KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG THỂ VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU MÁU SAU KHI CHỦNG NGỪA VACCINE PHÒNG HỘI CHỨNG CÒI CỌC TRÊN HEO SAU CAI SỮA (PMWS)

Mục đích của đề tài nhằm đánh giá hiệu quả của loại vaccine được sử dụng trong nghiên cứu thông qua xác định hàm lượng kháng thể bằng kỹ thuật ELISA và các chỉ tiêu sinh lý máu để đưa ra

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG THỂ VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU MÁU SAU KHI CHỦNG NGỪA VACCINE PHÒNG HỘI CHỨNG CÒI CỌC TRÊN HEO SAU CAI SỮA (PMWS)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THU GIANG Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 08/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG THỂ VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU MÁU SAU KHI CHỦNG NGỪA VACCINE PHÒNG HỘI CHỨNG CÒI CỌC TRÊN HEO SAU CAI SỮA (PMWS)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS HỒ THỊ NGA

Tháng 08/2009

Tôi cũng chân thành cảm ơn Kỹ Sư Lê Văn Huy, Kỹ Sư Nguyễn Minh Nam,

và các anh chị lớp DH04DY và DH04TY đã nhiệt tình giúp đỡ cho tôi hoàn thành tốt công việc trong thời gian thực tập

Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè của tôi, những người đã hết lòng động viên tôi giúp tôi có nghị lực vượt qua những khó khăn

Thành phố Hồ Chí Minh 15/ 07/ 2009 NGUYỄN THỊ THU GIANG

Mục đích của đề tài nhằm đánh giá hiệu quả của loại vaccine được sử dụng trong nghiên cứu thông qua xác định hàm lượng kháng thể bằng kỹ thuật ELISA và các chỉ tiêu sinh lý máu để đưa ra những khuyến cáo cho người chăn nuôi trong việc

sử dụng vaccine phòng bệnh PMWS

Qua khảo sát các chỉ tiêu sinh lý máu giữa heo lô thí nghiệm được chủng ngừa vaccine phòng PMWS và heo lô đối chứng không chủng ngừa cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê

Trong nghiên cứu này, bằng kỹ thuật ELISA chúng tôi đã xét nghiệm hiệu giá kháng thể trên nhóm heo được chủng ngừa vaccine và nhóm đối chứng không được chủng ngừa từ đó rút ra được nhận xét đó là hiệu giá kháng thể ở nhóm được chủng ngừa cao hơn có ý nghĩa so với nhóm heo đối chứng tại thời điểm tái chủng lần thứ hai với P < 0,05

Chúng tôi đã khảo sát những yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả của thí nghiệm như quy trình lấy mẫu, nhiệt độ phòng thí nghiệm, nhiệt độ ủ đĩa ELISA, thể tích hóa chất sử dụng từ đó khuyến cáo quy trình ELISA tối ưu nhất

SUMMARY

“Evaluation of antibody titer and hematology in pigs after vaccination against postweaning multisystemic wasting syndrome – PMWS”

This thesis was carried out from February to July, 2009 in two pig farms

The aim of this study was to evaluate the effect in the use of vaccine against PMWS by determination of the titer of antibodies by ELISA and hematological examination in pigs From that, we can recommend some suggestions to farmers for using vaccine against PMWS

The results of hematological examination showed that there was no significant difference between immunized and control pigs groups

In this study, with ELISA method we tested antibodies titer between pigs immunized with vaccine against PMWS and control groups We recognized that pigs immunized with vaccine against PMWS induced significantly high serum antibodies level response to PCV2 compared to control group after second boosting with P < 0.05

To optimise the ELISA procedure, we conducted some factors that can influence on the results such as: sampling process, lab temperature, incubation temperature or volume of uesd chemical then, we suggested a suitable ELISA procedure to ensure the precision of result

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG x

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Nội dung thực hiện 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về hội chứng PMWS và PCV2 3

2.1.1 Lịch sử bệnh 3

2.1.2 Hội chứng PMWS do PCV2 4

2.1.3 Đặc điểm virus gây bệnh 4

2.1.4 Dịch tễ 5

2.1.5 Cách sinh bệnh 6

2.1.6 Triệu chứng 6

2.1.7 Một số bệnh thường nhiễm kèm với virus PCV2 6

2.1.7.1 Hội chứng viêm da viêm thận - PDNS 6

2.1.7.2 Hội chứng hô hấp phức tạp trên heo - PRDC 7

2.1.7.3 Chứng run bẩm sinh - CT 7

2.1.7.4 Virus gây cúm heo - SIV 7

2.1.8 Bệnh tích đại thể và vi thể 8

2.1.9 Chẩn đoán 8

2.1.10 Phòng và điều trị bệnh do PCV2 8

2.1.10.1 Phòng bệnh 8

2.1.10.2 Điều trị 9

2.2.10.3 Vaccine phòng hội chứng PMWS trên heo 9

2.2 Tổng quan về sinh lý máu heo 12

2.2.1 Hồng cầu 12

2.2.2 Bạch cầu 13

2.2.3 Tiểu cầu 13

2.2.4 Tỉ dung (Hematocrit) 14

2.2.5 Công thức bạch cầu 14

2.3 Tổng quan về ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 14

2.3.1 Nguyên lý kỹ thuật ELISA 14

2.3.2 ELISA trực tiếp 15

2.3.3 ELISA gián tiếp 16

2.3.4 Sandwich ELISA 16

2.4 Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước 17

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 19

3.2 Đối tượng thí nghiệm 19

3.3 Vật liệu và hóa chất sử dụng 19

3.4 Phương pháp nghiên cứu 20

3.4.1 Bố trí thí nghiệm 20

3.4.2 Lấy mẫu xét nghiệm 20

3.4.3 Thực hiện các chỉ tiêu sinh lý máu 21

3.4.3.1 Xác định số lượng hồng cầu 21

3.4.3.2 Xác định số lượng bạch cầu 21

3.4.3.3 Xác định công thức bạch cầu 22

3.4.3.4 Xác định hàm lượng hemoglobin 22

3.4.3.5 Xác định chỉ số hematocrit 22

3.4.4 Khảo sát hiệu quả chủng ngừa vaccine bằng phương pháp ELISA 22

3.4.4.1 Nguyên tắc bộ kit SERELISA 22

3.4.4.2 Pha loãng mẫu 23

3.4.4.3 Tiến hành phản ứng 24

3.4.5 Đánh giá quy trình ELISA 25

3.4.6 Xử lý số liệu 26

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát các chỉ tiêu sinh lý máu 27

4.1.1 Số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng Hb, chỉ số Ht 27

4.1.2 Công thức bạch cầu 29

4.1.3 Nhận xét quy trình thực hiện khảo sát các chỉ tiêu máu 32

4.2 Kết quả khảo sát hiệu giá kháng thể bằng kỹ thuật ELISA 33

4.3 Đánh giá quy trình ELISA 36

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC

EDTA: ethylenediamine tetraacetic acid

ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Eu: ELISA unit

PCV1: Porcine circovirus type 1

PCV2: Porcine circovirus type 2

PDNS: Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome

PMWS: Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome

PRDC: Porcine Respiratory Disease Complex

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Công thức bạch cầu máu heo 15

Bảng 3.1 Nội dung bố trí thí nghiệm ở trại (A) và trại (B) 21

Bảng 3.2 Tiền pha loãng mẫu ở các nồng độ 1:10; 1:100; và 1:1000 25

Bảng 3.3 Sơ đồ bố trí các mẫu thí nghiệm ELISA 26

Bảng 4.1 Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng Hb và chỉ số Ht heo trại (A) 28

Bảng 4.2 Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng Hb và chỉ số Ht heo trại (B) 29

Bảng 4.3 Công thức bạch cầu heo trại (A) qua các lần khảo sát 31

Bảng 4.4 Công thức bạch cầu heo trại (B) qua các lần khảo sát 32

Bảng 4.5 Hiệu giá kháng thể heo ở trại (A) qua các lần khảo sát 35

Bảng 4.6 Hiệu giá kháng thể heo ở trại (B) qua các lần khảo sát 36

Bảng 4.7 Kết quả giá trị CV qua 3 lần khảo sát và CV trung bình 38

DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Porcine Circovirus type 2 nhìn dưới kính hiển vi điện tử 4

Hình 2.2 Vaccine Circumvent™ PCV 11

Hình 2.3 Vaccine Circovac® 12

Hình 2.4 Phương pháp Sandwich ELISA 18

Hình 3.1 Bộ kit SERELISA® PCV2 Ab Mono Blocking 24

Hình 4.1 Lâm ba cầu (1) và bạch cầu đơn nhân (2) 31

Biểu đồ 4.2 Hiệu giá kháng thể heo ở trại (A) 35

Biểu đồ 4.3 Hiệu giá kháng thể heo ở trại (B) 36

Bên cạnh những thuận lợi trên thì ngành chăn nuôi heo vẫn còn tồn tại một số khó khăn nhất định, đáng quan tâm hơn cả là việc phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh Một trong những bệnh ảnh hưởng đến năng suất chăn nuôi heo là hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome – PMWS) Hội chứng này do virus PCV2 (Porcine Circovirus type 2) gây ra Heo mắc hội chứng PMWS thường bị phụ nhiễm với các mầm bệnh khác

Gần đây, nhiều trại chăn nuôi heo trong nước đang gặp phải tình trạng tỷ lệ heo còi tăng lên đáng kể (trích dẫn bởi Lê Nguyễn Phương Khanh, 2006) Vì vậy để góp phần cải thiện tình hình nhằm hạn chế hội chứng PMWS, nhiều nhà chăn nuôi đã và đang áp dụng chương trình chủng ngừa cho heo con Tuy nhiên việc sử dụng vaccine

có đạt hiệu quả tốt hay không vẫn còn đang là vấn đề cần được quan tâm Hơn nữa việc khảo sát cơ thể thú sau khi chủng ngừa vaccine có làm thay đổi các chỉ tiêu sinh

lý hay không là cần thiết Xuất phát từ tình hình trên, nhằm mục đích đưa ra những khuyến cáo cần thiết cho người chăn nuôi trong việc phòng ngừa và ngăn chặn hội chứng PMWS; chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát hiệu giá kháng thể và một số chỉ tiêu máu sau khi chủng ngừa vaccine phòng hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome - PMWS)”

1.2 Mục đích

Đánh giá hiệu quả sử dụng của vaccine thông qua việc xác định hiệu giá kháng thể và các chỉ tiêu sinh lý máu để đưa ra những khuyến cáo cho người chăn nuôi trong việc ngăn chặn và phòng ngừa bệnh PMWS

1.3 Yêu cầu

- Bố trí thí nghiệm trên hai trại heo công nghiệp: lô thí nghiệm được tiêm vaccine phòng hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa và lô đối chứng không được tiêm vaccine

- Thu thập mẫu máu của heo ở các lô

- Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu sinh lý máu

- Ly trích huyết thanh từ máu không kháng đông của các nhóm heo trên

- Xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh bằng phương pháp ELISA

- Đánh giá quy trình ELISA đã thực hiện

1.4 Nội dung thực hiện

- Khảo sát một số chỉ tiêu sinh lý máu: số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm

lượng hemoglobin, chỉ số hematocrit, công thức bạch cầu

- Khảo sát hiệu giá kháng thể kháng PCV2 sau khi chủng ngừa vaccine

- Đánh giá quy trình kỹ thuật ELISA

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về hội chứng PMWS và PCV2

Từ khoảng 5 năm trở lại đây, ngành chăn nuôi heo tại Bắc Mỹ đã phải gánh chịu nhiều thiệt hại quan trọng gây nên bởi Porcine Circovirus type 2 (PCV2) Heo con sau thời gian dứt sữa bị èo uột, ốm o gầy còm, nuôi không lớn, không tăng trọng, khi thì trắng bạch, khi thì vàng da Người ta gọi đây là hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa (Postweaning multisystemic wasting syndrome – PMWS) Hiện nay Circovirus cũng được báo cáo đang có mặt tại Việt Nam Đây là một bệnh rất phức tạp và thường kết hợp với nhiều bệnh lý khác (Nguồn: www.khoahoc.net)

Nhiều nghiên cứu còn cho biết PCV2 có liên quan đến các hội chứng khác trên heo như: hội chứng viêm da viêm thận trên heo (PDNS – Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome), hội chứng hô hấp phức tạp trên heo (PRDC – Porcine Respiratory Disease Complex), chứng run bẩm sinh trên heo (CT – Congenital Tremor) Những hội chứng này có thể xuất hiện cùng với PMWS, gây khó khăn cho việc chẩn đoán (Chae, 2005)

Cũng theo Neumann và ctv (2002) những mẫu huyết thanh heo tại Mỹ lưu trữ

từ năm 1969 khi đem xét nghiệm tìm kháng thể kháng PCV2 đã cho kết quả dương tính Hiện nay PMWS được báo cáo có ở hầu hết các nước nuôi heo trên toàn thế giới

2.1.2 Hội chứng PMWS do PCV2

Cụm từ PMWS được dùng để chỉ căn bệnh thường thấy ở heo con từ 60 – 80 ngày tuổi với các dấu hiệu gầy yếu, tiêu chảy, da tái hoặc bị vàng da và tỷ lệ chết có thể dao động từ 1 – 2% đến 10 – 25% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

PMWS gây thiệt hại kinh tế đáng kể và ảnh hưởng đến sức khỏe đàn heo trong ngành chăn nuôi heo công nghiệp của nhiều quốc gia Ngày nay, Circovirus thường được thấy kết hợp với những bệnh khác như viêm phổi, hội chứng bệnh ngoài da và thận (Porcine Dermatitis - Nephropathy Syndrome), viêm ruột (Enteritis), xảo thai và xáo trộn sinh sản (Abortion - Reproductive Failure) ở heo nái Trên heo sau cai sữa thì các biểu hiện như giảm cân, chậm lớn, viêm khớp và hô hấp có chiều hướng gia tăng (www.khoahoc.net)

2.1.3 Đặc điểm virus gây bệnh

Theo Nguyễn Ngọc Hải (2007) virus gây PMWS là một DNA virus chuỗi đơn

dạng vòng, không vỏ bọc, đối xứng hai mươi mặt, thuộc họ Circoviridae, thường được

gọi là Porcine Circovirus (PCV) Khi nghiên cứu về Circovirus, người ta nhận thấy có hai loại PCV: PCV1 và PCV2 PCV1 được phân lập vào năm 1974, thường nhiễm vào môi trường nuôi cấy tế bào thận heo PK-15 và không gây bệnh trên heo PCV2 mới xuất hiện gần đây và gắn với PMWS

Hình 2.1 Porcine Circovirus type 2 nhìn dưới kính hiển vi điện tử

(www.khoahoc.net)

PCV1 không gây ngưng kết hồng cầu ở thú và có tỷ trọng trong CsCl là 1,37 g/ml PCV1 chịu được sự bất hoạt ở pH = 3 và chloroform, ổn định ở 70oC trong 15 phút (Barbara và ctv, 2006) Bộ gene DNA của PCV1 gồm 1759bp và của PCV2 là 1768bp (Meehan và ctv, 1997)

Bộ gene của PCV1 và PCV2 gồm hai khung đọc mở chính (Open Reading Frame - ORF1 và ORF2) theo hướng trực tiếp đối diện nhau Tuy nhiên các kết quả nghiên cứu về gene của hai loại virus này cho thấy hai loại virus này rất khác nhau về mặt di truyền với bộ nhiễm sắc thể chỉ tương đồng 68 – 76%, trong đó ORF1 chỉ tương đồng khoảng 83% về trình tự nucleotide và 86% amino acid; ORF2 chỉ tương đồng khoảng 67% về trình tự nucleotide và 65% amino acid Khi giải mã trình tự gene khung đọc mở ORF2 của vỏ capsid virus, những phân lập PCV2 ở Châu Mỹ có tính tương đồng rất cao với các phân lập PCV2 trên thế giới Mặc dù có một số khác biệt

về gene của ORF2 nhưng vùng gene mã hóa đầu N cuối (N-terminal region) của ORF2 gần như không thay đổi ở tất cả các phân lập virus được nghiên cứu (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Kích thước bộ gene của ORF1 là 942bp và ORF2 mã hóa cho protein capsid là 699bp (Kim và ctv, 2002)

2.1.4 Dịch tễ bệnh PMWS

Những cuộc khảo sát huyết thanh ở Châu Âu và Bắc Mỹ đã chỉ ra rằng quá trình xâm nhiễm trải rộng trong nhiều đàn heo nhưng chỉ một phần nhỏ các đàn dương tính huyết thanh học là có lịch sử bệnh Heo con cũng có thể bị nhiễm bệnh trước khi cai sữa (http://www.thepigsite.com)

Trong các trại chăn nuôi, hội chứng PMWS có thể tồn tại rất dai dẳng từ 4 đến hơn 18 tháng Sự phân bố bệnh PMWS trong đàn heo nhiễm cũng rất thay đổi PCV2

có thể lan truyền giữa các đàn khi chuyển heo từ đàn này sang đàn khác hoặc thông qua những động vật trung gian mang mầm bệnh, dụng cụ, quần áo công nhân

Thực nghiệm gây nhiễm PCV2 cho heo nuôi thí nghiệm lúc 1 ngày tuổi, Krakowka và ctv (2001) đã phát hiện acid nucleic của PCV2 có trong phân, nước bọt

và nước mắt của heo sau 31 ngày gây nhiễm Ngoài ra PCV2 cũng được tìm thấy trong tinh dịch của những heo đực nhiễm bệnh và sẽ lây truyền virus qua giao phối (Kim và ctv, 2002)

2.1.5 Cách sinh bệnh PMWS

Hiện nay vẫn chưa có những nghiên cứu chính xác nào về cơ chế gây bệnh của PCV2 Sau khi gây bệnh thực nghiệm qua đường mũi hoặc tiêm tĩnh mạch, người ta nhận thấy có sự hiện diện của virus trong bạch cầu đơn nhân và đại thực bào ở phổi, hạch hạnh nhân, lách, hạch lympho và những cơ quan khác trong hệ thống miễn dịch (trích dẫn bởi Lê Nguyễn Phương Khanh, 2006) PCV2 có thể làm hư hại hệ thống miễn dịch bằng cách ức chế miễn dịch Ngoài ra virus PCV2 còn tác động làm giảm tiểu cầu nghiêm trọng gây xuất huyết mô kéo dài Sự tấn công virus vào gan làm các tế bào gan, tế bào Kupffer, tế bào nội mô bị sưng và triển dưỡng nên gan to ra; sau đó các

tế bào này sẽ bị dung giải nên giảm số lượng và kích thước gan teo lại, đồng thời mật

có thể bị ứ lại trong ống mật làm gan bị vàng (Neumann và ctv, 2002) Một số báo cáo chỉ ra rằng số lượng lympho bào bị giảm trong những con heo nhiễm PMWS

2.1.6 Triệu chứng của bệnh PMWS

Thời gian ủ bệnh của heo kéo dài từ 8 – 14 ngày, tỷ lệ bệnh và chết do PMWS rất khác nhau Ở những ổ dịch tỷ lệ chết có thể lên đến 10% - 20% Tuy nhiên, khoảng 50% heo bệnh có thể sống trong nhiều tuần với thể trạng yếu (Trần Thị Bích Liên và ctv, 2001) Triệu chứng đầu tiên là gầy còm trên heo Trong vòng 3 – 7 ngày, tăng trọng giảm đáng kể, ốm trơ xương Heo bệnh bỏ ăn, da nhợt nhạt, khó thở, tăng sinh hạch lympho đặc biệt là hạch bẹn; ngoài ra heo có thể bị ho, loét dạ dày và có triệu chứng thần kinh Do thiếu sức đề kháng nên heo thường có những biến chứng như viêm phổi có mủ, áp xe

PMWS thường đi kèm với một số bệnh khác như viêm phổi, viêm phổi – màng phổi, bệnh Glassers, Salmonellosis

2.1.7 Một số bệnh thường nhiễm kèm với virus PCV2

2.1.7.1 Hội chứng viêm da viêm thận (Porcine dermatitis and nephropathy syndrome – PDNS)

PDNS gây tổn thất ở một mức khá cao Sau hơn một tháng bị bệnh thì tỷ lệ chết

của các đợt riêng rẽ là khoảng 60% PDNS ghi nhận đầu tiên vào năm 1993 tại

Scotland, từ đó nó được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới, nhưng gần đây chúng được phát hiện là có thể kết hợp với hội chứng PMWS

Khi PDNS bùng phát cùng với PMWS, những nguyên nhân gây bệnh mãn tính của hai hội chứng này khó tách rời Trong một vài trường hợp, bệnh chuyển biến thành

căn bệnh hệ trọng, có khả năng lây nhiễm trên nhiều heo cùng một lúc (http://repbiotech.com) Những dấu hiệu đầu tiên là sự thương tổn da, xuất hiện đốm tròn đỏ có đường kính 1 – 20mm Một thời gian ngắn sau khi xuất hiện tổn thương da, heo bị sốt, chán ăn, sụt cân trầm trọng (Chae và ctv, 2004)

2.1.7.2 Hội chứng hô hấp phức tạp trên heo (Porcine Respiratory Disease Complex - PRDC)

Hội chứng hô hấp phức tạp trên heo là một bệnh nghiêm trọng đối với heo từ 16 – 22 tuần tuổi Bệnh gây ra sự chậm lớn, chán ăn, lờ đờ, sốt và ho Bệnh viêm phổi ở heo cùng với PRDC là do sự kết hợp của nhiều tác nhân virus ví dụ như PCV2, virus

cúm heo SIV, Mycoplasma hyopneumoniae Sự đồng xâm nhiễm PCV2 và PRDC

cũng gây ra những dấu hiệu hô hấp trầm trọng và suy gây tổn thương phổi Những dấu hiệu này không đặc hiệu và rất đa dạng Trong quá trình phát triển, PCV2 kết hợp với PRDCV sẽ làm cho heo chậm lớn, ho kéo dài PRDC khi kết hợp với PCV2 sẽ gây ra viêm phổi kẽ cùng với sự xơ hóa quanh phế quản Ngược lại, PMWS được xác định thông qua sự viêm hạt diện rộng, các tế bào đa nhân và một số lượng thể vùi ưa kiềm của virus có trong các đại thực bào (Chae và ctv, 2004)

2.1.7.3 Chứng run bẩm sinh (Congenital tremor – CT)

Congenital tremors (CT) type A2 có liên quan với PCV dẫn đến sự thiếu hụt myelin Hầu hết các heo bị hội chứng CT có tỷ lệ tế bào bị nhiễm PCV cao hơn so với heo bình thường, PCV được tìm thấy trong các mô gan và hệ thần kinh trung ương của heo bị nhiễm bệnh, não và tủy sống bị nhiễm PCV nhiều hơn so với các mô không thuộc hệ thần kinh Trong các mô không thuộc hệ thần kinh, đại thực bào là loại tế bào

dễ dàng bị xâm nhiễm nhất Phân tích PCR cho thấy chỉ có PCV2 mà không thấy PCV1 trên các nhóm heo khảo sát (Stevenson và ctv, 2001)

2.1.7.4 Virus gây cúm heo (Swine Influenza Virus – SIV)

Hiện nay người ta phát hiện virus này có thể kết hợp với PCV2 và làm tăng biểu hiện bệnh của PCV2 Theo Harm và ctv (2001) tỷ lệ PCV2 nhiễm ghép với SIV

là 19,3% Bằng kỹ thuật PCR kết hợp phân lập virus và kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, Choi và ctv (2003) ghi nhận có 54 trong 636 heo nhiễm ghép SIV và PCV2 (8,49%) khi phân tích các căn bệnh trên đường hô hấp của heo

2.1.8 Bệnh tích đại thể và vi thể

Bệnh tích đại thể chủ yếu là tổn thương mô, nhất là mô bạch huyết và mô phổi; hạch bạch huyết sưng to Phổi bị xơ cứng, dai, nặng, không xẹp khi bị bóp mạnh Lách cũng sưng lớn nhưng không sung huyết Vùng nối thực quản với dạ dày bị loét, vách

dạ dày sưng phù Ruột viêm, thành ruột mỏng, màng treo ruột và manh tràng phù thủng Bệnh tích viêm gan, thận sưng lớn đồng thời phù thủng cũng có thể được nhìn thấy Ngoài ra, tuyến ức kém phát triển, các mô liên kết phù thủng và tích dịch trong xoang ngực, xoang bụng và bao tim

Sự phân bố và mức độ bệnh tích vi thể tại các cơ quan tùy thuộc vào từng giai đoạn bệnh Bệnh tích đặc trưng tại các cơ quan lympho là sự suy giảm tế bào lympho Đại thực bào đa nhân thường xuất hiện, đặc biệt tại mảng Peyer’s và hạch bạch huyết Thể vùi trong bào tương và lympho bào hoại tử cũng hiện diện tại mảng Peyer’s và hạch hạnh nhân (trích dẫn bởi Lê Nguyễn Phương Khanh, 2006)

2.1.10 Phòng và điều trị bệnh do PCV2 gây ra

2.1.10.1 Phòng bệnh do PCV2 gây ra

Các bác sĩ thú y và các nhà chăn nuôi đang cố gắng tìm tòi những biện pháp nhằm ngăn chặn và kiểm soát các bệnh liên quan đến PCV2 Bởi vì PCV2 là một loại virus, nên giải pháp sử dụng kháng sinh không giúp ngăn ngừa và xử lý bệnh Một số báo cáo gợi ý rằng khi vi khuẩn xâm nhiễm đồng thời với PCV2 thì việc sử dụng kháng sinh mới đạt hiệu quả cao Hầu hết những thành công trong việc quản lý bệnh

đều xuất phát từ việc tuân thủ theo những nguyên tắc an toàn sinh học, hệ thống vệ sinh tốt, chiến dịch sản xuất, quản lý môi trường và kiểm soát các bệnh khác

Thực hành an toàn sinh học và hạn chế các trường hợp nhập đàn; kiểm soát côn trùng, sâu bọ, gặm nhấm; tẩy trùng trước và sau khi vào trại Sử dụng công cụ và thiết

bị sạch sẽ để ngăn chặn sự lây lan cũng như mức độ trầm trọng của quá trình xâm nhiễm Tập cho thú thích nghi với khí hậu nơi ở mới trước khi nhập đàn, đảm bảo hàm lượng sữa non thú con được nhận, giảm kích thước đàn Kiểm soát môi trường sống, chuồng trại thông thoáng, không ẩm mốc cũng giúp làm giảm sự tác động của PCV2 Kiểm soát các mầm bệnh khác cũng là một giải pháp để tránh các vấn đề tiềm ẩn có liên quan đến PCV2 (Neumann và ctv, 2002) Hơn nữa, chiến dịch tiêm chủng vaccine cũng được áp dụng để phòng bệnh trên nhiều đàn heo

2.1.10.2 Điều trị bệnh do PCV2 gây ra

Đến nay vẫn chưa có biện pháp điều trị PMWS nào hoàn toàn triệt để Các chiến lược điều trị hiện nay thường tập trung vào những bệnh phụ nhiễm Những nghiên cứu về huyết thanh đã cho thấy hầu 100% ở những con heo sắp xuất chuồng (80 – 100 kg) đều có PCV2 trên những trang trại bị nhiễm bệnh Kinh nghiệm thực địa cho thấy việc sử dụng huyết thanh của những con heo này có giá trị trong cả việc ngăn chặn và điều trị bệnh Heo con có thể được điều trị trong thời gian cai sữa từ 3 tuần trở

đi, hoặc ngay từ lúc bắt đầu phát bệnh (trích dẫn bởi Nguyễn Kim Ngân, 2006)

2.1.10.3 Vaccine phòng hội chứng PMWS trên heo

Vaccine luôn luôn đóng một vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa các bệnh

do virus gây ra Vaccine thường sử dụng là vaccine bất hoạt hoặc vaccine sống đã bị biến đổi Vaccine bất hoạt gây ra phản ứng miễn dịch giới hạn do đó thường không đủ

để bảo vệ cơ thể Vaccine sống đã bị biến đổi khá khó để sản xuất, đồng thời có những vấn đề liên quan đến sự an toàn khi sử dụng virus làm vaccine Do đó, gần đây vaccine tiểu đơn vị protein và vaccine DNA đang được chú trọng sử dụng (Ju và ctv, 2005)

Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh được hiệu lực của vaccine tiểu đơn vị tái tổ hợp trong tế bào côn trùng Những nghiên cứu gần đây đều nhằm đến mục đích ngăn ngừa và kiểm soát PCV2 bằng cách sử dụng protein capsid của PCV2 như là một loại vaccine tiểu đơn vị Vaccine tiểu đơn vị có thể được xem là loại vaccine an toàn nhất nên được phát triển Một phương pháp để sản xuất vaccine tiểu đơn vị đó là sử dụng

hệ thống biểu hiện baculovirus để biểu hiện protein ORF2 của PCV2 Protein này có

thể tự động sắp xếp tạo thành những phần giống như PCV2, chúng có cấu trúc được xếp theo thứ tự và có tính lặp lại cao giúp tạo ra những phản ứng dịch thể và phản ứng

tế bào nhanh và mạnh (Fan và ctv, 2007)

Gần đây, vaccine DNA và vaccine tiểu đơn vị ORF1 và ORF2 của PCV2 đã được nghiên cứu phát triển và chứng minh rằng có hiệu quả bảo hộ cho heo phòng sự xâm nhiễm của PCV2 Một virus khảm được tạo ra bằng cách thay thế gene vỏ capsid của PCV1 bằng gene vỏ capsid của PCV2 và kết quả tạo ra virus PCV1 – 2 nhược độc trong cơ thể heo Virus này sẽ kích thích hệ thống miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu kháng lại protein vỏ capsid và tạo tính miễn dịch giúp cơ thể chống lại PCV2 hoang dại (Ju và ctv, 2005) Ngoài ra, các tác giả này cũng nghiên cứu sự tái tổ hợp giữa PCV2 và virus gây bệnh giả dại – PRV tạo ra một loại virus mới là PRV – PCV2 để biểu hiện protein dung hợp ORF1 – ORF2 của PCV2 bằng cách sử dụng virus giả dại

bị đột biến làm vector Virus tái tổ hợp này sẽ kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể

Circumvent PCV là vaccine PCV2 nhận được giấy phép của Bộ Nông Nghiệp

Mỹ (USDA) vào tháng 10/ 2005 Vaccine được cung cấp cho các bác sĩ thú y bắt đầu

từ tháng 4/ 2006 tuy nhiên vẫn còn giới hạn và đến năm 2007 số lượng vaccine trở nên dồi dào để đáp ứng được cho nhu cầu thị trường

Hình 2.2 Vaccine Circumvent™ PCV

(www.circumventpcv.com)

Vaccine Circumvent có khả năng làm giảm sự hoành hành của bệnh và còn cho phép heo duy trì sự phát triển bình thường, thêm vào đó còn giảm được tỷ lệ heo chết Các nghiên cứu có liên quan tới chương trình tiêm chủng Circumvent PCV vào 3

và 6 tuần tuổi chỉ ra rằng sự tăng trưởng được cải thiện giữa lô được tiêm vaccine và lô đối chứng Circumvent PCV có chứa tá dược Microsol Diluvac Forte® (MDF) là một

tá dược hiệu quả cao và an toàn trong hàng triệu liều vaccine (Intervet Inc., 2007)

 Vaccine Circovac®

Circovac là loại vaccine nhũ dầu bất hoạt phòng Porcine Circovirus type 2 Mỗi liều 2ml hoàn nguyên có chứa: PCV2 bất hoạt; 2,1log10 đơn vị ELISA, tá dược: Thiomersal 0,2mg, 2 ml nhũ dầu

Khi tiêm vaccine cho heo, hệ thống miễn dịch của heo sẽ nhận ra virus bất hoạt

là một tác nhân ngoại lai và sản xuất kháng thể để tiêu diệt chúng Những kháng thể này được truyền từ heo mẹ sang heo con thông qua sữa non nhờ đó giúp heo con chống lại sự xâm nhiễm của PCV2 sau khi được sinh ra

Hình 2.3 Vaccine Circovac® (www.viphavet.com)

Hiệu quả của các liều thử nghiệm đã chỉ ra rằng việc tiêm chủng vaccine cho heo mẹ bằng Circovac có thể làm giảm những tổn thương có liên quan đến Circovirus trong các mô bạch huyết của heo con Tỷ lệ heo chết do PCV2 ở các trại được thử nghiệm giảm từ 3,6% đến 10% (European Medicines Agency)

2.2 Tổng quan về sinh lý máu heo

2.2.1 Hồng cầu

Chức năng hồng cầu: Vận chuyển O2, CO2 và tham gia điều hòa pH máu Đường kính hồng cầu từ 4 – 8 µm (0,004 – 0,008 mm) và đặc trưng cho từng loài Hồng cầu hình cầu, dẹp và phẳng Hồng cầu ở loài có vú không nhân, lõm ở giữa, ở gia cầm có hình bầu dục, lồi hai mặt Các yếu tố ảnh hưởng đến số lượng hồng cầu trong máu: phái tính, tuổi, vận động, dinh dưỡng, mang thai, tiết sữa, cao độ và hoạt động vật lý

Chức năng hô hấp của hồng cầu do hemoglobin (Hb) đảm nhận Hb chiếm xấp

xỉ 95% hàm lượng protein hồng cầu và chiếm khoảng 35% khối lượng hồng cầu Phân

tử Hb kết hợp và phóng thích oxy dễ dàng làm hồng cầu có màu đỏ Hb có chức năng chuyên chở O2 từ máu đến mô, tham gia quá trình hô hấp và chức năng đệm (điều hòa

pH máu) Khi hồng cầu bị hủy, bilirubin được hình thành, vận chuyển đến gan để tổng hợp sắc tố mật, còn globin và sắt được tái hấp thu để tạo hồng cầu mới Trường hợp bệnh lý, hàm lượng Hb tăng trong những bệnh gây mất nước, tiêu chảy, nôn mửa, các bệnh làm tăng quá trình thẩm thấu, bệnh xoắn ruột, trúng độc cấp tính Hb giảm trong

các bệnh thiếu máu, việc giảm Hb có thể do hàm lượng chất này trong hồng cầu giảm, hoặc do số lượng hồng cầu giảm (Trần Thị Dân và Dương Nguyên Khang, 2006)

2.2.2 Bạch cầu

Tất cả các bạch cầu đều lớn hơn hồng cầu, chúng có nhân, bào quan và hạt Số lượng bạch cầu giảm khi bị bệnh do siêu vi, tăng khi cơ thể bị nhiễm trùng và nhiễm trùng kéo dài Có năm loại bạch cầu chia làm hai nhóm: bạch cầu hạt và bạch cầu không hạt Bạch cầu có hạt có ba loại: trung tính, ưa acid và ưa base; bạch cầu không hạt có hai loại: đơn nhân lớn và lâm ba cầu

Bạch cầu trung tính có kích thước 10 – 15 µm, chiếm hơn 50% trong tổng số bạch cầu, hầu hết dự trữ trong xương Giai đoạn còn non, nhân hình móng ngựa, gậy; khi già nhân chia 2 – 5 thùy nên gọi là bạch cầu đa nhân Bạch cầu trung tính tăng nhiều trong bệnh truyền nhiễm, phản ứng viêm có mủ, ngộ độc, tiêm protein lạ vào cơ thể; bạch cầu này có thể thực bào vi khuẩn và vật nhỏ nên được gọi là tiểu thực bào

Bạch cầu ưa acid có kích thước 14 – 20 µm Nhân hình móng ngựa, bầu dục, ba

lá Tế bào chất có hạt bắt màu eosin Bạch cầu ưa acid tăng trong trường hợp nhiễm ký sinh trùng, dị ứng, bệnh trên da Bạch cầu ưa acid có ít khả năng thực bào và tiêu hóa

vi khuẩn

Bạch cầu ưa base có kích thước 10 – 18 µm, có rất ít trong máu Bạch cầu ưa base chứa hạt phân tiết histamine và heparine, dạng polysaccharide và sulphate Bạch cầu ưa base có vai trò đáp ứng dị ứng

Bạch cầu đơn nhân có kích thước 14 – 22 µm, còn gọi là đại thực bào Có vai trò loại bỏ các mô bào chết Bạch cầu đơn nhân nằm trong mạch máu chỉ vài giờ sau

đó cư trú ở mô bào

Lâm ba cầu (bạch cầu lympho) lớn có kích thước 10 – 18 µm, lâm ba cầu nhỏ

có kích thước khoảng 6 – 10 µm, có khả năng vận động amip giới hạn; được tạo thành

từ nốt bạch huyết, lách và tuyến ức Lâm ba cầu có thể sống nhiều năm Lâm ba cầu bảo vệ cơ thể bằng cách kích thích hệ thống miễn dịch tạo kháng thể tiêu diệt vi sinh vật và chống tế bào ung thư (Trần Thị Dân và Dương Nguyên Khang, 2006)

2.2.3 Tiểu cầu

Tiểu cầu hình bầu dục, hình thoi, kích thước 2 – 4µm Khi mạch máu bị vỡ tiểu cầu gắn vào vết thương, giải phóng các chất phân giải ngoại bào trong túi bào quan qua hệ thống kênh Tiểu cầu không nhân nên không có khả năng phân chia tế bào Số

tiểu cầu nhiều hơn bạch cầu 20 – 40 lần, số lượng trong máu khoảng 150.000 - 600.000 tiểu cầu/mm3 Số tiểu cầu giảm trong bệnh truyền nhiễm cấp tính, choáng và

dị ứng Đời sống trung bình của tiểu cầu là 10 ngày, bị tiêu diệt bởi đại thực bào ở gan

và lách (Trần Thị Dân và Dương Nguyên Khang, 2006)

2.2.4 Tỉ dung (Hematocrit)

Tế bào máu dễ dàng tách khỏi huyết tương bằng cách quay ly tâm Hồng cầu lắng xuống đáy, bạch cầu và tiểu cầu hiện diện lớp mỏng bên trên hồng cầu Phần trăm thể tích giữa hồng cầu với máu được gọi là tỉ dung (hematocrit) Hồng cầu lắng xuống đáy vì có tỷ trọng lớn hơn huyết tương So với nước, tỉ trọng hồng cầu 1,09; bạch cầu 1,07 và huyết tương 1,03 Tỉ dung trung bình của heo là 40% (Dương Nguyên Khang, 2006) Và biến thiên trong khoảng 30 – 50% Tỉ dung trong máu gia súc thay đổi trong

cả điều kiện sinh lý bình thường, kích thước hồng cầu, dinh dưỡng, cao độ, vận động

Bảng 2.1 Công thức bạch cầu máu heo

Loại bạch

cầu

Bạch cầu trung tính

Bạch cầu đơn nhân

Tỷ lệ (%) 45 – 55 2 – 3 0,0 – 0,8 40 – 50 2 - 6

(Dương Nguyên Khang, 2006)

2.3 Tổng quan về ELISA

2.3.1 Nguyên lý kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung đều dựa trên cơ sở

sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện (John, 2002)

Kỹ thuật ELISA được thực hiện trên đĩa 96 giếng Dưới mỗi giếng có phủ protein có thể bắt với kháng thể cần kiểm tra Mẫu máu được tách lấy huyết thanh có

kháng thể (còn gọi là kháng thể sơ cấp) Huyết thanh được ủ trong giếng, và mỗi giếng

có chứa một huyết thanh khác nhau Trong 96 mẫu kiểm tra còn có một mẫu huyết thanh đối chứng dương và một mẫu huyết thanh đối chứng âm

Sau một khoảng thời gian, huyết thanh và các kháng thể không bám sẽ bị rửa trôi Để phát hiện kháng thể bám, một kháng thể thứ hai có gắn enzyme như peroxidase hoặc alkaline phosphatase được thêm vào mỗi giếng Những enzyme này

có thể chuyển hóa cơ chất không màu thành sản phẩm có màu Sau giai đoạn ủ, dung dịch kháng thể thứ hai này được rửa đi và những kháng thể không bắt cặp cũng bị rửa trôi Bước cuối cùng là thêm vào cơ chất của enzyme để tạo ra sản phẩm phát màu trong các giếng

Khi phản ứng enzyme được hoàn tất, toàn bộ đĩa ELISA được đem đi đo mật độ quang cho từng giếng nhờ máy đọc đĩa Lượng sản phẩm phát màu phản ánh lượng kháng thể sơ cấp gắn với protein ở đáy mỗi giếng (http://www.bio.davidson.edu)

Có 3 phương pháp chính làm nền tảng cho tất cả các kỹ thuật ELISA: ELISA trực tiếp, LISA gián tiếp và ELISA Sandwich Tất cả 3 hệ thống trên có thể được sử dụng làm cơ sở cho các xét nghiệm ELISA cạnh tranh và ELISA ức chế

2.3.2 ELISA trực tiếp – Direct ELISA

ELISA trực tiếp có thể được xem là dạng ELISA đơn giản nhất Kỹ thuật ELISA trực tiếp sử dụng phương pháp đánh dấu kháng thể trực tiếp Các đĩa được phủ mẫu có chứa kháng nguyên đích, và sự gắn kết với các kháng thể có đánh dấu được định lượng bằng phương pháp so màu, phát quang hóa học, hoặc chấm điểm huỳnh quang Khi cho kháng thể thứ hai vào, kỹ thuật ELISA trực tiếp sẽ trở nên khá nhanh

và tránh được nhiều vấn đề tiềm ẩn như phản ứng chéo của kháng thể thứ hai với các thành phần có trong mẫu kháng nguyên Tuy vậy, phương pháp ELISA trực tiếp đòi hỏi phải đánh dấu kháng thể sử dụng, gây mất nhiều thời gian và chi phí đắt (http://www.komabiotech.com)

Theo John (2002) kháng nguyên được pha loãng trong buffer, thường là buffer carbonate/bicarbonate có pH cao (9,6) hoặc trong phosphate-buffered saline (PBS) trung tính Sau giai đoạn ủ là giai đoạn rửa để loại bỏ kháng nguyên không bám dính Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên và được đánh dấu enzyme được thêm vào và kết hợp đặc hiệu tại những vị trí kháng nguyên trên bề mặt rắn

Ở giai đoạn ủ, kháng thể nối với kháng nguyên Sau đó rửa thêm một lần nữa để loại bỏ các kháng thể không bám Sau đó thêm cơ chất thích hợp, hoặc tổ hợp cơ chất/chất tạo sắc tố (substrate/chromogen) để enzyme đặc hiệu bám vào kháng thể Mục tiêu được phát hiện dựa vào phản ứng màu thông qua xúc tác enzyme Phản ứng xảy ra sau khi cho dung dịch kết thúc bằng cách thay đổi pH của hệ thống hoặc là thêm vào chất ức chế Cuối cùng, màu được định lượng bằng máy đọc quang phổ với bước sóng thích hợp

2.3.3 ELISA gián tiếp – Indirect ELISA

Trong kỹ thuật này, các kháng nguyên đã biết trước được gắn lên giá thể (các giếng của vỉ nhựa polystyrene hoặc màng lai…), dung dịch mẫu chẩn đoán và đối chứng được cho vào các giếng, ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định (tùy theo bộ kit của nhà sản xuất), sau đó mẫu ủ được rửa và cho tác dụng với kháng kháng thể có gắn enzyme, lại ủ mẫu trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định, rửa mẫu

và cuối cùng cơ chất tương ứng với enzyme được cho vào trong mẫu Phản ứng giữa enzyme và cơ chất tương ứng nếu xảy ra sẽ tạo màu và cường độ màu tạo tỷ lệ thuận với lượng kháng thể có trong mẫu đặc hiệu với kháng nguyên đã biết Kết quả của phản ứng ELISA được đọc tùy theo loại tác nhân chẩn đoán và tùy theo hãng sản xuất

bộ hóa chất sử dụng (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

2.3.4 Sandwich ELISA

Một kỹ thuật ít thông dụng hơn đó là Sandwich ELISA, được sử dụng để xét nghiệm kháng nguyên trong mẫu Các bước được thực hiện như sau:

 Chuẩn bị bề mặt bám của kháng thể

 Khóa những vị trí bám không đặc hiệu trên bề mặt

 Cho mẫu chứa kháng nguyên vào đĩa

 Rửa đĩa để loại bỏ những kháng nguyên không bám

 Cho kháng thể sơ cấp bám đặc hiệu với kháng nguyên

 Cho kháng thể thứ cấp có gắn enzyme và bám đặc hiệu với kháng thể sơ cấp

 Rửa đĩa để loại bỏ những kháng thể không bám

 Cho hóa chất được chuyển hóa bởi enzyme thành dấu hiệu điện hóa, huỳnh quang hoặc những sản phẩm màu

 Đo sự hấp thụ hoặc các tín hiệu huỳnh quang của các giếng để định lượng và định tính kháng nguyên

Hình 2.4 Phương pháp Sandwich ELISA

(1) Đĩa được phủ kháng thể bắt giữ; (2) mẫu có kháng nguyên được thêm vào để gắn kết với kháng thể bắt giữ; (3) kháng thể phát hiện được thêm vào, và gắn kết với kháng nguyên; (4) kháng thể thứ cấp có gắn enzyme được thêm vào và gắn kết với kháng thể phát hiện; (5) cơ chất được thêm vào và được enzyme chuyển hóa thành sản phẩm phát màu (vi.wikipedia.org)

Hình 2.4 mô tả việc sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn enzyme, mặc dù về mặt

kỹ thuật thì điều này không cần thiết nếu kháng thể sơ cấp được gắn enzyme Tuy nhiên, việc sử dụng kháng thể thứ cấp tránh những công đoạn tạo kháng thể gắn enzyme cho mỗi kháng nguyên Thuận lợi chính của phương pháp Sandwich ELISA

đó là khả năng sử dụng mẫu thô hoặc chưa được tinh sạch nhưng vẫn có thể gắn chọn lọc với kháng nguyên hiện diện trong mẫu Nếu không có lớp kháng thể bắt giữ thứ nhất, protein trong mẫu (bao gồm protein huyết thanh) sẽ hấp thụ cạnh tranh vào bề mặt đĩa làm giảm số lượng kháng nguyên cố định (http://en.wikipedia.org)

2.4 Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.4.1 Các công trình nghiên cứu trong nước

Lê Hồng Hạnh (2005) đã ứng dụng kỹ thuật PCR báo cáo tỷ lệ heo dương tính với virus PCV2 cao nhất thuộc nhóm heo 9 – 11 tuần tuổi (40%), thấp nhất ở nhóm heo 12 – 18 tuần tuổi (28,58%)

Bằng kỹ thuật PCR, Lâm Thị Thu Hương và ctv (2005) ghi nhận trong 25 heo biểu hiện còi tại một số trại heo công nghiệp ở Tp HCM và các vùng phụ cận có 9 con dương tính với virus PCV2 (36%)

Bằng phương pháp miễn dịch lên men peroxidase trên tế bào một lớp (IPMA), Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2006) báo cáo PCV2 xuất hiện ở Việt Nam ít nhất từ năm 2000 Theo tác giả này, tỷ lệ huyết thanh dương tính với virus PCV2 là 38,97% (53/136) vào năm 2000; 84,90% (270/318) vào năm 2003 – 2004 và 90,26% (482/534) vào năm 2005

2.4.2 Các công trình nghiên cứu nước ngoài

Năm 2001 tại Hàn Quốc, Lyoo và ctv báo cáo tỷ lệ nhiễm virus PCV2 là 40% (1998), 41,2% (1999) và 59,3% (2000) Tại Mỹ, Stevenson (2000) đã phát hiện 17 trại

có heo mắc hội chứng PMWS và ghi nhận rằng tất cả heo bệnh đều gầy còm và có tỷ

lệ chết trong khoảng 10 – 15%

Tại Tây Ban Nha, Segalés và ctv (2003) báo cáo có 500 đàn heo mắc hội chứng PMWS vào năm 2002 và tỷ lệ chết trong khoảng 15 – 20% Năm 1999, Ellis và ctv đã nghiên cứu thành công kỹ thuật PCR phát hiện virus PCV2 Đoạn mồi do tác giả này thiết kế khuếch đại đoạn DNA đặc trưng của virus có kích thước 481bp

Tại Hàn Quốc, Harmel và ctv (1998) đã thiết kế đoạn mồi cho kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn DNA đặc trưng của virus PCV2 có kích thước 361bp Tại Ý, Cerioli

và ctv (2003) đã nghiên cứu so sánh 3 phương pháp phát hiện virus PCV2 trên mẫu hạch bẹn Kết quả là phương pháp PCR nhạy nhất (phát hiện 78% mẫu dương tính với virus PCV2), kế đến là kỹ thuật mô miễn dịch dưới kính hiển vi điện tử (45,7% mẫu dương tính với virus PCV2) và thấp nhất là kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (23,2% mẫu dương tính với virus PCV2)

Qua quá trình nghiên cứu, Neilly và ctv (2002) cho biết kỹ thuật hóa mô miễn dịch, phân lập định lượng virus và ELISA bắt kháng nguyên đã phân biệt được heo nhiễm virus hay heo bệnh Larochelle và ctv (1999) đã nghiên cứu kỹ thuật Multiplex – PCR nhằm phát hiện Porcine Circovirus