XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM GAN A TRÊN NGHÊU BẰNG KỸ THUẬT RTPCR

TÓM TẮT Virus viêm gan A HAV là một trong những nguyên nhân chính gây ra viêm gan cấp tính ở người trên khắp thế giới và đôi khi dẫn đến sự suy thoái chức năng của gan.. Theo những số li

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM GAN A

TRÊN NGHÊU BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Sinh viên thực hiện : ĐỖ NGỌC QUYÊN Niên khóa : 2005 – 2009

Tháng 8 năm 2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM GAN A

TRÊN NGHÊU BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

CN HỒ THANH BÁ

Tháng 8 năm 2009

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn

Thầy Nguyễn Tiến Dũng và thầy Hồ Thanh Bá đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện và quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Các thầy cô trong và ngoài trường đã hết lòng truyền dạy cho tôi nhiều

kiến thức và kinh nghiệm trong suốt thời gian tôi theo học tại trường

Các thầy cô, các anh chị và các bạn làm việc trong Viện nghiên cứu

Công nghệ sinh học và Môi trường đã hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa

luận tốt nghiệp

Và con xin chân thành cảm ơn ba mẹ đã có công sinh thành, nuôi dưỡng và giáo

dục con nên người

Đỗ Ngọc Quyên

TÓM TẮT

Virus viêm gan A (HAV) là một trong những nguyên nhân chính gây ra viêm gan cấp tính ở người trên khắp thế giới và đôi khi dẫn đến sự suy thoái chức năng của gan Theo số liệu thống kê, mỗi năm có khoảng 1,4 triệu người bị mắc virus viêm gan

A Tại Việt Nam, khoảng 20 - 40% trường hợp viêm gan chẩn đoán trên lâm sàng là

do virus viêm gan A gây ra, và ở một số vùng, số liệu thống kê năm 2007 cho thấy có

từ 70 – 80% trẻ em bị nhiễm virus này

HAV lây truyền sang người qua nhiều con đường, trong đó việc tiêu thụ thực phẩm sống hoặc thực phẩm chỉ mới qua sơ chế là nguyên nhân chính dẫn đến sự nhiễm virus viêm gan A Tuy nhiên, HAV trong thực phẩm khó có thể phát hiện được bằng phương pháp nuôi cấy tế bào hay phương pháp miễn dịch thông thường, vì vậy phương pháp được lựa chọn sử dụng hiện nay là RT-PCR

Mặc dù nước ta có tỉ lệ nhiễm virus viêm gan A cao nhưng chưa có một nghiên cứu nào để phát hiện HAV trong thực phẩm Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xây dựng quy trình phát hiện HAV trên mẫu nhuyễn thể (Nghêu) bằng kỹ thuật RT-PCR Các bộ kit, các mẫu vaccine viêm gan A và RNA của virus viêm gan A được sử dụng

để xây dựng qui trình Kết quả cho thấy quy trình xây dựng được có độ nhạy cao, có thể phát hiện được hàm lượng RNA của HAV 0,8 pg/µl Áp dụng quy trình trên để phát hiện virus viêm gan A trên 20 mẫu nghêu thu tại bãi nuôi nghêu thuộc huyện Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh và tỉnh Bến Tre, kết quả cho thấy có 5 mẫu nghêu dương tính với HAV

SUMMARY

Hepatitis A virus (HAV) is a major cause of acute hepatitis worldwide that sometimes leads to fulminant hepatic failure The world has about 1,4 million people infected with hepatitis A virus in every year In Vietnam, about 20 - 40% cases of hepatitis diagnosed on clinical as by hepatitis A virus causes, and data collected in some regions of Vietnam in 2007 showed an infection rate of about 70 – 80% in children

HAV is infects to humans through several paths, and the most common path is raw food consumption However, HAV in food can not be detected by the method of raising cells or immunity, so the RT-PCR-based protocol is used

Although it is thought that Vietnam is a high endemic region of HAV infection, there is no study to detect HAV on food In this study, we set up a RT-PCR-based

protocol for the detection of HAV in bivalve molluscs (meretrix spp) RNA extraction

Kits, RT-PCR kits, RNA of HAV and Vaccine samples were used to set up the PCR protocol Amplification reaction showed high specificity and a detection limit of 0,8 pg/µl of pure HAV RNA Using the established protocol, we obtained five positive signals on 20 bivalve molluscs samples collected from rearing ponds in Can Gio Ward,

Ho Chi Minh City and Ben Tre Province

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng x

Danh sách các hình x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Một số virus trong nhuyễn thễ 3

2.1.1 Caliciviruses 3

2.1.2 Astroviruses 3

2.1.3 Rotaviruses 5

2.1.4 Adenoviruses 5

2.1.5 Enteroviruses 6

2.1.6 Hepatitis A virus 7

2.2 Virus viêm gan A (Hepatitis A virus) 7

2.2.1 Đặc điểm sinh học 8

2.2.1.1 Cấu tạo 8

2.2.1.2 Sức đề kháng 9

2.2.1.3 Sự nhân lên của virus 9

2.2.1.4 Miễn dịch 10

2.2.2 Khả năng gây bệnh 10

2.2.2.1 Dịch tễ học 10

2.2.2.2 Gây bệnh cho người 13

2.2.3 Các con đường lây truyền virus viêm gan A 15

2.2.3.1 Lây truyền từ người sang người 15

2.2.3.2 Lây truyền qua thức ăn 16

2.2.3.3 Lây truyền qua nguồn nước 16

2.2.3.4 Lây truyền từ các loài động vật linh trưởng 17

2.3 Các phương pháp phát hiện virus viêm gan A 17

2.3.1 Phương pháp miễn dịch học 17

2.3.1.1 Phương pháp miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) 17

2.3.1.2 Phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA) 18

2.3.2 Phương pháp khuếch đại gen 19

2.3.2.1 RT-PCR 20

2.3.2.2 Nested RT-PCR 20

2.3.2.3 Hemi-nested RT-PCR 21

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện: 22

3.1.1 Địa điểm 22

3.1.2 Thời gian 22

3.2 Vật liệu nghiên cứu 22

3.2.1 Trang thiết bị và dụng cụ 22

3.2.2 Các loại hoá chất - vật liệu 22

3.3 Phương pháp nghiên cứu 24

3.3.1 Phương pháp xử lí mẫu nghêu 24

3.3.2 Phương pháp tách chiết RNA virus 24

3.3.2.1 Tách chiết RNA virus với bộ kit của Bioneer 24

3.3.2.2 Tách chiết RNA virus với bộ kit của QIAGEN 25

3.3.3 Thực hiện phản ứng hnRT-PCR 26

3.3.3.1 Thực hiện phản ứng hnRT-PCR với bộ kit của Bioneer 27

3.3.3.2 Thực hiện phản ứng hnRT-PCR với bộ kit của Invitrogen 27

3.3.4 Điện di sản phẩm hnRT-PCR 28

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Xây dựng quy trình với bộ kit của Bioneer 29

4.2 Xây dựng quy trình với bộ kit của QIAGEN và Invitrogen 32

4.2.1 Phát hiện virus viêm gan A trong mẫu vaccine và mẫu RNA virus 33

4.2.2 Thử nghiệm độ nhạy của qui trình với mẫu RNA virus 34

4.2.3 Phát hiện virus viêm gan A trên các mẫu nghêu bổ sung RNA virus 34

4.2.4 Áp dụng qui trình để phát hiện HAV trên các mẫu nghêu lấy từ thực tế 35

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Đề nghị 37

Tài liệu tham khảo 38

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

cDNA : Complementary deoxyribonucleic acid

DEPC-DW : Diethylpyrocarbonate – distil water

EDTA : Ethylene diamine Tetra-acetic acid

ELISA : Enzyme-linked Immunosorbent Assay

HACCP : Hazard Analysis and Critical Control Points

(Phân tích các mối nguy và xác định các điểm kiểm soát tới hạn)

RT-PCR : Reverse transcription - Polymerase chain reaction

VASEP : Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers (Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam)

WTO : World Trade Organization

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thống kê tương đối số ca nhiễm HAV tại các khu vực trên thế giới 12

Bảng 3.1 Trình tự các primer được sử dụng 26

Bảng 3.2 Hàm lượng các thành phần phản ứng 27

DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Sơ đồ 2.1 Các bước tiến hành kỹ thuật ELISA 18

Sơ đồ 4.1 Qui trình phát hiện HAV trên nghêu 36

Hình 2.1 Astroviruses 4

Hình 2.2 Cấu trúc hạt rotaviruses 5

Hình 2.3 Adenovirus 6

Hình 2.4 Virus viêm gan A (Hepatitis A virus) 7

Hình 2.5 Cấu tạo bộ gene virus viêm gan A 9

Hình 2.6 Mức độ nhiễm HAV tại các khu vực trên thế giới 12

Hình 2.7 Các giai đoạn nhiễm bệnh viêm gan A 13

Hình 2.8 Các bước tiến hành kỹ thuật RIA 19

Hình 2.9 Sơ đồ phản ứng PCR 19

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu vaccine Havax 30

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu vaccine Havax và đối chứng âm 31

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu vaccine và RNA virus 33

Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu RNA virus ở các độ pha loãng 34

Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu nghêu thử nghiệm 35

Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu nghêu thực nghiệm 36

và thuỷ sản nói riêng khi nhập khẩu vào các thị trường này luôn đòi hỏi phải đảm bảo nhiều tiêu chuẩn khắt khe về vệ sinh an toàn thực phẩm

Các yếu tố gây mất an toàn vệ sinh thực phẩm là các loại hoá chất, kim loại nặng, các virus và vi sinh vật gây bệnh (Pierson và Corlett, 1992) Việc phát hiện và hạn chế các yếu tố này là điều kiện quan trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm thuỷ sản, không những đáp ứng cho thị trường trong nước mà còn mở rộng xuất khẩu ra các thị trường lớn, khắt khe nhưng đầy tiềm năng

Trong các chủng loài thuỷ sản hiện nay thì nhuyễn thể hai mảnh vỏ là loài có nguy cơ nhiễm các yếu tố gây mất an toàn vệ sinh thực phẩm nói chung và virus nói riêng là khá cao, vì đây là loại động vật ăn đáy và ăn lọc, trong khi đáy bãi nuôi luôn là nơi tích tụ phần lớn các yếu tố có hại trong môi trường Theo những số liệu đã được nghiên cứu thống kê ở Italia, khoảng 50 – 60% số ca nhiễm virus viêm gan A là do việc ăn các loài nhuyễn thể còn sống hay mới chỉ qua sơ chế một phần (Macaluso và ctv, 2006) Theo tiêu chuẩn quốc tế HACCP về an toàn thực phẩm, virus viêm gan A được xếp vào nhóm vi sinh vật gây mối nguy hiểm nghiêm trọng đến sức khỏe con người, do đó việc quản lý ngăn ngừa sự lây nhiễm HAV qua thức ăn là cần thiết

Việt Nam được cho là một trong những nước có tỉ lệ nhiễm HAV cao trên thế giới, tuy nhiên vẫn chưa có một nghiên cứu chính thức nào về hệ gen của HAV được thực hiện Đến năm 2008, tại Học viện Quốc gia về bệnh truyền nhiễm Nhật Bản, các bác sĩ thuộc bệnh viện Nhi đồng 1, TP Hồ Chí Minh đã nghiên cứu về các phương pháp phát hiện HAV trên mẫu huyết thanh của các trẻ em Việt Nam nghi nhiễm Các phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu này là phương pháp ELISA phát hiện

anti-HAV là IgM và IgG, phương pháp PCR nhân bản đoạn trình tự đặc trưng của HAV, và phương pháp giải trình tự gen (Phuc Le Hoang và ctv, 2008) Trong những năm gần đây, tại một số nước như Canada, Brazil, Thái Lan, Italia đã có những công trình nghiên cứu phát hiện HAV trên các đối tượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phương pháp khuếch đại gen như RT-PCR, Nested RT-PCR, hemi-nested RT-PCR (hn RT-PCR) và multiplex RT-PCR và đã đạt được những thành công nhất định

Việc xây dựng được quy trình phát hiện HAV trong nghêu nói riêng và nhuyễn thể nói chung sẽ giúp quản lí tốt chất lượng nước khu vực nuôi trồng cũng như chất lượng sản phẩm nhuyễn thể trong nước, phục vụ cho nhu cầu xuất khẩu ra các nước khác trên thế giới

1.2 Yêu cầu

Trong giới hạn của đề tài nghiên cứu, yêu cầu phải xây dựng được qui trình phát hiện virus viêm gan A trên nghêu bằng kĩ thuật hemi-nested RT-PCR (hnRT-PCR)

1.3 Nội dung thực hiện

- Xây dựng và tối ưu hóa quy trình phát hiện virus viêm gan A bằng kĩ thuật hnRT-PCR

- Thử nghiệm quy trình trên 20 mẫu nghêu được lấy tại các bãi nuôi nghêu thuộc tỉnh Bến Tre và huyện Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Một số virus trong nhuyễn thễ

2.1.1 Caliciviruses

Caliciviruses thuộc nhóm virus đường ruột, mang vật chất di truyền là RNA

mạch thẳng không phân đoạn, cấu trúc hình thái dạng cầu, kích thước nhỏ, đường kính

khoảng 30 – 35 nm Caliciviruses được chia thành hai nhóm là Norwalk-like viruses (NLV) và Sapporo-like viruses Hepatitis E virus đã từng được xếp vào nhóm

Caliviruses nhưng gần đây đã được xếp vào một nhóm khác (Lees, 2000)

Caliviruses không thể nuôi cấy trong phòng thí nghiệm bằng các kĩ thuật nuôi

cấy virus thông thường Điều này đã gây nhiều khó khăn cho quá trình nghiên cứu virus

này cho đến khi các kĩ thuật sinh học phân tử được ứng dụng Hiện nay, NLV, Sapporo

virus và hepatitis E virus đã được dòng hóa và giải trình tự thành công (Lees, 2000)

Sapporo-like viruses có nhiều khác biệt về mặt di truyền so với NLV Những

nghiên cứu về huyết thanh học cho thấy loại virus này phân bố rộng khắp thế giới với

một tỷ lệ nhiễm cao ở người lớn Sapporo-like viruses là một trong những nguyên

nhân gây dịch tiêu chảy, chủ yếu ở trẻ sơ sinh và trẻ em dưới 5 tuổi, có thể xảy ra ở

những lứa tuổi lớn hơn Chưa có nghiên cứu nào chứng minh Sapporo-like viruses lây

nhiễm sang người từ các loại hải sản (Lees, 2000)

NLV bao gồm nhiều chủng khác nhau, chia thành genogroup I bao gồm những chủng Norwalk virus nguyên thủy, và genogroup II bao gồm chủng Snow Mountain và những chủng còn lại Trong những năm gần đây, chủng NLV genogroup II trở nên phổ biến hơn NLV được xem là nguyên nhân chủ yếu gây nên những trận dịch bệnh về đường ruột xảy ra trong gia đình và trong cộng đồng NLV gây bệnh ở cả trẻ em và người lớn Các triệu chứng bệnh thường gặp là buồn nôn, nôn, tiêu chảy, sốt, và đau bụng kéo dài 1 đến 4 ngày và sẽ bình phục hoàn toàn mà không để lại bất kì biến chứng nào (Lees, 2000)

2.1.2 Astroviruses

Astroviruses thuộc họ Astroviridae, chứa RNA dạng mạch đơn, dương, kích

thước nhỏ, đường kính khoảng 28 nm (Lees, 2000; Trần Văn Hưng, 2005)

Hình 2.1 Astroviruses (http://www.abdserotec

com/antibodies/_-796.html) Astroviruses khó nuôi cấy trên tế bào nhưng một số chủng có thể nuôi cấy được

bằng phương pháp nuôi cấy tế bào liên tục, và gần đây một số dòng tế bào đặc biệt đã

được sử dụng để nuôi cấy astroviruses từ mẫu phân Một số phòng thí nghiệm sử dụng phương pháp miễn dịch học và sinh học phân tử để chẩn đoán astroviruses (Lees, 2000)

Có 7 serotypes astroviruses gây bệnh cho người Dịch bệnh do astrovirus xảy

ra trên khắp thế giới, chủ yếu tại những vùng có khí hậu ôn hòa trong suốt mùa đông Các triệu chứng nhiễm bệnh tương tự khi nhiễm NLV, như buồn nôn, nôn, sốt và đau bụng Thời gian bệnh có thể kéo dài hơn khi nhiễm bệnh do NLV khoảng 2 đến 4 ngày, với những triệu chứng tiêu biểu kéo dài 2 đến 3 ngày, và đôi khi kéo dài từ 10 đến 14 ngày Người bệnh sau khi bình phục thường không để lại biến chứng Sự miễn

nhiễm có thể được hình thành sau khi nhiễm astrovirus, tuy nhiên nó có thể suy giảm

theo thời gian và những người lớn tuổi có nguy cơ tái nhiễm cao (Lees, 2000)

Việc sử dụng kính hiển vi điện tử trong việc chẩn đoán astrovirus có thể gây hạn chế trong việc nhận định quy mô nhiễm astrovirus trong các trận dịch bệnh vì đặc điểm hình thái học của astroviruses khó có thể nhận thấy được trong mẫu phân Nguyên nhân dẫn đến những trận dịch bệnh do astroviruses thường là từ nguồn thức ăn và nước uống

không đảm bảo vệ sinh Việc ứng dụng thành công các kĩ thuật phân tử phát hiện

astrovirus trong điều tra dịch tễ và kiểm nghiệm thực phẩm cho phép khẳng định hải sản

là một trong những nguyên nhân chính lây truyền astroviruses (Lees, 2000)

2.1.3 Rotaviruses

Rotavirus thuộc giống Reovirus, họ Reoviridae, gây nhiễm trùng đường hô hấp

và đường tiêu hóa Rotavirus gây tiêu chảy nặng và đe dọa tính mạng trẻ em dưới 2

tuổi trên toàn thế giới (Lees, 2000)

Rotavirus có dạng hình cầu, kích thước hạt virus khoảng 65 – 72 nm Acid

nucleic là RNA sợi kép, phân thành 11 đoạn nằm ở trung tâm của hạt virus, đường kính 38 nm được bao bọc bởi hai lớp capsid gồm capsid trong và capsid ngoài có cấu trúc đối xứng hình khối Các capsome của lớp trong xếp theo hình nan hoa và kéo nối các capsome của lớp ngoài tạo nên hình vòng (Lees, 2000)

Hình 2.2 Cấu trúc hạt rotaviruses (http://www.nlv.ch/Rotavirus/Rotafactsheet.htm)

Đa số rotavirus gây bệnh cho người thuộc type A với 7 serotype gây bệnh khác nhau Ngoài ra còn có các rotavirus type B, C, , G, nhưng chỉ có rotavirus type A, B

và C gây bệnh cho người Rotavirus vào cơ thể người và nhân lên chủ yếu ở niêm mạc

tá tràng Rotavirus có thể nuôi trên tế bào ruột bào thai người, thận bào thai lợn Sự

nhân lên của virus có thể phát hiện bằng miễn dịch huỳnh quang và miễn dịch hiển vi điện tử (Lees, 2000)

2.1.4 Adenoviruses

Adenovirus thuộc họ Adenoviridae Hiện nay có hai giống adenovirus được

công nhận là Aviadenovirus (gây bệnh cho chim) và Mastadenovirus (gây bệnh cho

người và động vật có vú) (Lees, 2000)

Adenovirus chứa DNA mạch kép có trọng lượng phân tử từ 20x106 đến 25x106Dalton, đường kính hạt virus từ 70 – 80 nm, không có vỏ bọc, capsid có đối xứng hình khối và virus có hình đa giác đều tạo nên bởi 252 capsome Có hai loại capsome chính:

240 capsome hexon nằm trên 20 mặt hình đa giác đều và 12 capsome penton nằm ở 12 đỉnh của hình đa giác đều Mỗi penton mang một sợi nhô ra bên ngoài và tận cùng bởi một khối hình cầu nhỏ (Lees, 2000)

Hình 2.3 Adenovirus (http://nobelprize.org/nobel_prizes/

medicine/laureates/1993/illpres/genes-in-pieces.html )

10% trường hợp viêm dạ dày ruột ở trẻ sơ sinh là do adenoviruses gây ra

Adenoviruses là nguyên nhân gây tiêu chảy ở trẻ em, xếp hàng thứ 2 chỉ sau rotavirus

Triệu chứng bệnh ở trẻ em là buồn nôn, nôn và sốt Mặc dù adenoviruses được tìm thấy

trong nước thải bị ô nhiễm, nước biển và hải sản, nhưng hải sản không phải là nguyên

nhân gây ra các trận dịch bệnh Điều này có thể được giải thích là do adenoviruses chủ

yếu gây bệnh trên trẻ em, nhưng trẻ em thường được cho ăn các loại hải sản đã nấu chín,

khi đó adenoviruses hầu như đã được bất hoạt hoàn toàn (Lees, 2000)

2.1.5 Enteroviruses

Enterovirus thuộc họ Picornaviridae, gồm 2 giống: Enterovirus và Rhinovirus

Đặc điểm chung của enterovirus là kích thước nhỏ, đường kính khoảng 27 nm, chứa

RNA dạng sợi đơn, capsid đối xứng hình khối, không có vỏ bọc (Lees, 2000)

Giống Enterovirus gồm 4 loài:

+ Poliovirus: gồm có 3 type, gây bệnh bại liệt, viêm màng não

+ Coxsackievirus: gồm có 29 type, gây viêm màng não vô khuẩn, viêm cơ tim,

viêm họng áp tơ, phát ban ngoài da

+ Echovirus: gồm có 32 type, gây viêm màng não vô khuẩn, viêm đường hô hấp,

viêm não, viêm ruột, viêm cơ tim,

+ Enterovirus type 68 - 71 gây viêm kết mạc chảy máu, viêm tiểu phế quản; type

72 của Enterovirus gây viêm gan cấp tính (Hepatitis A virus)

Giống Rhinovirus: gây nhiễm trùng đường hô hấp trên

Mặt dù enteroviruses nhân lên trong đường ruột và lây truyền qua phân, chúng

lại không gây ra các triệu chứng tiêu biểu cho bệnh đường ruột như buồn nôn và nôn

Nhiều nhà khoa học đã phân lập được enteroviruses từ nước cống thải, các nguồn

nước bị ô nhiễm và từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ Tuy nhiên, nhuyễn thể hai mảnh vỏ

được xem như không liên quan đến việc lây truyền enterovirus (Lees, 2000)

2.1.6 Hepatitis A virus

Hepatitis A virus thuộc chi Hepatovirus, họ Picornaviridae, và là type 72 của

Enterovirus, sẽ được đề cập chi tiết hơn ở phần 2.2

2.2 Virus viêm gan A (Hepatitis A virus)

Bệnh viêm gan đã được đề cập đến trong y văn cổ Trung Quốc và Hy Lạp cổ, nhưng đến những năm 60 của thế kỷ 20, các virus gây viêm gan mới dần được phát hiện và nghiên cứu sâu hơn trong suốt 4 thập kỷ qua Hiện nay các virus viêm gan được biết gồm: Virus viêm gan A (HAV), virus viêm gan B (HBV), virus viêm gan C (HCV), virus viêm gan D (HDV), virus viêm gan E (HEV) và virus viêm gan G (HGV)

Virus viêm gan A thuộc chi Hepatovirus, một thành viên của họ Picornaviridae, và thuộc type 72 của Enterovirus (Phạm Văn Ty, 2005)

Hình 2.4 Virus viêm gan A (Hepatitis A virus)

Đến nay chỉ mới xác định được một serotype của HAV Tuy nhiên, sự không đồng nhất về di truyền giữa các thể phân lập khác nhau của HAV từ các vùng khác nhau trên thế giới đã cho phép phân loại HAV vào bảy genotypes khác nhau, được đặt tên từ I

đến VII Bốn genotype trong số này đã được xác định là có khả năng gây bệnh cho con người, đó là genotype I, II, III, và VII Phần lớn HAV gây bệnh cho người thuộc genotype I và III, trong đó 80% là do genotype I Genotypes I và III tiếp tục được chia thành subtype A và B Genotype II và VII cũng được tìm thấy ở con người, còn genotype IV, V, VI được phân lập từ các loài động vật linh trưởng (Ruiz và ctv, 2001)

Genotype IA là nguyên nhân của phần lớn các trường hợp nhiễm bệnh viêm gan A

và đã được phát hiện ở tất cả các vùng trên thế giới Genotype IB thường xuất hiện ở khu vực Địa Trung Hải và các vùng lân cận, trong khi virus thuộc genotype III được phân lập

từ các bệnh nhân tại Ấn Độ và Nepal Đại diện duy nhất của genotype II và VII đã được phân lập từ các bệnh nhân từ Sierra Leone và Pháp, trong khi đó một số nghiên cứu đã cho thấy rằng chủng HAV ở Bắc Mỹ chủ yếu thuộc subtype IA (Ruiz và ctv, 2001)

40 - 80 nucleotides với một trình tự poly (A) (Formadi, 2005)

Vùng P1 mã hóa ba loại protein chính của vỏ capsid virus là VP1, VP2 và VP3 Một loại protein vỏ capside khác là VP4 cần thiết cho việc hình thành virion nhưng không được phát hiện trong virus trưởng thành Mỗi protein capsid được cắt từ chuỗi polyprotein ban đầu nhờ enzyme protease virus 3C mã hóa ở vùng P3.Protein phi cấu trúc mã hóa trong vùng P2 và P3 được cho là có vai trò trong việc tổng hợp RNA và hình thành virion VPg (virion protein, genome liên kết), cũng được mã hóa trong vùng P3, liên kết đồng hóa trị với vùng khởi đầu ở đầu 5’ và bắt đầu tham gia vào việc tổng hợp của RNA (Formadi, 2005)

Hình 2.5 Cấu tạo bộ gene virus viêm gan A (Formadi, 2005)

Mặc dù hơn 20 năm trước đây, các nhà khoa học đã thành công trong việc đưa HAV vào các tế bào nuôi cấy, nhưng cho đến nay thành phần các protein virus vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn (Formadi, 2005)

2.2.1.2 Sức đề kháng

So với các Enterovirus khác, HAV tương đối ổn định với nhiệt độ Ở nhiệt độ

600C virus chỉ bị bất hoạt một phần, khi đun sôi ở nhiệt độ 850C trong vòng 1 phút, virus

sẽ bị tiêu hủy dễ dàng Nhờ vào một lớp vỏ kiên cố, virus viêm gan A có thể sống sót trong vòng nhiều năm ở nhiệt độ - 200C Virus viêm gan A vẫn tồn tại trong điều kiện

pH = 1 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng, trong môi trường có thuốc tẩy ở 370C trong 30 phút với 1% SDS, hay khi môi trường có chứa ether, chloroform (Formadi, 2005)

HAV bị bất hoạt khi tiếp xúc với formaldehyt 8% trong 1 phút ở 250C, hay HgCl 1 mg/l trong 30 phút, hay iodine 3 mg/l trong 5 phút, hay chlorine 2,0 – 2,5 mg/l trong 15 phút, hoặc khi bị chiếu tia cực tím, hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút (Formadi, 2005)

2.2.1.3 Sự nhân lên của virus

HAV nhân lên trong nguyên tương tế bào gan, tế bào bị xâm nhiễm giải phóng hạt virus vào máu gây nhiễm virus máu rồi được thải qua mật vào trong phân

HAV có thể nhân lên ở nhiều tổ chức nuôi cấy tế bào khác:

- Tổ chức nuôi cấy tế bào một lớp nguyên phát khỉ

- Tế bào thận thai khỉ

- Tế bào chuyển dạng của phôi khỉ

Trong các tổ chức nuôi cấy tế bào, sự nhân lên của virus này không gây nên hiệu ứng tế bào bệnh lý Tuy nhiên sự hiện diện của HAV trong tổ chức nuôi cấy tế bào có thể theo dõi bằng nhiều kỹ thuật khác nhau:

- Kính hiển vi điện tử

- Miễn dịch huỳnh quang

- Miễn dịch phóng xạ (RIA) và miễn dịch liên kết enzyme (ELISA)

2.2.1.4 Miễn dịch

Khi nhiễm virus viêm gan A cơ thể sẽ tạo ra các chất chống lại virus, gọi là kháng thể anti-HAV, được xác định trong huyết thanh bệnh nhân trong giai đoạn bệnh cấp tính khi hoạt tính enzyme aminotransferase (một loại enzyme do gan tiết ra khi bị tổn thương) trong máu tăng cao và virus được thải ra trong phân (Formadi, 2005)

Có hai loại kháng thể anti-HAV: IgM và IgG

- IgM xuất hiện từ lúc bệnh khởi phát và thường biến mất trong vòng bốn tháng,

nó biểu thị cho tình trạng đang nhiễm hoặc nhiễm gần đây virus viêm gan A

- IgG xuất hiện sau IgM một thời gian ngắn, tồn tại kéo dài trong nhiều năm, có tính chất bảo vệ bệnh nhân chống lại sự tái nhiễm trùng, nó cho biết quá khứ đã nhiễm virus viêm gan A hoặc đã được chích ngừa virus này

2.2.2 Khả năng gây bệnh

2.2.2.1 Dịch tễ học

Virus viêm gan A được tìm thấy trong mồ hôi, nước bọt, nước tiểu, nhưng nhiều nhất vẫn là phân của người có bệnh Vi khuẩn viêm gan A theo thức ăn, nước uống nhiễm khuẩn xâm nhập vào cơ thể người Một trong những phương thức lây bệnh khá thông thường là tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước bọt của bệnh nhân viêm gan A trong thời kỳ ủ bệnh HAV cũng có khả năng lây qua đường máu giữa người với người trong giai đoạn nhiễm virus máu Virus viêm gan A chỉ gây bệnh cho người và các loài động vật linh trưởng, các loài sinh vật khác chỉ mang virus và không

có biểu hiện bệnh khi nhiễm HAV (Formadi, 2005; Trần Văn Hưng, 2005)

Các trận dịch bệnh viêm gan do HAV gây ra thường xảy ra ở những khu vực đông dân, có điều kiện vệ sinh kém Dịch bệnh xảy ra ở hầu hết các khu vực trên thế giới, có tính chất địa phương, tản phát và có xu hướng tái phát theo chu kỳ Các trận dịch bệnh viêm gan A thường xảy ra vào cuối mùa thu và đầu mùa đông Bệnh có thể

xảy ra ở mọi lứa tuổi, ở trẻ em bệnh thường ở trạng thái thầm lặng, không có triệu chứng rõ rệt, nhưng người càng lớn tuổi thì biểu hiện bệnh càng nặng (Formadi, 2005)

Một nghiên cứu tiến hành ở Indonesia cho biết, có những vùng tỷ lệ nhiễm HAV ở trẻ em dưới 4 tuổi lên đến 90 - 100% (Sincero và ctv, 2005) Tại Việt Nam, khoảng 20 - 40% trường hợp viêm gan chẩn đoán trên lâm sàng là do virus viêm gan A gây ra Tại Hà Nội, theo các nghiên cứu, tỉ lệ nhiễm virus viêm gan A khoảng 28,7% trong tổng số bệnh nhân bị viêm gan Mỗi năm trên thế giới có khoảng 1,4 triệu người nhiễm HAV Tuy nhiên, các chuyên gia dịch tễ khẳng định trên thực tế số người nhiễm HAV có thể cao hơn từ 3 đến 10 lần (Thái Hà, 2006)

Một số trận dịch bệnh HAV được phát hiện trên thế giới (Formadi, 2005):

- Từ 2 thập kỷ trước, dịch bệnh có tỷ lệ ngày càng tăng trong nhóm người sử dụng ma túy tại Úc, Châu Âu, và Bắc Mỹ Ở Hoa Kỳ, dịch bệnh có liên quan đến nhóm người sử dụng thường xuyên methamphetamine đã chiếm đến 48% các trường hợp được báo cáo

- Năm 1988 ở Thượng Hải, Trung Quốc đã xảy ra một trận dịch bệnh có liên quan đến việc ăn sống các loại hải sản bị nhiễm HAV, và đã có hơn 300000 người nhiễm bệnh Trong cùng năm này, một trận dịch HAV trên quy mô lớn đã xảy ra tại Hồng Kông với ít nhất 17 nhóm người riêng biệt bị nhiễm HAV sau khi ăn hải sản

- Trong những năm 1995 - 1997 đã xảy ra những trận đại dịch ở miền Trung Á với tỷ lệ lúc cao nhất là 1000 trường hợp trong mỗi 100000 dân Tại Tashkent, Uzbekistan, hơn 7000 trường hợp đã được báo cáo, dẫn đến tình trạng các bệnh viện quá tải và phải đóng cửa các trường học Bệnh viêm gan do HAV chiếm tỷ lệ 50 - 60% trường hợp viêm gan cấp tính do virus ở trẻ em Pakistan

- Tại Mỹ, trong tháng 10/2003, trận dịch bệnh viêm gan A ở Georgia và Tennessee có liên quan đến hệ thống nhà hàng O'Charley, và trong tháng 11/2003, dịch bệnh viêm gan A ở Tây Pennsylvania có liên quan đến hệ thống nhà hàng Chi-Chi Nguyên nhân được xác định có thể là do hành lá được sử dụng trong các món ăn của nhà hàng đã bị nhiễm HAV

- Một trận dịch bệnh do HAV từ nguồn nước đã xảy ra ở phía nam Sumatra, Indonesia từ tháng 05 - 08/ 2000 và có bốn trên mười khu làng đã bị ảnh hưởng Người

ta cho rằng những người nhiễm bệnh đã sử dụng nước từ các giếng công cộng

- Tại Philippin, vào tháng 09/2000, người ta đã báo cáo khả năng bùng phát

dịch bệnh viêm gan A trong một trường tư thục lớn Tại đây có 11 trong số 3994 học

viên đang bị nhiễm bệnh và nguồn nước giếng được sử dụng trong canteen cũng đã bị

nhiễm HAV

- Nhiều trường hợp nhiễm bệnh viêm gan A được phát hiện ở những người có

quan hệ tình dục đồng tính nam tại Vancouver, Canada, từ năm 1997 đến năm 1998

Bảng 2.1 Thống kê tương đối số ca nhiễm HAV tại các khu vực trên thế giới

(Formadi, 2005)

(triệu người)

Tỷ lệ nhiễm bệnh (trên 100000 người/năm)

Tổng số ca nhiễm/năm

2.2.2.2 Gây bệnh cho người

Sau khi xâm nhiễm vào cơ thể người, HAV đến định vị ở gan, gây nhiễm virus máu và khởi phát sự nhiễm trùng Thời gian ủ bệnh khoảng 14 - 50 ngày Các triệu chứng chán ăn mệt mỏi, sốt, nhức đầu, vàng da xuất hiện 1 - 2 tuần sau khi bị nhiễm bệnh, nước tiểu đậm màu, gan to đau, enzyme aminotransferase (một loại enzyme do gan tiết ra khi gan bị tổn thương) tăng cao trong máu (Trần Văn Hưng, 2005))

Virus viêm gan A chỉ gây viêm gan cấp tính (acute inflammation), không tạo nên những biến chứng lâu dài như sơ gan (fibrosis), chai gan (cirrhosis), hoặc ung thư gan (cancer), như virus viêm gan B, C, và D Bệnh thuyên giảm vào tuần thứ 4 hoặc thứ 5 sau khi nhiễm bệnh, các triệu chứng biến mất, thời kỳ hồi phục cần 1 - 2 tháng sau Khoảng 15% bệnh nhân bị tái phát sau 6 - 9 tháng (Trần Văn Hưng, 2005) Hiện nay, trên thế giới vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu đối với HAV Do đó việc sử dụng vaccine để phòng bệnh là biện pháp cần thiết

Triệu chứng của bệnh viêm gan A có thể thay đổi tùy theo tuổi của bệnh nhân Hơn 80% trẻ em dưới 2 tuổi khi bị lây thường không biểu hiện triệu chứng Ngược lại hơn 80% bệnh nhân lớn hơn 6 tuổi khi nhiễm bệnh sẽ biểu hiện những triệu chứng tiêu biểu từ rất nhẹ đến rất nặng (Trần Văn Hưng, 2005)

Hình 2.7 Các giai đoạn nhiễm bệnh viêm gan A (Formadi, 2005)

Tùy theo sức khỏe của mỗi cá nhân, bệnh có thể phát triển thành một trong 5 trường hợp sau đây:

1) Viêm gan thầm lặng (asymptomatic)

2) Viêm gan tiêu biểu (classical hepatitis)

3) Viêm gan với vàng da kinh niên (cholestatic)

4) Viêm gan tái phát nhiều lần (relapsing)

5) Viêm gan ác tính (fulminant hepatitis)

- Viêm gan thầm lặng: gặp ở hầu hết trẻ em Khi bị nhiễm HAV, bệnh nhân không biểu hiện các triệu chứng bệnh lý tiêu biểu như sốt, buồn nôn, vàng da, … Virus tăng sinh nhanh chóng trong cơ thể bệnh nhân và có thể dễ dàng lây truyền bệnh cho những người xung quanh qua những sinh hoạt thường ngày Ðây là lý do một số người đã bị nhiễm bệnh từ lâu nhưng không biết, chỉ khi tiến hành các xét nghiệm máu mới biết cơ thể đã có kháng thể chống lại HAV

- Viêm gan tiêu biểu: xảy ra thường xuyên nhất Thường từ 15 đến 50 ngày (trung bình khoảng 28 ngày) sau khi nhiễm HAV, bệnh nhân sẽ cảm thấy khó chịu, nóng sốt đột ngột Bệnh phát triển nhanh trong vòng 24 giờ kèm theo những triệu chứng như buồn nôn, đau bụng, biếng ăn, tiêu chảy, đau nhức khớp xương, giảm cân Một số bệnh nhân da và mắt trở nên vàng, nước tiểu trở nên đậm màu

Hơn 90% trường hợp bệnh sẽ kéo dài từ vài ngày đến vài tuần, và các triệu chứng sẽ giảm dần trong vài tuần kế tiếp Triệu chứng đôi khi rất nhẹ và mơ hồ nên có thể bị nhầm lẫn với bệnh cảm cúm thông thường Bệnh thường không gây trở ngại đáng kể đến công việc hàng ngày của người bệnh Sau khoảng 8 tuần lễ, hoạt động của gan trở lại hoàn toàn bình thường

- Viêm gan với vàng da kinh niên: bệnh nhân cũng bắt đầu với những triệu chứng tiêu biểu như trên, nhưng da và mắt của họ vẫn tiếp tục bị vàng dù hoạt động của gan đã dần trở lại bình thường Tình trạng vàng da này có thể kéo dài từ một đến

ba tháng Bệnh nhân tuy vẫn bị vàng da và mắt nhưng cơ thể đã trở về tình trạng khỏe mạnh Trong giai đoạn này virus viêm gan A đã ngừng tăng trưởng trong cơ thể nên không còn khả năng truyền bệnh cho người khác

- Viêm gan tái phát nhiều lần: khoảng 10% bệnh nhân viêm gan A sẽ bị tái phát nhiều lần (relapsing hepatitis) Sau khi bệnh đã lành một thời gian, bệnh nhân bị bệnh trở lại kèm theo những triệu chứng tiêu biểu như trên, kéo dài vài tuần lễ Trong một