THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes KÍCH THÍCH SỰ GIA TĂNG TINH DẦU VÀ HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG CÂY BẠC HÀ (Mentha piperita L.) TRỒNG TRONG HỆ THỐNG THỦY CANH

Đề tài tiến hành trồng và khảo sát các chỉ tiêu sinh trưởng về số lá, chiều cao, trọng lượng thân, trọng lượng rễ của cây bạc hà trồng thủy canh tĩnh có bổ sung 2 dòng vi khuẩn dòng TR7

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes

KÍCH THÍCH SỰ GIA TĂNG TINH DẦU VÀ HÀM LƯỢNG

CÁC CHẤT TRONG CÂY BẠC HÀ (Mentha piperita L.)

TRỒNG TRONG HỆ THỐNG THỦY CANH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes

KÍCH THÍCH SỰ GIA TĂNG TINH DẦU VÀ HÀM LƯỢNG

CÁC CHẤT TRONG CÂY BẠC HÀ (Mentha piperita L.)

TRỒNG TRONG HỆ THỐNG THỦY CANH

KS.TRỊNH THỊ PHI LY

Tháng 8/2009

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

TS Trần Thị Lệ Minh, KS Trịnh Thị Phi Ly đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Th.S Nguyễn Vũ Phong đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình làm đề tài

Thầy Bùi Minh Trí đã cung cấp giống vi khuẩn cho em thực hiện đề tài

Các anh chị tại Vườn Ươm Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp

Các anh chị phụ trách phòng Hóa Lý, Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm Tp HCM đã giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Các bạn Nguyễn Thị Đức Thi, Nguyễn Thị Minh Trang, Nguyễn Thị Thoan đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

Toàn thể các bạn trong lớp DH05SH đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm đề tài tốt nghiệp

Các em Trinh, Trang, Bảo lớp DH06SH đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình làm đề tài

Con thành kính ghi ơn ba mẹ cũng những người thân trong gia đình đã luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập

Chân thành cảm ơn!

Tháng 07 năm 2009

Lê Thị Nhàn

iii

TÓM TẮT

Hợp thất thứ cấp có nhiều giá trị kinh tế Một trong những con đường làm tăng

tích lỹ hợp chất thứ cấp là sử dụng vi khuẩn A.rhizogenes Đã có công trình nghiên

cứu đối với cây cà độc dược có bổ sung vi khuẩn trồng thủy canh thì hợp chất thứ cấp

của cây tăng Vì thế đề tài “THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG VI KHUẨN A.rhizogenes

KÍCH THÍCH SỰ GIA TĂNG TINH DẦU VÀ HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG

CÂY BẠC HÀ (Mentha piperita L.) TRỒNG TRONG HỆ THỐNG THỦY CANH”

được tiến hành Đề tài được thực hiện tại trường Đại học Nông Lâm TP HCM từ 2/2009 đến 7/2009

Đề tài tiến hành trồng và khảo sát các chỉ tiêu sinh trưởng về số lá, chiều cao, trọng lượng thân, trọng lượng rễ của cây bạc hà trồng thủy canh tĩnh có bổ sung 2 dòng vi khuẩn (dòng TR7 và 11325) với mật độ khác nhau tại nhà lưới thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh; so sánh hàm lượng tinh dầu, hàm lượng menthol và menthone trong cây bạc hà trồng thủy canh bổ sung các nồng độ vi khuẩn của 2 dòng khác nhau, từ đó tìm ra được mật độ vi khuẩn tạo điều kiện cho cây sinh trưởng, phát triển và tạo được hàm lượng tinh dầu menthol, menthone tốt nhất; khảo sát về sự tăng trưởng về chiều cao, số lá, trọng lượng thân, trọng lượng rễ, số rễ tơ (rễ phụ), hàm lượng tinh dầu, hàm lượng menthol và menthone giữa mẫu bạc hà có bổ sung nồng độ vi khuẩn tốt nhất ở trên với mẫu không có bổ sung vi khuẩn; so sánh cây trồng trong hệ thống thủy canh tĩnh và hoàn lưu

Bạc hà trồng trong hệ thống thủy canh có bổ sung vi khuẩn tăng trưởng về trọng lượng thân, trọng lượng rễ, số rễ tơ, hàm lượng tinh dầu, hàm lượng menthol cao hơn mẫu không có bổ sung vi khuẩn

Giữa hai dòng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes bổ sung vào cây thì mẫu bổ

sung dòng 11325 cho sự phát triển cũng như hàm lượng tinh dầu, menthol và cao hơn mẫu bổ sung dòng TR7

iv

SUMMARY

Thesis: "ESSAY FOR USING BACTERIA Agrobacterium rhizogenes TO

STIMULATE THE YIELD OF ESSENTIAL OIL AND MAIN COMPOUNDS IN MINT

(Mentha piperita L ) PLANTED IN HYDROPONICS SYSTEM” was carried out at the

Nong Lam University TP HCM, Ho Chi Minh City, from 2 / 2009 to 7 / 2009

The goal of experiment: Planting and studying growth quotient about the number of leaves, height, body weight, weight of roots of mints, that were planted in aquatic cultivation environment and have added concentration of bacteria of two different lines (lines TR7 and 11325) in nursery garden, Derpartment of Biotechnology, Nong Lam University, Ho Chi Minh city; comparison the essential oil, menthol and menthone content in mint planted in aquatic cultivation medium with additional concentration of bacteria of two different lines From that, we choose the one which suitable for not only mass raising but also the yield of the essential oil, menthol and menthone; studying on the growth of height, leaves number, body weight, root weight, number aerial roots, the essential oil, menthol and menthone content between the type of adding the best concentration of above bacteria, and another without additional bacteria Comparison mints planted in circulation and tranquil hydroponics system

Mints planted in the hydroponic system which were added concentration of bacteria had the yield of, body weight, root weight, number of aerial roots, the essential oil, menthol and menthone are higher than the other one

Line 11325 was better than line TR7

v

MỤC LỤC

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng x

Danh sách các hình xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2.Yêu cầu đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về bạc hà 3

2.1.1 Nguồn gốc 3

2.1.2 Phân loại 3

2.1.3 Đặc điểm thực vật học 5

2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển 6

2.1.5 Điều kiện sinh thái 7

2.1.6 Thời vụ 8

2.1.7 Công dụng của tinh dầu bạc hà 9

2.2 Trồng cây bạc hà 9

2.2.1 Giống và chất lượng giống 9

2.2.2 Kỹ thuật trồng 10

2.2.2.1 Làm đất 10

2.2.2.2 Trồng 10

2.2.3 Bón phân 11

2.2.4 Phương pháp trồng cây thủy canh 11

2.3 Phương pháp chưng cất hơi nước 12

2.3.1 Phương pháp chưng cất bằng nước 12

vi

2.3.2 Phương pháp chưng cất bằng nước và hơi nước 13

2.3.3 Phương pháp chưng cất bằng hơi nước 14

2.4 Phương pháp sắc ký 15

2.4.1 Phương pháp sắc ký cột 16

2.4.2 Phương pháp sắc ký khí 17

2.5 Giới thiệu về vi khuẩn A rhizogenes 18

2.5.1 Vị trí phân loại 18

2.5.2 Đặc điểm chung vi khuẩn A rhizogenes 18

2.5.3 Ri-plasmid .19

2.5.4 Chức năng T-DNA 20

2.5.5 Chức năng các gene vir 20

2.6 Cơ chế chuyển T-DNA vào bộ gen của tế bào chủ 20

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 23

3.2 Vật liệu 23

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 23

3.2.2 Hóa chất và thiết bị 23

3.2.3 Môi trường nuôi cấy 23

3.2.3.1 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 23

3.2.3.2 Môi trường trồng thủy canh 22

3.3 Nội dung nghiên cứu 24

3.4 Phương pháp nghiên cứu 24

3.4.1 Chuẩn bị cây con cho vào hệ thống thủy canh 24

3.4.2 Chuẩn bị vi khuẩn 25

3.4.3 Ly trích tinh dầu 26

3.4.4 Xác định hàm lượng menthol và menthone 28

3.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn 28

3.4.5.1 Khảo sát sự sinh trưởng, phát triển 28

3.4.5.2 Xác định hàm lượng tinh dầu 29

3.4.5.3 Xác định hàm lượng menthol và menthone 30

3.4.6 Khảo sát cây bạc hà bổ sung vi khuẩn và không bổ sung vi khuẩn 30

vii

3.4.6.1 Khảo sát đặc điểm sinh học, so sánh sự sinh trưởng và phát triển 30

3.4.6.2 Xác định hàm lượng tinh dầu 31

3.4.6.3 Xác định hàm lượng menthol và menthone trong tinh dầu 31

3.4.7 So sánh cây bạc hà bổ sung vi khuẩn trồng thủy canh tĩnh và hoàn lưu 32

3.4.8 Xử lí số liệu 32

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 So sánh ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TR7 và 11325 32

4.1.1 Sự sinh trưởng và phát triển 32

4.1.2 So sánh hàm lượng tinh dầu 35

4.1.3 So sánh hàm lượng menthol và menthone 36

4.2 So sánh cây bổ sung vi khuẩn và cây không bổ sung vi khuẩn 38

4.2.1 Đặc điểm sinh học của các cây bạc hà 38

4.2.2 So sánh sự sinh trưởng, phát triển 38

4.2.3 So sánh diện tích và số rễ tơ (rễ phụ) của bộ rễ 40

4.2.4 So sánh hàm lượng tinh dầu 42

4.2.5 So sánh hàm lượng menthol và menthone 42

4.3 So sánh cây bổ sung vi khuẩn trồng thủy canh tĩnh và hoàn lưu 43

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45

5.2 Đề nghị 45

5.1 Kết luận 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A rhizogenes : Agrobacterium rhizogenes

chv : chromosomal virulence

DNA : deoxyribonucleic acid

OD : Optical density (độ hấp thu quang phổ)

ORF : Open reading Frame

PCR : polymerase chain reaction

Ri plasmid : Root inducing plasmid

rol : resistance to osmotic lysis

TL – DNA : Transferred left DNA

TR – DNA : Transferred right DNA

ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Các chỉ tiêu sinh trưởng 32

Bảng 4.2 Kết quả hàm lượng tinh dầu (%) 35

Bảng 4.3 Kết quả hàm lượng menthol (%) 36

Bảng 4.4 Kết quả theo dõi chiều cao và số lá 39

Bảng 4.5 Các chỉ tiêu sinh trưởng 40

Bảng 4.6 Số rễ phụ trung bình trên 1cm 41

Bảng 4.7 Hàm lượng tinh dầu (%) của cây bạc hà 42

Bảng 4.8 Hàm lượng menthol (%) trong tinh dầu 43

Bảng 4.9 Trung bình các chỉ tiêu 44

x

xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây bạc hà Nhật (Mentha piperita L.) 3

Hình 2.2 Chưng cất bằng nước 13

Hình 2.3 Hệ số phân chia 16

Hình 2.4 Sơ đồ tổng quát mô tả các bộ phận của một máy sắc ký khí 17

Hình 2.5 Vi khuẩn A rhizogenes xâm nhập và tạo rễ tóc cây hai lá mầm 18

Hình 2.6 Phương thức chuyển T-DNA vào genome của thực vật 21

Hình 3.1 Các bịch nilon ươm cây con 25

Hình 3.2 Cấy chuyền vi khuẩn 25

Hình 3.3 Cấy tăng sinh vi khuẩn 26

Hình 3.4 Quy trình li trích tinh dầu .27

Hình 3.5 Chậu xốp trồng thủy canh tĩnh 29

Hình 3.6 Mô hình thủy canh hoàn lưu 30

Hình 4.1 Chiều cao của cây bổ sung 2 dòng vi khuẩn 45 ngày sau trồng .33

Hình 4.2 Số lá của cây bổ sung 2 dòng vi khuẩn 45 ngày sau trồng .33

Hình 4.3 Khối lượng thân và rễ 34

Hình 4.4 Kết quả đường chuẩn menthol bằng sắc ký khí 36

Hình 4.5 Sơ đồ chuyển hóa menthone thành menthol 37

Hình 4.6 Cây bạc hà trồng thủy canh 38

Hình 4.7 Chỉ tiêu tăng trưởng về chiều cao 39

Hình 4.8 Chỉ tiêu tăng trưởng về số lá 40

Hình 4.9 Mẫu rễ của cây 41

Hình 4.10 Kích thước bộ rễ 41

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Tinh dầu là những hợp chất có hương thơm được chiết tách chủ yếu từ thực vật

và một số ít từ động vật trên thế giới Nó là một loại chất lỏng được tinh chế (thông

thường nhất là bằng cách chưng cất bằng hơi hoặc nước) từ lá cây, thân cây, hoa, vỏ cây, rễ cây hoặc những thành phần khác của thực vật, động vật (rất ít) Ngày nay tinh dầu được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, dệt, dược phẩm, hóa

mỹ phẩm, một đặc điểm quan trọng không thể thay thế, đó là tinh dầu so với hợp chất hữu cơ tổng hợp khác thì nó không gây ô nhiễm môi trường và dễ phân hủy

Do có những công dụng thực tiễn quan trọng nên càng ngày có nhiều nghiên cứu cũng như khai thác về tinh dầu trên toàn thế giới Một số loại tinh dầu đang được

sử dụng nhiều hiện nay là: Tinh dầu hoa hồng, tinh dầu cam chanh, tinh dầu sả, tinh dầu hoa lài, tinh dầu bạc hà,…Trong đó, tinh dầu bạc hà từ cây bạc hà châu Âu

(Mentha piperita) đang rất được quan tâm do những ứng dụng của nó trong một số

lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, dược phẩm như: Công nghiệp bánh kẹo, kem đánh răng, sản xuất thuốc lá…và vấn đề bảo vệ sức khỏe của con người Hàm lượng tinh dầu cùng với các hợp chất có trong tinh dầu ở mỗi loại cây phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển của cây, vật liệu trồng, phương pháp trồng, ngoại cảnh, thu hoạch, bảo quản, phương pháp chiết xuất thích hợp…Trong các yếu tố đó, điều kiện canh tác của cây có ảnh hưởng rất nhiều đến thành phần hóa học và hàm lượng tinh dầu

Mặt khác như ta đã biết vi khuẩn Agrobacterium zhirogene là vi khuẩn gram

âm, sống trong đất, thuộc họ Rhizobiaceae, có độc tính sở hữu Ri-plasmid, nó gây ra

bệnh trên tầng lông hút của rễ cây song tử diệp Khi cây bị nhiễm A rhizogenes qua

các vết thương, biểu hiện bệnh rõ nhất là các rễ bất định hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm Một số công trình nghiên cứu gần đây người ta cho lây nhiễm vi khuẩn để làm tăng hợp chất thứ cấp (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007) Đã có kết quả nghiến cứu đối với

cây cà độc dược có bổ sung vi khuẩn A zhirogenes trồng trong môi trường thủy canh

người ta thấy hàm lượng các hợp chất thứ cấp trong cây tăng (Trần Thị Lệ Minh, 2005), vì thế đề tài được tiến hành

1

1.2 Yêu cầu đề tài

So sánh sự tăng trưởng, hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone của cây bạc

hà trồng thủy canh có bổ sung 2 dòng vi khuẩn TR7 và 11325 với mật độ khác nhau

trồng thủy canh tĩnh, từ đó tìm ra dòng có mật độ vi khuẩn tác động tốt nhất

So đặc điểm hình thái, tăng trưởng, hàm lượng tinh dầu, hàm lượng menthol và

menthone của cây bạc hà trồng thủy canh hoàn lưu có bổ sung vi khuẩn dòng có mật

độ vi khuẩn tác động tốt nhất và cây không có bổ sung vi khuẩn

So sánh cây bạc hà bổ sung vi khuẩn trồng thủy canh tĩnh và hoàn lưu

1.3 Nội dung thực hiện

Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây bạc hà trồng thủy canh có bổ sung

2 dòng vi khuẩn TR7 và 11325 với mật độ khác nhau trồng trong hệ thống thủy canh

tĩnh (tại nhà lưới Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nông Lâm Thành Phố

Hồ Chí Minh)

Xác định hàm lượng tinh dầu, hàm lượng menthol và menthone của cây bạc hà

trồng thủy canh có bổ sung 2 dòng vi khuẩn TR7 và 11325

Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển giữa cây có bổ sung vi khuẩn dòng có mật

độ vi khuẩn tác động tốt nhất và cây không có bổ sung vi khuẩn trồng trồng trong hệ

thống thủy canh hoàn lưu

Xác định hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone giữa cây có bổ sung vi

khuẩn dòng có mật độ vi khuẩn tác động tốt nhất và cây không có bổ sung vi khuẩn

2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về bạc hà

2.1.1 Nguồn gốc

Trên thực tế, các giống bạc hà đựơc chia làm hai nhóm chính là bạc hà châu Âu

và bạc hà Nhật Bạc hà châu Âu có hàm lượng menthol là 45-70%, còn bạc hà Nhật là

70-90% và trong sản xuất, trong thương mại Mentha piperita L đựơc gọi là bạc hà Âu

và Mentha arvensis L gọi là bạc hà Nhật

Bạc hà Nhật (Mentha arvensis L.): Trồng nhiều ở Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn

Độ, Brazil Ở Việt Nam, bạc hà Châu Á mọc hoang nhiều ở Việt Bắc (Lào Cai, Sơn

La, Lai Châu) được di thực về đồng bằng để trồng trọt nhưng không phát triển Do vậy, ta đã di thực nhiều chủng có năng suất cao hơn như: bạc hà 974, 975, 976 và bạc

hà Đài Loan Riêng chủng loài 974 được trồng nhiều ở cả 2 miền Nam Bắc vì chủng này có ưu điểm: Chịu hạn, chịu rét, chịu sâu bệnh

Bạc hà châu Âu (Mentha piperita L.): Nguồn gốc của loài bạc hà này được coi

là nước Anh-vùng Mitsam, vì trước đây khoảng một trăm năm vùng Mitsam đã trồng

và từ đó lan tràn phần lớn ra các nước khác Đây là giống lai nhưng vẫn giữ nguyên được tính chất từ thế kỷ XIX đến nay (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

2.1.2 Phân loại

Hình 2.1 Cây bạc hà Nhật (Mentha piperita L.)

3

Loài: Mentha piperita L

Bạc hà gồm nhiều chủng loại khác nhau: Bạc hà Âu, Á, húng lũi, húng dổi, húng láng, húng quế Hiện nay bạc hà được phân theo 2 nhóm lớn:

Nhóm bạc hà và tinh dầu bạc hà Âu (có tên khoa học là Mentha piperita L.): Bạc hà Âu là kết quả của sự lai tạp từ 3 loài khác nhau (Mentha Sylves, Mentha

Rotundifolia và Mentha Aquatica) do đó dễ bị tác động của ngoại cảnh

Nhóm bạc hà Á (bạc hà Nhật có tên khoa học là Mentha arvensis L.) Nhóm

bạc hà này chiếm sản lượng chủ yếu cũng là nguồn chủ yếu cung cấp menthol cho toàn thế giới

Trong mỗi nhóm cũng có tối thiểu đến 2 dạng Ví dụ trong nhóm bạc hà châu

Âu có 2 dạng là :

Dạng thân tím: Lá có gân tím, dài, đỉnh hơi nhăn, xổ răng cưa, mang chút ít lông Thân có viền tím đỏ, hoa ra ở chóp cành và trên đầu cây, có màu đỏ nâu Lá khô chứa tới 2,5% tinh dầu, hàm lượng menthol chiếm từ 48-68% Loại này cần ít dinh dưỡng, sản xuất nhiều tại Bungari và một số nước châu Âu Trên thế giới được biết với tên bạc hà đen, tiếng Anh là Black mint rất phổ biến trên thế giới, có tên khoa học là

Mentha piperita var officinalis forma rubescens Camus

Dạng thân xanh: Lá dài có gân xanh, hầu như hoàn toàn nhẵn, có xẻ răng cưa sâu, đỉnh ngọn có vẻ nhiều lông, thân màu xanh, hoa trắng Tinh dầu thơm mát, chất lượng tốt, đòi hỏi dinh dưỡng cao hơn bạc hà tím nhưng năng suất thấp hơn Thế giới thường biết với tên bạc hà trắng do có tên tiếng Anh là White mint, có tên khoa học là

Mentha piperita var officinalis palles-cens Camus

Trong nhóm bạc hà châu Á (bạc hà Nhật) cũng có 2 dạng tím và xanh nhưng chưa có tài liệu nào nói tên khoa học của 2 dạng này (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

4

2.1.3 Đặc điểm thực vật học

Rễ: Cấu tạo từ thân ngầm dưới đất Phân bố lớp đất 30 – 40 cm phân nhánh như

rễ phụ, từ các đốt ngầm mọc thân kí sinh Thân ngầm không chứa nhiều tinh dầu, khi

bộ phận khí sinh tàn lụi, thân ngầm vẫn sống qua đông Mùa xuân ấm áp tiếp tục phát triển thành rễ và cho cây bạc hà mới Khi cây và rễ mới hình thành xong, thân ngầm cũ héo và chết Tuy cây bạc hà có thời kỳ sinh trưởng 1 năm, song sinh trưởng của thân ngầm và thân ký sinh lệch pha nhau

Thân ngầm không có thời kỳ ngủ nghỉ rõ rệt, thời kỳ ngừng tạm thời vào tháng

11 Thân ngầm là đối tượng nhân giống và vị trí giữ cho tỉ lệ sống sót cao nhất

Thân: Thân chính và cành cấp I, II,… tạo thành bộ khung tán cây Giữa thân chính và tán tạo thành hình dạng chóp nón cho cây bạc hà Tán càng lớn sản lượng càng cao Thân thảo, tiết diện hình vuông, sinh sản bằng phân nhánh ở phần gốc thân ngay trên hoặc dưới mặt đất

Nếu mọc ở gốc thân trên mặt đất tạo thành dải bò màu tím có mang lá Tại các phần đốt sát đất sinh các bó rễ con giữ chặt dải thân với đất Tại các dải thân nơi không tiếp xúc với đất mọc lên các cành thẳng mang lá

Thân chính cao 0,4 – 0,8 m rỗng ruột khi già Trên thân có đốt, mỗi đốt mọc 2 mầm đối xứng nhau và các rễ bất định Giữa 2 đốt là các lóng, độ dài ngắn phụ thuộc vào các giống trồng trọt Thân chứa tinh dầu với hàm lượng thấp

Lá bạc hà: Lá là cơ quan dinh dưỡng quan trọng nhất làm nhiệm vụ quang hợp,

hô hấp, thoát hơi nước và mang tinh dầu Lá là nguyên liệu chính để cất tinh dầu Chiếm 40 – 50 % khối lượng khí sinh, tùy chủng lượng tinh dầu biến đổi từ 2 – 6 %

Lá đơn: Mọc đối chéo chữ thập, cuống lá ngắn, lá hình trứng màu xanh thẫm có thể đỏ tím, xẻ răng cưa không đều, dài từ 4 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm Hai phía mặt lá là túi tinh dầu, mặt trên số lượng nhiều hơn mặt dưới Qua giải phẫu hình thái lá thấy có

2 loại lớp lông đặc biệt:

Lông thẳng nhọn gồm 3 – 4 tế bào gọi là lông che chở (lông đa bào)

Lông ngắn hơn, tù, có tinh dầu gọi là lông tiết tinh dầu (túi dầu) Cấu tạo một túi dầu gồm 9 tế bào, một tế bào đáy, còn 8 tế bào xếp tròn trên đáy tạo thành một khoang trống Khi chứa đầy tinh dầu thì có màng phủ căng và dễ dàng bị vỡ dưới tác động cơ giới Do đó khi thu hoạch phải thu hoạch đúng lúc và tránh tác động bên ngoài để giảm năng suất tinh dầu thu hoạch được

5

Tế bào tiết tinh dầu trên lá tăng từ đầu lá đến cuống lá và từ mép lá vào giữa lá

Số lượng tùy thuộc vào giống và môi trường trồng trọt

Trên thân có 13 – 15 đốt tại đốt lá thứ 8 (từ gốc lên) có nhiều tinh dầu nhất Hoa: Cụm hoa bồng hình chop Trên hoa có cuống ngắn, 5 đài cánh hợp lại tạo thành chuông Mặt ngoài đài hoa có lông bao phủ Hoa ở Việt Nam và một số nước khác không kết hạt Ở Liên Xô và một số cơ sở nghiên cứu trên thế giới, bằng phương pháp đa bội thể đã làm cho hoa bạc hà kết hạt Quả bạc hà là quả bế 4 ngăn, hạt bé có trọng lượng: 1000 hạt = 0.06 – 0.07 gr (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển

Cây bạc hà có 4 giai đoạn sinh trưởng: Mọc – phân cành – làm nụ – nở hoa Thời kì mọc mầm: Từ khi cây con mọc đến khi định rõ hàng trồng, quá trình mọc khoảng 10 – 15 ngày Sau khi trồng các đốt thân ngầm bắt đầu mọc rễ phụ và mầm Để bạc hà ra rễ và nẩy mầm tốt cần chú ý đến độ ẩm của đất, thiếu ẩm (40% –50%) rễ không phát triển và sau đó không kích thích được phát triển mầm Do đó việc xác định thời vụ trồng là vấn đề quan trọng giúp cho bạc hà mới trồng có đủ ẩm để phát triển

Thời kì phân cành: Sau khi mọc khoảng 45 – 55 ngày, thời kỳ này khi bộ rễ phát triển đầy đủ cây con bắt đầu phát triển mạnh về chiều cao, các mầm nách bắt đầu phát triển cành lá mới Đó là là quá trình phân cành theo trình tự sau:

Tại đốt gốc thân chính, đôi lá có mầm mọc lên và tiếp dần lên ngọn, các cành gần ngọn ra muộn và độ dài cành ngắn dần – tạo hình nón Thời gian này tốc độ sinh trưởng và khối lượng chất xanh của cây tăng mạnh, quyết định năng suất của bạc hà (cần chú ý cung cấp đủ dinh dưỡng, ánh sáng, nước… Để cây phát triển hết mức về thân cành lá, tạo năng suất cao)

Thời kì làm nụ: Kéo dài từ 10 – 15 ngày, tốc độ ra lá của cây ở giai đoạn này chậm lại và sau đó ngừng hẳn; tuy nhiên cây vẫn tiếp tục tăng lên về mặt kích thước của thân lá và trọng lượng cũng như tỷ lệ tinh dầu

Tại điểm sinh trưởng xuất hiện mầm hoa cụm bông, giai đoạn này yêu cầu về đạm có giảm, nhưng lại cần nhiều lân, lúc này do khối lượng chất xanh và tích lũy tinh dầu tiếp tục tăng lên nên các điều kiện ngoại cảnh nhất là độ ẩm, ánh sáng ở thời kỳ này là cao nhất trong các thời kỳ sinh trưởng

6

Thời kỳ hoa nở: Hoa bạc hà nở kiểu vô hạn Hoa cành chính nở trước sau đó theo thứ tự cành nào ra trước nở trước và đi từ gốc lên ngọn

Thời kỳ hoa nở là thời kỳ bạc hà đạt tới khối lượng chất xanh và tinh dầu cao nhất Một ngày của thời gian này có thể tạo ra 280 kg chất hữu cơ/ha Hoa nở 50%, hàm lượng tinh dầu đạt tới cao nhất, bạc hà ngừng sinh trưởng Đây là thời điểm thu hoạch Nếu thu muộn (100 % hoa đã nở), lá đã rụng nhiều làm giảm năng suất và hàm lượng tinh dầu

Các điều kiện ngoại cảnh như: Nhiệt độ, ẩm độ có ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ tinh dầu và hàm lượng menthol trong tinh dầu

Nếu nhiệt độ cao (28 – 30°C) làm tăng tỷ lệ tinh dầu và hàm lượng tinh menthol trong tinh dầu

Nhiệt độ cao >30°C và gió nhiều sẽ làm giảm tỷ lệ tinh dầu và chất lượng thay đổi

Hạn úng làm lá rụng nhiều năng suất thu hoạch giảm (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

2.1.5 Điều kiện sinh thái

Về nhiệt độ: Sinh trưởng ở nhiệt độ 18 – 25°C; thời kỳ nụ và ra hoa 28 – 30°C Giai đoạn ngừng sinh trưởng (ngủ nghỉ) có thể chịu nhiệt độ –10°C Thân rễ bắt đầu phát triển ở nhiệt độ 2 – 3°C Cây con nhạy cảm với nhiệt độ thấp và chết ở nhiệt độ từ –7 đến – 8°C

Tổng tích ôn hữu hiệu của thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng (từ nảy mầm đến lên hoa) là 1500 – 1600°C thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng của bạc hà từ 80 – 200 ngày, tùy thuộc vào nhiệt độ: nếu điều kiện nhiệt độ trung bình/ngày mà thấp và kết hợp với điều kiện ngày ngắn cây sẽ không ra hoa (mùa xuân)

Nhiệt độ trung bình ngày đêm cao, cây nở hoa càng nhanh

Về ẩm độ: Bạc hà là cây không đòi hỏi nhiệt độ đặc biệt về nhiệt độ Bộ rễ bạc

hà phân bố nông và kém phát triển, sức hút và giữ nước kém, mẫn cảm với hạn hán, gặp hạn liên tục sẽ bị thất thu

Suốt thời kì sinh trưởng nếu độ ẩm cao bạc hà đạt tới năng suất chất xanh cực đại, nhưng hàm lượng tinh dầu lại giảm Cần chú ý trước khi thu hoạch 7 – 10 ngày cần làm giảm độ ẩm đất < 50% có tác dụng làm giảm chất xanh tăng tỷ lệ tinh dầu trong lá

7

Về ánh sáng: Bạc hà là cây trồng ngày dài, ưa ánh sáng và phát triển tốt Để phát triển bình thường cây yêu cầu ánh sáng ban ngày khoảng bằng hoặc hơn 12 giờ

Càng lên phía bắc thời gian sinh trưởng cây bạc hà càng ngắn lại do thời gian chiếu sáng trong ngày dài hơn

Điều kiện ngày dài (14 – 16 giờ) cây chuyển từ sinh trưởng sinh dưỡng sang sinh thực và nở hoa Thời gian sinh trưởng từ nụ đến hoa kéo dài 34 – 40 ngày và nở hoa sớm

Thời gian chiếu sáng từ 8 – 10 giờ làm cây không chuyển giai đoạn được, cành gốc trở thành thân ngầm, năng suất chất xanh giảm, tỷ lệ thân ngầm tăng lên

Tóm lại yêu cầu của bạc hà với ánh sáng là cao, nên khi trồng bạc hà cần chú ý chế độ ánh sáng hợp lý cho cây, không nên trồng xen khi có sự cạnh tranh về ánh sáng Trồng quá dầy thiếu ánh sáng làm rụng lá, năng suất chất xanh và tinh dầu giảm Ngoài ra 2 yếu tố nhiệt độ và độ dài ngày có tác dụng ảnh hưởng tổng hợp đến hình thái bên ngoài của cây và sự khác nhau trong cụm hoa

Đất đai và dinh dưỡng:

Bạc hà ưa đất xốp, có thành phần cơ giới nhẹ, giàu dinh dưỡng, thoát và giữ hơi nước tốt Các loại đất phù sa ven sông, đất đen, đất có tầng canh tác dày, mực nước ngầm thấp…đều phù hợp với sinh trưởng của bạc hà Các loại đất không có cấu tượng

dễ bị hạn, đất sét nặng làm bạc hà ung bí, đất cát giữ ẩm kém cũng không thích hợp Yêu cầu đất có độ pH = 6 – 7.5 Đất trồng bạc hà cần cày bừa kỹ, bón phân đầy đủ, nhất là đạm, lân và có điều kiện chủ động tưới tiêu tốt Không nên trồng bạc hà liên canh 2, 3 năm, vì như vậy sâu bệnh sẽ phát triển mạnh, năng suất giảm rõ rệt Cần chú

ý hàm lượng kali trong đất quá cao sẽ thúc đẩy quá trình oxy hóa khử làm giảm tích lũy tinh dầu, giảm năng suất(Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

Vùng ngập nước, ven sông, đất bãi cắt 2 lứa trong năm tháng 5, 10

Vùng núi bắc bộ: Trồng 5/3 – 20/4 thu hoạch tháng 7 và tháng 10

8

Vùng núi khu Bốn (cũ) trồng sớm 1/1 – 10/2

Các tỉnh phía nam trồng tháng 11, 12

Thời vụ trồng bạc hà không khắt khe lắm, bạc hà là cây chịu rét tốt, nên tranh thủ trồng sớm để cây có thời gian sinh trưởng dài cho năng suất cao (110 ngày sinh trưởng) Trồng muộn cây có thời gian sinh trưởng ngắn (80 – 90 ngày) nên năng suất thấp(Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

2.1.7 Công dụng của tinh dầu bạc hà

Cây bạc hà, tinh dầu và hoạt chất menthol trong cây bạc hà được người ta chú ý

và sử dụng với nhiều cách khác nhau, như:

Lá bạc hà giúp cho tiêu hóa, trừ co thắt, trị nôn (do có tinh dầu) Các flavonid

có tác dụng lợi mật Dạng dùng là chè thuốc Trong y học cổ truyền người ta dùng bạc

hà làm thuốc chữa cảm nóng, nhức đầu, ho, viêm khí quản, mụn nhọt, lở ngứa

Tinh dầu bạc hà là thành phần của cao Sao Vàng và các cao, dầu xoa khác để chữa cảm lạnh, nhức đầu, chóng mặt, say tàu xe… Nó còn là chất thơm dùng trong công nghiệp thuốc lá, thuốc đánh răng, kẹo, mỹ phẩm…

Menthol có tính sát khuẩn, tiếp xúc với da gây cảm giác mát và tê tại chỗ (do hiện tượng bay hơi)

Thuốc bôi chữa đau răng (có tên là thuốc lỏng Bonain) gồm có một phần menthol, một phần phenol và một phần cocain

Nhu cầu hàng năm trong nước khoảng 50 tấn tinh dầu (Nguyễn Khang, Phạm Văn Khiển, 2001)

2.2 Trồng cây bạc hà

2.2.1 Giống và chất lượng giống

Bạc hà có thể trồng bằng hạt hoặc đoạn thân cành và thân ngầm Hạt thường thu được từ các cây đa bội, ở Việt Nam hạt thường phải nhập từ nước ngoài Chọn thân:

Có thân cành, thân dải bò và thân ngầm, để có năng suất cao nên chọn thân ngầm để trồng Ngoài ra tuổi phát dục của hom có ảnh hưởng đến năng suất và hàm lượng tinh dầu của bạc hà Nói chung thân trắng (đoạn gốc) cho năng suất chất xanh và hàm lượng tinh dầu cao nhất Thân ở trên mọc không đều, yếu, năng suất chất xanh và hàm lượng tinh dầu thấp (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

9

2.2.2 Kỹ thuật trồng bạc hà

Chọn vườn ươm nơi quang đãng, sau khi đã chọn được đất, đem phân ra vãi đều một lượt, mỗi mẫu bón từ 2 đến 4 tấn phân bắc và phân chuồng, 10 tấn phân bùn; cày sâu 27 - 33 cm, bừa nhỏ và san bằng dất sau đó làm luống rộng 1,3 m, cao 13 – 17 cm

Cách ươm cây bạc hà

Ươm bằng hạt:

Hạt được ngâm một đêm bằng nước ấm (với tỉ lệ 2 sôi : 3 lạnh), bỏ nước đem đi

ủ bằng giấy lọc trong 24 giờ, sau đó lấy ra trộn đều với đất bột hoặc cát rồi gieo vãi lên luống Sau khi gieo xong, rắc một lớp đất mùn mỏng không quá 4mm lên luống, lấy vồ đập nhẹ lên mặt luống, sau cùng là phủ dạ và tưới nước Được 2 - 3 tuần là cây đã mọc Sau khi cây đã mọc đều thì lấy dạ đi, bón phân, tưới nước Khi cây đã mọc cao 7-

10 cm thì chọn ngày giâm mát thì nhổ cây đi trồng

Ươm bằng thân ngầm:

Chọn những đoạn thân ngầm tốt, cắt thành những đoạn có chiều dài từ 7 – 10

cm, cứ 23 – 33 cm thì đánh một rãnh, nếu trồng theo từng lỗ thì cứ cách 23 – 27 cm đào một lỗ sâu 7 cm, mỗi lỗ trồng từ 2 - 3 hom, sau khi đã đặt hom và lấp đất lại cho mặt luống bằng phẳng Sau khi trồng nên luôn giữ cho mặt luống luôn luôn ẩm, cây chóng mọc Cây mọc được 10 – 13 cm thì có thể nhổ cây khỏi vườn ươm mang trồng

ở vườn trồng

Ươm bằng thân, cành:

Chọn những thân, cành bánh tẻ để trồng Cắt đoạn dài 10 cm, đặt sâu 2/3, mỗi cây cũng như mỗi hàng cách nhau 5 - 7cm, trồng xong phải che phủ cho giữ ẩm; sau khi trồng được 2 - 3 tuần thì mầm cây đã mọc, mọc cao 10 – 13 cm thì có thể nhổ khỏi vườn ư

Cách trồng cây bạc hà

Khi cây đã mọc cao 7 – 13 cm thì có thể nhổ cây đem ra ruộng trồng, vì bạc hà rất dễ sống, ngoài những ngày sương giá, còn lúc nào cũng có thể trồng được, nhưng trồng về mùa xuân là tốt nhất Trên luống đánh thành rạch cách nhau 33 cm Trên rạch

cứ 13 cm thì trồng một cây Nếu trồng theo lỗ thì trồng hai cây, lấp dất kín gốc cây, san phẳng mặt luống, tưới giữ ẩm cho đất, tạo điều kiện cho cây sống

Ở trên thế giới, giới thiệu nhiều phướng pháp trồng và những nơi thiếu giống đều có thể áp dụng; nhưng nói chung phương pháp trồng bằng thân ngầm là thích hợp

10

nhất và cũng là tốt nhất Trồng bằng hạt phần lớn là áp dụng những nơi mới trồng hay những nơi dùng để chọn giống Trồng bằng thân cành chỉ áp dụng đối vơi những nơi nhiều dất nhưng thiếu giống bằng thân ngầm, vì không những tốn nhiều công mà thu hoạch sản lượng không cao (Chu Thị Thơm và ctv, 2006).

2.2.3 Bón phân

Bạc hà tuy là cây dễ trồng, dễ thích nghi, song là cây chiếm đất 10 – 12 tháng, 1 năm cho đến 3, 4 lứa cắt và 3, 4 lần tái sinh Khối lượng chất xanh lớn (1 lứa cắt 20 –

25 tấn/ha); cho 20 – 30 kg tinh dầu nên cần phải bón phân

Yêu cầu về đạm: Là cây lấy thân lá nên cần đạm để tăng cường khối lượng chất xanh, tăng năng suất tinh dầu Đạm bón đủ làm kéo dài thời gian sinh trưởng, tăng chiều cao cây, số cành, lá và trọng lượng lá Có thể nói đạm là yếu tố tăng sản lớn nhất Lượng thích hợp 250 – 300 kg/ha

Yêu cầu về lân: Hiệu quả gần bằng đạm, làm tăng cường chuyển hóa tích lũy chất hữu cơ, 300 – 400 kg/ha

Yêu cầu về kali: Cẩn thận trọng khi bón kali, vì tuy làm tăng năng suất chất xanh song làm giảm năng suất tinh dầu, khoảng 400 kg/ha (Chu Thị Thơm và ctv, 2006)

2.2.4 Phương pháp trồng cây thủy canh (Võ Thị Bạch Mai, 2003)

Thủy canh là kỹ thuật trồng cây không dùng đất mà trồng trực tiếp vào dung dịch dinh dưỡng hoặc các giá thể mà không phải là đất Các giá thể đó có thể là cát, trấu, rán, vỏ xơ dừa, than bùn, vermiculite perlite…

Kỹ thuật thủy canh là một trong những kỹ thuật tiến bộ của nghề làm vườn hiện đại Chọn lựa môi trường tự nhiên cần thiết cho cây phát triển là sự sử dụng những chất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây tránh được sự phát triển của cỏ dại, côn trùng và bệnh tật lây nhiễm từ đất

Có nhiều dạng mô hình thủy canh khác nhau như thủy canh tĩnh, hoàn lưu, phun sương,…

Ưu điểm của kỹ thuật trồng thủy canh hiện đại:

Không cần đất, chỉ cần không gian để đặt hộp dụng cụ trồng, do vậy có thể triển khai ở những vùng đất cằn cỗi như hải đảo, vùng núi xa xôi, cũng như tại gia đình trên sân thượng, balcon

Không phải làm đất, không có cỏ dại, không cần tưới

11

Trồng được nhiều vụ, có thể trồng trái vụ

Không phải sử dụng thuốc trừ sâu bệnh và các hóa chất độc hại khác

Năng suất cao, vì có thể trồng liên tục

Sản phẩm hoàn toàn sạch, đồng nhất, giàu dinh dưỡng và tươi ngon

Không tích lũy chất độc, không gây ô nhiễm môi trường

Không đòi hỏi lao động nặng nhọc, người già, trẻ em đều có thể tham gia hiệu quả

Kỹ thuật thủy canh cũng có những điểm yếu sau:

Chỉ trồng các loại cây rau quả, hoa ngắn ngày

Giá thành sản xuất còn cao

2.3 Phương pháp chưng cất hơi nước

Phương pháp chưng cất hơi nước dựa trên sự khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao Người ta chia các phương pháp chưng cất hơi nước làm ba loại chính: Chưng cất bằng nước, chưng cất bằng nước và hơi nước, chưng cất bằng hơi nước Cả ba loại này đều có lý thuyết giống nhau chỉ khác nhau ở cách thực hiện (Lê Ngọc Thạch, 2003)

2.3.1 Phương pháp chưng cất bằng nước

Cho nước phủ kín nguyên liệu, nhưng phải chừa một khoảng không gian tương đối lớn phía bên trên lớp nước để tránh khi nước sôi mạnh làm văng chất nạp qua hệ thống hoàn lưu (hình 2.2) Nhiệt cung cấp có thể đun trực tiếp bằng củi lửa hoặc đun bằng hơi nước dẫn từ nồi hơi vào (sử dụng bình có hai lớp đáy) Trong trường hợp chất nạp quá mịn lắng chặt xuống đáy nồi gây hiện tượng cháy khét nguyên liệu ở mặt tiếp xúc với đáy nồi, lúc đó nồi phải trang bị những cánh khuấy trộn đều bên trong suốt thời gian chưng cất

Sự chưng cất này thường không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy giải Những nguyên liệu xốp và rời rạc thích hợp cho phương pháp này Những cấu phần có nhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi với lượng lớn nước phủ đầy, khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những hợp chất này Vì thế người ta chỉ dùng phương pháp này khi không thể sử dụng các phương pháp khác (Lê Ngọc Thạch, 2003)

2.3.2 Phương pháp chưng cất bằng nước và hơi nước

Nguyên liệu được xếp trên một vỉ đục lỗ và nồi cất được đổ nước sao cho nước không chạm đến vỉ Nhiệt cung cấp có thể là ngọn lửa đốt trực tiếp hoặc dùng hơi nước

từ nồi hơi dẫn vào lớp bao chung quanh phần đáy nồi Ta có thể coi phương pháp này là một trường hợp điển hình của phương pháp chưng cất bằng hơi nước với hơi nước ở áp suất thường Như vậy chất ngưng tụ sẽ chứa ít sản phẩm phân hủy hơn trường hợp chưng cất bằng hơi nước trực tiếp, nhất là ở áp suất cao hay hơi nước quá nhiệt

Việc chuẩn bị nguyên liệu trong trường hợp này quan trọng hơn nhiều so với phương pháp trước, vì hơi nước tiếp xúc với chất nạp chỉ bằng cách xuyên qua nó nên phải sắp xếp thế nào cho chất nạp tiếp xúc tối đa với hơi nước thì mới có kết quả tốt Muốn vậy thì chất nạp nên có kích thước đồng đều không sai biệt nhau quá

Nếu chất nạp được nghiền quá mịn, nó dễ tụ lại vón cục và chỉ cho hơi nước đi qua một vài khe nhỏ do hơi nước tự phá xuyên lên Như vậy phần lớn chất nạp sẽ không được tiếp xúc với hơi nước Ngoài ra, luồng hơi nước đầu tiên mang tinh dầu có thể bị ngưng tụ và tinh dầu rơi ngược lại vào lớp nước nóng bên dưới gây hư hỏng thất thoát Do đó việc chuẩn bị chất nạp cần được quan tâm nghiêm túc và đòi hỏi kinh nghiệm tạo kích thước chất nạp cho từng loại nguyên liệu

Tốc độ chưng cất trong trường hợp này không quan trọng như trong trường hợp chưng cất bằng hơi nước Tuy nhiên tốc độ nhanh sẽ có lợi vì ngăn được tình trạng quá ướt của chất nạp và gia tăng vận tốc chưng cất Về sản lượng tinh dầu mỗi giờ, người

13

ta thấy nó khá hơn phương pháp chưng cất bằng nước nhưng vẫn còn kém hơn phương pháp chưng cất bằng hơi nước

So với phương pháp chưng cất bằng nước, ưu điểm của nó là ít tạo ra sản phẩm phân hủy Do đó dù với thiết bị loại nào đi nữa thì ta phải đảm bảo là chỉ có phần đáy nồi được phép đốt nóng và giữ cho phần vỉ chứa chất nạp không tiếp xúc với nước sôi Phương pháp này cũng tốn ít nhiên liệu, tuy nhiên nó không thể áp dụng cho những nguyên liệu dễ bị vón cục

Khuyết điểm chính của phương pháp là do thực hiện ở áp suất thường nên những cấu phần có nhiệt độ sôi cao sẽ đòi hỏi một lượng rất lớn hơi nước để hóa hơi hoàn toàn và như thế sẽ tốn rất nhiều thời gian Về kỹ thuật, khi xong một lần chưng cất, nước ở bên dưới vỉ phải được thay thế để tránh cho mẻ sản phẩm sau có mùi lạ (Lê Ngọc Thạch, 2003)

2.3.3 Phương pháp chưng cất bằng hơi nước

Hơi nước tạo ra từ nồi hơi thường có áp suất cao hơn không khí được đưa thẳng vào bình chưng cất Trong kỹ nghệ ngày nay, phương pháp này thường dùng để chưng cất tinh dầu từ các nguyên liệu thực vật

Điểm ưu việt của phương pháp này là người ta có thể điều chỉnh áp suất, nhiệt

độ như mong muốn để tận thu sản phẩm, nhưng phải giữ nhiệt độ ở mức giới hạn để tinh dầu không bị phân hủy

Việc sử dụng phương pháp này cũng lệ thuộc vào những điều kiện hạn chế như

đã trình bày đối với hai phương pháp chưng cất trên cộng thêm 2 yếu tố nữa là yêu cầu hơi nước không quá nóng và quá ẩm Nếu quá nóng nó có thể phân hủy những cấu phần có nhiệt độ sôi thấp, hoặc làm chất nạp khô quăn khiến hiện tượng thẩm thấu không xảy ra Do đó trong thực hành nếu dòng chảy của tinh dầu ngưng lại sớm quá, người ta phải chưng cất tiếp bằng hơi nước bão hòa trong một thời gian cho đến khi sự khuếch tán hơi nước được tái lập lại, khi đó mới tiếp tục dùng lại hơi nước quá nhiệt Còn trong trường hợp hơi nước quá ẩm sẽ đưa đến hiện tượng ngưng tụ, phần chất nạp phía dưới sẽ bị ướt Trong trường hợp này người ta phải tháo nước ra bằng một van xả dưới đáy nồi Trong công nghiệp, trước khi vào bình chưng cất, hơi nước phải đi ngang qua bộ phận tách nước

Với hơi nước có áp suất cao thường gây ra sự phân hủy quan trọng nên tốt nhất

là bắt đầu chưng cất với hơi nước ở áp suất thấp và cao dần cho đến khi kết thúc

14

Không có một quy tắc chung nào cho mọi loại nguyên liệu vì mỗi chất nạp đòi hỏi một kinh nghiệm và yêu cầu khác nhau

Hiệu suất và chất lượng tinh dầu phụ thuộc vào đặc tính cả tinh dầu và cách chọn phương pháp chưng cất Thông thường các loại tinh dầu có tỷ trọng lớn hơn nước, khi chưng cất hơi nước trong thiết bị áp suất cao cho hiệu suất ly trích cao trong thời gian chưng cất ngắn (Lê Ngọc Thạch, 2003)

Việc tách hai hợp chất nào đó ra riêng có đạt kết quả tốt hay không là tùy vào

hệ số phân chia (partition coeffient) (hình 2.3) Bất kỳ một hợp chất nào khi được đặt vào một hệ thống gồm có 2 pha (thí dụ: Hai pha lỏng - lỏng hoặc rắn - lỏng) lúc đạt đến trạng thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỉ lệ nồng độ nhất định, tỉ lệ này phụ thuộc vào các tính chất động học của các chất và của hai pha

Hệ số phân chia K được biểu diễn như sau:

Cũng tương tự, một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất khác nhau khi được đặt vào hệ thống gồm có 2 pha, mỗi loại hợp chất sẽ có ái lực riêng của nó đối với hai pha,

vì thế sẽ có tương tác mạnh yếu khác nhau đối với pha tĩnh Hệ quả là mỗi loại hợp chất sẽ di chuyển qua pha tĩnh với vận tốc khác nhau, nhờ vậy kỹ thuật sắc ký có thể tách riêng các loại hợp chất (Nguyễn Phi Kim Phụng, 2007)

15

Nguyên tắc của sắc ký cột là mẫu thử được nạp lên trên đầu một cột chứa chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxit…) Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng đối với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng sẽ bị giải hấp và di chuyển theo vận tốc khác nhau tạo thành các băng có vị trí khác nhau, ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau (Trần Hùng, 2004)

Sắc ký cột cung cấp những phân đoạn có độ tinh khiết cao hơn phương pháp chưng cất, nhưng khối lượng mỗi phân đoạn thu được thấp hơn vì khối lượng tinh dầu

sử dụng ít hơn Phương pháp này đòi hỏi phải biết chọn hệ dung môi (pha động) thích

16

hợp cho từng loại phân đoạn Có thể kiểm soát thành phần các phân đoạn bằng phương pháp sắc ký bản mỏng hoặc phương pháp sắc ký khí kèm theo

Phương pháp sắc ký cột nếu làm kỹ và phân đoạn nhiều lần thì có thể cô lập riêng ra được một số cấu phần có thành phần bách phân cao trong tinh dầu

2.4.2 Phương pháp sắc ký khí

Hình 2.4 Sơ đồ tổng quát mô tả các bộ phận của một máy sắc ký khí

(Nguyễn Phi Kim Phụng, 2007)

Hiện nay sắc ký khí là một thiết bị không thể thiếu được trong việc nghiên cứu

về tinh dầu Có hai loại cột được sử dụng trong các máy sắc ký khí là cột nhồi (paked column, colonne remplir) và cột mao quản (capillary column, colonne capillaire) Cột mao quản cho độ phân giải tốt hơn

Nguyên tắc của sắc ký khí là mỗi cấu phần trong tinh dầu sẽ bị hấp thụ trên pha tĩnh của cột phân tích khác nhau Trên cơ sở khác nhau về thời gian lưu này mà người

ta có thể định tính và định lượng cấu tử cần nghiên cứu

Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và detector Nhờ có khí mang, mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt Quá trình sắc ký xảy ra ở đây, sau khi các cấu tử rời bỏ cột tách tại các thời điểm khác nhau các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển

17

thành tín hiệu điện, tín hiệu này được khuếch đại và xử lý trên hệ thống máy tính thành các peak khác nhau về cả chiều cao và diện tích

Trên sắc ký đồ thu được ta có các tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là peak Thời gian lưu của peak là đại lượng đặc trưng cho chất cần tách (định tính) còn diện tích peak là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp nghiên cứu (Trịnh Thị Phi Ly, 2005)

2.5 Giới thiệu về vi khuẩn A rhizogenes

2.5.2 Đặc điểm chung vi khuẩn A rhizogenes

A rhizogenes là vi khuẩn hình que, gram âm, sống trong đất, có tính di động,

không sinh bào tử, có độc tính sở hữu Ri-plasmid thuộc họ Rhizobiaceae Nó gây ra

bệnh trên tầng lông hút của rễ cây song tử diệp A rhizogenes là loài vi khuẩn gây

bệnh cho thực vật được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai

18

vào mô và tế bào thực vật A rhizogenes có chứa một plasmid lớn (200 đến hơn 800

kb) gọi là Ri-plasmid (root inducing plasmid) chính là tác nhân gây bệnh cho cây (Bùi

Chí Bửu, 2000) Vi khuẩn xâm nhập vào vách tế bào thực vật ở vị trí vết thương, do A

rhizogenes bị hấp dẫn bởi hợp chất phenol (ví dụ như acetosyringone) được giải

phóng ra từ những tế bào bị tổn thương của mô đó Vi khuẩn không xâm nhập vào tế bào thực vật mà Ri plasmid được chuyển vào, trong quá trình lây nhiễm này một phần nhỏ của Ri plasmid gọi là T – DNA được chuyển vào và gắn với DNA của nhân tế

bào thực vật Khi cây bị nhiễm A rhizogenes qua các vết thương, biểu hiện bệnh rõ

nhất là các rễ bất định hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm Người ta hiện biết tương đối khá ít về T-DNA của Ri plasmid Sự hình thành rễ bất định sau đó có thể tiếp tục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn Vi khuẩn này thường được sử dụng trong nuôi cấy mô để nuôi cấy rễ chuyển gen (Hairy roots) sản xuất các hợp chất thứ cấp (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)

2.5.3 Ri-plasmid

Plasmid là các vòng DNA tự sinh sản độc lập Đặc điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập

Ri plasmid được phân thành hai loại chính tùy theo sản phẩm opine mà nó tổng hợp ra trong quá trình cảm ứng tạo rễ tóc Thứ nhất là agropine Ri plasmid tổng hợp opine agropine và mannopine, thứ hai là mannopine Ri plasmid tổng hợp opine mannopine Hầu hết các nghiên cứu về Ri plasmid là thuộc về agropine Ri plasmid

Cấu trúc Ri – plasmid có 4 vùng tương đồng, vùng T – DNA và vùng vir, liên quan trực tiếp đến sự hình thành khối u, hai vùng còn lại chứa gene mã hóa cho việc tái bản plasmid và chuyển nạp

Vùng T – DNA luôn được truyền sang tế bào thực vật, trong agropine Ri plasmid vùng này được tách thành hai phần là TL – DNA và TR – DNA Vùng vir có

tên gọi là vùng độc, chứa các gen vir, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển T –

DNA vào bộ gen tế bào thực vật

Ngoài ra còn chứa các gen nằm ngoài vùng T – DNA mã hóa cho các enzyme phân giải opine để làm nguồn carbon và nitơ cho vi khuẩn (Bùi Chí Bửu, 2000)

19

2.5.4 Chức năng T-DNA

T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 10-30 kb trong đó chứa gen mã hóa

cho sinh tổng hợp auxin, opine Khi cây nhiễm A rhizogenes, do T-DNA nạp vào

trong hệ gene của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các rễ bất định Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn” nhờ gene chuyển hóa opine

trên Ri-plasmid (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007) Trong nhiều dòng của A rhizogenes, nó

sản xuất ra opine agropine, T-DNA được tách ra thành hai phần: TL và TR Mỗi phần

có kích thước khoảng 20 kb nằm kẹp giữa hai trật tự 25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái (left border = LB) và biên phải (right border = RB) LB và RB là những yếu tố cần thiết để định hướng cho sự chuyển TL – DNA và TR – DNA Trên TR – DNA chứa các gen quan trọng là gen tổng hợp auxin, tổng hợp opine, trên TL – DNA

mang 3 gen rolA, rolB và rolC đóng vai trò quan trọng trong sự cảm ứng tạo rễ tóc

Vùng này chứa 18 khung đọc mở (ORF) trong đó 3 khung đọc mở quan trọng là ORF

10, 11, 12 tương ứng với 3 gen rolA, rolB, rolC (Satuti và ctv, 2000)

2.5.5 Chức năng các gene vir

Trong các vùng DNA của Ri plasmid, ngoài T-DNA, được nghiên cứu nhiều

hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Vùng vir có

kích thước khoảng 30,2 kb chứa 23 gen tương ứng là virH1, virA, virB1 – 11, virG, virC1

– C2, virD1 – D5, virF, virE Tìm thấy virE3 trong pRi 1724, khác với Ti plasmid có virE1 và virE2 đóng vai trò quan trọng cho việc gây độc, 2 gen này không có trong pRi

1724 Những gen vir này mã hóa cho các vai trò như: Tấn công vào tế bào thực vật, nhận

ra tế bào thực vật, cắt bỏ đoạn chuyển gen và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T – DNA vào tế bào ký chủ Hoạt động của các gen này có liên quan chặt chẽ đến sự có mặt của các hợp chất phenol được tiết ra từ vết thương của cây (Satuti và ctv)

2.6 Cơ chế chuyển T-DNA vào bộ gen của tế bào chủ

Để gắn T – DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A rhizogenes phải tiếp

xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương Quá trình này được thực hiện nhờ các gen

chvA và chvB Gen chvB mã hóa một protein liên quan đến hình thành β – 1,2 glucan

mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng

trong của tế bào vi khuẩn

20

Protein vận chuyển giúp vận chuyển β – 1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất β – 1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn

Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ

không có sự dẫn truyền T – DNA

Hình 2.6 Phương thức chuyển T-DNA vào genome của thực vật

(Nguyễn hoàng Lộc, 2007)

Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T – DNA từ

vi khuẩn vào tế bào thực vật Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T – DNA khỏi plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T – DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào bộ gen của cây chủ

Thực chất, chỉ riêng T – DNA của plasmid được chuyển vào bộ gen tế bào thực vật, mà không còn phần nào khác Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen

vir và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T – DNA Tuy

nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T – DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các

21

sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền

Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hóa nhờ tác

động của các hợp chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật

tổn thương Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE

Trước đó, khi gen virD được hoạt hóa, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB

và LB của T – DNA và làm đứt phần T – DNA ra khỏi DNA của plasmid thành các sợi đơn Đồng thời, quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm suất màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng Các sợi đơn T – DNA được gắn vào

protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn

Ngay sau đó, sợi T – DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật Cầu nối

chính là sự tiếp hợp giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành Khi T –

DNA đã được chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp nhất vào bộ

gen tế bào thực vật, được ổn định và di truyền như các gen bình thường khác (Nguyễn

Hoàng Lộc, 2007)

22

Chương 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành

Thời gian: Từ 2/2009 – 7/2009

Địa điểm thực hiện: Nhà lưới thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học và viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố

Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trên giống bạc châu Âu (Mentha piperita L.), vi

khuẩn Agrobacterium zhirogenes dòng TR7 và dòng 11325

3.2.2 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất:

Petroleum ether (Trung Quốc)

Natrisulphate (Trung Quốc)

Hexan (Merck)

Thiết bị:

Cân điện tử BP 210S – Sartorius AG Gottingen (Đức)

Máy lắc Orbital shaker SO1 – Stuart Scientific (Anh)

Bồn siêu âm Power sonic 510 – Hwashin Technology Co (Hàn Quốc)

Bộ chưng cất hơi nước Clevenger (Việt Nam)

Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R – 200 – Buchi (Thụy Sĩ) Máy sắc ký khí HP 6890 N (G1540N) – Agilent Technologies (Mỹ)

3.2.3 Môi trường nuôi cấy

3.2.3.1 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường YMB lỏng là môi trường có thành phần như trong phụ lục 2 không có agar Môi trường có pH=7 sau khi pha xong cho được cho vào mỗi ống falcon với thể tích là 30 ml, đem đi khử trùng ở 121oC trong vòng 25 phút

23

Môi trường YMB rắn là môi trường có thành phần như phụ lục 2 Môi trường có pH=7 sau khi hấp khử trùng như trên được đổ vào đĩa petri, mỗi đĩa đổ

20 ml môi trường

3.2.3.2 Môi trường trồng thủy canh

Môi trường C có thành phần như bảng phụ lục 1 Khi pha môi trường dinh dưỡng ở dạng nước thì phải nắm rõ nguyên tắc pha chế để chúng không bị kết tủa làm mất tác dụng của hóa chất Ta thấy trong thành phần dung dịch dinh dưỡng C thì Canxi nitrat và Magie sunphat hiện diện với liều lượng cao trong dung dịch vì thế dễ gây ra kết tủa, nên pha riêng hai chất này

3.3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát sự sinh trưởng, phát triển của các mẫu cây trồng có bổ sung 2 dòng vi khuẩn TR7 và 11325 trong hệ thống thủy canh tĩnh

Chiết xuất, xác định hàm lượng tinh dầu, hàm lượng menthol và menthone của các mẫu cây trồng có bổ sung 2 dòng vi khuẩn TR7 và 11325

Khảo sát đặc điểm sinh học, sự sinh trưởng phát triển của cây trồng thủy canh có bổ sung vi khuẩn và cây không bổ sung vi khuẩn trong hệ thống thủy canh hoàn lưu

Xác định hàm lượng tinh dầu, hàm lượng menthol và menthone của cây trồng

thủy canh có bổ sung vi khuẩn và cây không bổ sung vi khuẩn

So sánh cây bổ sung vi khuẩn trồng trong hệ thống thủy canh tĩnh và hồi lưu

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Chuẩn bị cây con cho vào hệ thống thủy canh

Hạt được ngâm một đêm bằng nước ấm (với tỉ lệ 2 sôi : 3 lạnh), bỏ nước đem đi

ủ bằng giấy lọc trong 24 giờ, sau đó lấy ra trộn đều với đất bột hoặc cát rồi gieo vãi lên luống Sau khi gieo xong, rắc một lớp đất mùn mỏng không quá 4mm lên luống, tưới nước phun sương hàng ngày Được 2 - 3 tuần là cây đã mọc Vì hạt bạc hà quá nhỏ nên khi gieo khó mà đều, nên khi cây mọc được cỡ từ 1 – 1,5 cm thì dùng dao nhọn nhỏ Thái Lan bấng cây chuyển sang các chậu đất đã được trộn sẵn tỷ lệ 2:1:1 (2 đất : 1 phân trùng : 1 tro trấu) với khoảng cách 3 – 5 cm một cây Cây mới chuyển vào chậu còn yếu nên cần được che mát 1 tuần rồi mới mang ra ngoài trời bình thường Tưới nước cho cây hằng ngày vào sáng sớm hoặc lúc chiều tối Khoảng 30 ngày sau khi

24