứng; ES*: phức chất giữa enzyme và cơ chất mà cơ chất đã được

biến đổi thành dạng gần như sản phẩm

a Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và cơ chất

Khi nồng độ cơ chất bão hòa tăng gấp đôi nồng độ enzyme sẽ tăng gấp đôi vận tốc phản ứng Hay nói cách khác là trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme:

b Ảnh hưởng của chất kìm hãm (inhibitor)

Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất có bản chất hóa học khác nhau Các chất làm giảm hoạt độ của enzyme gọi là các chất kìm hãm hay các chất ức chế Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ

kể cả những phân tử protein Các chất gây biến tính protein là các chất kìm hãm không đặc hiệu enzyme Nhiều chất khác không làm biến tính protein enzyme nhưng vẫn làm giảm hoạt độ xúc tác của nó theo cơ chế khác Các chất này được chia làm hai loại là: Các chất kìm hãm cạnh tranh: Các chất này có cấu trúc tương tự như cơ chất, do

đó có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme chiếm chỗ kết hợp của enzyme với cơ chất, do đó làm giảm số lượng phân tử enzyme có khả năng kết hợp với

cơ chất nên làm giảm tốc độ phản ứng

Các chất kìm hãm không cạnh tranh: Các chất này kết hợp với phân tử enzyme ở chỗ khác với trung tâm hoạt động làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme do đó theo hướng không có lợi cho hoạt độ xúc tác của nó làm giảm tốc độ phản ứng xúc tác (Phạm Thị Trân Châu và Nguyễn Thị Ánh, 1997)

c Ảnh hưởng của các ion kim loại

Ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hoá enzyme Các ion kim loại nặng ở nồng độ gây biến tính protein có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch enzyme

Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng Và giới hạn này là khác nhau cho từng loại ion riêng biệt

Tác dụng của ion kim loại có mối quan hệ qua lại giữa pH của enzyme và cơ chất Tác dụng hoạt hoá ion kim loại có tính đặc hiệu, mỗi ion kim loại thường hoạt hoá các enzyme xúc tác cho 1 kiểu phản ứng nhất định và cũng thay đổi tuỳ ion

d) Ảnh hưởng của các anion

Nhiều anion có tác dụng hoạt hoá enzyme ( ảnh hưởng đến hoạt độ của α- amylase động vật) Khi có mặt các anion có thể làm thay đổi pH thích hợp của enzyme về phía kiềm

Trực tiếp: acid ascorbic, a.lipoic, glutation dạng khử có thể trực tiếp tham gia phản ứng kết hợp và loại thuận nghịch hydro nên chúng có thể hoạt hoá các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hoá-khử và chúng thường tác dụng vào trung tâm hoạt động của enzyme hoặc làm thay đổi cấu hình phân tử enzyme theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác

f) Ảnh hưởng của pH

pH thích hợp (pHopt) của phần lớn enzyme vào khoảng 7 Tuy nhiên một số enzyme có pHopt rất thấp (pepsin) hoặc rất cao (subtilisin) hoặc ít thay đổi trong khoảng pH xác định

Cần chú ý là pHopt của một enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính và nhiệt độ cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ phản ứng

Độ bền của phân tử enzyme cũng phụ thuộc vào trạng thái ion hoá của phân

tử, phần lớn enzyme bền trong khoảng 5 < pH < 9

Bản chất hoá học của thành phần dung dịch đệm cũng ảnh hưởng tới độ bền, hoạt độ xúc tác của enzyme

g) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ hoạt động thích hợp topt của nhiều enzyme vào khoảng 40 - 50oC Trên 50oC hoạt độ thường bị giảm mạnh do làm hỏng cấu trúc phân tử enzyme Topt

của một số enzyme vi sinh vật và enzyme có nguồn gốc thực vật thì cao hơn

Topt của một enzyme chỉ có nghĩa là ở điều kiện đó thì enzyme có hoạt độ cao nhất Ở khoảng 700C thì phần lớn enzyme bị mất hoàn toàn hoạt độ, gọi là nhiệt độ tới hạn Ở khoảng tới hạn enzyme bị biến tính hiếm khi hồi phục lại được

2.2 Khái quát enzyme colagenase

Collagenases là những enzyme thuộc loại protease thuộc nhóm hydrolases, có khả năng phân hủy collagen Hay nói cách khác là một enzyme mà nó bẻ gãy các liên kết peptid của collagen (Joseph H Dreisbach and Joseph R Merkel 1978)

Enzyme này được sử dụng trong các nghiên cứu của công nghệ sinh học để tiêu hóa collagen, và cũng để chia các vị trí đặc biệt trong công nghệ protein (dung hợp protein) Vì thế công nghệ protein sử dụng collagenase sẽ làm cho enzyme này hữu dụng hơn trong công nghệ sinh học

Enzyme collagenase xúc tác cho phản ứng thủy phân, phản ứng này làm đứt liên kết đồng hóa trị giữa hai nguyên tử của phân tử cơ chất gắn các phần tử của phân

tử H2O vào các hóa trị được tạo nên do sự đứt liên kết kể trên Có thể được biểu thị như sau: A-B + H2O  A-H + B-OH

Trong đó A - B là phân tử cơ chất

Các phản ứng do enzyme lớp hydrolase này xúc tác luôn có nước tham gia Đặc điểm khác là các hydrolase thường không cần coenzyme cho hoạt động xúc tác của chúng (Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong)

Enzyme collagenase giúp làm mềm tế bào mô liên kết Các enzyme này gây ra các “vết nứt” hoặc bẻ gãy các myotome khi bảo quản cá bằng đá trong một thời gian dài hoặc khi bảo quản chỉ trong thời gian ngắn nhưng ở nhiệt độ cao (Phan Thị Thanh Quế, 2005)

Collagenase là enzyme có khả năng thủy phân liên kết peptide dạng proline đặc trưng trong vùng xoắn của collagen ở trạng thái tự nhiên của cơ chất

poly-L-Các protease có thể thủy phân hạn chế collagen tự nhiên nhưng chỉ tại phần cuối của chuỗi xoắn có ∞ ở ngoài vùng xoắn đặc trưng của collagen, không có khả năng tấn công các liên kết ở trong vùng xoắn của collagen không biến tính

2.3 Ứng dụng của colagenase

2.3.1 Ứng dụng collagenase trong nghiên cứu collagen

Collagenase được dùng để phân tách collagen thành các chuỗi xoắn ∞ phục vụ cho nghiên cứu quá trình hình thành cấu trúc xoắn của collagen Bên cạnh các nghiên cứu về cấu trúc phân tử collagen, collagenase còn được dùng trong việc xác định collagen cho phép khẳng định bản chất collagen của protein được tổng hợp

2.3.2 Ứng dụng collagenase trong công nghiệp thực phẩm – làm mềm thịt

Trong công nghệ thực phẩm, các protease được dùng để biến tính protein nhằm cải biến một số tính chất dinh dưỡng hoặc chức năng của chúng Vai trò của enzyme ở đây chủ yếu là thực hiện phản ứng thủy phân từng phần, làm biến đổi cấu trúc protein Collagenase là một trong số các protease được dùng với mục đích biến đổi cấu trúc protein để đạt được hiệu quả mong muốn Khi bị thủy phân một phần, các tính chất chức năng và cảm quan của protein có thể được cải thiện như khả năng giữ nước, khả năng nhũ tương hóa, độ bền tạo nhũ, tạo bọt, độ dai…

2.3.3 Ứng dụng collagenase trong việc làm giảm tính gây dị ứng của một số protein thực phẩm

Các trường hợp dị ứng thực phẩm thực sự phổ biến trong vài chục năm trở lại đây Các báo cáo về hiện tượng này cho thấy số lượng người phải chịu đựng sự dị ứng

do thực phẩm gây nên tăng dần lên trên quy mô toàn cầu

Một nhóm tác giả nghiên cứu về vấn đề này đã đề cập đến các khả năng tạo ra các sản phẩm không gây dị ứng khi xử lý các protein dị ứng của bột mỳ với collagenase cho thấy chúng có tính chất công nghệ thích hợp hơn là khi xử lý với các protease thông thường khác do các enzyme này phân giải quá mức protein Nghiên cứu này đã mở đường cho ý tưởng sử dụng collagenase như là một công cụ tiềm năng trong việc tác động lên cấu trúc protein và làm giảm khả năng gây dị ứng của các protein dạng này mà vẫn giữ được các tính chất công nghệ cần thiết của chúng

2.3.4 Ứng dụng collagenase trong y tế - dược phẩm – mỹ phẩm

Do khả năng phân cắt đặc hiệu collagen, collagenase được dùng như một công

cụ hữu hiệu để phân tách các thành phần cấu trúc trong mô liên kết Collagenase còn được sử dụng như một công cụ hiệu quả trong việc phân tách tế bào trong mạng lưới

mô liên kết Ngoài ra collagenase có thể được sử dụng trong nghiên cứu các tiến trình của một số bệnh và cơ chế làm lành vết thương hay điều trị bỏng, ngăn ngừa khối u, điều chế da thay thế, chỉ phẫu thuật, các vỏ viên thuốc v.v

2.3.5 Ứng dụng collagenase trong nhiều lĩnh vực khác

Công nghiệp da, công nghiệp mỹ phẩm trong việc sản xuất kem tẩy da chết v.v

2.4 Đối tượng thí nghiệm

Tôm sú là loài tôm được đánh bắt và nuôi trồng hàng đầu thế giới, là đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao Theo thống kê của tổ chức Lương thực Nông nghiệp thế

giới (FAO), sản lượng tôm sú năm 1997 chiếm 52% sản lượng tôm nuôi trồng toàn thế giới, với tốc độ tăng trưởng trung bình 2%/năm Hiện nay tôm sú được nuôi phổ biến ở hơn 22 quốc gia trên thế giới

Trong các vùng nuôi tôm chủ yếu trên thế giới, Ðông Nam Á là vùng dẫn đầu chiếm 53,7% tổng sản lượng tôm toàn thế giới trong tổng số 54 quốc gia có ngành công nghiệp nuôi tôm phát triển (thống kê của FAO năm 1997)

Hiện nay, ở Việt Nam tôm sú là một trong 5 loại tôm được nuôi trồng phổ biến

và quan trọng nhất đối với nền kinh tế Việt Nam

Ở Việt Nam, nghề nuôi tôm sú phát triển mạnh mẽ từ Bắc tới Nam, đã góp phần quan trọng trong việc thay đổi bộ mặt vùng nông thôn ven biển Những thành tựu đạt được đã khẳng định vai trò chủ lực của tôm sú trong nuôi trồng thủy sản hiện tại và tương lai

Hình thái : Tôm sú/ Tôm Giang/ Tôm cỏ thuộc lớp giáp xác bộ mười chân, họ

tôm he Tôm sú có tên khoa học là Penaeus monodon, Fabricius 1789.

Trên cơ thể tôm sú có vệt sọc màu xám đậm, hơi xanh hoặc nâu đỏ, tôm có chùy dài hơi cong, có 7 – 8 gai trên chùy

Phân loại: Ngành: Arthropoda, Lớp: Crustacea, Bộ: Decapoda, Họ chung:

Penaeidea, Họ: Penaeus Fabricius , Giống: Penaeus, Loài: Monodon, Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius

Đặc điểm sinh học : Tôm sú sinh trưởng nhanh, khoảng 4-5 tháng là tôm đạt

mức trưởng thành, dài đến 27cm và trọng lượng khoảng 25g Ðó là trọng lượng lý tưởng cho tôm thương phẩm tiêu thụ quốc tế

Trong tự nhiên tôm nước mặn sinh trưởng tới mùa sinh sản chúng tiến vào gần

bờ và đẻ trứng Trứng nở ra ấu trùng trải qua 3 thời kỳ biến thái Naupilus, Zoea, Mysis, ấu trùng theo các làn sóng biển dạt vào các cửa sông, nơi nước biển và nước sông pha trộn nhau nên độ mặn thấp hơn ngoài biển, thích hợp cho ấu trùng phát triển,

đó là vùng nước lợ Trong môi trường này, ấu trùng (larvae) tiến sang thời kỳ hậu ấu trùng (postlarvae) Sau đó postlarvae chuyển sang thời kỳ ấu niên (juvenile) đồng thời bơi ra biển, tiếp tục tăng trưởng, sinh sản và tiếp diễn chu trình sống của chúng

Trong tự nhiên tôm sú có thể chịu được sự biến động về độ mặn rất lớn (3-45%),

độ mặn tối ưu là 15-25% Tôm sú thuộc loài sinh hoạt về đêm và hay ăn thịt lẫn nhau Thường thường lúc còn nhỏ, ấu trùng tôm sú có khuynh hướng bám vào thành ao hồ,

các góc hồ hoặc chui sâu dưới lớp cát đáy ao hồ về ban ngày, đến ban đêm nổi lên hoạt động, kiếm tìm thức ăn

Tôm sú thuộc loại động vật máu lạnh, thân nhiệt thay đổi theo nhiệt độ môi trường bên ngoài Nhiệt độ ảnh hưởng tới nhiều phương diện trong đời sống của tôm:

hô hấp, tiêu hóa thức ăn, miễn nhiễm đối với bệnh tật, sự tăng trưởng Nhiệt độ thay đổi theo khí hậu mỗi mùa, vì thế tại miền Nam Việt Nam có thể nuôi tôm quanh năm trong khi miền Bắc chỉ nuôi tôm trong mùa nóng Ở nhiệt độ 28°C, tôm sú lớn tương đối chậm, ở nhiệt độ 30°C tôm lớn nhanh hơn nhưng rất dễ mắc các dịch bệnh như bệnh MBV (Monodon Baculor Virus) Nhiệt độ tối ưu cho tôm sú phát triển tại các vùng ao hồ nhiệt đới là 28°-30°C

Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài Loan, phía Đông Tahiti, phía Nam châu Úc và phía Tây châu Phi (Racek - 1955,

Holthuis và Rosa - 1965, Motoh - 1981, 1985) Nhìn chung, tôm sú phân bố từ kinh độ 30E đến 155E từ vĩ độ 35N tới 35S xung quanh các nước vùng xích đạo, đặc biệt là Indonesia, Malaixia, Philippines và Việt Nam Tôm bột (PL.), tôm giống (Juvenile) và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và rừng ngập mặn ven bờ Khi tôm trưởng thành di chuyển xa bờ vì chúng thích sống vùng nước sâu hơn

Ở Việt Nam tôm sú phân bố tự nhiên ở vùng duyên hải miền Trung Miền Bắc và miền Nam hiếm hơn, chỉ ở vùng Kiên Giang có khá nhiều

Khi ươm trong ao sâu 25 – 30 ngày, tôm sú đạt kích cỡ 2 – 3 cm Khi nuôi trong

ao, sau 4 tháng, tôm sú có thể đạt kích cỡ trung bình 25 – 40g/con Tôm sú lột xác nhiều lần và có tính chu kỳ đẻ lớn

Tôm sú ở vùng biển miền trung, mùa đẻ rộ của tôm sú từ tháng 2 đến tháng 4 và

từ tháng 7 đến tháng 9 Ở các thủy vực miền nam, mùa đẻ của tôm sú có thay đổi chút

ít, tùy thuộc vào điều kiện thời tiết hàng năm.Tôm sú tự nhiên ở vùng biển Khánh Hòa

có thể đẻ từ 300.000 đến 1.000.000 trứng.Tôm thường đẻ trứng ở các bãi xa bờ, nước sâu, nước trong sạch, có độ mặn cao, trên 30‰

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

- Hóa chất pha đệm Tris-HCl 0.05M

- Hóa chất pha đệm phosphate: muối NaH2PO4.2H2O và muối Na2HPO4.12H2O

- Nước muối sinh lý, nước cất

- Cát thạch anh

- Hóa chất tủa protein: cồn 960, acetone, muối (NH4)2SO4

- Hóa chất pha thuốc thử Ninhydrin 2%: Ninhydrin ( C9H4O3.H2O M = 178,14 ), dung dịch Methylcellosole, đệm citrate pH = 5

- Hóa chất pha thuốc thử Bradford: CCB (Bio-rad, dạng bột), Ethanol tuyệt đối

và H3PO4 85%

- Hóa chất để dựng đường chuẩn L-Leucine C6H13NO2

- Hóa chất dùng trong quá trình lọc gel: Biogel P-100 (Bio-rad)

- Hóa chất để xác định hoạt tính enzyme: gelatin, HCl 0.1N, SnCl2

3.3 Thiết bị

- Micropipet, pipet các loại (1ml, 2ml, 5ml 10ml)

- Cân phân tích 3 số, máy đo pH

- Máy khuấy từ, Vortex

- Bể điều nhiệt, tủ sấy, máy ly tâm

- Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad gồm phễu đổ gel, flow adaptor,

- vòi hút chân không để khử khí cho dung dịch

- Bình định mức, ống đong, phễu lọc, giấy lọc, đũa khuấy

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu

Mẫu nội tạng tôm làm nguyên liệu thu chế phẩm enzyme được tách từ tôm sú

tươi (khoảng 40 – 50 con/kg) Mẫu nên được dùng ngay, ướp đá xay kết hợp với muối

và bảo quản ở nhiệt độ 00C (dưới 4 giờ) Nếu cần bảo quản lâu hơn thì cho mẫu vào các túi PE, bảo quản ở -200C để dùng dần trong các lần thí nghiệm Thời gian bảo quản nội tạng càng ngắn càng tốt để tránh hiện tượng enzyme bị biến tính

Chiết rút thu dịch chiết collagenase từ mẫu nội tạng Nghiền nhuyễn nội tạng bằng cối inox thêm cát thạch anh Sử dụng dung môi nước cất ở tỷ lệ 1/5, khuấy đảo liên tục ở điều kiện nhiệt độ 0 – 40C trong 60 phút để chiết rút enzyme, ly tâm ở 40C, tốc độ 10.000 rpm trong 10 phút để loại bỏ phần cặn, thu dịch chiết (DC)

10 phút, thu cặn là chế phẩm enzyme thô (CPT) Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tủa

và tác nhân tủa từ đó chọn ra tác nhân và nồng độ thích hợp để tủa DC thu

collagenase

3.4.3 Bố trí thí nghiệm

Quy trình tách chiết, tinh sạch và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng hoạt động của enzyme collagenase từ mẫu nội tạng tôm sú được tiến hành theo sơ đồ bố trí sau:

Hình 3.1 Quy trình tách chiết, tinh sạch và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính

của enzyme collagenase từ mẫu nội tạng tôm sú

3.4.4 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

a) Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brillant blue khi tạo phức với protein Trong dung dịch mang tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang màu xanh dương và hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm Độ hấp thu ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên là xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền đến 1 giờ Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta được ODx, độ hấp thụ tỷ lệ với lượng protin có trong mẫu Thực hiện mẫu đối chứng với HCl (OD0) Lấy giá trị ∆OD = ODx – OD0 Lượng

protein trong mẫu dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ giá trị ∆OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành

b) Hóa chất – thiết bị

Thiết bị: máy quang phổ UV – Vis

Hóa chất: Dung dịch mẫu protein, Nước cất, Dung dịch albumin 0,1 µg/ml, Dung dịch thuốc thử Braford ( Coomasie Brillant Blue - 0,001g, Ethanol tuyệt đối - 4,7g,

H3PO4 85% - 8,5g, Phẩm màu coomasie làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp,

bổ sung H3PO4 85% thêm nước cất đến 100ml)

c) Dựng đường chuẩn Albumin

Chuẩn bị 11 ống nghiệm khô, sạch

Pha dung dịch albumin chuẩn (0,1 µg/ml) thành dung dịch albumin có các nồng

d) Tiến hành phản ứng xác định hàm lượng protein có trong mẫu

Mẫu thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự như trên Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng của đường chuẩn Từ đó suy ra hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm

Bảng 3.2 Sơ đồ phản ứng xác định hàm lượng protein trong mẫu

Từ phương trình đường chuẩn và giá trị OD của mẫu khảo sát ta suy ra hàm lượng pretein của mẫu là X (µg/ml) có trong m (g) nguyên liệu

Vậy lượng prtein có trong 1 g nguyên liệu là:

Hình 3.3 Cấu tạo hóa học phân tử Ninhydrin

Phản ứng kiểm tra Ninhydrin: Dưới tác dụng của ninhydrin ở nhiệt độ cao, acid amin tạo thành NH3, CO2 và aldehid tương ứng có mạch carbon ngắn hơn acid amin 1 carbon; Ninhydrin chuyển thành aminodixetohidrinden

OD của dung dịch, từ đó xác định hàm lượng acid amin

Để định lượng acid amin có thể dùng phương pháp so màu đo cường độ màu phản ứng hoặc dùng phương pháp đo thể tích khí CO2 hoặc NH3 được tạo thành

b) Dụng cụ - Hóa chất

Dụng cụ: Bể điều nhiệt, máy đo OD, máy ly tâm v.v

Hóa chất: Acid amin L-Leucine C6H13NO2, Cơ chất gelatin: 0,5 g gelatin hòa tan trong 50 ml nước nóng (hoặc sử dụng máy khuấy từ kèm nhiệt độ cao) thu được hỗn hợp gelatin trong suốt đồng nhất, Dung dịch HCl 0,1 N, Dung dịch Methylcellosole, Dung dịch đệm citrate /NaOH tỷ lệ 1:1, pH = 5, Thuốc thử Ninhydrin 2 %: cân chính xác 2 g Ninhydrin hòa tan trong 100 ml dung dịch gồm: dung dịch methylcellosole và dung dịch đệm citrate/NaOH tỷ lệ 1:1, pH = 5, Dung dịch SnCl2.2H2O 0,1 %

c) Dựng đường chuẩn L-Leucine

Bảng 3.3 Sơ ứng dựng đư hu L- ucin

Làm nguội bằng nước đá

ành thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp

ẫu được pha loãng sao cho trị số

Hình 3.5 Đường chuẩn l-leucine

d) Tiến h

Ninhydrin

Mẫu thí nhiệm cũng làm tương tự như trên M

mật độ quang đo được trong khoảng đường chuẩn

Thực hiện phản ứng tạo màu khi trộn và đun sôi 20 phút hỗn hợp phản ứng bao gồm 1 ml dung dịch mẫu, 1 ml cơ chất gelatin, 1 ml dung dịch HCl 0,1 N, 2 ml dung

g -

B ồ phản ứng xác h hoạt tính enzyme b phương pháp Ninhydrin

Với: d: hệ số pha loãng , V: Thể tích enzyme ban đầu (ml), ν: Thể tích dung dịch enzyme làm thí nghiệm (ml), t: Thời gian phản ứng (phút) , m: Khối lượng của chế phẩm (g), µgleucin: Giá trị của mẫu thí nghiệm sau khi đo OD và chiếu vào đường

át các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính collagenase của CPT từ nội

ng pháp Ninhydrin

iệm khảo sát ảnh hưởng c

pH cũng là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme mỗi enzyme có một khoảng pH hoạt động thích hợp và một giá trị pH tối ưu nhất Tiến hành thí nghiệm, chuẩn bị dịch chiết enyzme và gelatin có pH thay đổi theo dãy: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 bằng cách pha loãng dịch chiết enzyme và pha gelatin bằng dung dịch đệm phosphate pH 2 đến 12 Sau đó cho enzyme collagenase CPT của mẫu nội tạng tôm sú tác dụng

Hình 3.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme

collagenase

c) Độ bền nhiệt

Tiến hành ủ enzyme ở nhiệt độ 50oC trong các khoảng thời gian (phút): 10, 20,

30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 Sau đó cho tác dụng với gelatin 10 mg/ml Xác định hoạt tính theo phương pháp ninhydrin

Hình 3.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ bền nhiệt đến hoạt độ

enzyme collagenase

d) Kim loại

Tiến hành thí nghiệm, pha loãng enzyme collagenase CPT của mẫu nội tạng tôm sú bằng các dung dịch kim loại: Pb, Mo, Zn, Ca, Hg, Mn, CN, EDTA, Fe, Ba, Cu, Mg…Sau đó cho tác dụng với gelatin 10 mg/ml, xác định hoạt tính bằng phương pháp ninhydrin