PHÂN LẬP, CHỌN LỌC VÀ NHÂN SINH KHỐI CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN GIẢI LÂN

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập, chọn lọc và nhân sinh khối các chủng vi khuẩn phân giải lân” được thực hiện, tại viện Công Nghệ Sinh Học – Công Nghệ Môi Trường - Trườ

Trang 1

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, CHỌN LỌC VÀ NHÂN SINH KHỐI CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN GIẢI LÂN

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện :PHẠM THỊ NGỌC NGA

Tháng 8/2009

Trang 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, CHỌN LỌC VÀ NHÂN SINH KHỐI CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN GIẢI LÂN

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiện

ThS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG PHẠM THỊ NGỌC NGA

KS TĂNG THỊ ÁNH THƠ

Tháng 8/2009

Trang 3

Gởi lời cảm ơn thân ái đến toàn thể các bạn lớp DH05SH đã luôn bên cạnh động viên,

an ủi và giúp đỡ tôi trong những lúc tôi gặp khó khăn nhất trong những học kì qua và trong suốt quá trình làm đề tài

Và trên hết, con xin chân thành gởi lời mến thương nhất đến ba má và các anh chị em trong gia đình luôn là chỗ dựa vững chắc cho con trong suốt quãng đời sinh viên Không ai khác, con tự tin khẳng định rằng chính gia đình mình và sự nổ lực của con sẽ

là động lực mạnh mẽ nhất giúp con thành công trên con đường mà con đã chọn Mến thương đến gia đình rất nhiều!

Sinh viên thực hiện Phạm Thị Ngọc Nga

Trang 4

iv

TÓM TẮT

Photpho là một nguyên tố cần thiết cho sự phát triển của cây trồng Tuy nhiên photpho tồn tại trong đất ở dạng khó tan, do vậy cây trồng khó hấp thụ để chuyển hoá thành chất dinh dưỡng Nguồn photpho trong đất vẫn chưa được cây trồng sử dạng một cách hiệu quả Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập, chọn lọc và nhân sinh khối các chủng vi khuẩn phân giải lân” được thực hiện, tại viện Công Nghệ Sinh Học – Công Nghệ Môi Trường - Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ đầu tháng 3/2009 đến cuối tháng 6/2009, nhằm mục đích tìm ra những chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hoá photpho khó tan trong đất thành dạng dễ hoà tan, từ đó bổ sung sinh khối của chúng vào phân bón hữu cơ vi sinh để giúp cây trồng tăng hiệu quả sử dụng photpho, mang lại hiệu quả kinh tế cho người làm nông

Từ 40 mẫu đất trồng hoa màu ở 4 vùng Đồng Nai, Bình Dương, Hóc Môn, Củ Chi, tiến hành sàng lọc và chọn ra 11 chủng phân giải lân vô cơ mạnh nhất, và được chia thành 3 nhóm Trong đó, nhóm 1 là trực khuẩn, G - gồm 5 chủng DN7, BD6, DN2, BD4, HM1, nhóm 2 là trực khuẩn, G + sinh bào tử gồm 3 chủng HM2, BD10, BD8, nhóm 3 là cầu khuẩn G + gồm 3 chủng BD1, DN1, BD9 Chủng DN7 và BD6 là

2 chủng tốt nhất được tiến hành nghiên cứu để tạo chế phẩm phân bón hữu cơ vi sinh trên 2 môi trường Pikovskaya lỏng và nước bột thịt Môi trường Pikovskaya lỏng là tốt nhất cho nhân sinh khối của 2 chủng này, đối với chủng vi khuẩn DN7 trong thời gian

72 giờ tại pH 7 cho sinh khối cao nhất, chủng vi khuẩn BD6 trong thời gian 96 giờ tại

pH 8 cho sinh khối tối đa

Trang 5

v

SUMMARY

Phosphorus is one of the major nutrients for plant growth However, phosphorus is highly insoluble and unavailable to plant, amount available to plant is usually a small proportion of this total Thesis “Isolating, Selecting, and Increasing in the mass of phosphate solubilizing bacterium” have been done from 1 March, 2009 to

30 June, 2009 at Reseach Institute Biological and Enviromental Technology, Nong Lam University to find out different bacterial strains to solubilize phosphate compounds best application on organic fertilizer

Phosphate solubilizing bacteria were isolated from four provinces Dong Nai,

Binh Duong, Hoc Mon and Cu Chi and were classified into three groups: group 1 is

Aerobic Rods and Cocci, G - bacteria inclusion DN7, BD6, DN2, BD4 and HM1, group 2 is endospore-forming, Rods, G + bacteria inclusion HM2, BD10 and BD8, group 3 is Cocci, G + bacteria inclusion BD1, DN1 and BD9

Increasing in the mass with two media: Pikovskaya and beaf extract of DN7, BD6 strains Pikoskaya’s medium was consonant with the growth of DN7, BD6 strains DN7 strain: mass reached maximum activity at 72 hours, optimal pH 7 and BD6 strain: mass reached maximum activity at 96 hours, optimal pH 8

Trang 6

vi

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn .iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Lân trong tự nhiên 2

2.2 Sự chuyển hóa photpho nguồn hữu cơ 3

2.3 Sự chuyển hóa các hợp chất vô cơ chứa photpho 4

2.4 Nguồn phân lập vi khuẩn phân giải hợp chất vô cơ chứa photpho 5

2.4.1 Bacillus 6

2.4.2 Alcaligenes 6

2.4.3 Agrobacterium 6

2.5 Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến vi khuẩn phân giải lân vô cơ 7

2.6 Phân hữu cơ vi sinh 7

2.7 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn 8

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

3.1 Thời gian và địa điểm 10

3.2 Vật liệu 10

3.2.1 Mẫu đất phân lập 10

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 12

2.2.3 Hóa chất 12

3.3 Phương pháp thí nghiệm 13

Trang 7

vii

3.3.1 Phân lập và làm thuần 13

3.3.2 Lấy mẫu và tăng sinh mẫu 13

3.3.3 Phân lập chọn lọc 13

3.3.4 Làm thuần vi khuẩn 13

3.3.5 Bảo quản giống vi khuẩn 13

3.3.6 Khảo sát khả năng phân giải lân vô cơ 14

3.3.7 Quan sát hình thái 14

3.3.8 Định danh vi khuẩn 14

3.3.8.1 Khảo sát đặc điểm hình thái 15

3.3.8.2 Khảo sát đặc điểm sinh hóa 16

3.3.9 Khảo sát ảnh hưởng của (thời gian, pH) 18

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 18

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

4.1 Kết quả phân lập và làm thuần 19

4.2 Kết quả phân nhóm vi khuẩn 24

4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian 32

4.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian và pH đối với chủng DN7 32

4.3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian và pH đối với chủng BD6 37

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 3

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC 3

Sinh viên thực hiện :PHẠM THỊ NGỌC NGA 3

Niên khóa :2005 - 2009 3

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO iv

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP iv

LỜI CẢM ƠN iii

Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các anh chị và các bạn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: iii

Trang 8

viii

Thạc sĩ: Trương Phước Thiên Hoàng, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều

kiện cho em thực hiện khóa luận này Em xin chân thành cảm ơn cô rất nhiều! iii

Kỹ sư: Tăng Thị Ánh Thơ: là người hết lòng tận truyền đạt những kinh nghiệm quí báu trong suốt quá trình em làm đề tài Em xin chân thành cảm ơn cô rất nhiều! iii

Em cảm ơn các quí thầy cô cùng ban lãnh đạo của viện Công Nghệ Sinh Học – Công Nghệ Môi Trường - Trường đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài tại viện iii

Gởi lời cảm ơn thân ái đến toàn thể các bạn lớp DH05SH đã luôn bên cạnh động viên, an ủi và giúp đỡ tôi trong những lúc tôi gặp khó khăn nhất trong những học kì qua và trong suốt quá trình làm đề tài iii

Và trên hết, con xin chân thành gởi lời mến thương nhất đến ba má và các anh chị em trong gia đình luôn là chỗ dựa vững chắc cho con trong suốt quãng đời sinh viên Không ai khác, con tự tin khẳng định rằng chính gia đình mình và sự nổ lực của con sẽ là động lực mạnh mẽ nhất giúp con thành công trên con đường mà con đã chọn Mến thương đến gia đình rất nhiều! iii

TÓM TẮT iv

Photpho là một nguyên tố cần thiết cho sự phát triển của cây trồng Tuy nhiên photpho tồn tại trong đất ở dạng khó tan, do vậy cây trồng khó hấp thụ để chuyển hoá thành chất dinh dưỡng Nguồn photpho trong đất vẫn chưa được cây trồng sử dạng một cách hiệu quả Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập, chọn lọc và nhân sinh khối các chủng vi khuẩn phân giải lân” được thực hiện, tại viện Công Nghệ Sinh Học – Công Nghệ Môi Trường - Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ đầu tháng 3/2009 đến cuối tháng 6/2009, nhằm mục đích tìm ra những chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hoá photpho khó tan trong đất thành dạng dễ hoà tan, từ đó bổ sung sinh khối của chúng vào phân bón hữu cơ vi sinh để giúp cây trồng tăng hiệu quả sử dụng photpho, mang lại hiệu quả kinh tế cho người làm nông .iv

Từ 40 mẫu đất trồng hoa màu ở 4 vùng Đồng Nai, Bình Dương, Hóc Môn, Củ Chi, tiến hành sàng lọc và chọn ra 11 chủng phân giải lân vô cơ mạnh nhất, và được chia thành 3 nhóm Trong đó, nhóm 1 là trực khuẩn, G - gồm 5 chủng DN7, BD6, DN2, BD4, HM1, nhóm 2 là trực khuẩn, G + sinh bào tử gồm 3 chủng HM2, BD10, BD8, nhóm 3 là cầu khuẩn G + gồm 3 chủng BD1, DN1, BD9 Chủng DN7 và BD6 là 2 chủng tốt nhất được tiến hành nghiên cứu để tạo chế phẩm phân bón hữu cơ vi sinh trên 2 môi trường Pikovskaya lỏng và nước bột thịt Môi trường Pikovskaya lỏng là tốt nhất cho nhân sinh khối của 2 chủng này, đối với chủng vi khuẩn DN7 trong thời gian 72 giờ tại pH 7 cho sinh khối cao nhất, chủng vi khuẩn BD6 trong thời gian 96 giờ tại pH 8 cho sinh khối tối đa .iv

SUMMARY v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

Chương 4 19

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

4.1 Kết quả phân lập và làm thuần 19

Từ 40 mẫu đất thu nhận ở 4 vùng Đồng Nai, Bình Dương, Hóc Môn, Củ Chi Chúng tôi đã tiến hành phân lập và làm thuần trên môi trường PVK rắn Kết quả chúng tôi đã thu nhận được 50 chủng thuần và xác định được mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở từng vùng 19

Trang 9

ix

Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ cao nhất ở tỉnh Đồng Nai, mẫu đất thu được ở Đồng Nai có sự đa dạng về chủng loại, tiếp đến là tỉnh Bình Dương, huyện Hóc

Môn, và mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ thấp nhất là ở huyện Củ Chi 19

Bảng 4.1 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Đồng Nai 19

Bảng 4.2 Mật độ vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Bình Dương 20

Bảng 4.4 Mật độ vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở huyện Củ Chi 22

Chương 5 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

Qua hệ thống phân lập trên môi trường chọn lọc PVK chúng tôi kết luận: 42

+ Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ cao nhất ở đất trồng Chôm Chôm của xã Quang Trung, huyện Thống Nhất, tỉnh Đồng Nai là 31,90 x 104 (CFU/g), đây là loại đất thích hợp cho vi khuẩn phân giải lân vô cơ phát triển 42

+ Chủng có khả năng phân giải lân vô cơ mạnh nhất là 2 chủng DN7 và BD6 .42

Các chủng vi khuẩn phân giải lân vô cơ mạnh nhất được phân thành 3 nhóm: 42

+ Nhóm 1: Trực khuẩn, G -, nhóm này gồm các chủng: DN7, BD6, DN2, BD4, HM1 42

+ Nhóm 2: Trực khuẩn G +, sinh bào tử, nhóm này bao gồm các chủng: HM2, BD10, BD8 .42

+ Nhóm 3: Cầu khuẩn (xếp thành chuỗi), G+, nhóm này bao gồm các chủng: BD1, DN1, BD9 42

Môi trường PVK lỏng nhân sinh khối 2 chủng DN7 và BD6 tốt hơn môi trường nước bột thịt 42

+ Chủng BD6: Nhân sinh khối trong thời gian 96 giờ, ở pH 8 trên môi trường PVK lỏng cho sinh khối cao nhất là 34,00 x 108 (CFU/ml) 42

+ Chủng DN7: Nhân sinh khối trong thời gian 72 giờ, ở pH 7 trên môi trường PVK lỏng cho sinh khối cao nhất là: 22,47 x 108 (CFU/ml) 42

5.2 Đề nghị 42

Định danh đến giống và loài của 11 chủng vi khuẩn dựa trên sự phân nhóm đã có bằng phương pháp PCR 42

Nhân sinh khối của 2 chủng DN7, BD6 trên nhiều môi trường khác nhau để tìm ra môi trường thích hợp mang lại hiệu quả kinh tế cho quá trình nhân sinh khối bổ sung vào phân hữu cơ vi sinh .42

Trộn sinh khối của 2 chủng DN7, BD6 vào các loại phân bón khác nhau và thử nghiệm trên đồng ruộng 42

13 http://www.agronomy-journal.org/articles/agro/pdf/2001/06/a1619.pdf 44

14 http://www.insinet.net/rjabs/2007/701-703.pdf 44

15 http://www.clrri.org/lib/omonrice/14-06.pdf 44

16 www.humixvn.com.htm 44

Phụ lục 1 1

Bảng 5 Bảng ANOVA của mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Bình Dương số liệu trên bảng 4 3

Total (corrected) 1.7708E0009 29 3

Bảng 6 Bảng trắc nghiệm phân hạng mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Bình Dương số liệu trên bảng 4 3

Bảng 7 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở huyện Hóc Môn 4

Bảng 10 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở huyện Củ Chi 5

Trang 11

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Lân tổng số và dễ tiêu trong đất Việt Nam 2

Bảng 2.2 Nhóm vi sinh vật phân giải 2 loại acid hữu cơ 5

Bảng 3.1 Ký hiệu mẫu và nơi lấy mẫu đất ở Đồng Nai 11

Bảng 4.1 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Đồng Nai 19

Bảng 4.2 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Bình Dương 20

Bảng 4.3 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở huyện Hóc Môn 21

Bảng 4.4 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở huyện Củ Chi 22

Bảng 4.5 Kích thước vòng phân giải lân vô cơ của 11 chủng vi khuẩn 23

Bảng 4.6 Hình dạng và kích thước tế bào của vi khuẩn nhóm 1 24

Bảng 4.7 Các đặc điểm sinh hoá của nhóm 1 25

Bảng 4.9 Các đặc điểm sinh hóa của nhóm 2 27

Bảng 4.11 Các đặc điểm sinh hóa của nhóm 3 29

Bảng 4.12 Khảo sát thời gian 12, 24, 36 giờ trên PVK lỏng của DN7 32

Bảng 4.15 Khảo sát thời gian 12, 24, 36 giờ trên nước bột thịt của DN7 34

Bảng 4.16 Khảo sát thời gian 48, 60, 72 giờ nước bột thịt của DN7 35

Bảng 4.17 Khảo sát thời gian 84, 96, 108 giờ trên nước bột thịt của DN7 35

Bảng 4.18 Khảo sát thời gian 12, 24, 36 giờ trên PVK lỏng của BD6 37

Trang 12

xii

Bảng 4.21 Khảo sát thời gian 12, 24, 36 giờ trên nước bột thịt của BD6 39

DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 3.1 Các mẫu đất phân lập 10

Hình 4.1 Nhuộm Gram của vi khuẩn nhóm 1 24

Hình 4.2 Phản ứng sinh hóa của 2 chủng nhóm 1 25

Hình 4.7 Khuẩn lạc sau 24 giờ của nhóm 1 30

Hình 4.8 Khuẩn lạc của HM2 và BD4 31

Hình 4.9 Khuẩn lạc sau 24 giờ của nhóm 3 31

Sơ đồ 2.1 Sự chuyển hóa nucleoprotein 4

Sơ đồ 2.2 Vòng tuần hoàn photpho trong tự nhiên 8

Trang 13

cơ vi sinh, giúp cây trồng hấp thụ lân tốt hơn, mang lại hiệu quả kinh tế cho người nông dân là vấn đề cần được giải quyết Trên những cơ sở đó tiến hành đề tài: “Phân lập, chọn lọc và nhân sinh khối các chủng vi khuẩn phân giải lân”

1.2 Yêu cầu đề tài

Chọn lọc và bước đầu phân nhóm các chủng vi khuẩn phân giải lân mạnh nhất, khảo sát ảnh hưởng của yếu tố (thời gian, pH) đến quá trình nhân sinh khối của một

số chủng vi khuẩn tiêu biểu

1.3 Nội dung thực hiện

Phân lập, làm thuần và làm thuần các chủng vi khuẩn phân giải lân

Khảo sát khả năng phân giải lân trên môi trường chọn lọc để chọn ra những chủng

có khả năng phân giải lân mạnh

Phân nhóm các chủng vi khuẩn phân giải lân vô cơ dựa vào các đặc điểm hình thái, nhuộm Gram và sinh hoá

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: thời gian, pH và môi trường nuôi cấy đến quá trình nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn phân giải lân

Trang 14

2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lân trong tự nhiên

Photpho là một thành phần khoáng rất quan trọng trong tế bào của vi sinh vật và

là yếu tố dinh dưỡng không thể thiếu được trong sự phát triển của thực vật và động vật Đối với nhiều loài vi sinh vật, lượng photpho trong tế bào chiếm 50% tổng lượng khoáng Photpho có mặt trong nhiều thành phần quan trọng của tế bào như chúng có mặt trong acid nucleic, photpho protein, photpholipid ở các hợp chất cao năng và các coenzyme quan trọng như flavin, tiamin, biotin Do đó, việc phân hủy các hợp chất vô

cơ và hữu cơ chứa photpho đối với vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng như việc được cung cấp nguyên liệu cho quá trình tạo ra những chất trên cho cơ thể (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Hình thành trong vùng nhiệt đới ẩm Việt Nam có mức độ phân hoá sâu sắc, hàm lượng lân tổng số và dễ tiêu trong đất nói chung không cao trừ một vài trường hợp đặc biệt

Bảng 2.1 Lân tổng số và dễ tiêu trong đất Việt Nam

(Nguyễn Tử Siêm và Trần Khải, 1995)

Đất đỏ nâu trên đá vôi 0,10 – 0,20 5 – 10

Đất nâu đỏ trên đá bazan 0,20 – 0,30 3 – 10

Đất vàng nhạt trên đá cát 0,04 – 0,06 1 – 1,5

Đất phù sa hệ thống sông Hồng 0,08 – 0,15 10 – 15

Đất phù sa hệ sông Cửu Long 0,05 – 0,10 1 - 8

Trang 15

3

Đá mẹ và mẫu chất là yếu tố độ phì nhiêu về tiềm năng lân Phần lớn các đất núi

có hàm lượng photpho tổng số cao như đất đen nhiệt đới trên macgalit, đất feralit có mùn trên núi, đất nâu đỏ bazan, tỉ lệ lân tổng số có thể đạt tới 0,3 – 0,5% P2O5 Đất phát triển trên đá macma chua, như đất đỏ vàng trên phiến thạch, phù sa cổ, có lân tổng số thấp hơn Đất đồng bằng phù sa sông Hồng, mặn trung tính kiềm có tỉ lệ lân trung bình (0,1%), đất ở hệ thống sông suối khác nghèo lân, phần nhiều < 0,05% P2O5 Xét về độ phì nhiêu thì thực tế lân tổng số không có ý nghĩa gì nhiều, vì đại bộ phận lân tổng số ở dạng khó tiêu đối với thực vật Thành phần các nhóm photphat phản ứng trung thực tình trạng cung cấp lân của các loại đất và cho những gợi ý về giá trị khai thác lân trong đất và quản lý lượng bón lân vào đất Lân hữu cơ trong đất biến động từ 10 – 15% lân tổng số gồm các phytin, nucleoprotein, leucytin, hợp chất mùn

và các acid hữu cơ chứa lân Các acid mùn chứa 4 – 5% photpho, trong điều kiện thuận lợi giải phóng 15 – 20 kg P/ha/năm Song hầu hết hệ thống cây trồng cân bằng lân hữu cơ thường bằng không hoặc âm, vì chỉ riêng vi sinh vật đã tiêu tốn hết 10 g P2O5 để tiêu hủy 1 g cellulose (Nguyễn Tử Siêm và Trần Khải, 1995)

2.2 Sự chuyển hóa photpho nguồn hữu cơ

Các dạng lân hữu cơ thường gặp: phytin, acid nucleic, nucleoprotein,

phospholipid Sự chuyển hóa này đã được nghiên cứu từ 1911 bởi J.Stoklasa Những

nghiên cứu đầu tiên này không gây sự chú ý đến nhiều nhà khoa học đương thời Mãi cho đến năm 1952 các nhà khoa học mới quan tâm và nghiên cứu khá kỹ khả năng chuyển hóa các hợp các hợp chất hữu cơ chứa photpho bởi các loại vi sinh vật

Các kết quả nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas là những

loài vi sinh vật đóng vai trò chủ yếu trong sự chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa

photpho trong nước và trong đất Trong loài Baciluss có nhiều giống như Bacillus mycoides và Bacillus megatherium var photphotium là những giống có khả năng chuyển hóa mạnh nhất Ngoài ra, còn có các giống khác như Bacillus cereus và Bacillus asterosporus cũng có khả năng chuyển hóa tốt Quá trình chuyển hóa các hợp

chất hữu cơ chứa photpho thường giải phóng ra acid phosphoric

Trang 16

4

Nucleoprotein

Nucllin Protein

Acid nucllin Các acid amin

Đường Adenin Guamin Timin Cytosine H3PO4 NH3 CO2 H2O H2S Một số chất khác

Sơ đồ 2.1 Sự chuyển hóa nucleoprotein (Trần Linh Phước, 2002)

Sự chuyển hóa leucytin thành H3PO4 theo cơ chế sau:

Leucytin Glycerophotphate H3PO4 Nhờ VSV mà lân hữu cơ được vô cơ hoá thành muối của acid phosphoric Các dạng lân này một phần được sử dụng biến thành lân hữu cơ, một phần bị cố định dưới dạng lân khó tan như Ca3(PO2)2, FePO4, AlPO4 Những dạng lân khó tan này trong những môi trường có pH thích hợp sẽ chuyển hóa thành dạng dễ tan và vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong quá trình này

2.3 Sự chuyển hoá các hợp chất vô cơ chứa photpho

Lân vô cơ thường ở dạng khoáng như: apatit, phosporic, phosphat sắt, phosphat nhôm Muốn cây trồng sử dụng được phải chuyển hoá thành dạng dễ tan

Nghiên cứu sự chuyển hoá các hợp chất vô cơ chứa photpho bắt đầu từ năm 1900

do J.Stokolasa Ông đã sử dụng giống Bacillus buytrieus để nghiên cứu, ngoài ra ông còn phát hiện Pseudomonas fluorescens vi khuẩn nitrat hoá, nấm sợi, xạ khuẩn cũng

có khả năng phân giải Ca3(PO4)2 và bột apatit Các nghiên cứu sau này cho thấy các vi khuẩn lên men butyric, vi khuẩn lên men lactic, vi khuẩn lên men acetic cũng có khả năng phân giải Ca3(PO4)2

Các nhà khoa học cho biết, sự phân giải hợp chất vô cơ có chứa photpho có liên quan nhiều đến sự tạo acid hữu cơ của giống vi sinh vật, trong đó có sự hình thành acid carbonic Acid này đóng vai trò rất quan trọng trong sự chuyển hóa các hợp chất

vô cơ chứa photpho

Trang 17

5

Quá trình phân giải hợp chất vô cơ chứa photpho trong đất diễn ra như sau:

Ca3(PO4)2 + 4H2CO3 +H2O = Ca(PO4)2H2O + 2Ca(HCO3)2

Trong đất các vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn lưu huỳnh cũng đóng vai trò rất to lớn trong quá trình chuyển hóa photpho Trong quá trình sống của những vi khuẩn này

sẽ tích lũy trong môi trường HNO3 và H2SO4, các acid này đóng vai trò hòa tan photpho Quá trình hòa tan này được biểu hiện theo phương trình sau:

Ca3(PO4)2 + 4HNO3 = Ca(H2PO4)2 + 2Ca(NO3)2

Ca3(PO4)2 + 2H2SO4 = Ca(H2PO4)2 + 2CaSO4

Trong thiên nhiên photpho được thực vật hấp thụ thường ở dạng pyrophotphat và được chuyển hóa thành các hợp chất hữu cơ chứa photpho, từ những chất này nó sẽ được giải phóng ở dạng photphat

2.4 Nguồn phân lập vi khuẩn phân giải hợp chất vô cơ chứa photpho

Các nghiên cứu gần đây càng khẳng định rõ vai trò quan trọng của vi sinh vật rễ trong qua trình thúc đẩy sự phát triển của đất và cây trồng Nhóm vi sinh vật này bao

gồm các chủng: Alcaligenes, Agrobacterium, Acinetobacter, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Erwinia, Flavobacterium, Paenibacillus, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia… Chúng được sử dụng như là phân bón sinh học góp phần cải

thiện năng suất cây trồng và phục vụ cho các công trình nghiên cứu Bản chất của sự phân giải các hợp chất vô cơ chứa photpho có liên quan tới việc sản xuất ra acid hữu

cơ như: gluconic, 2- ketogluconic

Bảng 2.2 Nhóm vi sinh vật phân giải 2 loại acid hữu cơ: gluconic, 2- ketogluconic

Trong đó Bacillus sản xuất ra các loại acid như: lactic, isovaleric, isobutyric và

acid acetic Các loại acid hữu cơ khác như: glycolic, oxalic, malonic, succinic cũng

được tìm thấy trong quá trình phân giải lân Nhóm, Bacillus, Agrobacterium, Rhizobium, Pseudomonas được xem là phân giải lân mạnh nhất Ngoài ra sự sản sinh

các loại acid vô cơ cũng được tìm thấy trong sự phân giải lân như: acid nitric, acid

Acid Gluconic Pseudomonas sp, Erwinia herbicola, Pseudomonas cepacia Acid 2- ketogluconic Rhizobium legumimosarum, Rhizobium meliloti, Bacillus

Trang 18

loài khác nhau, trong đó đa số là vô hại Bào tử Bacillus có dạng elip đến hình cầu,

kích thước chiều rộng 0,6-0,9 , phần lớn được tạo thành ở 48 giờ Mỗi cá thể chỉ tạo

một bào tử, bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn Bacillus có phản

ứng Catalase dương tính, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong

quá trình trao đổi chất (Holt, 1994)

2.4.2 Alcaligenes

Vi khuẩn hình que hoặc hình cầu, kính thước tế bào 0,5 – 1 x 0,5 – 2,6 (μm), các

tế bào thường xếp riêng lẻ thành từng que Vi khuẩn này được tìm thấy nhiều trong đất

và môi trường thủy sản Vách tế bào mỏng ít peptidoglycan, có nồng độ lipid cao nên khi nhuộm Gram sẽ bắt màu hồng của thuốc thử Fuschin, do vậy mà vi khuẩn này nhuộm Gram âm, có khả năng di động, có 1 – 8 tiên mao, hiếu khí bắt buộc, sử dụng

khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất Phản ứng

nitrate dương tính , phát triển tốt nhất ở 20 – 370C Phản ứng Catalase dương tính, oxdase dương tính, indol âm tính, không sử dụng cellulose, esculin, gelatin Sử dụng nguồn carbon từ các acid hữu cơ và các amino acid, các nguồn carbohydrates không

Trang 19

7

làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất, nhiệt độ phát triển thích hợp nhất là 25 - 280C Khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng có hình lồi

và tròn Các phản ứng catalase, oxidase, urease đều dương tính, sử dụng nguồn cacbon

từ muối của acid hữu cơ, các amino acid, không sử dụng cellulose, tinh bột, glucose, D-galactose và các carbohydrates khác (Holt, 1994)

2.5 Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự phát triển vi khuẩn phân giải lân

Độ pH: nhìn chung pH ảnh hưởng không nhiều đến vi sinh vật phân giải lân Tuy nhiên ở pH 7,8 – 7,9 ảnh hưởng tốt đến sự phát triển của hệ vi sinh vật phân giải lân

Độ ẩm: những nơi ngập nước làm tăng quá trình phân giải lân

Hợp chất hữu cơ: hàm lượng chất hữu cơ mùn hóa không ảnh hưởng đến quá trình phân giải lân Hợp chất hữu cơ tươi làm tăng sự sinh trưởng của hệ vi sinh vật dẫn đến tăng quá trình hòa tan hợp chất lân khó tan

Hệ rễ: hệ rễ cây trồng kích thích sự phát triển của hệ sinh vật phân giải lân khó tan

2.6 Phân hữu cơ vi sinh

Từ các mẫu đất, nước, rễ cây các chủng giống vi sinh vật được phân lập, tuyển chọn, đánh giá và lưu giữ bảo quản tại các phòng thí nghiệm dưới dạng bộ sưu tập quỹ gen Các vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu và sản xuất phân bón bao gồm các sinh

vật cố định nitơ sống cộng sinh với cây bộ đậu (Rhizobium, Bzadyrhizobium), sống tự

do trong đất, nước (Azotobacter, Clostridium, Arthrobacter, Klebsiella, Serratia, Pseudomonas, Bacillus, vi khuẩn lam ) hay sống hội sinh trong vùng rễ cây trồng (Azospirillum), vi sinh vật phân giải lân (Bacillus, Pseudomonas, Penicillium, Aspergillus, Fussarium, Candida), vi sinh vật phân giải xelluloza (Trichoderma, Chetomium, Aspergillus, Gliogladium ), vi sinh vật sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật (Agrobacterium, Flavobacterium, Bacillus, Enterobacter, Azotobacter, Gibberella ) và các vi sinh vật đối kháng vi sinh vật gây bệnh vùng rễ

cây

Phân bón vi sinh vật (phân vi sinh) là sản phẩm chứa vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn có mật độ phù hợp với tiêu chuẩn ban hành, thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được như nitơ, photpho, lưu huỳnh, sắt hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nông sản Phân vi sinh vật phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến người, động, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản (TCVN 6168, 2002)

Trang 20

8

Cây xanh Động vật

Sơ đồ 2.2 Vòng tuần hoàn photpho trong tự nhiên (Nguyễn Xuân Thành, 2003)

2.7 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn

Người ta nghiên cứu sự sinh trưởng vi khuẩn bằng cách phân tích đường cong sinh trưởng môi trường nuôi cấy vi khuẩn Khi vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường lỏng, được phát triển trong hệ thống kín, không được cung cấp chất dinh dưỡng trong quá trình ủ, thì lượng cơ chất dinh dưỡng sẽ giảm và chất thải sẽ tăng Sự sinh trưởng của vi khuẩn theo hình thức trực phân sẽ được chia thành 4 giai đoạn

Phase tiềm phục

Khi vi khuẩn đưa vào môi trường nuôi cấy mới, sẽ không có sự gia tăng ngay lập tức số lượng hay sinh khối tế bào Một phase tiềm phục trước khi tế bào bắt đầu phân chia thì cần thiết bởi nhiều lý do sau: tế bào già và thiếu năng lượng, thiếu các coenzyme cần thiết và thiếu ribosome Môi trường nuôi cấy có thể khác với môi trường trước đây mà vi khuẩn sống Trong trường hợp này tế bào có thể cần những enzyme mới để sử dụng được những cơ chất dinh dưỡng mới Vi khuẩn có thể bị tổn thương và đòi hỏi một thời gian để hồi phục

Chất hữu cơ tươi và tế bào vi sinh vật Chất hữu cơ mùn hóa

Cố định tạm thời Photpho vô cơ

Ion PO4-3 trong dung dịch đất

Ion PO4-3 bị hấp thụ

Quá trình cố định Quá trình khoáng Hòa tan

Trang 21

9

Phase cấp số

Trong phase này vi khuẩn sẽ phân chia ớ mức cực đại, điều này phụ thuộc vào khả năng di truyền của chúng, bản chất của môi trường và điều kiện nuôi cấy Vận tốc tăng trưởng không thay đổi trong phase cấp số, vi khuẩn phân chia và nhân đôi trong một khoảng thời gian đều đặn

Phase ổn định

Ở phase ổn định, mỗi loại vi khuẩn sẽ có mật độ tối đa khác nhau Có nhiều lý

do khiến vi khuẩn đi vào phase ổn định là do sự giới hạn về chất dinh dưỡng Sinh vật hiếu khí thì bị giới hạn bởi O2, bởi vì O2 không dễ được hòa tan và được tiêu thụ nhanh chóng nên chỉ có ở bề mặt canh trùng là có nồng độ O2 đủ cho dự tăng trưởng

Sự tích lũy những chất độc hại cũng làm dừng sự tăng trưởng

Phase tử vong

Một biến đổi có hại của môi trường là thiếu chất dinh dưỡng, tích tụ các chất độc, sẽ làm giảm số lượng tế bào sống Đây là nét đặc trưng của phase tử vong Số lượng tế bào trong phase này không thay đổi, vì tế bào không tự ly giải sau khi chết

Trang 22

10

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 03/2009 đến cuối 06/2009

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại viện Công Nghệ Sinh Học - Công Nghệ Môi Trường - Trường đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Mẫu đất phân lập

Mẫu đất phân lập được lấy từ 4 vùng Đồng Nai, Bình Dương, Hóc Môn, Củ Chi

Ở mỗi vùng thu nhận 10 mẫu khác nhau, tổng số mẫu đất thu được là 40 mẫu

Hình 3.1 Các mẫu đất thu nhận ở 4 vùng a: mẫu đất Đồng Nai, b: mẫu đất Bình

Dương, c: mẫu đất Hóc Môn, d: mẫu đất Củ Chi

Trang 23

DN 1 Vườn Bắp, Hưng Long, Hưng Thịnh, huyện Thống Nhất, Đồng Nai

DN2 Vườn Mía, Hưng Nghĩa, Hưng Lộc, huyện Thống Nhất, Đồng Nai DN3 Vườn cây Nam Bộ, Hưng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai

DN4 Vườn Cà Phê, Quang Trung, Thống Nhất, Đồng Nai

DN5 Vườn Cao Su, Quốc lộ 1A, thị trấn Trảng Bom, Đồng Nai

DN6 Vườn Tiêu, Lê Lợi, Quang Trung, Thống Nhất, Đồng Nai

DN7 Vườn Chôm Chôm, Lê Lợi, Quang Trung, Thống Nhất, Đồng Nai DN8 Vườn Cải Ngọt, Lê Lợi, Quang Trung, Thống Nhất, Đồng Nai DN9 Vườn Xoài, đường Võ Thị Sáu, thành phố Biên Hòa, Đồng Nai DN10 Vườn Bí Đỏ, Lê lợi, Quang Trung, Thống Nhất, Đồng Nai

BD1 Vườn Măng Cụt, Bình Đức, Bình Nhâm, Dĩ An, Bình Dương BD2 Vườn Nhãn, Hưng Thọ, Hưng Định, Thuận An, Bình Dương

BD3 Vườn Bưởi, Chi Liêu, Tân Đông Hiệp, Dĩ An, Bình Dương

BD4 Vườn Đu Đủ, Bình Đức, Bình Nhâm, Thuận An, Bình Dương BD5 Vườn Cà Pháo, Tân Long, Tân Đông Hiệp, Dĩ An, Bình Dương BD6 Vườn Bòn Bon, Hưng Phước, Hưng Định, Thuận An, Bình Dương BD7 Vườn Samboche, Hưng Thọ, Hưng Định, Thuận An

BD8 Vườn Xà Cừ, Tân Long, Tân Đông, Dĩ An, Bình Dương

BD9 Vườn Mít, Bình Đức, Bình Nhâm, thị trấn Lái Thiêu, Bình Dương BD10 Vườn Bí Đỏ, Chi Liêu, Tân Đông Hiệp, Dĩ An, Bình Dương

HM1 Vườn Bông Cải, ấp 4, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

HM2 Vườn Cải, ấp 4, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

HM3 Vườn Đậu Bắp, ấp 4 , Xuân Thới Sơn, Hóc Môn

HM4 Vườn rau Bạc Hà, ấp 3, Xuân Thới Sơn, Hóc Môn

HM5 Vườn Bắp, ấp 4, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

HM6 Vườn Dưa Leo, ấp 2, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

HM7 Vườn Khổ Qua, ấp 4, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

Trang 24

12

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị

+ Lò Microwave + Kính hiển vi

+ Máy lắc + Màng lọc vô trùng

+ Tủ sấy + Nồi hấp vô trùng autoclave

Và một số dụng cụ cơ bản khác của phòng thí nghiệm vi sinh

3.2.3 Hóa chất

 Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải lân vô cơ là môi trường PVK (TCVN 6167,1996)

 Môi trường nước bột thịt (nhân sinh khối vi khuẩn)

 Môi trường PGA( giữ giống vi khuẩn)

 Môi trường TSI để thử nghiệm phản ứng TSI

 Môi trường SCA để thử nghiệm khả năng biến dưỡng Citrate

 Môi trường Urea Broth Rustigian – Stuart

 Môi trường nước trypton đểt thử nghiệm khả năng sinh Indol

 Môi trường MR – VP Broth để thử nghiệm phản ứng Methyl Red

 Môi trường lỏng Clark – Lub (môi trường MR – VP)

HM8 Vườn Bí Đỏ, ấp 4, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

HM9 Vườn Đậu Bắp, ấp 5, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

HM10 Vườn Bí Chanh, ấp 4, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

CC1 Vườn Thanh Long, ấp Thượng, Tân Thông Hội, Hóc Môn

CC2 Vườn Cải, ấp Thượng, Tân Phú Trung, Hóc Môn

CC3 Vườn Tràm, ấp Thượng, xã Tân Thông Hội, Hóc Môn

CC4 Vườn rau Muống, ấp Trạm Bơm, Tân Phú Trung, Hóc Môn

CC5 Vườn Na, ấp Thượng, Tân Thông Hội, Hóc Môn

CC6 Vườn rau Thơm, ấp Tân Tiến, Tân Thông Hội, Hóc Môn

CC7 Vườn Thơm, ấp Chợ, Tân Phú Trung, Hóc Môn

CC8 Vườn Mía, ấp Tân Tiến, Tân Thông Hội, Hóc Môn

CC9 Vườn Xoài, ấp Trạm Bơm, Tân Phú Trung, Hóc Môn

CC10 Vườn Bí Đỏ, ấp Tân Tiến, Tân Thông Hội, Hóc Môn

Trang 25

3.3.2 Lấy mẫu

Mẫu đất được lấy ở các vùng trồng hoa màu ở Hóc Môn, Củ Chi, Bình Dương, mỗi vùng lấy 10 mẫu Đối với mỗi tỉnh vùng lấy 10 loại đất khác nhau nhằm mục đích xác định mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ trên từng vùng, từng loại cây từ đó đánh giá được loại đất và cây trồng nào thích hợp cho chủng vi khuẩn phân giải lân vô cơ phát triển Mẫu được lấy bằng cách: cào lấy phần đất cách mặt đất khoảng 2cm (lấy gần ở phần có rễ cây vì đó là nơi có chứa nhiều loại vi khuẩn sống có lợi)

3.3.3 Phân lập và chọn lọc

Phơi 10 g đất tươi ở nhiệt độ phòng (để loại bỏ bớt những vi sinh vật tạp) Cho

10 g đất đã phơi khô và 90 ml nước cất vô trùng vào bình tam giác 250ml, bỏ vào máy lắc để đồng nhất mẫu trong 15 phút, để yên vài phút sau khi lắc, sau đó hút 1 ml mẫu

và tiến hành pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 Hút 0,1 ml mẫu lần lượt ở các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 trải lên môi trường rắn PVK tương ứng và

ủ ở nhiệt độ phòng

3.3.4 Làm thuần vi khuẩn

Sử dụng môi trường PVK để làm thuần bằng 2 phương pháp: cấy ria và chấm thành từng điểm, thực hiện liên tiếp 3 – 4 lần

3.3.5 Bảo quản giống vi khuẩn

Sau khi giống vi khuẩn được làm thuần 3- 4 lần trên môi trường PVK tiến hành giữ giống trên môi trường PGA, môi trường này sau 3 tháng phải cấy chuyển một lần Ngoài ra chủng thuần còn được giữ trong Glycerol 35-50%, bảo quản trong điều kiện -20oC Thực hiện bằng cách: cắt 2 miếng thạch trên môi truờng PVK chứa 2

Trang 26

14

khuẩn lạc cho vào một ống nhỏ có chứa Glycerol 35-50% Giống được bảo quản trong glycerol có thể giữ được lâu dài từ 6 tháng trở lên

3.3.6 Khảo sát khả năng phân giải lân vô cơ

Nhằm xác định khả năng phân giải lân vô cơ khó tan của các chủng vi khuẩn vừa phân lập được, tạo điều kiện cho quá trình chọn lọc ra chủng tốt để tiến hành nhân

sinh khối Các chỉ tiêu ghi nhận là: đường kính vòng phân giải, thời gian tạo vòng

phân giải, hoat độ phân giải lân vô cơ khó tan trong quá trình phân lập và làm thuần Loại bỏ những chủng có hoạt tính phân giải lân yếu và giảm trong quá trình làm làm

thuần bảo cấy chuyển

Đo kích thước vòng phân giải

Dùng que tăm thu lấy sinh khối của chủng thuần và cấy thành các điểm riêng biệt trên môi trường thạch PVK, ủ ở nhiệt độ phòng Sau 2 ngày lấy ra quan sát vòng

phân giải và dùng thước đo để xác định kích thước vòng phân giải

Đếm khuẩn lạc

Vi khuẩn nuối cấy trên môi trường PVK, ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ chọn

những đĩa có từ 15 – 300 khuẩn lạc và đem đi đếm

N = ∑ C / [(n1+0,1n2) * d]

Trong đó:

C: là tổng số khuẩn lạc đếm trên các đĩa đã chọn

n1, n2: Số đĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ 1, thứ 2

d: là hệ số pha loãng của độ pha loãng thứ nhất

3.3.7 Quan sát hình thái

Nhằm xác định hình dạng, kích thước tế bào trên cơ sở đó sơ bộ phân chia các

nhóm vi khuẩn để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình định danh

Tiến hành

Quan sát sự phát triển và hình dạng của khuẩn lạc sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PVK nhằm ghi nhận hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi ở vật kính 40X và 100X Ghi nhận đặc điểm về hình thái, kích

thước của của tế bào vi khuẩn

3.3.8 Định danh vi khuẩn

Sau khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, chúng ta có thể thu được các khuẩn lạc đơn thuần khiết, còn gọi là “chủng thuần” Chủng thuần là yêu cầu cần cho việc

Trang 27

15

định danh các vi sinh vật Việc định danh này được thực hiện dựa trên các đặc điểm về kiểu hình, cùng với các đặc tính sinh lý, sinh hóa cũng như khả năng biến dưỡng một

số cơ chất của các chủng vi sinh vật phân lập được, trong đó quan trọng nhất là các thử

nghiệm sinh hóa

3.3.8.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái

Đo kích thước tế bào

Sau khi nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm Crytal Violet, quan sát dưới kính hiển vi ở

vật kính 40X, và 100X, sử dụng kính trắc vi thị kính, vật kính để đo kích thước tế bào

Thử nghiệm Gram

Phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng lưu giữ phẩm màu Crystal Violet trên thành tế bào

vi khuẩn sau khi rửa bằng cồn Vi khuẩn Gram dương có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan, nhờ đó mà màu tím của Crytal Violet được gắn chắc vào tế bào (nhờ iodine) nên không bị khử bởi cồn, do đó vẫn giữ được màu thuốc nhuộm ban đầu Còn

vi khuẩn Gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn), nhưng lại

có nồng độ lipid cao, khi rửa bằng cồn lớp chất béo này sẽ bị hòa tan kéo theo màu của thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt với màu hồng đỏ của thuốc nhuộm Fuschin Như vậy, sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram âm có màu hồng đỏ; còn vi khuẩn Gram dương có màu tím

Các bước thực hiện: Nhỏ sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường PVK sau 24 giờ lên lam kính sạch (nếu mật độ vi khuẩn quá dày đặc thì có thể pha loãng ra) cố định tiêu bản vi khuẩn bằng ngọn lửa đèn cồn Nhuộm mẫu bằng dung dịch tím tinh thể (Crystal Violet) trong 3 phút, rửa lại bằng nước Nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa lại bằng nước Rửa mẫu bằng ethanol 95%: aceton (1:1) trong 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước Nhuộm tiếp mẫu bằng dung dịch Fuschin Ziehl trong 30-60 giây, rửa lại bằng nước Để khô, quan sát sự bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi

Phương pháp String test

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng tạo nhầy (kéo sợi) giữa sinh khối của vi khuẩn với dung dịch KOH 3% Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng, vách tế bào của vi khuẩn Gram âm bị phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhầy (kéo sợi) String

Trang 28

Khả năng di động

Nguyên tắc: Vi khuẩn có thể di động nhờ cấu trúc protein, gọi là tiên mao (flagella) Đây có thể là một trong những căn cứ dùng để phân biệt các vi sinh vật Các bước thực hiện: Có thể ghi nhận khả năng di động của bằng 2 phương pháp Phương pháp 1: Thử nghiệm trong môi trường thạch mềm LDC Nếu vi khuẩn mọc theo đường cấy và lan ra cả bên ngoài đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động Ngược lại, nếu vi khuẩn chỉ mọc theo đường cấy mà không lan ra ngoài thì không có khả năng di động Tuy nhiên, hiện tượng quan sát được không rõ, vì vậy cần tiến hành thí nghiệm 2

Phương pháp 2: Quan sát các tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi: dàn đều sinh khối

vi khuẩn lên giọt nước trên lam kính sạch, và quan sát sự di động của tế bào vi khuẩn

3.3.8.2 Đặc điểm sinh hóa

Khảo sát hoạt tính Catalase

Nguyên tắc: Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi điện tử tạo H2O2 Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và giải phóng O2, gây hiện tượng sủi bọt khí

Thử nghiệm urease

Nguyên tắc: Dựa trên khả năng tổng hợp enzyme urease, xúc tác sự thủy phân urea, giải phóng NH3 và CO2, làm tăng pH của môi trường, đổi màu Phenol - Red Phản ứng

(+) khi có màu đỏ cánh sen

Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

Nguyên tắc: Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2, đồng thời phân giải muối ammonium, sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường, làm đổi màu của chất chỉ

thị bromothymol blue

Trang 29

17

Thử nghiệm khả năng sinh Indole

Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amine có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật

có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p-Dimethylaminpobenzaldehyde (p-DMABA) Nhân pyrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ

kết hợp với nhân benzen của p-DMABA tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ Thử nghiệm Voges-Proskauer

Nguyên tắc: Trong điều kiện có oxy và pH kiềm, 2,3-butanediol bị chuyển hóa thành acetonin, và acetonin tiếp tục bị oxy hóa thành diacetyl dưới sự xúc tác của –naphthol Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong pepton kết tụ thành phức

này thông qua sự đổi màu của phần sâu và phần nghiêng Nếu vi sinh vật sử dụng

sucrose thì sau 18 giờ phần nghiêng sẽ có pH acid và có màu vàng Nếu sinh vật chỉ lên men glucose: sau 24– 48 giờ nuôi cấy phần môi trường bề mặt ống thạch nghiêng trở nên có pH kiềm Do chỉ thị trong môi trường là phenol red nên bề mặt thạch

nghiêng sẽ có màu đỏ và phần sâu sẽ có màu vàng Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả

glucose và lactose, thì sau 24 – 48 giờ nuôi thì toàn bộ môi trường đều trở nên có pH acid, môi trường biến thành màu vàng hoàn toàn Nếu vi sinh vật không sử dụng cả 3 ngưồn cacbon này thì bề mặt ống thạch nghiêng trở nên bị kiềm hoá trở nên có màu đỏ

do vi sinh vật sử dụng pepton cho sự chuyển hoá năng lượng, phần sâu không có hiện

tượng đổi màu

Thử nghiệm Methyl Red

Nguyên tắc: Nhằm phân biệt vi sinh vật dựa trên sự khác biệt dựa trên khả năng tạo

ra và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có tính acid bền trong môi trường trong quá

trình lên men glucose

Trang 30

18

Thử nghiệm khả năng sinh H 2 S

Nguyên tắc: Một số vi sinh vật tổng hợp được enzyme desulfohydrase xúc tác sự chuyển hoá trong điều kiện kỵ khí các acid amin chứa lưu huỳnh như: cysteine, cystin, methionine và giải phóng H2S Thành viên quan trọng nhất của nhóm enzyme này là cysteine desulfohydrase Các acid amin này là sản phẩm của quá trình thuỷ phân protein thành acid amin Khí H2S sinh ra sẽ tạo tủa màu đen với chất chỉ thị sulfide

chứa trong môi trường nuôi cấy

3.3.9 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố (pH, thời gian) của quá trình nhân sinh khối

Nhằm xác định được pH tối ưu và thời gian thích hợp để thu được mật số vi khuẩn phân giải lân cao nhất Qua đó đánh giá được môi truờng tối ưu nhất cho việc nhân sinh khối: nhanh, rẻ tiền, tiết kiệm chi phí để ứng dụng nhân sinh khối ở qui mô lớn

Trang 31

19

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập và làm thuần

Từ 40 mẫu đất thu nhận ở 4 vùng Đồng Nai, Bình Dương, Hóc Môn, Củ Chi

Chúng tôi đã tiến hành phân lập và làm thuần trên môi trường PVK rắn Kết quả chúng tôi đã thu nhận được 50 chủng thuần và xác định được mật số vi khuẩn phân giải lân

vô cơ ở từng vùng

Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ cao nhất ở tỉnh Đồng Nai, mẫu đất thu được

ở Đồng Nai có sự đa dạng về chủng loại, tiếp đến là tỉnh Bình Dương, huyện Hóc

Môn, và mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ thấp nhất là ở huyện Củ Chi

Bảng 4.1 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Đồng Nai

Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau không giống nhau thì có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05)

Số thứ tự Mẫu Mật số vi khuẩn (10 4 CFU/g) Sự khác biệt

Trang 32

20

Mật độ vi khuẩn phân giải lân ở tỉnh Đồng Nai tương đối cao, cao nhất ở vùng DN7 (đất vườn trồng Chôm Chôm, ấp Lê Lợi, xã Quang Trung, huyện Thống Nhất, tỉnh Đồng Nai) với mật số là 31,90 x 104 (CFU/g) Trong quá trình lấy mẫu, quan sát thấy đất ở khu vực này là đất cát pha thịt, độ ẩm cao Đối với vùng DN8 (đất vườn trồng Cải, ấp Lê Lợi, xã Quang Trung huyện Thống Nhất) cũng cho mật số vi khuẩn phân giải lân cao là 28,53 x 104 (CFU/g), đất ở đây cũng là đất cát pha thịt, độ ẩm cao, gần khu vực sông Do vậy, loại đất cát pha thịt ở khu vực ấp Lê Lợi, xã Quang Trung , huyện Thống Nhất thích hợp cho nhóm vi khuẩn phân giải lân vô cơ phát triển Trong khi đó, mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ thấp nhất ở DN5 (đất vườn trồng Cao Su, quốc lộ 1A, thị trấn Trảng Bom) là 5,37 x 104 (CFU/g), đây là loại đất cát pha thịt nhưng tỷ lệ cát cao, độ ẩm thấp Đồng thời đất ở DN4 (đất trồng Cà Phê, ấp Lê Lợi,

xã Quang Trung, huyện Thống Nhất) cũng có mật số rất thấp là 5,30 x 104 (CFU/g), đất ở đây là loại đất đỏ

Bảng 4.2 Mật độ vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Bình Dương

Trang 33

21

Đất ở tỉnh Bình Dương được khẳng định là tốt nhất cho sự phát triển của vi khuẩn phân giải lân Đối với vùng BD2 (đất vườn Nhãn, vườn cây Ba Tâm, ấp Hưng Thọ, xã Hưng Thịnh) có mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ cao nhất là 28,57 x 104 (CFU/g), đây là loại đất thịt rất tươi xốp, có màu đen Hơn nữa, mẫu đất được lấy ở gần vị trí rễ nên có chứa nhiều loại vi khuẩn có ích Các mẫu đất tiếp theo cũng cho mật độ vi khuẩn phân giải lân vô cơ tương đối cao như: BD1, BD4, BD6, đất ở các vùng này cũng giống với đất ở vườn cây Ba Tâm là loại đất thịt màu đen, độ ẩm cao, đều được lấy rất gần với rễ cây Do vậy, loại đất thịt màu đen, có độ ẩm cao ở tỉnh Bình Dương cho mật số vi khuẩn phân giải vô cơ cao hơn cả tỉnh Đồng Nai Hệ vi khuẩn phân giải lân hiện diện nhiều ở vùng rễ của các loại đất và cây trồng này Trong khi đó mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ thấp nhất ở BD3 (đất trồng bưởi, ấp Chi Liêu, xã Tân Đông Hiệp, huyện Dĩ An) là 4,90 x 104 (CFU/g), đây là đất loại đất cát gần lưu vực sông Đồng thời đất ở vùng BD7 cũng cho mật số tương đối thấp, đất ở đây khô cứng (thiếu nước) Loại đất ở các vùng này không phù hợp cho các chủng vi khuẩn phân giải lân vô cơ phát triển

Bảng 4.3 Mật độ vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở huyện Hóc Môn

Trang 34

22

Đất ở huyện Hóc Môn có mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ thấp Mật số cao nhất được ghi nhận ở 2 vùng HM5 và HM4 đây là các mẫu đất lấy ở gần rễ của cây Bắp và rau Bạc Hà, với mật số HM5: 26,63 x 104 (CFU/g), HM4: 28,90 x 104 (CFU/g) Các mẫu đất được lấy ở huyện Củ Chi không thích hợp cho sự phát triển của các chủng vi khuẩn phân giải lân vô cơ so với các mẫu đất lấy ở Đồng Nai và Bình Dương

Bảng 4.4 Mật độ vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở huyện Củ Chi

Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở Củ Chi là thấp nhất so với Đồng Nai, Bình Dương, Hóc Môn Có sự chênh lêch lớn về mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ giữa CC10 và các vùng còn lại Vùng CC10 (đất trồng Bí Đỏ, ấp Chi Liêu, xã Tân Đông Hiệp) có mật số cao nhất là 20,13 x 104 (CFU/g) Trong khi đó vùng CC7 (đất trồng thơm, ấp chợ, xã Tân Phú Trung) có mật số thấp nhất là 2,03 x 104 (CFU/g), đây là đất cát có bổ sung phân chuồng

Khả năng phân giải lân vô cơ của các chủng vi khuẩn khác nhau, do vậy để tìm

ra những chủng mạnh nhất thì cần phải tiến hành khảo sát vòng phân giải trên môi trường chọn lọc PVK Kết quả chọn ra 11 chủng vi khuẩn tiêu biểu phân giải lân vô cơ mạnh nhất đáp ứng đầy đủ những tiêu chí sau: đường kính vòng phân giải lân vô cơ lớn, thời gian tạo vòng phân giải ngắn, hoat độ phân giải lân vô cơ khó tan trong quá trình phân lập và làm thuần ổn định

Trang 35

23

Bảng 4.5Kích thước vòng phân giải lân vô cơ của 11 chủng vi khuẩn tiêu biểu

Đây là các chủng vẫn còn giữ đươc hoạt tính phân giải lân cao trong quá trình làm thuần và giữ giống, thời gian tạo vòng phân giải nhanh Chủng DN7, BD6, DN1 sau 24 giờ đã tạo được vòng phân giải có kích thước 9 -11 mm Từ biểu đồ 4.4 ta thấy kích thước vòng phân giải lân vô cơ của chủng DN7 là cao nhất với đường kính vòng phân giải là 11mm Do vậy DN7 là chủng phân giải lân mạnh nhất, đồng thời các chủng DN1, BD6 cũng phân giải lân vô cơ mạnh với kích thước vòng phân giải lần lượt là: 10,67 mm, 10,33 mm

Chủng cho vòng phân giải thấp nhất là HM2 với đường kính vòng phân giải là: 6,17 mm Đây là chủng phân giải lân vô cơ yếu nhất so với 10 chủng còn lại

phân giải (mm)

Sự khác biệt

DN7 Vườn trồng Chôm Chôm - Đồng Nai 11,00 ± 2,51 a

BD6 Vườn trồng Bòn Bon – Bình Dương 10,33 ± 3,79 a

BD4 Vườn trồng cây Dầu – Bình Dương 9,00 ± 1,24 b

HM1 Vườn trồng Bông Cải – Hóc Môn 6,20 ± 0,86 c

Trang 36

24

4.2 Kết quả phân nhóm 11 chủng vi khuẩn phân giải lân vô cơ tiêu biểu

Dựa vào hình dạng tế bào, kết quả nhuộm Gram và các phản ứng sinh hóa, 11 chủng vi khuẩn trên được chia thành 3 nhóm

Nhóm 1 Trực khuẩn, G -, nhóm này gồm 5 chủng: DN7, BD6, DN2, BD4, HM1 Các chủng vi khuẩn nhóm này có đặc điểm chung là khuẩn lạc có hình dạng tròn,

tế bào có dạng hình que, vách tế bào mỏng do vậy khi nhuộm Gram bắt màu hồng

Bảng 4.6 Đặc điểm hình thái của các chủng nhóm 1

Hình 4.1 Nhuộm Gram vi khuẩn nhóm 1 ở vật kính 100X a: chủng DN7, b: chủng BD6.

Chủng Hình dạng

khuẩn lạc Màu sắc

Hình dạng

tế bào Kích thước tế bào (μm)

DN7 Tròn, trơn Trắng sữa Que 1,12 ± 0,23 x 5,06 ± 1,12BD6 Tròn, trơn Trắng đục Que 1,51 ± 0,25 x 4,05 ± 0,33DN2 Tròn, trơn Trắng sữa Que 0,90 ± 0,11 x 2,20 ± 0,55BD4 Tròn, trơn Vàng Que 0,92 ± 0,10 x 2,05 ± 0,51HM1 Tròn, nhăn Vàng Que 1,01 ± 0,21 x 5,02 ± 1,02

Trang 37

25

Bảng 4.7 Đặc điểm sinh hoá của các chủng nhóm 1

Hình 4.2 Kết quả phản ứng sinh hóa 2 chủng nhóm 1. a: chủng DN7, b: chủng BD6 Từ trái sang phải theo thứ tự là các phản ứng: TSI, MR, Indol, Urease, VP, Citrate, Gelatinase

Chủng

Các phản ứng sinh

Kéo sợi + + + + +

Di động + + + + + Catalase + + + + + Glucose + - + - + Sucrose - - - - - Lactose - - -

Indol - - - - Urease + + - + -

Citrate + + + - -

Gelatin + + - + -

Trang 38

26

Nhóm 2: Trực khuẩn G +, sinh bào tử, nhóm này gồm các chủng HM2, BD10, BD8 Các chủng vi khuẩn nhóm này có đặc điểm chung là khuẩn lạc có dạng bất định, màu vàng kem, tế bào có dạng hình cầu, vách tế bào dày do vậy khi nhuộm Gram bắt màu tím

Các vi khuẩn thuộc nhóm 2 phân giải lân vô cơ yếu hơn các vi khuẩn nhóm 1 và nhóm 3

BD8 Răng cưa, có

nhân vàng Vàng kem Cầu 1,05 ± 0,32 x 3,21 ± 0,98

Trang 39

27

Bảng 4.9 Đặc điểm sinh hoá của các chủng nhóm 2

Hình 4.4 Kết quả phản ứng sinh hóa của 2 chủng nhóm 2 a: chủng BD10 b: chủng HM2

Từ trái sang phải theo thứ tự là các phản ứng: TSI, MR, Indol, Urease, VP, Citrate, Gelatinase

Chủng Các phản

Trang 40

28

Nhóm 3: Cầu khuẩn (tế bào xếp thành chuỗi), G+

Các chủng vi khuẩn nhóm này có đặc điểm chung là khuẩn lạc có dạng tròn, màu vàng kem và trắng sữa, tế bào xếp thành chuỗi, vách tế bào dày do vậy khi nhuộm Gram bắt màu tím

Hình 4.5 Nhuộm Gram của các chủng vi khuẩn thuộc nhóm 3 ở vật kính 100X

Xếp thành chuỗi 1,53± 0,51 x 6,12 ± 1,12

Định dạng
Số trang	114
Dung lượng	1,14 MB