THIẾT LẬP KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR

Mục tiêu: Sử dụng phương pháp multiplex PCR để xác định giới tính trước chẩn đoán đột biến DMD và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD.. Đối tượn

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH

LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR

Sinh viên thực hiện : PHẠM NGỌC KHÔI Niên khoá : 2005 – 2009

Tháng 8/2009

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH

LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện Th.S NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN PHẠM NGỌC KHÔI PGS.TS TRẦN THỊ DÂN

Tháng 8/2009

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn đến:

Ban Giám Hiệu, Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng với các Thầy Cô đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt bốn năm học vừa qua tại Trường Ban Chủ nhiệm Phòng Di truyền – Bệnh viện Từ Dũ TP.HCM đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp này

Th.S Nguyễn Khắc Hân Hoan và PGS.TS Trần Thị Dân đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức quý giá và chân thành động viên tôi trong khoảng thời gian thực hiện Khóa luận tốt nghiệp này

Tập thể Y – Bác sĩ, Thầy Cô và Anh Chị – Phòng Di truyền đã tận tâm chỉ bảo, đóng góp nhiều ý kiến quý báu, hết lòng hỗ trợ và đã cầm tay chỉ việc cho tôi trong suốt khoảng thời gian thực hiện Khóa luận này tại Phòng Di truyền

TS Trần Vân Khánh (Labo Trung tâm Y Sinh học – Đại học Y Hà Nội), Th.S Nguyễn Thị Băng Sương (Bộ môn Hóa sinh – Đại học Y khoa Huế), Th.S Ngô Diễm Ngọc (Bệnh viện Nhi Trung ương), KS Nguyễn Thị Phương Mai (Bệnh viện Nhi Trung ương), Th.S Thái Hạnh Quyên (Công ty TNHH BCE Việt Nam) và Ông Robert Schuit (MRC – Holland, Amsterdam, Hà Lan) đã nhiệt tình góp ý, truyền đạt những kinh nghiệm quý giá để tôi có thể hoàn thành tốt Khóa luận tốt nghiệp này

CN Phan Thị Thùy Ngân, BS Nguyễn Minh Đức và Anh Chị tại Trung tâm Y khoa Phước An (HEPA) đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi vào thời điểm cuối của Khóa luận Tập thể lớp DH05SH cùng với những người bạn thân của tôi, những người bạn đã gắn bó, chia sẻ cùng tôi những buồn vui trong suốt quá trình học tập của tôi cũng như đã hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện Khóa luận này

Và trên tất cả là lời ghi ơn sâu sắc nhất xin được dành cho Ba Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục, dạy dỗ để tôi có được như ngày hôm nay, với tất cả sự kính trọng, niềm tự hào và lòng biết ơn chân thành nhất

TP.HCM, ngày 25 tháng 08 năm 2009

TÓM TẮT

Loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là một trong những bệnh thần kinh – cơ di truyền phổ biến nhất với tỷ lệ mới mắc là 1/3500 trẻ

trai đẻ sống Bệnh DMD có bản chất là do đột biến gen dystrophin trên nhiễm sắc

thể giới tính X Hơn 65% trường hợp là đột biến mất hoặc lặp đoạn gen Kỹ thuật MLPA gần đây được cho là chẩn đoán mất đoạn gen rất hiệu quả

Mục tiêu: Sử dụng phương pháp multiplex PCR để xác định giới tính trước chẩn đoán đột biến DMD và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Hai mươi mẫu DNA của bệnh nhân được dùng để xác định giới tính và hai mươi mẫu DNA của bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng là bệnh DMD/BMD và đã được phát hiện đột biến mất đoạn gen bằng multiplex PCR Bảy mươi chín exon của gen được khảo sát bằng kit SALSA®MLPA® P034 – A2 và P035 – A2, điện di mao quản bằng CEQTM 8000 và phân tích

tự động bằng phần mềm Gene Marker

Kết quả: Đã hoàn thiện kỹ thuật multiplex PCR để xác định giới tính và phương pháp MLPA cho phép xác định chính xác kích thước của đoạn DNA bị đột biến, kỹ thuật phân tích dễ dàng, trực quan, nhanh và có độ lặp lại cao Tất cả exon của gen DMD bị mất đều được khẳng định trên biểu đồ kết quả Bộ ba multiplex PCR chẩn đoán trước đó chỉ khảo sát được hai mươi lăm exon và có những exon không được phát hiện so với MLPA

Kết luận: Kỹ thuật multiplex PCR dùng để xác định giới tính chính xác, đặc hiệu; và phương pháp MLPA giúp phát hiện nhanh chóng, toàn diện các đột biến mất đoạn gen DMD và ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR

SUMMARY

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common genetic neuromuscular disorders affecting 1/3500 live man births DMD is caused by

mutation in the X – linked dystrophin gene More than 65% of cases are deletion or

duplication mutation Recently, MLPA is described as an effective method to detect these mutations

Objective: To set up multiplex PCR that determines the sex and evaluate the effectiveness of MLPA in detecting DMD gene deletion mutations

Method: Twenty DNA samples of patient that were used to determine the sex and twenty DNA samples of patient having clinical signs of DMD/BMD detected the deletion mutations by multiplex PCR, which were tested for seventy nine exons with SALSA® MLPA® P034 – A2 and P035 – A2 kit, capillary electrophoresis with CEQTM 8000 and automated analysis with Gene Marker software

Results: The multiplex PCR method to determine the sex and the MLPA protocol to detect the size of DNA fragment lost were optimized The techniques are easy, visual, rapid and reproducible All deleted exons were present in electropherogram results The previous set of three multiplex PCR only detects twenty five exons and some exons can not be found by this set in comparison with MLPA

Conclusion: The multiplex PCR method determined the sex exactly and specifically; and the MLPA helps to rapid detect all deletions of DMD gene and has more advantage than the multiplex PCR

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các hình xii

Danh sách các biểu đồ và lưu đồ xiii

Danh sách các bảng xiv

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD 3

2.2 Tổng quan về bệnh DMD 3

2.3 Nguyên nhân gây bệnh 6

2.3.1 Gen dystrophin và các sản phẩm của nó 6

2.3.2 Chức năng của dystrophin 10

2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh DMD 11

2.4.1 Phương pháp chẩn đoán điện 11

2.4.1.1 Đo tốc độ dẫn truyền vận động 11

2.4.1.2 Điện cơ 11

2.4.2 Kiểm tra creatine kinase 11

2.4.3 Sinh thiết cơ 12

2.4.4 Hóa mô miễn dịch 12

2.4.5 Western blot 12

2.5 Chẩn đoán di truyền phân tử 13

2.5.1 Multiplex PCR 13

2.5.2 Southern blot 14

2.5.3 DGGE 14

2.5.4 MAPH 15

2.5.5 MLPA 15

2.5.6 Phân tích liên kết gen 17

2.5.6.1 RFLP 17

2.5.6.2 STR 18

2.5.7 FISH 18

2.5.8 RT – PCR 18

2.5.9 PTT 20

2.6 Chẩn đoán trước sinh 20

2.7 Điều trị 20

2.8 Tổng quan nghiên cứu bệnh DMD trên thế giới 21

2.9 Tổng quan nghiên cứu bệnh DMD tại Việt Nam 21

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26

3.2 Nội dung nghiên cứu 26

3.3 Vật liệu 26

3.3.1 Xác định giới tính bằng multiplex PCR 26

3.3.1.1 Mẫu bệnh phẩm 26

3.3.1.2 Mồi 26

3.3.1.3 Hóa chất cho tách chiết DNA 27

3.3.1.4 Hóa chất cho phản ứng multiplex PCR 27

3.3.1.5 Hóa chất cho điện di trên gel agarose 27

3.3.1.6 Thiết bị – Dụng cụ 28

3.3.2 Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA 29

3.3.2.1 Mẫu bệnh phẩm 29

3.3.2.2 SALSA® MLPA® Kit P034 – A2 / P035 – A2 DMD / Becker 29

3.3.2.3 Hóa chất cho điện di mao quản trên máy CEQTM 8000 30

3.3.2.4 Thiết bị – Dụng cụ 31

3.4 Phương pháp nghiên cứu 31

3.4.1 Xác định giới tính bằng multiplex PCR 31

3.4.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu 31

3.4.1.2 Phương pháp tách chiết DNA 32

3.4.1.3 Phương pháp multiplex PCR 32

3.4.1.4 Đảm bảo chất lượng phản ứng 33

3.4.1.5 Phương pháp điện di trên gel agarose 34

3.4.2 Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA 34

3.4.2.1 Bảo quản mẫu 34

3.4.2.2 Phương pháp MLPA 34

3.4.2.3 Đảm bảo chất lượng phản ứng 36

3.4.2.4 Điện di MLPA bằng hệ thống điện di mao quản CEQTM 8000 36

3.4.2.5 Phương pháp phân tích kết quả 37

3.4.3 Đề xuất lưu đồ tầm soát trước sinh 37

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Kết quả 38

4.1.1 Xác định giới tính bằng multiplex PCR 38

4.1.2 Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA 42

4.1.3 Đề xuất lưu đồ tầm soát trước sinh 51

4.2 Thảo luận 51

4.2.1 Xác định giới tính bằng multiplex PCR 51

4.2.2 Chẩn đoán đột biến mất đoạn gen DMD bằng MLPA 52

4.2.3 Đề xuất lưu đồ tầm soát trước sinh 55

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57

5.1 Kết luận 57

5.2 Đề nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 62

DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis

DSCP Double strand conformation polymophism

dATP 2’ – deoxyadenosine – 5’ – triphosphate

dCTP 2’ – deoxycytidine – 5’ – triphosphate

dGTP 2’ – deoxyguanosine – 5’ – triphosphate

dNTP 2’ – deoxyribonucleotide – 5’ – triphosphate

dTTP 2’ – deoxythymidine – 5’ – triphosphate

EDTA ethylene diamine tetraacetic acid

FISH Fluorescent in situ hybridization

HDA Heteroduplex analysis

MAPH Multiplex amplifiable probe hybridisation

MK marker

MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification

mRNA messenger ribonucleic acid

NIL nihil (Latin), nothing hay zero

PTT Protein truncation test

RFLP Restriction fragment length polymorphism

RT – PCR Reverse transcriptase – PCR

STR Short tandem repeat

SNP Single nucleotide polymorphism

SSCP Single strand conformation polymophism

STT số thứ tự

UV ultraviolet

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Kiểu di truyền của bệnh DMD 4

Hình 2.2 Chuyển đoạn Xp21 giữa NST X và NST 21 5

Hình 2.3 So sánh giữa dạng bình thường với DMD và BMD 6

Hình 2.4 Vị trí protein dystrophin trên mặt trong màng tế bào cơ vân .7

Hình 2.5 Vị trí locus Xp21 7

Hình 2.6 Chuỗi gen dystrophin 9

Hình 2.7 Dystrophin liên kết với phức hệ glycoprotein định vị ở màng bao cơ 10

Hình 2.8 So sánh kỹ thuật MLPA với các kỹ thuật sinh học phân tử khác 16

Hình 2.9 Quy trình kỹ thuật MLPA 17

Hình 2.10 Thủ thuật chọc ối 20

Hình 3.1 Bộ ly trích DNA của Roche 27

Hình 3.2 Máy ly tâm 28

Hình 3.3 Máy ủ nhiệt 28

Hình 3.4 Máy định lượng DNA 28

Hình 3.5 Máy luân nhiệt 28

Hình 3.6 Bể điện di 29

Hình 3.7 Máy chụp hình gel 29

Hình 3.8 Các bộ hóa chất cho điện di mao quản 30

Hình 3.9 Máy CEQTM 8000 31

Hình 3.10 Hệ thống 8 mao quản 31

Hình 3.11 Đĩa đựng mẫu 31

Hình 3.12 Nắp đĩa Buffer 31

Hình 3.13 Wetting Tray 31

Hình 3.14 Nguyên lý hoạt động của hệ thống điện di mao quản CEQTM 8000 36

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát gen SRY trên 10 mẫu máu 39

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát gen SRY trên 10 mẫu ối 41

Hình 4.3 Kết quả đột biến mất exon bằng ba bộ multiplex A, B và C 43

Hình 4.4 Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P034 – A2 (1) 47

Hình 4.5 Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P034 – A2 (2) 47

Hình 4.6 Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P035 – A2 (1) 48

Hình 4.7 Kết quả phân tích mẫu 8029 bằng Probemix P035 – A2 (2) 48

Hình 4.8 Kết quả phân tích mẫu chứng nam bằng Probemix P034 – A2 49

Hình 4.9 Kết quả phân tích mẫu chứng nam bằng Probemix P035 – A2 49

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ VÀ LƯU ĐỒ BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1 Vùng mất đoạn các exon của gen DMD 51

LƯU ĐỒ Trang Lưu đồ 4.1 Lưu đồ tư vấn và tầm soát trước sinh bệnh DMD 56

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Trình tự 4 đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng multiplex PCR 27

Bảng 3.2 Thành phần bộ kit SALSA® MLPA® (100 phản ứng) 30

Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng multiplex PCR xác định giới tính 33

Bảng 3.4 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng multiplex PCR 33

Bảng 3.5 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng MLPA 35

Bảng 4.1 Danh sách bệnh nhân làm bộ NST đồ karyotype 38

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát gen SRY của bệnh nhân làm karyotype 39

Bảng 4.3 Danh sách thai nhi làm kỹ thuật FISH 40

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát gen SRY của thai nhi làm kỹ thuật FISH 41

Bảng 4.5 Danh sách gia đình mắc DMD cùng với đột biến đã chẩn đoán 42

Bảng 4.6 Kích thước của 25 exon được khuếch đại trong 3 bộ multiplex PCR 42

Bảng 4.7 Danh sách 18 bệnh nhân DMD cùng với đột biến đã chẩn đoán 43

Bảng 4.8 Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P034 – A2 44

Bảng 4.9 Kết quả chẩn đoán DMD bằng Probe P035 – A2 45

Bảng 4.10 Danh sách bệnh nhân DMD bị đột biến mất exon (MLPA) 50

Bảng 4.11 Tần suất mất đoạn các vùng exon của gen DMD 50

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là một

bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính Bệnh gây nên bởi sự đột biến gen dystrophin,

gen này nằm ở vị trí Xp21 trên NST X, và đến bây giờ chúng được biết như là một gen lớn nhất trong cơ thể người với chiều dài hơn 2400 kb, mã hóa bản phiên mã mRNA dài 14 kb, bao gồm 79 exon và 99,4% cấu trúc gen là intron Protein mã hóa bởi gen này là dystrophin với khối lượng phân tử là 427 kDa, có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định của màng cơ Bệnh DMD là bệnh cơ rất nặng, hầu hết những trẻ trai mắc bệnh đều có triệu chứng suy yếu cơ tiến triển, cuối cùng dẫn đến tàn phế, mất khả năng đi lại ở lứa tuổi 12 và tử vong ở lứa tuổi 20 – 25 do tổn thương cơ tim và rối loạn

hô hấp

Bệnh DMD chiếm tỷ lệ cao nhất trong số nhóm bệnh di truyền về thần kinh cơ (1/3500 trẻ trai) và gây hậu quả nặng nề cho gia đình người bệnh cùng cộng đồng xã

hội Cho đến nay bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định hoàn tất

với hai vùng đột biến mất đoạn trọng điểm (hotspot region) là vùng 5’ tận cùng (vùng exon 3 – 19) và vùng trung tâm (vùng exon 45 – 52) chiếm trên 60% tỷ lệ đột biến, đột biến điểm đứng thứ 2 chiếm 25 – 30%, còn lại là đột biến lặp đoạn chiếm tỷ lệ khoảng

10 – 15%

Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu ở mức độ phân tử Tuy nhiên, do khó khăn trong việc tách chiết RNA tổng số từ máu tươi, những nghiên cứu này mới chỉ xác định đột biến ở mức DNA Do chỉ mới sử dụng 19 cặp mồi để khuếch đại 19 exon hay xảy ra đột biến mất đoạn nên kết quả chỉ phát hiện được gần 40% số bệnh nhân có đột biến mất đoạn so với tỷ lệ thường gặp là 60% Điều này chứng tỏ rằng khoảng 20% đột biến nằm ở ngoài vùng 19 exon hay xảy ra đột biến mất đoạn trên bệnh nhân DMD được nghiên cứu ở Việt Nam

Trong khi đó nếu chẩn đoán bệnh DMD bằng kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) thì có thể khuếch đại được toàn bộ chiều dài

gen dystrophin Xác định đột biến bằng kỹ thuật MLPA có thể xác định được toàn bộ đột biến mất đoạn và lặp đoạn trên gen dystrophin ở bệnh nhân DMD Bên cạnh đó, vì

bệnh DMD hầu hết chỉ xảy ra ở các trẻ trai vì thế nếu xây dựng được quy trình xác định giới tính thì ta có thể sàng lọc được bệnh ở giai đoạn đầu mà không cần đến việc phải chẩn đoán đột biến về sau

Việt Nam hiện có tần suất bệnh khá cao, chi phí điều trị lại quá lớn trong khi nước ta nguồn lực lại có hạn vì thế không thể nào kham nổi chi phí này Do đó, chẩn đoán trước sinh là biện pháp hiệu quả làm giảm gánh nặng bệnh tật lên xã hội Vì thế việc thành lập một chương trình phòng chống bệnh DMD với những kỹ thuật di truyền thích hợp tại Việt Nam là hết sức cần thiết

Hiện tại, Phòng Di truyền – Bệnh viện Từ Dũ TP.HCM đang bắt đầu triển khai

áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định các đột biến gây bệnh DMD trong chẩn đoán trước sinh Khóa luận này nằm trong khuôn khổ của nghiên cứu trên, được thực hiện tại Phòng Di truyền – Bệnh viện Từ Dũ TP.HCM từ ngày 05/02/2009 đến

ngày 05/06/2009 và được mang tên là “Thiết lập kỹ thuật chẩn đoán bệnh loạn dưỡng

cơ Duchenne dựa trên phản ứng PCR”

1.2 Yêu cầu nghiên cứu

Khóa luận này được tiến hành với mục tiêu xây dựng quy trình xác định chính

xác giới tính thai nhi và quy trình MLPA phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin

1.3 Nội dung nghiên cứu

Xây dựng protocol cho phản ứng multiplex PCR xác định giới tính thai nhi

Sử dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán các loại đột biến gen dystrophin gây nên

bệnh DMD, và so sánh kết quả chẩn đoán bằng MLPA với kết quả chẩn đoán trước đó của Bệnh viện Nhi Trung ương dùng kỹ thuật multiplex PCR với 25 cặp mồi đặc hiệu Thiết lập quy trình chẩn đoán bệnh DMD trước sinh

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD

Bác sĩ Edward Meryon người Anh là người đầu tiên đã mô tả chi tiết về 8 trẻ trai trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà hiện nay gọi là bệnh DMD Đến năm 1861, nhà thần kinh học người Pháp Guillaume Benjamin Amand Duchenne mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai, phân biệt với các bệnh cơ khác nhau và sau đó, bệnh được mang tên ông Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen

dystrophin đã được phát hiện đầy đủ gồm 79 exon với kích thước 2400 kb Đến nay,

cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càng được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen

đã và đang được các nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng nề của bệnh

2.2 Tổng quan về bệnh DMD

Theo Nguyễn Hữu Công (2006), bệnh DMD nằm trong nhóm bệnh loạn dưỡng cơ với năm đặc trưng: bệnh có tính di truyền; tất cả các triệu chứng đều là do yếu cơ gây nên, không có biểu hiện của mất phân bố thần kinh, không rối loạn cảm giác; yếu cơ tăng tiến không ngừng; các triệu chứng chủ yếu khu trú ở các cơ vân, đôi khi cũng có thể gặp ở cơ trơn và cơ tim; mô học chỉ có biểu hiện bệnh của tế bào cơ (thoái hóa và tái sinh tế bào cơ) mà không có hiện tượng tích lũy các sản phẩm chuyển hóa bất thường Bệnh DMD do rối loạn gen DMD nằm trên nhiễm sắc thể X Đặc trưng của bệnh là thoái hóa cơ không ngừng và không hồi phục, khởi đầu từ những thay đổi vi mô ở các cơ,

cơ không cân xứng ở hai bên, sức cơ yếu dần, cuối cùng là liệt mềm và xơ hóa của cơ Bệnh có đặc điểm di truyền gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể X Cá thể nữ 46,XX mang gen bệnh là người có một NST X mang gen đột biến Người nữ mang gen thường không biểu hiện bệnh nhưng lại có 50% khả năng truyền gen đột biến này cho con trai hoặc cho con gái Một số trường hợp hiếm có thể gặp bé gái có biểu hiện bệnh

do bé gái đó chỉ có một NST X (hội chứng Turner – 45,X), hay do hiện tượng bất hoạt của NST X bình thường còn lại của cặp XX

Ở cá thể nam 46,XY chỉ có một NST X Nếu NST X mang gen đột biến thì cá thể nam sẽ có biểu hiện bệnh ở các mức độ như trên Hầu hết các trường hợp con trai bị bệnh là do thừa hưởng NST X mang gen đột biến từ mẹ

Hình 2.1 Kiểu di truyền trong bệnh DMD (Nguồn: www.uptodateonline.com)

Ngoài ra, cũng có trường hợp con trai bị bệnh DMD trong khi mẹ là người hoàn toàn bình thường không mang gen đột biến Đó là do đột biến gen mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử, xảy ra khoảng 1/3 trường hợp bệnh (Emery, 1993)

Có thể có hai cách giải thích cho một gia đình không có tiền sử mắc bệnh DMD lại bất ngờ có một đứa con bị mắc chứng bệnh này: đột biến gen đã xảy ra và lưu hành trong số các phụ nữ của gia đình trong nhiều thế hệ mà không ai hay biết, không có một trẻ trai nào của các đời thế hệ trước đó sinh ra mắc bệnh hoặc nếu có mắc bệnh nhưng lại không hay chưa được chẩn đoán phù hợp; trẻ bị bệnh DMD là do thừa hưởng một đột biến mới, chỉ nảy sinh từ một trong các tế bào noãn của quá trình tạo trứng của mẹ

Khi sinh con ra với chứng DMD, bao giờ cũng có thể có khả năng là trên tế bào

noãn bị đột biến gen dystrophin khiến người mẹ này có nguy cơ cao hơn mức bình

thường về việc truyền gen đột biến cho một đứa con khác nữa Một khi sự đột biến

Mẹ mang gen bệnh DMD Bố bình thường

Con gái bình thường Con gái mang gen Con trai bình thường Con trai bị bệnh (25%) (25%) (25%) (25%)

mới được chuyển qua cho đứa con trai hay con gái, em này có thể chuyển nó cho thế

hệ kế tiếp

Cá thể nam bị bệnh DMD không thể nào chuyển các gen bất thường cho con trai

vì con trai chỉ nhận NST Y từ bố Thế nhưng, chắc chắn là ông ta sẽ truyền gen đột biến cho con gái vì con gái chỉ nhận NST X từ bố Và như thế những người con gái này sẽ là người mang mầm bệnh và mỗi người con trai của họ có 50% nguy cơ bị mắc bệnh và cứ thế tiếp diễn

Khi một trẻ gái thừa kế gen DMD từ người mẹ, thì đồng thời trẻ cũng có được

gen dystrophin tốt từ người bố, nhờ vậy em có đầy đủ protein để bảo vệ mình không bị

mắc bệnh Các trẻ trai một khi thừa kế sự đột biến sẽ mắc bệnh ngay vì rằng cơ thể các

em không có gen dystrophin thứ hai để bù đắp cho gen bị khiếm khuyết

Thực tế lâm sàng cho thấy một số phụ nữ mang gen đột biến cũng bị ảnh hưởng với biểu hiện lâm sàng ở dạng nhẹ hơn Ở các phụ nữ này, tình trạng khiếm khuyết dystrophin có thể làm cho các cơ bị yếu ở vùng lưng, chân và tay khiến rất dễ bị mỏi Ngoài ra còn có thể có các triệu chứng về tim như cảm giác bị hụt hơi hay không thể thực hiện được các động tác thể dục vừa phải, đôi khi có thể trở nên rất nghiêm trọng

Bình thường Chuyển đoạn

Hình 2.2 Chuyển đoạn Xp21 giữa NST X và NST 21 (Một trường hợp làm mất gen

dystrophin trên Xp21 mã hóa cho protein dystrophin) (Nguồn: www.cbs.dtu.dk)

NST X

NST X

Một thể nhẹ hơn DMD là bệnh loạn dưỡng cơ Becker (Becker muscular dystrophy, BMD) cũng do đột biến gen DMD gây ra Bệnh BMD thường khởi phát ở tuổi thiếu niên và diễn tiến bệnh thường chậm hơn

Hình 2.3 So sánh giữa dạng bình thường với DMD/BMD (Nguồn: www.humgen.nl)

2.3 Nguyên nhân gây bệnh

Năm 1986, nguyên nhân bệnh đã được xác định là do sự đột biến tại locus định

vị Xp21 mã hóa cho một loại protein đa chức năng tên là dystrophin Dystrophin là một protein nằm ở mặt trong màng tế bào cơ vân và hoạt động như là một yếu tố ổn định chức năng màng, thiếu dystrophin gây biến đổi thoái hóa cả hệ cơ xương lẫn hệ

cơ tim (hình 2.4)

2.3.1 Gen dystrophin và các sản phẩm của nó

Từ đầu những năm 1980 những hiểu biết về bệnh và thay đổi trong chức năng bệnh này đã có những tiến bộ rất đáng kể, khởi đầu là việc xác định chính xác locus DMD ở cánh ngắn p của NST Xp21 (Dvies và cộng sự, 1983)

Đến bây giờ nó được biết như là một gen lớn nhất trong cơ thể người với 2400kb, gồm 79 exon và 99,4% cấu trúc gen là intron Gen có kích thước lớn này mã cho bản phiên mã mRNA 14kb với nhiệm vụ kiểm soát sự ghép nối và phiên mã một cách tinh

tế, tổng hợp nên protein dystrophin có khối lượng phân tử là 427 kDa (Brown và Dickson, 1994) (hình 2.5)

Hình 2.4 Vị trí protein dystrophin trên mặt trong

màng tế bào cơ vân (Theo Muscular Dystrophy Association of NSW)

Hình 2.5 Vị trí locus Xp21 (Nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov)

Trình tự amino acid của dystrophin chỉ có bốn domain cấu trúc phân biệt:

Domain cuối N (amino acid 14 – 240): bao gồm khoảng 240 amino acid đầu tiên, tương đồng trình tự cao với domain gắn actin của -actin và -spectrin

Toàn bộ cơ

Bó sợi cơMàng sợi cơ (vị trí chất dystrophin)

Màng tế bào cơ Protein

Dystrophin

Domain mảnh (rod domain) (amino acid 253 – 3040): ở trung tâm có 24 đoạn lặp tương đồng, trung bình có 109 amino acid cũng tương đồng cao với -actin và -spectrin Cấu trúc này theo dự đoán là làm thúc đẩy tương tác xoắn  để có cấu trúc giống hình que dài 100 – 125 nm, tạo thuận lợi cho sự kết hợp (Blake và cộng sự, 1995) Tính linh hoạt này giống như bản lề trên phân tử là do có mặt 4 vùng giàu proline nằm rải rác dọc chiều dài của que này (Blake và cộng sự, 1994) Tuy nhiên, domain này thường được coi là vùng ít chức năng nhất

Domain giàu cystine (amino acid 3080 – 3360): gồm hai motif gắn calcium có

ở calmodulin cũng như ở -actin và -spectrin, mặc dù khả năng gắn calcium thực sự của nó vẫn còn đang tranh cãi (Ahn và Kunkel, 1993)

Cuối cùng là domain cuối C (amino acid 3361 – 3685): bao gồm 240 amino acid đặc hiệu đối với họ dystrophin mà chủ yếu là dystrophin và nhiều protein có liên quan đến dystrophin (dystrophin-related proteins, DRP) như protein utrophin (DRP1), DRP2, Torpedo 87 (Robert và cộng sự, 1996) và dystrobrevin (Blake và cộng sự, 1996) Đến nay 8 promoter độc lập đã được sáng tỏ nhờ việc kiểm soát phiên mã ở locus DMD bằng những phương pháp đặc hiệu tế bào (Matsuo, 1996) Bốn trong số các promoter này khởi đầu phiên mã cho một bản phiên mã mRNA có độ dài đầy đủ, khác nhau ít nhất là exon đầu tiên khi mã cho các protein 427 kDa là M (muscle), L (lymphoblastoid), C (cortical) và protein dystrophin P (Purkinje) với tất cả bốn domain cấu trúc

Các promoter bổ sung S (Schawann) và G (glal) kiểm soát sự biểu hiện của protein apo-dystrophin cuối C ngắn Promoter S phiên mã cho một bản phiên mã mRNA 5,6 kb mã cho protein 116 kDa có tên là Dp 116 hay apo-dystrophin-2, chỉ biểu hiện ở hệ thần kinh ngoại biên của người trưởng thành (Blake và cộng sự, 1995) Promoter G phiên mã cho ít nhất 2 bản phiên mã mRNA 4,8 và 2,2 kb có tên là apo-dystrophin-1 và apo-dystrophin-3, chúng có các mẫu biểu hiện đồng nhất và dư thừa trong não bộ và các mô không phải là mô cơ, nhưng không phát hiện được ở mô

cơ xương đã biệt hóa hoàn toàn (Tinsley và cộng sự, 1994)

Gần đây hai bản phiên mã dystrophin bổ sung 260 kDa (Piller và cộng sự, 1993)

và 140 kDa (Lodov và cộng sự, 1995) đã được sáng tỏ, nó khởi đầu từ các promoter R mới (retina) và B (brain, CNS) Tuy nhiên, tính phức tạp của sự kiểm soát phiên mã

gen dystrophin và sự ghép nối của mRNA thì vượt rất xa những protein khung tế bào

đã biết và có thể còn có những bản phiên mã nhỏ khác nữa cũng đang tồn tại

(A)

(B)

Hình 2.6 Chuỗi gen dystrophin; (A): Sơ đồ gen dystrophin chỉ vị trí gần đúng của 79 exon

và 8 promoter đồng nhất; (B): Sự tổ chức các domain giả định của sản phẩm gen dystrophin

(Theo Stephen Murphy, George Dickson, Gene Therapy Technologies, Applications

and regulations, John Wiley & Sons Ltd., 1999)

Sự biểu hiện của DMD và BMD cho đến nay đều do đột biến ở gen mã cho dystrophin Tỷ lệ đột biến vào khoảng 790 – 100 x 10-6 gen/thế hệ, tỷ lệ này cao hơn rất nhiều so với các bệnh di truyền khác (Emery, 1993) Sự tác động đặc biệt cao và với phạm vi rộng của các đột biến có liên quan đến locus gen DMD

Tuy nhiên, nhiều điểm trong gen dystrophin có tỷ lệ đột biến cao nên rõ ràng nó

là đích đặc hiệu cho việc gây đột biến (Brown và Dickson, 1994) Trong nhiều trường hợp, sự nghiêm trọng lâm sàng của kiểu hình này có thể có liên quan đến bản chất của

sự loại bỏ phân tử (Monaco và cộng sự, 1988) Kiểu hình DMD nói chung là do đột biến làm phá vỡ khung đọc rồi dẫn đến tạo sản phẩm gen không có chức năng và kiểu hình thiếu hụt chức năng một cách nghiêm trọng Tuy nhiên kiểu hình BMD nói chung cũng do sự đột biến hay sự loại bỏ nhưng vẫn duy trì được khung đọc do đó tạo nên

Chiều dài đầy đủ của dystrophin: 427 kDa Vùng bản lề

Vùng giàu cystine

Dystrophin genome: Xp21

Domain cuối N Domain mảnh

Domain cuối

Gắn actin Tự dimer hóa Gắn dystrophin Gắn syntrophin

Exon 1 – 8 Exon 8 – 64 Exon 65 – 67 Exon 68 – 79

các sản phẩm protein bất thường, tuy có bị biến đổi về cấu trúc nhưng vẫn còn giữ được một vài chức năng, kiểu hình này luôn luôn phụ thuộc vào quá trình đột biến (Bushby và cộng sự, 1992)

2.3.2 Chức năng của dystrophin

Dystrophin là thành phần chính của các sợi cơ bình thường, nó định vị ở màng bao cơ với mức đầy đủ ngay khi thai đang phát triển (Arahata và cộng sự, 1988) Ngay

từ giai đoạn sớm của sự tạo cơ, những nguyên bào cơ chưa biệt hóa bình thường đã có một lượng dystrophin Sự xuất hiện dystrophin trùng với việc hòa lẫn một cách tự động các tế bào tạo cơ đơn nhân để hình thành một hợp bào đa nhân sau giảm phân (Miranda và cộng sự, 1988) Tuy nhiên, trong loạn dưỡng cơ thì không có hay thiếu hụt nhiều dystrophin, sở dĩ như vậy là do khi các sợi cơ được tái tạo, thoái hóa hay hoại tử thì kích cỡ sợi sẽ bị biến đổi (Miranda và cộng sự, 1988) Sự vắng mặt của dystrophin không làm chết tức thời tất cả các sợi cơ ở bệnh nhân DMD và BMD, các chức năng của chúng vẫn được duy trì trong các quá trình tiến triển của bệnh Tuy nhiên, sự tái sinh của các sợi cơ bị hủy hoại không bù đắp được mức độ thoái hóa sợi

cơ ngày càng tăng và tai hại hơn là có thể dẫn đến sự hóa xơ ở các vị trí bị tác động nghiêm trọng dẫn đến bất ổn định các sợi cơ (Miller và Hoffman, 1994) (Nguyễn Văn Kình, 2007)

Hình 2.7 Sơ đồ đại diện của dystrophin liên kết với phức hệ glycoprotein định vị ở màng bao cơ của tất cả tế bào cơ bình thường

(Nguồn: Bruce R Korf, 1996)

2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh DMD

Chẩn đoán bệnh DMD thường được dựa vào: hỏi tiền sử bản thân và gia đình, khám và phát hiện các dấu chứng lâm sàng, thực hiện các xét nghiệm chẩn đoán như điện cơ, xét nghiệm enzyme creatine kinase, sinh thiết cơ và chẩn đoán phân tử

2.4.1 Phương pháp chẩn đoán điện

2.4.1.1 Đo tốc độ dẫn truyền vận động

Khi kích thích một dây thần kinh vận động bằng một xung điện, dây thần kinh sẽ

bị khử cực tại điểm kích thích, tạo thành một xung thần kinh Xung thần kinh này di chuyển dọc theo dây thần kinh vận động, gây co cơ Điện cực ghi đặt trên bắp cơ ghi được một làn sóng do co cơ sinh ra

Mục đích của phương pháp chẩn đoán này là muốn xác định tình trạng yếu của bệnh nhân bắt nguồn từ cơ hay các dây thần kinh kiểm soát các cơ này Các dây thần kinh kiểm soát cơ hay là các neurone vận động, bắt nguồn từ não bộ, tủy sống và nối với tất cả các cơ, có thể gây ra tình trạng yếu có vẻ như từ bắp thịt nhưng sự thật lại không phải như vậy (Nguyễn Hữu Công, 2006)

2.4.1.2 Điện cơ (Electromyography, EMG)

Điện cơ là phương pháp dùng điện cực có hình dáng giống một kim chích để ghi các hoạt động điện của cơ vân Nếu một cơ tăng hoạt động điện do đâm kim và có hoạt động điện tự phát, thì nghi cơ đó bị mất phân bố thần kinh, căn nguyên do đứt dây thần kinh, hay bệnh dây thần kinh tổn thương sợi trục Điện thế của đơn vị vận động: trong bệnh cơ thì thấp bé và hẹp lại, trong yếu cơ do căn nguyên thần kinh thì cao lớn và rộng ra (Nguyễn Hữu Công, 2006)

2.4.2 Kiểm tra creatine kinase, CK

Trong giai đoạn đầu của tiến trình chẩn đoán, các bác sĩ thường yêu cầu người bệnh làm xét nghiệm máu bởi vì định lượng enzyme huyết thanh rất có giá trị trong chẩn đoán bệnh Creatine kinase là enzyme thường dùng nhất cho chẩn đoán bệnh DMD, đây là một enzyme xúc tác sự tạo năng lượng giúp cho quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong tế bào cơ Enzyme này xúc tác phản ứng:

Creatine + ATP Phosphocreatine + ADP

Creatine kinase

Phosphocreatine là dạng dự trữ năng lượng cho hoạt động của cơ và vận chuyển chất trong tế bào cơ

Chẩn đoán bệnh DMD thường dựa vào hoạt độ CK trong máu Ở bệnh nhân

DMD, gen dystrophin bị đột biến làm thay đổi cấu trúc protein dystrophin trên màng tế

bào, dẫn đến tổn thương màng tế bào cơ và giải phóng một lượng lớn CK vào máu Phương pháp được tiến hành là đo tổng số enzyme CK trong máu theo nguyên tắc là đối với những bệnh nhân DMD thì lượng CK thoát ra khỏi tế bào cơ đi vào mạch máu nhiều, vì thế dẫn đến lượng CK cao bất thường vào khoảng 15000 – 35000 IU/l

so với người bình thường là khoảng 60 IU/l (Nguyễn Hữu Công, 2006)

2.4.3 Sinh thiết cơ

Làm sinh thiết cơ là một thủ thuật lấy một mẫu thử nghiệm nhỏ từ cơ của người bệnh sẽ được sinh thiết bằng một kim nhỏ Sau đó, mẫu mô này sẽ được nhuộm để kiểm tra sự hiện diện của dystrophin trên mô bào Qua việc xét nghiệm mẫu thử này, các bác sĩ có thể biết rõ hơn về những gì thực sự đang xảy ra bên trong các cơ Điều này có thể giúp xác định hoặc chứng bệnh là DMD (không có dystrophin) hay BDM

(có một ít dystrophin) (Nguyễn Hữu Công, 2006)

2.4.4 Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry)

Hóa mô miễn dịch là quá trình protein dystrophin định vị trong tế bào của lát mô gắn với kháng thể tương ứng của chúng theo nguyên tắc kháng nguyên – kháng thể

Để quan sát được chúng, các kháng thể này phải gắn với các chất thể hiện, có thể là các enzyme như horseradish peroxidase, alkaline phosphatase hay chất phát huỳnh quang như fluorescein isothiocyanate (FITC) (Phan Kim Ngọc, 2007)

di trên gel Một thang hỗn hợp protein có sẵn sẽ giúp xác định khối lượng phân tử của protein dystrophin quan tâm Để protein dystrophin có thể được phát hiện bởi kháng thể, chúng được chuyển thấm tách từ gel lên màng nitrocellulose Các protein tích điện

di chuyển từ trong gel vào màng, nhưng vẫn duy trì tổ chức của chúng có trong gel Kết quả của quá trình là sự hiện diện protein dystrophin trên bề mặt màng Sự có mặt hay vắng mặt protein dystrophin sẽ giúp các nhà chẩn đoán có kết luận cuối cùng về bệnh nhân DMD (Phan Kim Ngọc, 2007)

2.5 Chẩn đoán di truyền phân tử

Các xét nghiệm chẩn đoán di truyền DNA sử dụng hoặc tế bào máu hoặc tế bào

ối hoặc tế bào cơ để biết thông tin chính xác về di truyền nay đã được sử dụng phổ biến rộng rãi hơn Do bởi nhiều người đàn ông bị mắc chứng DMD vẫn có thể có con, cho nên điều quan trọng là phải biết chắc họ bị chứng bệnh di truyền nào Chị em gái của những người mắc bệnh DMD cũng có thể được thử nghiệm để tìm xem liệu họ có phải là người mang bệnh, nghĩa là họ có thể sẽ sinh con mang chứng bệnh này không Đối với phương pháp chẩn đoán phân tử có thể cho phép phát hiện được các gen đột biến và cả các cá thể mang gen bệnh Với khả năng phát hiện đột biến mất đoạn và lặp đoạn lên đến 70% những trường hợp mắc bệnh DMD, phương pháp chẩn đoán phân tử đã được đánh giá cao hơn hẳn so với các phương pháp truyền thống khác (Thomas W Prior, 2005)

2.5.1 Multiplex PCR

Multiplex PCR là phương pháp PCR sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho các đoạn DNA đích đặc hiệu Kỹ thuật multiplex PCR có ưu điểm là cho phép thực hiện chỉ một phản ứng PCR nhưng có thể khuếch đại cùng lúc nhiều gen, cho phép tiết kiệm thời gian và chi phí chẩn đoán xét nghiệm Tuy nhiên trong kỹ thuật multiplex PCR việc lựa chọn các cặp mồi có nhiệt độ bắt cặp tương đương nhau và những cặp mồi này phải không có sự kết hợp bổ sung với nhau Kỹ thuật multiplex PCR vì thế phức tạp hơn trong việc xây dựng các thông số thích hợp và thường có độ nhạy kém hơn so với kỹ thuật PCR sử dụng một cặp mồi (Phạm Hùng Vân, 2009)

Các nhóm nghiên cứu trên thế giới thường dùng kỹ thuật multiplex PCR dùng để chẩn đoán bệnh DMD vì kỹ thuật này cho kết quả nhanh và hiệu quả hơn hẳn Với kỹ thuật multiplex PCR, người ta đã dùng khoảng 20 cặp mồi để phát hiện đột biến gen

dystrophin với tỉ lệ chính xác là 98% (Thomas W Prior, 2005)

Dựa vào các sản phẩm multiplex PCR, các kỹ thuật dùng để chẩn đoán đột biến điểm trên bệnh nhân DMD đã được phát triển như: kỹ thuật phân tích dựa vào đa dạng cấu hình mạch đơn (Single strand conformation polymophism, SSCP), kỹ thuật phân

tích dựa vào đa dạng cấu hình mạch đôi (Double strand conformation polymophism, DSCP) và phân tích dị kép (Heteroduplex analysis, HDA) (Phan Kim Ngọc, 2007; Trần Nguyễn An Phú, 2007)

2.5.2 Southern blot

Southern blot là phương pháp thấm mao quản hay thấm qua hút chân không để chuyển toàn bộ các vạch DNA trên gel điện di qua màng nitrocellulose Mục đích là dùng các đoạn dò đặc hiệu gen DMD muốn tìm đã đánh dấu enzyme hay đồng vị phóng xạ phủ trên màng nitrocellulose để tìm vị trí của đoạn DNA có mang trình tự đặc hiệu gen DMD Từ vị trí được xác định trên màng lai này, cắt mảnh gel điện di tại đúng vị trí đã được xác định trên màng, và như vậy là có hy vọng bắt được đoạn DNA chứa gen DMD mong muốn Tuy nhiên để có được trọn vẹn gen DMD mong muốn,

các nhà nghiên cứu phải thực hiện kỹ thuật này rất nhiều lần (Phạm Hùng Vân, 2009)

Các nhóm nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng phương pháp Southern blot với

các clon cDNA của gen dystrophin dùng để phát hiện các đột biến mất đoạn và lặp

đoạn một cách chính xác Tuy nhiên, với kỹ thuật này đòi hỏi cần có chất đồng vị phóng xạ, nồng độ phân tử DNA cao và thời gian tiến hành kéo dài nên kỹ thuật này cũng gặp phải những hạn chế nhất định

Bên cạnh đó, nếu như với phương pháp Southern blot đòi hỏi phải có các probe cDNA lai và phải mất vài tuần mới có được kết quả chẩn đoán thì với kỹ thuật multiplex PCR có thể hoàn thành chỉ trong vòng 1 ngày Vì thế kỹ thuật multiplex PCR luôn là sự lựa chọn của các nhóm nghiên cứu về bệnh DMD trên thế giới vì kỹ thuật này cho kết quả chẩn đoán nhanh và chính xác (Thomas W Prior, 2005)

2.5.3 Điện di gel thang biến tính (Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)

DGGE được Myers và cộng sự mô tả lần đầu vào năm 1987 khi điện di phân tử DNA mạch đôi trên gel polyacrylamide có chứa các chất biến tính như formamide và urea với nồng độ tăng dần Sự phân tách của đoạn DNA dựa trên cách thức nóng chảy của phân tử Nhiệt độ mà tại đó đoạn DNA tách ra gọi là nhiệt độ nóng chảy phụ thuộc vào trình tự của chuỗi DNA Tại điểm phân tử DNA trải qua sự biến tính một phần thì sự di chuyển của nó trên gel rất chậm Nhờ đó mà 2 đoạn DNA mạch đôi khác nhau chỉ 1 nucleotide có thể được phân biệt do sự di chuyển khác nhau giữa các đoạn này trên gel

Kỹ thuật này có thể cho phép khảo sát đoạn DNA từ 50 – 1000 bp với thời gian chạy điện di từ 7,5 – 10 giờ Sau khi nhuộm ethidium bromide và phát hiện bất thường thì tiến hành các phân tích tiếp theo bằng các kỹ thuật khác để xác định bản chất của đột biến Nhược điểm của phương pháp này là tốn kém và đòi hỏi máy móc chuyên dụng (Tubiello G., 1995; Trần Nguyễn An Phú, 2007)

2.5.4 Lai nhiều probe khuếch đại (Multiplex amplifiable probe hybridisation, MAPH)

MAPH là 1 kỹ thuật dựa vào phản ứng PCR định lượng các probe DNA ngắn được phục hồi sau quá trình lai để giữ cố định DNA của hệ gen trên màng nitrocellulose Mỗi probe DNA sẽ đại diện cho một exon đã được khuếch đại và clon vào một vector đặc hiệu Thay cho việc phải tái khuếch đại sử dụng nhiều cặp mồi cho nhiều vị trí clon thì giờ đây ta có thể cùng một lúc khuếch đại tất cả các probe này trong cùng một phản ứng mà chỉ sử dụng duy nhất một cặp mồi mà thôi Người ta thường chia các exon của gen DMD thành hai nhóm riêng lẻ cho từng phản ứng một Với 1 μg DNA biến tính sẽ được đem lai trên một màng nitrocellulose nhỏ và chúng được cho lai qua đêm trong dung dịch chứa một trong các probe của gen DMD Sau

đó, chúng sẽ được rửa 1 cách nghiêm ngặt vào ngày tiếp theo nhằm loại bỏ các probe lai không đặc hiệu và tất cả các probe sau khi đã được rửa sạch sẽ được cho vào 1 tube PCR để chạy phản ứng PCR định lượng và phân tích bằng hệ thống điện di mao quản với các primer PCR đã được đánh dấu huỳnh quang trước đó Bằng việc so sánh kết quả các đỉnh sau khi chạy điện di mao quản giữa mẫu kiểm tra và mẫu chứng mà người phân tích có thể kết luận có hay không việc mất từng exon một hay lặp đoạn mà các phương pháp chẩn đoán khác khó biết được (White SJ., 2006)

2.5.5 Khuếch đại nhiều probe phụ thuộc quá trình nối (Multiplex dependent probe amplification, MLPA)

ligation-MLPA là một kỹ thuật được Jan P Schouten và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 2002 Đây là một kỹ thuật cho phép chẩn đoán di truyền phân tử tốt nhất hiện nay, bởi vì nó cho phép phát hiện được các trường hợp mất đoạn, lặp đoạn một cách chính xác và hiệu quả mà ít có kỹ thuật nào có thể phát hiện được

Hình 2.8 So sánh kỹ thuật MLPA với các kỹ thuật sinh học phân tử khác

Kỹ thuật MLPA cho phép phát hiện đột biến với một giới hạn lớn hơn, phù hợp với các kích thước genome thay đổi từ đột biến điểm đến hay mất đoạn và lặp đoạn NST

(Nguồn: www.mlpa.com)

Kỹ thuật MLPA đặc trưng ở chỗ là không phân tích dựa vào chuỗi gốc mà lại phân tích dựa vào sản phẩm khuếch đại của chúng, tuy nhiên các probe MLPA lại được lai vào chính các chuỗi gốc này Khi so sánh với một kỹ thuật multiplex PCR cơ bản thì MLPA chỉ sử dụng duy nhất một cặp PCR primer cho quá trình khuếch đại MLPA Kết quả sản phẩm khuếch đại của bộ kit SALSA® MLPA® có chiều dài nằm trong khoảng 130 đến 480 nt và có thể phân tích bởi hệ thống điện di mao quản Nhận xét kết quả MLPA thông qua việc so sánh các đỉnh đạt được so với các đỉnh chuẩn của một người hoàn toàn bình thường để chỉ ra được các dạng bất thường

Quá trình thực hiện MLPA có thể được chia thành năm giai đoạn chính: biến tính DNA và lai probe MLPA; phản ứng nối; phản ứng PCR; phân tích sản phẩm khuếch đại bằng điện di mao quản; phân tích dữ liệu bằng các phần mềm phân tích chuyên dụng (hình 2.9)

Trong suốt quá trình đầu tiên, DNA được biến tính và ủ qua đêm với một hỗn hợp của probe MLPA Mỗi probe MLPA chứa hai loại oligonucleotide riêng biệt, mỗi loại chứa một trình tự primer PCR Sau đó 2 probe oligonucleotide được lai vào trình

tự gốc ngay lập tức Chỉ khi 2 probe oligonucleotide được nối vào trình tự gốc thì phản ứng nối mới xảy ra sau phản ứng lai Bởi vì chỉ duy nhất các probe đã được lai thì mới được khuếch đại theo cấp lũy thừa trong suốt quá trình PCR xảy ra sau đó Số sản phẩm sau khi được khuếch đại bằng phản ứng PCR sẽ được phân tích bằng hệ thống điện di mao quản Những probe oligonucleotide ban đầu nếu không được nối hay chỉ

nối một đầu của trình tự gốc thì sẽ không được khuếch đại theo cấp lũy thừa và kết quả sau khi chạy điện di mao quản là không có tín hiệu các đỉnh

Hình 2.9 Quy trình kỹ thuật MLPA (Nguồn: www.mlpa.com)

2.6.6 Phân tích liên kết gen

Mục đích của việc sử dụng các kỹ thuật phân tích liên kết gen trong chẩn đoán bệnh DMD là nhằm xác định nguồn gốc gen đột biến gây bệnh DMD, trong những trường hợp không phát hiện được đột biến ở các ca mắc bệnh

2.5.6.1 Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn DNA của bộ gen bị cắt bởi enzyme cắt giới hạn (Restriction fragment length polymorphism, RFLP)

Kỹ thuật này được Jeffereys thực hiện vào năm 1985 và kỹ thuật này được tóm tắt như sau: trước hết, mẫu máu được lấy từ các người cần kiểm tra gen DMD để tách được bạch cầu, sau đó tách chiết toàn bộ bộ gen nguyên vẹn của bạch cầu trong các

mẫu kiểm tra; cắt đoạn các bộ gen đã tách chiết này bằng enzyme cắt giới hạn Hinf1,

đây là một enzyme cắt nhận diện được bốn trình tự base đặc hiệu, nhờ đó cắt đoạn

nữ mang gen đột biến

được bộ gen thành những mảnh DNA dài ngắn khác nhau, trong đó có những mảnh chứa những trình tự base lặp lại; điện di mẫu kiểm tra để phân tách các đoạn DNA này trên gel agarose, sau đó chuyển các đoạn DNA trên gel này qua một màng nitrocellulose; phát hiện vị trí các trình tự base lặp lại trên màng nitrocellulose bằng cách lai với một trong những probe DNA đánh dấu đồng vị phóng xạ và đặc hiệu cho các trình tự base lặp lại này

Xét nghiệm RFLP có một hạn chế là phải có mẫu thử nhiều tế bào để có thể trích được bộ gen nguyên vẹn (phải lấy không dưới 10ml máu để có đủ bạch cầu dùng trong tách chiết bộ gen) Do vậy xét nghiệm này không thể áp dụng được khi mẫu phân tích quá ít, thậm chí là các dấu vết sinh học không thể cân đo được vì quá nhỏ (Phạm Hùng Vân, 2009)

2.5.6.2 Trình tự lặp lại ngắn (Short tandem repeats, STR)

STR là các trình tự có kích thước nhỏ dưới 1000 base tạo nên bởi các trình tự lõi khoảng 2 đến 4 base lặp lại nhiều lần (từ 10 đến 60 lần) Khi một STR được nhân bản bằng kỹ thuật PCR, trong tube phản ứng sẽ có một trong ba loại kiểu hình về kích thước STR tùy thuộc vào STR trong mẫu DNA kiểm tra là đồng hợp tử vì nhận từ bố

và mẹ với STR kích thước giống nhau hay dị hợp tử vì nhận được STR từ bố có kích thuớc khác STR nhận từ mẹ (Phạm Hùng Vân, 2009)

2.5.7 Lai tại chỗ có gắn huỳnh quang (Fluorescent in situ hybridization, FISH)

FISH là một kỹ thuật tế bào học có thể sử dụng để phát hiện và định vị các trình

tự DNA của gen DMD trên NST X Phương pháp này sử dụng các mẫu dò phát quang gắn chuyên biệt vào các phần NST có sự tương đồng trình tự cao Kính hiển vi huỳnh quang có thể được sử dụng để xác định các nơi có mẫu dò gắn vào NST X

Để tiến hành FISH, trước hết một mẫu dò được thiết kế đủ dài để lai chuyên biệt với DNA đích của nó trên NST X (và không có trình tự tương tự trên bộ gen), nhưng không quá lớn để cản trở quá trình lai Mẫu dò được gắn trực tiếp với chất phát huỳnh quang và với các DNA đích NST X được cố định vào một cơ chất thường là thủy tinh (Phan Kim Ngọc, 2007)

2.5.8 PCR phiên mã ngược (Reverse transcriptase – PCR, RT – PCR)

RT – PCR là phương pháp mà nucleic acid đích cần phải phát hiện là RNA Để

có thể thực hiện được PCR này thì trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (Reverse transcription, RT) thành cDNA, rồi sau đó sẽ dùng PCR để khuếch đại trình

tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự này Vì phải thực hiện hai giai đoạn: RT rồi mới đến PCR nên kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật RT – PCR Đối tượng của RT – PCR là RNA đích mà bản chất của RNA lại rất dễ bị phân hủy trong

môi trường cũng như bị enzyme RNase tiết ra từ các vi sinh vật ở trong môi trường, chai lọ, thiết bị, dụng cụ và dung dịch Bên cạnh đó, RNase lại rất bền và khó phân hủy

bởi nhiệt độ Vì thế, RT – PCR là 1 kỹ thuật không dễ khi dùng để chẩn đoán bệnh DMD (Phạm Hùng Vân, 2009)

Tuy nhiên, chẩn đoán ở mức độ DNA đối với bệnh DMD sẽ mất nhiều thời gian

và tiêu tốn hóa chất nên người ta thường chỉ xác định đột biến ở 2 vùng trọng điểm (5’ tận cùng và trung tâm) vì vậy bỏ sót đột biến gen ở 60 exon còn lại Trong khi đó, khi

sử dụng kỹ thuật chẩn đoán ở mức độ mRNA thì có thể xác định nhanh và toàn diện

đột biến mất đoạn trên gen dystrophin Phương pháp thường được tiến hành là tách

chiết RNA tổng số từ máu ngoại vi và tổng hợp cDNA, sau đó thực hiện phản ứng nested PCR (PCR tổ) và đọc trình tự (sequencing) được sử dụng để phát hiện đột biến mất đoạn (Yuge L., 1999)

2.5.9 Kiểm tra sự cắt ngắn protein (Protein truncation test, PTT)

PTT là kỹ thuật dựa trên sự phát hiện các đột biến điểm ở giai đoạn sớm của cuối quá trình dịch mã Kỹ thuật này được dùng để phát hiện đột biến trong một vài bệnh lý

di truyền Kỹ thuật PTT được thực hiện lần lượt qua các bước sau đây: thực hiện phản ứng RT – PCR, tổng hợp nên cDNA; từ cDNA này, phiên mã thành mRNA; với mRNA, dịch mã thành protein, lúc này đánh dấu protein bằng các amino acid (chất phóng xạ hay biotin)

Điện di phân tách kích thước của các protein đánh dấu, phân tử protein có khối lượng phân tử thấp sẽ di chuyển trong điện trường xa hơn các phân tử protein có khối lượng phân tử lớn hơn Các protein được đánh dấu bằng phóng xạ có thể quan sát bằng phóng xạ tự ghi (autoradiography) trong khi đó các protein được đánh dấu bằng biotin

sẽ quan sát bằng kỹ thuật Western blot

Đối với cá thể đồng hợp tử với 2 allele bình thường sẽ tạo nên protein có khối lượng phân tử bình thường Còn đối với cá thể dị hợp tử có đột biến cắt ngắn thì gen bình thường sẽ tạo nên protein có khối lượng phân tử bình thường, trong khi đó gen bị đột biến mất đoạn làm chúng ngắn lại sẽ tạo nên protein có khối lượng phân tử ngắn

hơn rất nhiều Đây cũng là một phương pháp được dùng để chẩn đoán mất đoạn ở bệnh nhân DMD ở mức độ RNA (Saad, 1994)

2.6 Chẩn đoán trước sinh

Nếu mẹ là những cá thể mang gen bệnh DMD thì việc chẩn đoán trước sinh là rất quan trọng để phòng tránh sự ra đời của những trẻ trai bị bệnh DMD Vì vậy những người nữ trong gia đình liên quan với bệnh nhân DMD theo dòng họ mẹ bao gồm: mẹ bệnh nhân, chị em gái của mẹ bệnh nhân muốn sinh con tiếp theo hay chị em gái của bệnh nhân lớn lên xây dựng gia đình muốn sinh con; đó là những người có nhu cầu cấp thiết cần được tư vấn di truyền và áp dụng sàng lọc trước sinh để phòng tránh việc sinh ra trẻ bị bệnh DMD

Phương pháp được tiến hành là chọc ối thai phụ để chẩn đoán thai nhi có mang gen bị bệnh DMD hay không khi tuổi thai vào khoảng 16 đến 28 tuần và có một trong các điều kiện sau: có tiền căn con bị bệnh DMD; trong gia đình có người bị bệnh DMD; bản thân thai phụ bị nghi ngờ là cá thể mang gen đột biến DMD

Hình 2.10 Thủ thuật chọc ối (Nguồn www.revolutionhealth.com)

2.7 Điều trị

Hiện nay có nhiều phương pháp trị liệu tốt để giúp đối phó với tất cả những ảnh hưởng của bệnh DMD Các phương pháp này bao gồm: vật lý trị liệu, điều trị bằng thuốc, thay thế bằng tế bào gốc hay gen trị liệu Tuy nhiên hiện vẫn chưa có phương pháp nào điều trị triệt để

Đầu dò siêu âm

Nước ốiThai nhi

2.8 Tổng quan nghiên cứu bệnh DMD trên thế giới

Dựa vào các nghiên cứu trước đây, Trần Vân Khánh và cộng sự (2004) đã tổng kết và so sánh tỉ lệ đột biến mất đoạn giữa các dân tộc khác nhau bao gồm Châu Mỹ, Châu Âu và Châu Á

Bảng tổng kết đã cho thấy tỉ lệ đột biến mất đoạn trên gen dystrophin dao động

từ 33 – 65% Ở các quốc gia Châu Mỹ, Châu Âu, bệnh nhân Hoa Kỳ và Hy Lạp với tỉ

lệ tìm thấy đột biến khá cao khoảng 60 – 65%, tiếp sau đó đến Mexico và Anh, thấp hơn nữa là Đức, Argentina và Venezuela dao động từ 30 – 40% Còn ở các quốc gia Châu Á, bệnh nhân Thái Lan, Ấn Độ, Singapore, Nhật Bản, Thổ Nhĩ Kỳ chiếm tỉ lệ tìm thấy đột biến cũng khá cao tương tự như một số quốc gia ở Châu Mỹ và Châu Âu khoảng 60 – 65%, các quốc gia còn lại tỉ lệ đột biến thấp hơn dao động trong khoảng

33 – 46%, trong đó bệnh nhân Philippine với tỉ lệ đột biến thấp nhất (33%)

Tỉ lệ đột biến trên bệnh nhân Việt Nam là 38% tỉ lệ này nhìn chung là thấp hơn

so với các dân tộc khác ngoại trừ Philippine Điều này có thể là do các bệnh nhân Việt Nam có tỉ lệ đột biến điểm và một số đột biến khác cao, để trả lời câu hỏi này cần phải

có một nghiên cứu tiếp theo để xác định các dạng đột biến khác như đột biến điểm, đột biến lặp đoạn, đột biến thêm đoạn bằng các phương pháp đặc hiệu khác

Tuy nhiên, cũng cần phải nói thêm rằng, mặc dù các bệnh nhân đều được chẩn đoán dựa vào các đặc điểm lâm sàng hết sức điển hình và nồng độ CK tăng cao trong máu nhưng hầu hết các bệnh nhân này đều không được làm sinh thiết cơ, một xét nghiệm cơ bản để chẩn đoán chính xác nhất bệnh nhân DMD/BMD Điều này khó có thể tránh khỏi những sai sót nhỏ trong quá trình chẩn đoán (Bảng so sánh tỉ lệ đột biến của bệnh nhân DMD/BMD giữa các dân tộc khác nhau được đính kèm vào phụ lục 1) Hầu hết các báo cáo đều dùng phương pháp PCR là phương pháp chính để chẩn đoán đột biến mất đoạn đối với bệnh nhân DMD/BMD Trong báo cáo tổng kết trên có

14 báo cáo dùng phương pháp PCR trong khi đó chỉ có 5 báo cáo dùng phương pháp Southern blot, ngoại trừ một số báo cáo dùng cả hai phương pháp So sánh tỉ lệ tìm thấy đột biến giữa hai phương pháp thì cả hai đều là những phương pháp hữu hiệu, song PCR vẫn là phương pháp được ưa chuộng hơn

2.9 Tổng quan nghiên cứu bệnh DMD tại Việt Nam

Vì tính chất nặng nề và phổ biến nên bệnh DMD đã được quan tâm nghiên cứu ở nước ta từ nhiều năm nay Đó là những nghiên cứu về tần suất mắc bệnh, mối liên

quan giữa chẩn đoán lâm sàng và xét nghiệm CK, ứng dụng của xét nghiệm CK trong chẩn đoán người mang gen bệnh Đặc biệt trong vài năm trở lại đây đã có một số nghiên cứu ở mức độ sinh học phân tử, song hầu hết các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ xác định đột biến trên các đối tượng được chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh DMD

và chưa có nhiều nghiên cứu nào xác định người mang gen và chẩn đoán trước sinh Chính vì vậy, việc nghiên cứu chẩn đoán chính xác người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh cần được thực hiện một cách có hệ thống và là một việc làm hết sức cấp bách để sớm đưa ra những lời khuyên về mặt di truyền nhằm mục đích ngăn ngừa

và giảm tỉ lệ mắc bệnh

Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Hoàn và cộng sự (1991) đã có nghiên cứu xác định số lượng bệnh nhân DMD trong vòng 10 năm (1981 – 1990) tại Viện Bảo vệ sức khỏe trẻ em, Hà Nội Nhóm tác giả đã xác định được 131 bệnh nhân trong tổng số 107 gia đình, trong đó có gia đình có tới 2, 3 hay 4 người con đều bị mắc bệnh

Nguyễn Thị Phượng và cộng sự (1996) đã tổng kết số lượng bệnh nhân trong vòng 5 năm (1991 – 1995) và đã xác định được 176 bệnh nhân trong tổng số 148 gia đình, trong đó nhiều gia đình có 2 – 4 người con bị bệnh và có đến 6 gia đình bệnh di truyền qua hai thế hệ liên tục Qua hai nghiên cứu trên, chúng ta thấy rõ mức độ phổ biến của bệnh này ở Việt Nam

Nguyễn Thị Trang và cộng sự (1996) đã nghiên cứu giá trị của xét nghiệm CK trong chẩn đoán người mang gen bệnh và đã phát hiện được khoảng trên 50% trường hợp có khả năng là người mang gen Tuy nhiên, họ mới chỉ dừng ở mức làm xét nghiệm nồng độ CK chứ chưa có khả năng xác định chính xác những tổn thương tại gen nên kết quả chỉ mang tính chất gợi ý và chưa được coi là một căn cứ xác thực để thực hiện tư vấn di truyền Nồng độ CK tăng trong bệnh DMD nhưng ngoài ra cũng tăng trong một số trường hợp viêm cơ khác Chẩn đoán người mang gen để đưa ra lời khuyên về di truyền giúp họ sinh được những đứa con khoẻ mạnh đòi hỏi phải thật chính xác và có độ tin cậy cao

Trong những năm từ 1998 – 2003, hầu hết các tác giả chỉ mới tiến hành nghiên

cứu ở mức độ thăm dò với số lượng bệnh nhân thấp

Trần Vân Khánh và những cộng sự Việt Nam tại Bệnh viện Nhi Trung ương đã phối hợp với Masafumi Matsuo (Đại học Y khoa Kobe, Nhật Bản) (2004) xác định đột biến với số lượng lớn 85 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh DMD Do khó khăn

trong việc tách chiết RNA tổng số từ máu tươi (vì đòi hỏi phải tách chiết trong 24 giờ), tác giả và cộng sự chỉ mới xác định đột biến ở mức độ DNA sử dụng 19 cặp mồi để khuyếch đại 19 exon (bao gồm các exon 1, 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 47, 48,

49, 50, 51, 52, 60) thường xảy ra đột biến mất đoạn trên gen dystrophin nhưng vẫn

chưa khuyếch đại được 60 exon còn lại trong tổng số 79 exon

Hầu hết các đột biến đều tập trung ở vùng trung tâm của gen, chiếm tỉ lệ 66% với

21 trường hợp, trong đó vùng tận cùng 5’ chiếm tỉ lệ 22% với 7 trường hợp Có 4 trường hợp (12%) có đột biến mất đoạn kéo dài từ vùng tận cùng 5’ đến vùng trung tâm của gen Dạng đột biến này đa số giống với các dạng đột biến đã được báo cáo từ trước đến nay với tỉ lệ đột biến ở vùng trung tâm của gen DMD là 2/3 so với vùng tận cùng 5’ Điều này chứng tỏ không có sự khác biệt về mô hình đột biến trên gen

dystrophin giữa các chủng tộc khác nhau Exon 47, 48, 49, 50 là các exon hay xảy ra

đột biến phổ biến nhất trên bệnh nhân Việt Nam, trong đó exon 47 gặp nhiều nhất với

12 trường hợp Ở vùng tận cùng 5’, exon hay đột biến nhất là exon 8 và 12 với 6 trường hợp Tuy nhiên, tác giả không phát hiện được trường hợp nào đột biến exon 60

trên các bệnh nhân Việt Nam

Kết quả trên chỉ phát hiện được 38% số bệnh nhân có đột biến mất đoạn so với tỉ

lệ thường gặp là trên 60% Điều đó chứng tỏ rằng khoảng trên 22% đột biến nằm ở ngoài vùng 19 exon hay xảy ra đột biến mất đoạn trên đối tượng bệnh nhân Việt Nam Kết quả này cho thấy sự cần thiết phải xác định đột biến ở 60 exon còn lại Một trở ngại lớn là nếu xác định đột biến ở mức độ DNA với 60 exon còn lại thì sẽ phải thiết

kế thêm 60 cặp mồi, trong khi đó nếu chẩn đoán ở mức độ mRNA thì chỉ cần 15 cặp

mồi đã có thể khuyếch đại được cả chiều dài gen dystrophin Vì vậy xác định đột biến

ở mức độ mRNA sẽ giảm được công sức, hóa chất, thời gian và có thể xác định được

toàn bộ đột biến mất đoạn trên gen dystrophin đối với bệnh nhân Việt Nam tránh để bỏ

sót tổn thương

Trần Vân Khánh và cộng sự (2005) đã phát hiện trên hai anh em mắc bệnh DMD, cả hai đều có đột biến mất đoạn từ exon 45 – 47, đột biến này nằm ở vùng rod của gen và không làm thay đổi khung dịch mã vì thế sẽ gây nên bệnh BMD mà không

là bệnh DMD (đột biến làm thay đổi khung dịch mã gây nên bệnh DMD) Điều này không tương xứng giữa chẩn đoán lâm sàng và kết quả phân tích gen Vùng rod của gen trước đây được coi như là vùng ít chức năng nhất Tuy nhiên, kết quả trên đã cho

thấy, một vài exon nằm ở vùng rod có thể đóng vai trò quan trọng đối với chức năng

của gen dystrophin

Đến năm 2005 và 2006, Nguyễn Thị Trang, Nguyễn Thị Hoàn và cộng sự đã tiến hành xác định đột biến mất đoạn trên bệnh nhân DMD Việt Nam Song cho đến nay, tất cả các nghiên cứu mới chỉ dừng ở mức xác định đột biến đơn thuần ở mức độ DNA

mà chưa tiến hành chẩn đoán người mang gen và chẩn đoán trước sinh

Nguyễn Thị Trang và cộng sự (2007) đã dùng kỹ thuật multiplex PCR để sàng

lọc trước sinh bệnh DMD với mẫu là nước ối của thai nhi Các tác giả đã sử dụng kỹ thuật PCR để xác định giới tính thai và tìm đột biến mất đoạn gen DMD ở các exon 3,

4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 và 60 Mười chín exon này

tương ứng với hai vùng thường xảy ra đột biến mất đoạn gen dystrophin, đó là vùng

tận cùng 5’ từ exon 3 – 19 và vùng trung tâm của gen từ exon 45 – 52 Nghiên cứu cho thấy dùng PCR để xác định giới tính và đột biến mất đoạn là phương pháp chính xác

và nhanh, rất có ích để góp phần phòng tránh sinh con trai bị bệnh DMD

Nguyễn Thị Phương Mai và cộng sự (2007) tiếp tục sử dụng kỹ thuật multiplex

PCR thay thế PCR cổ điển trong phân tích gen dystrophin ở các bệnh nhân DMD

nhưng lần này tác giả đã sử dụng ba bộ multiplex PCR A, B và C để phát hiện mất đoạn của 25 exon đặc hiệu tập trung ở vùng hotspot của gen DMD với trình tự mồi, điều kiện phản ứng và kích thước sản phẩm khuếch đại được thiết kế theo Chamberlain và cộng sự (1990) Kết quả đã phát hiện được 12 trong tổng số 28 bệnh nhân chiếm tỉ lệ 42,9% có đột biến mất đoạn ở 25 exon được phân tích, trong đó đột biến tập trung chủ yếu ở vùng hotspot trung tâm của gen là 83,4%

Nguyễn Thị Băng Sương và cộng sự (2009) đã phát hiện 13 trong số 25 bệnh

nhân được chẩn đoán nghi là mắc bệnh DMD dựa vào triệu chứng lâm sàng như CK

tăng cao có đột biến mất đoạn gen dystrophin dựa vào kỹ thuật tách chiết RNA, tổng

hợp cDNA, phản ứng nested PCR và giải trình tự Phương pháp chẩn đoán đột biến ở mức độ mRNA này giúp tiết kiệm thời gian và kinh phí so với chẩn đoán đột biến ở mức độ DNA

Trần Vân Khánh và cộng sự (2009) đã sử dụng phương pháp RT – nested PCR

và giải trình tự trên 1 bệnh nhân DMD cùng với 6 thành viên nữ của gia đình để phát

hiện đột biến gen dystrophin Tác giả đã hoàn thành được quy trình phát hiện đột biến

mất đoạn gen ở mức độ RNA và quy trình phát hiện là người lành mang gen đột biến

Gần đây, các tác giả nước ngoài đã sử dụng kỹ thuật MLPA chẩn đoán đột biến mất đoạn gây DMD/BMD rất hiệu quả Tuy nhiên đến nay Việt Nam vẫn chưa có những nghiên cứu nào về kỹ thuật này Vì thế, chúng tôi thực hiện thử nghiệm xác định đột biến mất đoạn gen DMD bằng kỹ thuật MLPA và so sánh hiệu quả với kỹ thuật multiplex PCR

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Khóa luận được thực hiện tại Bộ phận Di truyền phân tử, Phòng Di truyền, Khoa Giải phẫu bệnh – Tế bào – Di truyền, Bệnh viện Từ Dũ TP.HCM từ ngày 05/02/2009 đến ngày 05/06/2009

3.2 Nội dung nghiên cứu

Thiết lập phản ứng multiplex PCR nhằm xác định giới tính thai nhi với 2 cặp mồi đặc hiệu: 1 cặp mồi dùng làm chứng nội tại cho phản ứng PCR và 1 cặp mồi dùng trong xác định giới tính thai nhi nhằm khảo sát gen SRY trên NST Y ở nam giới

Chẩn đoán di truyền phân tử nhằm phát hiện đột biến gen dystrophin trên bệnh

nhân DMD bằng kỹ thuật MLPA

Đề xuất quy trình chẩn đoán bệnh DMD trước sinh đối với các thai phụ có tiền

3.3.1.2 Mồi

Bốn đoạn mồi do Sigma Proligo tổng hợp được trình bày trong bảng 3.1 Các

thông số của các cặp mồi này đã được kiểm tra thông qua trang http://genome.ucsc.edu

và phần mềm thiết kế mồi PerlPrimer v1.1 (chi tiết được đính kèm vào phụ lục 2)