KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PROTEASE NỘI TẠNG CÁ NGỪ TRƯỚC VÀ SAU SẮC KÝ

Enzyme trong dung dịch dễ dàng bị kết tủa dưới tác dụng của muối trung hoà như sulphatamon hoặc các dung môi hữu cơ như cồn, acetone ở nhiệt độ thấp nhưng không bị mất hoạt tính xúc tác.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PROTEASE NỘI TẠNG CÁ NGỪ

TRƯỚC VÀ SAU SẮC KÝ

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: BẠCH NGỌC MINH

Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 09 năm 2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PROTEASE NỘI TẠNG CÁ NGỪ

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn

Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường

Ban quản lý Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo cho em những điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tại đây

Thầy Nguyễn Tiến Thắng, Cô Đỗ Thị Tuyến đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Các anh chị ở bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, và các bạn ở phòng thí nghiệm Hoạt Tính Sinh Học đã nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận

Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 31 đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực tập

Sinh viên thực hiện

BẠCH NGỌC MINH

TÓM TẮT

Đề tài: “Khảo sát quá trình tách chiết và một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme protease nội tạng cá ngừ trước và sau sắc ký”, được thực hiện tại phòng Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 02/2009 đến tháng 07/2009

Với mục đích tận dụng nguồn enzyme protease trong nội tạng cá ngừ, việc nghiên cứu và khảo sát nhằm tìm ra các điều kiện tối ưu cho quá trình tách chiết, thu nhận, tinh sạch enzyme protease và các điều kiện thuận lợi giúp tăng và duy trì hoạt tính enzyme protease từ nội tạng cá ngừ

Quá trình nghiên cứu đã thu nhận được một số kết quả Quá trình tách chiết nội tạng cá ngừ bằng dung dịch đệm phosphat với tỷ lệ nội tạng / đệm là 1 / 8, thời gian ủ

ở nhiệt độ lạnh 50C – 100C trong thời gian 40 phút Sau đó, xử lý dịch chiết bằng muối sulphate amoni với nồng độ muối là 65% trong 40 phút ở điều kiện lạnh 00C – 40C Quá trình này sẽ thu được sản phẩm thô có hoạt tính protease cao nhất

Enzyme protease nội tạng cá ngừ thu được có hoạt tính tốt nhất ở khoảng nhiệt

độ 500C – 600C; với khoảng nồng độ muối ăn là 3 %; hoạt tính ở pH tối thích 7 – 8 Các ion kim loại kiềm hóa trị 2 như Mn, Mg, Ba, Ca có ảnh hưởng tốt lên hoạt tính của enzyme protease

Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel làm tăng hoạt tính lên từ 1,68 – 2,46 lần, với hiệu suất tinh sạch đạt hơn 60 %

Kết quả của nghiên cứu này có thể được sử dụng trong quá trình nghiên cứu tiếp theo sử dụng chế phẩm enzyme thô hay chế phẩm enzyme đã tinh sạch trong sản xuất thử nghiệm các sản phẩm mới với thành phần dinh dưỡng cao từ protein được thủy phân

SUMMARY

Subject “Study process of extraction and purification of protease from intestine

of Tuna fish (Scombridae)”

The process of research was conducted from Feb, 2009 to Jul, 2009 at Bioactive

Substances Department – Institute of Tropical Biology, Ho Chi Minh city

This study focussed on tranformation of fish-by-products to food and products with bioactivity, which brings economic benefits and reduces waste ratio in fishsery industry

The study has found optimal conditions for protease extraction from Tuna fish intestine Intestine and phosphate buffer ratio 1/8 (w/w); pH 7; extractive time is 40 minutes Sulphate amoni (NH4)2SO4 is a suitable precipitating agent for protease purification The optimal ratio of (NH4)2SO4 is 65 %; temperature 0 – 4 0C

Some factors have optimal conditions for protease extraction from Tuna fish intestine Active temperature 50 – 60 0C; sodium chloride concentration is 3 %; pH 7 – 8; some chemicals such as: Ca2+, Ba2+,, Mn2+ ,etc

The protease recovery yield is 66 % and the purity degree is 2,46

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Một số khái niệm cơ bản về enzyme 3

2.1.1 Giới thiệu chung về enzyme 3

2.1.2 Bản chất, cấu trúc enzyme 3

2.1.2.1 Bản chất của enzyme 3

2.1.2.2 Cấu trúc enzyme 3

2.1.3 Danh pháp và phân loại enzyme 4

2.1.4 Cơ chế tác dụng của enzyme 4

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme 5

2.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 5

2.1.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 5

2.1.5.3 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hoá 5

2.1.5.4 Ảnh hưởng của pH môi trường 6

2.1.5.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ 6

2.1.5.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại 7

2.2 Enzyme protease và lược sử nghiên cứu 7

2.2.1 Giới thiệu chung 7

2.2.2 Phân loại enzyme protease 7

2.2.3 Protease nội tạng cá và các động vật thủy sản 8

2.2.4 Lược sử nghiên cứu về protease 9

2.3 Ứng dụng protease và protease của cá trong chế biến thuỷ sản 10

2.3.1 Giới thiệu chung 10

2.3.2 Nghiên cứu và ứng dụng protease trong chế biến thuỷ sản ở Việt Nam 12

2.3.3 Các nguồn thu enzyme protease 13

2.3.4 Nguồn thu protease từ cá ngừ 13

2.3.5 Ứng dụng enzyme protease 14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 16

3.2 Đối tượng nghiên cứu 16

3.3 Thu thập và bảo quản mẫu 16

3.4 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 16

3.4.1 Dụng cụ và thiết bị 16

3.4.2 Hóa chất 16

3.5 Phương pháp nghiên cứu 17

3.5.1 Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano 17

3.5.1.1 Nguyên tắc 17

3.5.1.2 Hoá chất và thiết bị 17

3.5.1.3 Các bước tiến hành 17

3.5.2 Phương pháp tách chiết, thu nhận và tinh sạch enzyme protease 19

3.5.2.1 Chiết rút thu dịch chiết 19

3.5.2.2 Thu nhận chế phẩm protease 19

3.5.2.3 Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel 20

3.5.3 Nội dung thí nghiệm 21

3.5.3.1 Khảo sát dung môi và điều kiện chiết rút enzyme protease 21

3.5.3.2 Khảo sát chọn tác nhân và điều kiện kết tủa enzyme protease 24

3.5.3.3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính chế phẩm thô 25

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 28

3.7 Tính toán kết quả 28

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Khảo sát, lựa chọn dung môi và điều kiện chiết rút enzyme protease 29

4.1.1 Xác định tỷ lệ dung môi chiết nội tạng 29

4.1.1.1 Xác định tỷ lệ dung môi nước cất 29

4.1.1.2 Xác định tỷ lệ dung dịch muối sinh lý 30

4.1.1.3 Xác định tỷ lệ dung dịch đệm phosphate 31

4.1.2 Lựa chọn dung môi thích hợp 31

4.1.3 Xác định thời gian chiết 32

4.2 Khảo sát, lựa chọn tác nhân và điều kiện tủa enzyme protease 33

4.2.1 Xác định tỷ lệ (nồng độ) tác nhân tủa enzyme 33

4.2.1.1 Xác định nồng độ (NH4)2SO4 bão hoà để tủa enzyme 33

4.2.1.2 Xác định tỷ lệ cồn để tủa enzyme 34

4.2.1.3 Xác định nồng độ acetone để tủa enzyme 35

4.2.2 Lựa chọn tác nhân tủa thích hợp 35

4.3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính chế phẩm thô 37

4.3.1 Xác định ảnh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm thô 37

4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm thô 37

4.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt tính chế phẩm thô 39

4.3.4 Xác định độ bền nhiệt của enzyme protease chế phẩm thô 40

4.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của một số kim loại đến hoạt tính chế phẩm thô 41

4.4 Tinh sạch chế phẩm enzyme thô bằng sắc ký lọc gel 41

4.5 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính sau khi tinh sạch 44

4.5.1 Xác định ảnh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký 44

4.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký 45

4.5.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký 46

4.5.4 Xác định độ bền nhiệt của enzyme protease chế phẩm sau sắc ký 46

4.5.5 Khảo sát ảnh hưởng của kim loại đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký 47

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

5.1 Kết luận 49

5.2 Đề nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Tỷ lệ các loại hóa chất cần thiết để dựng đường chuẩn tyrosine 18

Bảng 4.1 Kết quả quá trình tách chiết của các loại dung môi khác nhau 32

Bảng 4.2 Kết quả quá trình tủa enzyme bằng các loại dung môi khác nhau 36

Bảng 4.3 Hàm lượng và hoạt tính của chế phẩm thô sau sắc ký 43

Bảng 4.4 Kết quả tinh sạch enzyme protease 44

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Sơ đồ tổng quát quá trình nghiên cứu 22

Hình 3.2 Sơ đồ thí nghiệm chiết rút enzyme protease theo tỷ lệ dung môi 23

Hình 3.3 Sơ đồ thí nghiệm chiết rút enzyme protease theo thời gian chiết mẫu 24

Hình 3.4 Sơ đồ thí nghiệm tủa enzyme protease theo tỷ lệ tác nhân tủa 24

Hình 3.5 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease 25

Hình 3.6 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính 26

Hình 3.7 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính 26

Hình 3.8 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease 27

Hình 3.9 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số kim loại đến hoạt tính 27

Hình 4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước cất đến quá trình chiết protease 29

Hình 4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch muối sinh lý đến quá trình chiết protease 30

Hình 4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch đệm phosphate đến quá trình chiết protease 31

Hình 4.4 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết rút protease 32

Hình 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến quá trình kết tủa protease 33

Hình 4.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ cồn đến quá trình kết tủa protease 34

Hình 4.7 Ảnh hưởng của nồng độ acetone đến quá trình kết tủa protease 35

Hình 4.8 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease chế phẩm thô 37

Hình 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm thô 38

Hình 4.10 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính chế phẩm thô 39

Hình 4.11 Độ bền nhiệt của protease chế phẩm thô 40

Hình 4.12 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính chế phẩm thô 41

Hình 4.13 Sắc ký đồ mẫu tủa muối sulphate amoni 42

Hình 4.14 Sắc ký đồ mẫu tủa cồn 42

Hình 4.15 Sắc ký đồ mẫu tủa acetone 42

Hình 4.16 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease chế phẩm sau sắc ký 44

Hình 4.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký 45

Hình 4.18 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký 46

Hình 4.19 Độ bền nhiệt của protease chế phẩm sau sắc ký 46

Hình 4.20 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính chế phẩm sau sắc ký 47

ở nhiều nước có nghề cá phát triển, nhằm thoả mãn nhu cầu to lớn và đang tăng lên nhanh chóng về chế phẩm protease

Việt Nam là một trong những quốc gia có nghề cá phát triển, với trên 200 loài

cá kinh tế, sản lượng 1,5 triệu tấn/năm Tuy sản lượng lớn nhưng phần đựơc sử dụng hữu ích từ cá chỉ chiếm khoảng gần 50% Nghĩa là hàng năm có trên 700.000 tấn phế liệu, trong đó có trên 30.000 tấn nội tạng cá Theo thói quen, nội tạng cá chỉ được sử dụng làm bột cá chăn nuôi, một phần được chế biến nước mắm, phần lớn bị thải bỏ vào môi trường, vừa lãng phí vừa là nguồn gây ô nhiễm

Tình hình trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học là sử dụng hợp lí

và hiệu quả lượng phế liệu cá rất lớn do các nhà máy chế biến cá tạo ra hàng ngày để sản xuất ra những sản phẩm mới, có giá trị cao

Với mong muốn góp phần giải quyết yêu cầu trên, em thực hiện đề tài “Khảo sát quá trình tách chiết và một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme protease nội tạng cá ngừ trước và sau sắc ký”

1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu

1.2.1 Mục đích

Mục đích chung của đề tài là khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết enzyme từ nội tạng cá, cũng như tính chất của enzyme này

1.2.2 Nội dung nghiên cứu

a Xác định quy trình tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng

– Xác định tỷ lệ dung môi chiết mẫu

– Xác định dung môi chiết enzyme protease

– Xác định thời gian chiết enzyme protease

– Xác định tỷ lệ (nồng độ) tác nhân kết tủa thu chế phẩm thô

– Xác định tác nhân kết tủa thu chế phẩm thô

– Tinh sạch chế phẩm enzyme thô bằng sắc ký lọc gel

b Khảo sát một số tính chất của enzyme protease thu được từ nội tạng cá ngừ trước và sau khi tinh sạch

– Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nhiệt độ

– Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease

– Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo pH

– Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nồng độ muối ăn

– Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease khi có mặt một số ion kim loại, chất đặc hiệu nhóm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Một số khái niệm cơ bản về enzyme

2.1.1 Giới thiệu chung về enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Enzyme tham gia xúc tác cho hầu hết các phản ứng hoá học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho quá trình chuyển hoá các chất trong cơ thể với tốc độ nhịp nhàng, cân đối theo chiều hướng xác định Do đó đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống

Hiện nay người ta đã khám phá hơn 2.000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme thu được ở dạng tinh thể Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong mọi lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc biệt là công nghiệp chế biến thực phẩm: bia, rượu, bánh mì, tương chao, nước mắm… (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.1.2 Bản chất, cấu trúc enzyme

2.1.2.1 Bản chất của enzyme

Enzyme là protein có hoạt tính sinh học nên nó có đủ tính chất của protein Giống với các protein hình hạt khác, enzyme có thể hoà tan trong nước, dung dịch đệm phasphate, dung dịch đệm Tris, dung dịch muối sinh lý…

Dung dịch enzyme có tính chất của dung dịch keo ưa nước Enzyme trong dung dịch dễ dàng bị kết tủa dưới tác dụng của muối trung hoà như sulphatamon hoặc các dung môi hữu cơ như cồn, acetone ở nhiệt độ thấp nhưng không bị mất hoạt tính xúc tác Do đó, có thể dùng các tác nhân này để thu chế phẩm enzyme Ngược lại, dưới tác dụng của các yếu tố gây biến tính protein (nhiệt độ cao, acid hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng nồng độ cao) enzyme thường bị mất khả năng xúc tác Và mức giảm hoạt tính tương ứng với mức độ biến tính của phân tử protein – enzyme (Nguyễn Tiến Thắng, 2007)

(“agon” hoặc “coenzyme”) Trung tâm hoạt tính của enzyme chiếm phần rất nhỏ so với phân tử enzyme nhưng có vai trò quan trọng trong việc tham gia kết hợp đặc hiệu với cơ chất trong quá trình xúc tác

Ở các enzyme một cấu tử, trung tâm thường bao gồm một tổ hợp các nhóm chức acid amin liên kết lại với nhau…Nhờ có cấu trúc bậc 3, 4 các nhóm này tuy nằm cách xa nhau trong mạch polypeptid, nhưng do xoắn cuộn mạch mà được gần nhau hơn Với enzyme hai cấu tử, ngoài một số nhóm chức của acid amin còn có nhóm ngoại tham gia trung tâm hoạt tính enzyme (Nguyễn Tiến Thắng, 2007)

2.1.3 Danh pháp và phân loại enzyme

Theo quy ước quốc tế, tên gọi enzyme thường được gọi theo cơ chất đặc hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia Theo đó tên enzyme thường có hai phần: phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân của phản ứng

Năm 1960, Hiệp hội hoá sinh quốc tế đã thống nhất phân loại enzyme ra làm 6 lớp sau: – Oxydoreductase: enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hoá khử

– Transpherase: enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị

– Hydrolase: enzyme xúc tác cho quá trình thuỷ phân

– Liase: enzyme tham gia xúc tác cho phản ứng loại CO2 hay phản ứng tách thuận nghịch phân tử nước

– Isomerase: enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hoá tương hỗ phức tạp giữa galactose và glucose

– Ligase: enzyme này xúc tác cho phản ứng carboxyl hoá pyruvic tạo thành oxaloacetid acid

2.1.4 Cơ chế tác dụng của enzyme

Bản chất của phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của enzyme, các

cơ chất sẽ được hoạt hoá mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hoá học của cơ chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản phẩm của phản ứng Do tác dụng của enzyme

mà cơ chất có thể có những thay đổi không chỉ về cấu trúc hoá học, mà còn thay đổi tính chất hoá học Theo Nguyễn Tiến Thắng (2007), quá trình xúc tác của enzyme xảy

ra ba giai đoạn:

 Giai đoạn thứ nhất: enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ

đó sẽ tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất Phức hệ này thường không bền Phản

ứng tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất thường xảy ra nhanh và chỉ đòi hỏi một ít năng lượng

 Giai đoạn thứ hai: khi cơ chất tạo phức với enzyme thì sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết Kết quả các liên kết

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme

Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: bản chất và nồng

độ của cơ chất, nồng độ enzyme, pH môi trường phản ứng, nhiệt độ, các ion kim loại, các chất vô cơ và hữu cơ khác có tác dụng kìm hãm hay hoạt hoá enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Ở giai đoạn đầu của phản ứng, khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất Khi nồng độ cơ chất đủ lớn sao cho tất cả nồng

độ enzyme đều tham gia phản ứng để tạo ra phức hợp enzyme – cơ chất, phản ứng sẽ tạo ra được vận tốc cực đại Nhưng đôi khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lên thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng

2.1.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Nồng độ của các enzyme tham gia phản ứng có ảnh hưởng đến chất lượng phản ứng enzyme Nhìn chung, trong điều kiện nồng độ enzyme thấp hay thừa cơ chất, thì tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, tốc độ phản ứng tăng chậm, hoặc không tăng

2.1.5.3 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hoá

Hoạt tính enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ và hữu

cơ khác nhau Các chất này có thể làm tăng, hoặc làm giảm hoạt tính enzyme Tác dụng của chúng có thể là đặc hiệu hoặc không đặc hiệu và thay đổi tuỳ từng chất, từng enzyme khác nhau

Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ làm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hoá bởi enzyme Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, kể cả protein, kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, cạnh tranh hay không cạnh tranh Khi biết được tác dụng ức chế của các chất này đối với từng loại enzyme trong từng phản ứng cụ thể ta

có thể điều chỉnh được phản ứng

Chất hoạt hoá là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme chuyển thành dạng hoạt tính từ dạng không hoạt tính Các chất này thường có bản chất hoá học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại, hoặc các chất hữu cơ Chất hoạt hoá có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính của enzyme một cách trực tiếp hoặc gián tiếp Cơ chế của sự kích hoạt này là do các chất tác dụng trực tiếp với trung tâm hoạt tính của enzyme, làm thay đổi cấu hình không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt tính xúc tác hoặc gián tiếp thông qua việc loại trừ các chất ức chế ra khỏi hỗn hợp phản ứng, nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme

2.1.5.4 Ảnh hưởng của pH môi trường

pH của môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng enzyme vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, ion hoá enzyme, và độ bền của protein – enzyme

pH thích hợp của phần lớn enzyme là 7

pH thích hợp của enzyme còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như đặc tính và nồng độ cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ phản ứng…

2.1.5.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Do bản chất hoá học của enzyme là protein nên khác với các phản ứng hoá học, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong 1 giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng enzyme cho thấy nhiệt độ hoạt tính thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40 – 500C, trên 500C hoạt tính thường bị giảm mạnh do làm hỏng cấu trúc phân tử enzyme Các enzyme có nguồn gốc thực vật và một số enzyme vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp cao hơn Nhiệt

độ thích hợp của enzyme còn phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau như: thời gian xác định hoạt tính, pH…Ở nhiệt độ thấp dưới 00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều, nhưng

có thể hồi phục khi đưa về nhiệt độ bình thường Ở nhiệt độ vào khoảng 700C, phần

lớn enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính, gọi là nhiệt độ tới hạn Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bị biến tính, hiếm khi được hồi phục hoạt tính trở lại

2.1.5.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại

Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hoá enzyme Các ion kim loại nặng,

ở nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch enzyme

Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng, mức độ hoạt hoá chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp trong một giới hạn xác định, khi vượt quá nồng độ này lại có tác dụng kìm hãm enzyme Giới hạn nồng

độ có tác dụng hoạt hoá enzyme của mỗi ion kim loại có thể khác nhau, vì vậy ở cùng một nồng độ, cùng điều kiện phản ứng, đối với một enzyme, hai ion có thể có tác dụng trái ngược nhau Hiện tượng này thường xảy ra giữa các ion cùng hoá trị

2.2 Enzyme protease và lược sử nghiên cứu

2.2.1 Giới thiệu chung

Protease là một nhóm các enzyme có khả năng xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết peptide trong phân tử protein Trong cơ thể cá còn sống các protease là tác nhân xúc tác quá trình trao đổi chất phục vụ hoạt tính sống của cá Sau khi cá chết, khả năng xúc tác quá trình thủy phân của các enzyme này vẫn còn và là nguyên nhân gây

ra sự biến đổi thịt cá sau khi chết Khi tách ra khỏi cơ thể cá thì protease vẫn giữ được khả năng xúc tác quá trình thủy phân Do đó, cần nghiên cứu các đặc tính của protease nội tạng nhằm sử dụng nguồn enzyme này từ phế liệu cá trong công nghiệp chế biến thủy sản, tạo ra các sản phẩm có giá trị cao từ thịt cá

2.2.2 Phân loại enzyme protease

Theo Barett và Donald (1986) thì protease được chia thành hai nhóm lớn là (proteinase) và exopeptidase

Nhóm endopeptiase

Là các enzyme phân giải các liên kết ở giữa chuỗi mạch polypeptide Theo phân loại của Ủy ban enzyme thuộc Hội Hóa sinh quốc tế, các enzyme nhóm này gồm

4 phân nhóm là:

 Phân nhóm 1: proteinase – xerin; gồm các enzyme như tripsin, chimotrysin

 Phân nhóm 2: proteinase – xistein hay proteinase – thiol; gồm các enzyme cathepsin

 Phân nhóm 3: aspactic – protease hay protease acid; gồm các enzyme pepsin, gastricsin

 Phân nhóm 4: metalo – proteinase như colagenase, calpain…

Nhóm exopeptidase

Là các enzyme thủy phân liên kết peptide ở đầu mút của chuỗi mạch peptide Các enzyme thuộc nhóm này gồm cacboxyl – peptidase, amino – peptidase, dipeptidase Các exopeptidase không có khả năng thủy phân liên kết peptide ở trung tâm mà chỉ tác dụng thủy phân liên kết ngoài cùng của chuỗi polypeptide, hoặc đầu amin, hoặc đầu cacboxyl, tuần tự tách từng acid amin ra khỏi chuỗi polypeptide

2.2.3 Protease nội tạng cá và các động vật thủy sản

Hệ tiêu hóa của cá gồm nhiều bộ phận khác nhau Mỗi bộ phận có chức năng và đặc điểm riêng của quá trình chuyển hóa, hấp thu thức ăn Do đó, hệ enzyme protease trong các bộ phận này cũng khác nhau Tuy nhiên hoạt tính của enzyme chủ yếu diễn

ra ở dạ dày và ruột cá (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

a Enzyme dạ dày

Dạ dày của cá là cơ quan duy nhất có pepsin xúc tác cho quá trình thủy phân protein trong môi trường acid mạnh Trong dạ dày cá có hai loại enzyme chính là pepsin và parapepsin

Pepsin là enzyme chủ yếu tiêu hóa thức ăn có protein trong dạ dày, được sinh tổng hợp trong các tế bào màng nhày của dạ dày và tiết ra dưới dạng không hoạt tính gọi là pepsinogen Pepsinogen có khối lượng phân tử 39.000 – 40.000 Da, bền trong môi trường trung tính và acid yếu, nhưng dưới tác dụng của acid clohydric và sự có mặt của một lượng nhỏ pepsin tự do trong dạ dày, sẽ chuyển hóa thành pepsin dạng hoạt tính là một chuỗi polypeptide có khối lượng 32.700 Da Pepsin có tác dụng của một proteinase, transpeptidase và esterase nhưng chủ yếu có tác dụng của endopeptidase và thủy phân chủ yếu các liên kết peptide sát gốc L – acid amin thơm

và dicacboxyl

b Enzyme đường ruột

Trong màng nhày ruột và trong dịch ruột, người ta xác định được có 22 enzyme tham gia vào quá trình tiêu hóa thức ăn Trong đó các enzyme protease gồm: enterokinase, amino – peptidase, amino – tripeptidase, dipeptidase, cacboxylpeptidase

Enterokinase là enzyme hoạt hóa đặc hiệu tripsinogen và chymotripsinogen

Enterokinase được tổng hợp từ tế bào màng ruột nhờ tác dụng của các muối mật mà xâm nhập vào khe ruột và hoạt hóa tripsonogen trên bề mặt màng nhày của ruột cũng như trong khoang ruột Dưới tác dụng của enterokinase, phân tử tripsinogen bị cắt một đoạn 6 acid amin tại vùng giữa lysin và isoleusin và do đó chuyển thành dạng hoạt tính Ngoài ra, tuyến tụy còn tiết ra một lượng enterokinase cân bằng với tripsin để

hoạt hóa chymotripsinogen thành chymotrtpsin

Chymotripsin là enzyme thuộc nhóm proteinase – serin, khối lượng phân tử khoảng 25.000 Da gồm 3 chuỗi polypeptide gắn với nhau bằng hai cầu nối sulfua Chymotripsin xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết peptide trong đó có nhóm –CO– của các acid amin thơm hoặc metionin Nó cũng xúc tác cho phản ứng thủy phân

este của các acid amin này

Tripsin và chymotripsin có khả năng cắt dứt các liên kết ở giữa mạch polypeptide của phân tử protein, kết quả hoạt tính thủy phân protein của chúng tạo thành các đoạn polypeptide Các đoạn này khi vào khoang ruột sẽ được các protease khác tiếp tục thủy phân tạo thành sản phẩm cuối cùng là các acid amin

2.2.4 Lược sử nghiên cứu về protease

Loài người sử dụng enzyme protease trong sản xuất và đời sống từ lâu đời, trước khi biết đến chúng 5000 năm trước công nguyên, con người đã sử dụng renin có trong dạ day bê như chất đông tụ để sản xuất pho mát Các thổ dân Nam Mỹ cổ đại đã sử dụng lá

đu đủ để làm mềm thịt và phương pháp này đã được kế thừa, phát triển thành kỹ thuật làm mềm thịt nhân tạo bằng papain và các enzyme protease khác Ở Việt Nam, từ lâu đời, ông cha ta đã chế biến nước mắm trên cơ sở quá trình tự phân giải thịt cá nhờ hệ enzyme có sẵn trong nội tạng và cơ thịt cá, trong điều kiện nồng độ muối cao

Đến thế kỷ 18, Reomur mới phát hiện dịch dạ dày của loài chim ăn thịt có khả năng tiêu hoá thịt; năm 1836 Schwann nghiên cứu hoạt tính phân giải protease của dịch vị trong dạ dày chó; năm 1857 Corvisart tách được chế phẩm thô tripxin từ dịch tụy; năm 1862 Danilevxki tách được tripxin và amylaza từ tụy tạng Từ những năm 50 của thế kỷ 20, các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu, thu nhận và ứng dụng enzyme protease từ vi sinh vật, đồng thời phát triển và hoàn thiện công nghệ thu nhận protease

từ các mô động vật và thực vật Từ đó đến nay, hàng loạt các protease từ vi sinh vật, từ

động vật và thực vật đã được sản xuất và ứng dụng vào mọi lĩnh vực sản xuất và đời sống Đặc biệt, những năm cuối thế kỷ 20, đầu thế kỷ 21, công nghệ enzyme phát triển

vô cùng nhanh chóng, các loại protease được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vục sản xuất, đời sống, y học và nghiên cứu khoa học Nếu như năm 1980, cả thế giới sản xuất

và tiêu thụ khoảng 1.300 tấn enzyme các loại trong đó protease chiếm 40,7 % thì đến năm 1985, thị trường enzyme thế giới đã có sản lượng được mua bán là 45 000 tấn, trị giá 650 triệu USD và đến năm 1990, doanh thu từ các enzyme công nghiệp của thế giới đạt 1,5 tỷ USD, trong đó thị phần enzyme protease là 48% Như vậy cứ khoảng 5 năm, lượng enzyme được sản xuất và tiêu thụ trên toàn thế giới tăng gấp đôi, trong đó lượng enzyme protease chiếm khoảng 50 % Các cường quốc về sản xuất và tiêu thụ enzyme protease công nghiệp là Mỹ, Pháp, Nhật, Đức, Ý, Thụy Điển, Hà Lan, Đan Mạch, Trung Quốc, …hầu hết thuộc các nước công nghiệp phát triển Dự báo, trong thế kỷ 21, sản xuất và tiêu thụ enzyme của thế giới sẽ tăng với tốc độ hàng năm khoảng 20 %

Tuy protease được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau nhưng cho đến những năm gần đây, các protease sử dụng trong công nghiệp chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật, các protease có nguồn gốc thực vật và động vật có vị trí thứ yếu (www.sinhhocvietnam.com)

2.3 Ứng dụng protease và protease của cá trong chế biến thuỷ sản

2.3.1 Giới thiệu chung

So với các protease có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật và động vật trên cạn, protease của động vật thuỷ sinh nói chung, cá nói riêng ít được ở trong quy mô công nghiệp Những nguyên nhân của tình trạng trên có thể là:

 Nguồn nguyên liệu thuỷ sản mang tính mùa vụ lại không tập trung, cố định nên việc cung cấp nguồn thu enzyme không ổn định, khó tổ chức sản xuất chế phẩm enzyme ở quy mô công nghiệp

 Trong cơ thể động vật thuỷ sản, cơ quan tập trung enzyme lớn và có hoạt lực cao là nội tạng nên thường sử dụng nội tạng của chúng làm nguồn thu enzyme Tuy nhiên, nội tạng cá thường có mùi tanh hôi, không hấp dẫn đối vói công nhân sản xuất, lại rất khó bảo quản ở điều kiện tự nhiên

 Protease của động vật thuỷ sản là một hệ gồm rất nhiều loại protease khác nhau

Để tách riêng và làm tinh sạch từng enzyme cần trải qua hàng chục bước khác nhau với kỹ thuật phức tạp Chính vì vậy, cho đến nay, trên thị trường chưa có

chế phẩm protease thương mại từ nguyên liệu thuỷ sản Để phát triển sản xuất chế phẩm enzyme từ thuỷ sản phải nghiên cứu, hoàn thiện công nghệ và giảm giá thành sản phẩm

Từ những năm 50 của thế kỷ trước, ở nhiều nước đã phát triển công nghệ sản xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật Hàng trăm loại chế phẩm protease từ các chủng vi sinh vật khác nhau đã được sản xuất và mua bán trên thị trường sản lượng các chế phẩm protease thương mại tăng nhanh, liên tục và tỷ trọng các protease từ vi sinh vật trong tổng doanh số enzyme trên thị trường thế giới luôn ở mức cao nhất so với các protease từ các nguồn khác Việc sản xuất các chế phẩm protease thương mại

từ vi sinh vật có những ưu điểm như:

 Có rất nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease, chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, có thể thu nhận enzyme hàng chục lần trong năm,

có thể chủ động về nguyên liệu

 Có thể dễ dàng điều hoà, định hướng quá trình sinh tổng hợp enzyme cần thiết trên cơ sở tác động vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật, chọn lọc hoặc gây đột biến ở chủng vi sinh vật

 Hiệu suất sinh tổng hợp enzyme trong môi trường nuôi cấy tổng hợp cao nên việc thu nhận enzyme thuận lợi

 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật dễ chế tạo, chi phí thấp, giá thành enzyme hạ

Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng các chủng vi sinh vật để sản xuất enzyme công nghiệp gặp phải một số trở ngại Các chủng vi sinh vật protease phải được đánh giá, kiểm tra nghiêm ngặt về độc tính để bảo đảm an toàn, vệ sinh cho sản phẩm Việc phân tích, kiểm tra phải tiến hành thường xuyên, liên tục với độ chính xác cao nên cần phải có các phòng thí nghiệm, phân tích chuyên dùng, trang bị dụng cụ hiện đại, chi phí đầu tư lớn

Trong khi đó, các enzyme protease có nguồn gốc từ động vật và thực vật luôn được đánh giá là an toàn, sau khi thu nhận có thể sử dung ngay vào quá trình chế biến mà không cần kiểm tra độc tính Với sản lượng 100 triệu tấn cá biển và 30 triệu tấn cá nước ngọt hàng năm, cả thế giới có tới 6,5 – 9 triệu tấn nội tạng và nếu đưa vào xử lý để thu nhận enzyme protease, nguồn lợi thu được là không nhỏ (Phạm Thị Trân Châu, 2006)

2.3.2 Nghiên cứu và ứng dụng protease trong chế biến thuỷ sản ở Việt Nam

Đến nay trong phạm vi quốc gia, ngành thuỷ sản chưa có một cơ quan, đơn vị chuyên nghiên cứu và ứng dụng enzyme trong chế biến thuỷ sản Các Viện nghiên cứu, các trường đào tạo cán bộ khoa học công nghệ chuyên ngành thuỷ sản chưa có chương trình nghiên cứu và ứng dụng enzyme nói chung, enzyme thuỷ sản nói riêng Chính vì vậy, có thể nói ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu về enzyme của cá và động vật thuỷ sinh cũng như các hưóng ứng dụng chúng vào sản xuất và đời sống, vào chế biến thuỷ sản hầu như chưa có gì Những năm gần đây, một số nhà khoa học và công nghệ đã bắt đầu quan tâm đến vấn đề này, nhưng mới chỉ là những nỗ lực cá nhân, chưa được sự quan tâm của nhiều người, chưa được sự đầu tư về tài, lực cho nghiên cứu nên kết quả mới là bước đầu và còn rất khiêm tốn Các tài liệu, số liệu về enzyme thuỷ sản và ứng dụng enzyme trong ngành thuỷ sản còn nghèo nàn, thiếu hệ thống

Tuy nhiên có một ngành chế biến có truyền thống lâu đời, chế biến nước mắm Các công trình nghiên cứu về nước mắm đều đi đến kết luận là nước mắm là sản phẩm của quá trình thuỷ phân protein trong thịt cá dưới tác dụng của hệ enzyme protease của bản thân nguyên liệu Quá trình thuỷ phân thịt cá bằng enzyme thực hiện trong điều kiện có muối ăn ở nồng độ cao, để ngăn hoạt tính của các vi khuẩn gây thối rữa, tạo thành các chất đạm hoà tan, chủ yếu là axit amin và peptit ngắn mạch Do thuỷ phân thịt cá bằng hệ enzyme của bản thân nguyên liệu trong điều kiện muối mặn nên quá trình chế biến nước mắm trong điều kiện tự nhiên có thời gian dài, từ trên 10 tháng tới

1 – 2 năm Trong quá trình lâu dài ấy, đồng thời với quá trình thuỷ phân thịt cá còn có các quá trình lên men khác với sự tham gia của hệ vi sinh vật yếm khí hình thành các hợp chất bay hơi, các acid hữu cơ…Làm cho nước mắm có hương vị, màu, mùi đặc trưng, có giá trị dinh dưỡng và cảm quan đặc biệt

Bên cạnh ứng dụng protease trong chế biến nước mắm, các nhà khoa học công nghệ nứoc ta cũng đã quan tâm mở rộng thêm nhiều lĩnh vực ứng dụng protease trong chế biến thuỷ sản Các lĩnh vực sử dụng protease trong chế biến thuỷ sản chủ yếu tập trung vào lĩnh vực nâng cao hiệu quả sử dụng phế liệu thuỷ sản cũng như nguồn cá tạp, cá kém giá trị kinh tế

So với kết quả nghiên cứu về enzyme protease của thực vật, động vật máu nóng

và vi sinh vật có lịch sử phát triển hàng trăm năm thì việc nghiên cứu, ứng dụng

enzyme protease cá Ứng dụng protease trong chế biến thuỷ sản mới chỉ tập trung vào việc tận dụng enzyme protease có sẵn trong nguyên liệu Các lĩnh vực nghiên cứu, ứng dụng protease trong chế biến thuỷ sản còn hạn chế, và chỉ mới dừng ở trong phòng thí nghiệm, chưa chuyển giao công nghệ để sản xuất công nghiệp

Yêu cầu sản xuất chế phẩm protease từ thuỷ sản để sử dụng trong chế biến cũng như cung cấp cho các ngành khác đang đặt ra trực tiếp và cấp bách Các công trình nghiên cứu về protease của cá và các lĩnh vực ứng dụng đang tăng lên nhanh chóng ở nhiều nước có nghề cá phát triển Tiềm năng phát triển sản xuất chế phẩm protease từ thuỷ sản và ứng dụng để chế biến ra những sản phẩm mới là rất to lớn Trong thời đại bùng nổ thông tin, sự hội nhập và trao đổi thông tin đang rất khẩn trương và thuận lợi, các nhà khoa học công nghệ nước ta cần nhanh chóng tiếp thu các thành tựu mới trong lĩnh vực này để áp dụng vào sản xuất, góp phần phát triển nhanh chóng công nghiệp chế biến thuỷ sản của đất nước (Nguyễn Đức Lượng, 2004 và www.agro.gov.vn)

2.3.3 Các nguồn thu enzyme protease

Enzyme nói chung va enzyme protease nói riêng được thu nhận chủ yếu từ ba nguồn cơ bản: mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật

Enzyme được tách từ các mô như: tụy tạng, dạ dày, ruột…của một số động vật thuỷ sản (mực, cá…) thường là trypsin, pepsin, chymotrypsin, cathepsin, …Từ thực vật có thể thu được một số enzyme thuỷ phân như: papain từ nhựa đu đủ, bromelin từ thân, lá và vỏ dứa Ngoài ra, còn có thể thu được một số enzyme khác như: amylase, urease, peroxydase…

2.3.4 Nguồn thu protease từ cá ngừ

Cá ngừ thuộc họ cá thu ngừ (Scombridae) có giá trị kinh tế quan trọng nhất ở

biển Việt Nam Cá ngừ phân bố ở khắp các vùng biển Việt Nam, kích thước cá tương đối lớn (6 loài có kích thước từ 20 – 70 cm, khối lượng từ 0, 5 – 4 kg Riêng hai loài

cá ngừ vây vàng và cá ngừ mắt to có kích thước lớn 70 – 200 cm, khối lượng 1, 6 –

64 kg) Căn cứ vào tập tính di cư có thể chia cá ngừ ở Việt Nam thành 2 nhóm nhỏ:

 Nhóm các loài có kính thước nhỏ, di cư trong phạm vi địa lý hẹp

 Nhóm các loài di cư đại dương

Mùa vụ khai thác: Mùa vụ khai thác cá ngừ ở vùng biển Việt Nam gồm hai vụ,

vụ chính bắt đầu từ tháng 4 đến tháng 8, vụ phụ từ tháng 10 đến tháng 2 năm sau Cá

ngừ thường tập trung thành đàn và di cư, trong đàn thường bao gồm một số loài khác nhau Sản lượng khai thác các ngừ hàng năm chiếm tới 10 – 15% tổng sản lượng cá khai thác hàng năm nhưng lại chiếm tới 50 – 60% sản lượng cá xuất khẩu và 60 – 70% giá trị kim ngạch xuất khẩu cá (www.agro.gov.vn)

có thể sử dụng enzyme loại này đối với quy trình chế biến nguyên liệu chứa nó

Hưóng 2: Tách enzyme ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và sử dụng chúng vào trong các quá trình sản xuất Việc tách chiết enzyme dựa vào tính chất của chúng: enzyme tan được trong nước, trong dung dịch muối sinh lý, các dung dịch đệm Dịch chiết thu được chứa enzyme, protein tạp, các chất hữu cơ và vô cơ nên phải tiến hành tinh sạch để thu chế phẩm Các chế phẩm enzyme được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau

a Trong ngành thực phẩm

Enzyme protease được sử dụng trong chế biến thịt, làm cải biến giá trị cảm quan, làm tăng giá trị sản phẩm Người ta sử dụng protease từ dứa, đu đủ, nội tạng động vật để thuỷ phân làm mềm nguyên liệu, hoặc thuỷ phân nguyên liệu tạo thành dịch dễ hấp thu, dễ tiêu hoá

Trong chế biến nước giải khát, trong công nghiệp bia, các chế phẩm protease được sử dụng làm trong dịch quả, dịch bia Dùng protease trong công nghiệp chế biến sữa, làm phomat

Protease được dùng làm tăng giá trị sản phẩm về mặt thương mại của các sản phẩm có giá trị thấp Ví dụ như dùng protease để thuỷ phân protein trong phế liệu công nghiệp thực phẩm (xương, collagen…) thành các dạng hoà tan, thu dịch đạm

thuỷ phân làm thức ăn cho người hoặc thức ăn chăn nuôi Dùng protease để thuỷ phân màng tế bào gan cá để trích ly dầu cá

b Trong các ngành công nghiệp

Trong ngành công nghiệp dệt, người ta dùng chế phẩm protease dể sản xuất dung dịch hồ tơ làm tăng độ bóng, không ảnh hưởng đến độ bền của tơ Protease đựơc

sử dụng trong ngành ảnh để sản xuất gellatin trên bề mặt phim ảnh, dùng để tái sinh ảnh, giấy ảnh và các phim chụp X – quang Protease còn được sử dụng trong ngành

da để tẩy sơ bộ da nguyên liệu, lam mềm da, tăng lượng lông thu hồi (tỷ lệ thu hồi tăng 25 – 30% so với khi dùng phương pháp hoá học), va da có chất lượng cao

Ngoài ra, protease còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất xà phòng, chất tẩy rửa, công nghiệp mỹ phẩm, protease được thêm vào để sản xuất xà phòng, kem đánh răng… có tác dụng tẩy sạch các vết mủ, hay bổ sung protease vào kem bôi mặt

để loại các lớp biểu bì chết, làm mịn da

c Trong ngành dược phẩm

Dùng protease để bổ sung vào thuốc chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hoá, thuốc tiêu mủ ở các vết thương, thuốc chữa nghẽn mạch máu để làm sạch vết thương và giảm đau cho người bệnh Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm bằng cách thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, và có ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân

d Trong chế biến thuỷ sản

Nước mắm được hình thành từ quá trình thuỷ phân protein trong thịt cá dưới tác dụng của hệ enzyme protease có sẵn trong nguyên liệu trong điều kiện muối mặn và thời gian dài Người ta đã sử dụng chế phẩm protease để bổ sung trong quá trình sản xuất nước mắm với lượng nhất định nhằm rút ngắn thời gian chế biến Nhờ vậy mà làm tăng hiệu quả kinh tế, tăng sự luân chuyển vốn

Ngoài ra, người ta còn sử dụng protease vào việc sản xuất bột đạm cá, bột đạm hoà tan,…từ các loại cá có giá trị kinh tế thấp (như cá mối, cá tạp…) Sở dĩ làm như vậy vì hướng sản xuất này có thể tận dụng được các phế liệu trong quá trình chế biến, tiết kiệm nguyên liệu, tăng giá trị sản phẩm, … đem lại hiệu quả kinh tế cao

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành

– Thời gian thực hiện bắt đầu từ tháng 2/2009 đến tháng 7/2009

– Quá trình nghiên cứu tại phòng “Các chất có hoạt tính sinh học” thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng thu enzyme protease là nội tạng cá ngừ Theo nghiên cứu của GS.TS Nguyễn Trọng Cẩn (1984) thì nội tạng cá ngừ chiếm tỷ trọng không lớn so với toàn bộ

cơ thể (5 – 6% trọng lượng cơ thể) Tuy nhiên do kích thước của từng cá thể lớn nên

nộ tạng thu được từ một con là khá lớn Thêm vào đó với sản lượng khai thác từ 150.000 – 180.000 tấn/năm (www.agro.gov.vn) thì lượng nội tạng thu được là khá lớn

Trong quá trình xử lý chế biến cá có thể dễ dàng tách riêng và thu gom nội tạng

3.3 Thu thập và bảo quản mẫu

Mẫu nghiên cứu là nội tạng cá ngừ vằn được thu gom tại chợ Thủ Đức vào sáng sớm ngay khi cá mới về Mẫu sau khi thu thập sẽ được xác định khối lượng ban đầu, đem bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh ở nhiệt độ - 40C Khi cần sử dụng, mẫu được đem

ra, cân chính xác lượng cần dùng trong thời gian nhanh chóng và vẫn trong điều kiện lạnh, và chuyển phần mẫu còn lại vào tủ lạnh để bảo quản ở nhiệt độ âm, tránh làm mất hoạt tính mẫu

3.4 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

3.4.1 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ phòng thí nghiệm: ống nghiệm thủy tinh, pippet, cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống đong,…Các loại máy: máy đo quang phổ UV – Vis, máy sắc ký lọc gel, cân điện tử, máy khuấy từ, máy đo pH, máy ly tâm, bể ủ nhiệt…

3.4.2 Hóa chất

Hoá chất dùng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích trong phòng thí nghiệm Cơ chất để xác định hoạt tính enzyme: casein Hoá chất dùng trong quá trình chiết: NaCl, Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4.2H2O…Hoá chất dùng trong quá trình tủa: aceton, cồn, sulphatamol Các thuốc thử hàm lượng và hoạt tính của protease

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano

3.5.1.1 Nguyên tắc

Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng màu với thuốc thử folin Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thuỷ phân dưới tác dụng của enzyme Hoạt tính của enzyme được biểu hiện bằng đơn vị hoạt tính thuỷ phân protein của enzyme

3.5.1.2 Hoá chất và thiết bị

Hoá chất: HCl 0, 1 M, Na2CO3 0, 4 M, Cl3CCOOH 0, 4 M, tyrosine tinh khiết, thuốc thử folin (pha loãng 5 lần khi sử dụng), đệm phosphate pH = 7;0, 1 M, dung dịch casein 1%: cân 1 g casein từ sữa (hãng Merck) thêm vào vừa đủ 100 ml dung dịch đệm photphase pH = 7;0, 1 M

Dụng cụ và thiết bị: ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc, bể ổn nhiệt, máy đo quang phổ UV – Vis, máy đo pH

3.5.1.3 Các bước tiến hành

a Xây dựng đường chuẩn tyrosine

Pha tyrosine tinh khiết thành dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau: 10,

20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 µg tyrosine/ml HCl Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0, 4

M vào dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau và thêm 1 ml thuốc thử folin vào dung dịch hỗn hợp Sau khi lắc đều, để ổn định dung dịch ở 37±0, 5oC trong 20 phút Cách pha loãng dung dịch tyrosine và dựng đường chuẩn tyrosine được trình bày như Bảng 3.1 trang 18

Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660nm Ghi nhận kết quả As10 ,

Bảng 3.1 Tỷ lệ các loại hóa chất cần thiết để dựng đường chuẩn tyrosine

Ống

nghiệm

Nồng độ (µg/ml)

Dung dịch tyrosinse chuẩn (µl)

Dung dịch HCl (µl)

Na 2 CO 3

(ml)

Thuốc thử folin (ml)

b Xác định hoạt tính enzyme protease

Hoạt tính của enzyme được khảo sát ở 37oC và pH = 7

Cho 1 ml cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 37 ± 0, 5oC trong 10 – 15 phút

Sau thời gian ủ, cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào và lắc đều Đem ủ hỗn hợp

này ở 37 ± 0, 5oC trong 60 phút

Cho vào 2 ml dung dịch Cl3CCOOH 0, 4 M để ngừng phản ứng

Để ổn định trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa

Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 0, 4 M vào 1 ml dịch lọc

Thêm 1 ml thuốc thử folin

Lắc đều, để yên ở 37 ± 0, 5oC trong 20 phút

Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm(ghi

nhận kết quả này là Am)

Mẫu đối chứng: lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml enzyme và tiến hành các bước

tương tự như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện Ghi nhận kết quả độ hấp thụ này là Ao

Hàm lượng tyrosine được giải phóng do potease thuỷ phân được tính bằng cách

lấy Am – Ao rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt tính

protease theo tính toán sau:

Một đơn vị hoạt tính (ĐVHĐ) enzyme protease được xác định là lượng enzyme

để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 µg tyrosine trong 1 ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm

F = (10/As10 + 20/As10 + 30/As10 + 40/As10 + 50/As10 + 60/As10 + 70/As10 + 80/As10 + 90/As10)/9

Hoạt tính enzyme protease(ĐVHĐ/ml) = (Am – Ao) F 1/100 n

Hoạt tính enzyme protease(ĐVHĐ/g) = (Am – Ao) F 1/100 n V 1/m Trong đó: Am: độ hấp thụ của mẫu; Ao: Độ hấp thụ của ống đối chứng

F: hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine và độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm trên đường chuẩn

n: hệ số pha loãng của enzyme; m: khối lượng nội tạng 1/100: hệ số chuyển đổi; V: thể tích của dung dịch enzyme

3.5.2 Phương pháp tách chiết, thu nhận và tinh sạch enzyme protease

Tiến hành tách chiết và thu nhận enzyme protease từ các phần riêng khác nhau: nội tạng cá Toàn bộ quá trình tách chiết thu enzyme được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp (0 – 4oC) để hạn chế sự biến tính của protein – enzyme dưới tác động của môi trường Nội tạng cá được nghiền mịn với cát thạch anh trong cối inox đặt trong một thau đá

3.5.2.1 Chiết rút thu dịch chiết

Dùng một số dung môi có khả năng hoà tan enzyme (nước cất, dung dịch muối sinh lý, dung dịch đệm phosphate) với tỷ lệ và thời gian thích hợp để chiết rút thu enzyme Nhiệt độ dung môi trước khi phối trộn là 0 – 4oC Trong quá trình chiết rút, ta khuấy liên tục (ở 0 – 4oC), sau đó ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch chiết Xác định hoạt tính enzyme dịch chiết theo phương pháp Amano, chọn tỷ lệ, dung môi, thời gian thích hợp

3.5.2.2 Thu nhận chế phẩm protease

Kết tủa protein – enzyme trong dịch chiết thu được từ nội tạng bằng các tác nhân: aceton, cồn, (NH4)2SO4 Các hoá chất đã làm lạnh được cho từ từ vào dịch chiết với tỷ lệ và nồng độ thích hợp, để gây kết tủa protease Quá trình kết tủa enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh 0 – 4oC Sau đó ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút thu chế phẩm thô Chế phẩm thô được bảo quản trong dung dịch đệm phosphate 0,1M;

pH 7 Xác định hoạt tính enzyme chế phẩm thô theo phương pháp Amano, chọn tỷ lệ, tác nhân, thời gian tủa thích hợp

3.5.2.3 Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel

a Chọn lựa gel

Sắc ký dùng để tinh sạch enzyme dùng cột 50 x 1, 5 và Biogel P – 100

Cỡ hạt hay sử dụng 100 – 200 mesh (10 – 40µm) hay 200 – 400 mesh (20 – 80µm) Hạt nhỏ cho kết quả tách tốt hơn, nhưng thời gian thực hiện lại rất dài

b Chuẩn bị gel và cột

Cân 5g gel Bio – Gel P – 100 khô (chính xác cần dùng 4,4g nhưng vì thể tích gel sẽ bị mất trong suốt quá trình thao tác nên cần cân dư) Cho nước cất vào từ từ, luợng nước cất nhiều gấp 2 lần so với thể tích lớp nền gel cần cho vào trong cột Cụ thể ít nhất 53 x 2 = 106 ml nước cất

Đối với các gel từ Bio gel P – 30 đến Bio gel P – 100 cần 12 giờ ở 20oC để hydrate hoá hoặc 4 giờ nếu bắt đầu ở 100oC Sau khi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, để ổn định trong suốt quá trình hydrate hoá Sau khi quá trình hydrate hoá xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt Chuyển dung dịch vào 1 bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không Khử khí của dung dịch trong khoảng từ 5 – 10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ bình Không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hư gel

Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền (106 ml) và lắc nhẹ Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95 % số hạt ổn định Gạn hoặc loại bỏ lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để tạo các hạt mịn Lập lại công việc trên 4 lần để loại > 90

% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel

Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy

20 % thể tích cột Rót dung dịch gel vào cột thành 1 dòng di chuyển nhẹ Tránh làm bẩn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bọt khí Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 – 5 cm, mở khoá đầu ra của cột cho đến khi cột nạp đầy gel

Khi cột đã nạp đầy gel, khoá đầu ra của cột và gắn flow adaptor Mở khoá đầu

ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền (106 ml) chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ qua dòng chảy Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh dòng điện xuống lớp nền gel Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm

mẫu vào trên lớp nền gel qua dòng điện Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị

Tốc độ dòng chảy nên điều chỉnh ở mức độ thấp hơn một chút so với dòng chảy tự

do Thông thường đối với gel có kích thước lỗ nhỏ, nên sử dụng tốc độ 8 – 12 ml/cm2 mặt cắt ngang (15 – 25 ml/h), còn đối với gel lỗ lớn 2 – 5 ml/cm2 (5 – 10 ml/h) Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén Phương pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự

do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel bằng lỗ nhỏ Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng chảy ổn định, nên phải dùng bơm nén Thông thường là nén theo chiều trọng lực, tuy nhiên cũng có tác giả sử dụng cách nén ngược lên

d Thu và xác định mẫu

Dịch ra khỏi cột được đo ở bước sóng 280 nm bằng bộ tách sóng trong hệ sắc

ký và được thể hiện độ hấp thụ dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP data view trên máy tính Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi phân đoạn 2 ml

Dựa vào sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak sau đó phân tích hàm lượng protein và xác định hoạt tính

3.5.3 Nội dung thí nghiệm

3.5.3.1 Khảo sát dung môi và điều kiện chiết rút enzyme protease

Với mục đích chung của đề tài là khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến việc tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá ngừ; cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme trước và sau khi sắc ký Quá trình nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ Hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ tổng quát quá trình nghiên cứu

Ly tâm thu chế phẩm thô

Nội tạng cá Nghiền mịn Chiết rút enzyme protease

Ly tâm thu dịch chiết Dịch chiết Tủa enzyme protease

dung môi : nội tạng

Dung môi chiết

Thời gian

Mẫu sau sắc ký

Xác định hoạt tính và hàm lượng

Xác định các yếu

tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease

pH Nhiệt độ

Độ bền nhiệt Nồng độ muối ăn Ion kim loại

Chế phẩm thô

Tinh sạch enzyme bằng sắc

ký lọc gel

Xác định hoạt tính và hàm lượng

Xác định các yếu

tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease

pH Nhiệt độ

Độ bền nhiệt Nồng độ muối ăn Ion kim loại

a Xác định tỷ lệ dung môi chiết

Tỷ lệ dung môi là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của enzyme Dựa trên khả năng hoà tan của enzyme, tiến hành chiết rút enzyme protease bằng các dung môi (nước cất, dung dịch muối sinh lý, dung dịch đệm phosphate) với các tỷ lệ khác nhau, thời gian 30 phút, ly tâm dịch chiết Xác định hoạt tính enzyme protease của từng dịch chiết theo phương pháp Amano

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chiết rút enzyme protease theo tỷ lệ dung môi / mẫu

Tiến hành thử nghiệm trên ba loại dung môi khác nhau là nước cất, dung dịch muối sinh lý (NaCl 0,9%) và dung dịch đệm phosphate 0,05M ở pH 7 Ở mỗi loại dung môi, giữ cố định lượng nội tạng thử nghiệm là 1g, thay đổi tỷ lệ dung môi chiết đưa vào từ 1ml, 2ml, 3ml, …đến 10ml

b Lựa chọn dung môi chiết thích hợp

Với các dung môi khác nhau thì khả năng chiết rút thu enzyme khác nhau Do vậy, sau khi xác định được các tỷ lệ dung môi chiết: mẫu thích hợp, ta so sánh hoạt tính protease trong dịch chiết từ nước cất, dung dịch muối sinh lý, dung dịch đệm phosphate để chọn dung môi chiết thích hợp

c Xác định thời gian chiết

Hiệu suất của quá trình chiết còn phụ thuộc vào thời gian chiết Sau khi xác định được tỷ lệ, dung môi chiết, tiến hành xác định thời gian chiết thích hợp cho

Nội tạng (đã nghiền)Chiết bằng các loại dung môi với tỷ lệ dung môi / mẫu

Xác định hoạt tính enzyme Chọn tỷ lệ dung môi chiết / mẫu thích hợp

enzyme Sau mỗi khoảng thời gian 10, 20, 30, …, 70 phút, ly tâm thu dịch chiết, xác định hoạt tính enzyme, chọn thời gian chiết thích hợp

Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chiết rút enzyme protease theo thời gian chiết mẫu

3.5.3.2 Khảo sát chọn tác nhân và điều kiện kết tủa enzyme protease

a Xác định tỷ lệ (nồng độ) tác nhân tủa enzyme

Tỷ lệ tác nhân kết tủa là một trong những yếu tố có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Tiến hành kết tủa enzyme protease bằng các dung môi (acetone, cồn, (NH4)2SO4) với các tỷ lệ (nồng độ) khác nhau, thời gian 40 phút, ly tâm thu sản phẩm Xác định hoạt tính enzyme protease của từng chế phẩm thô theo phương pháp Amano

Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tủa enzyme protease theo tỷ lệ tác nhân tủa / dịch chiết

Dịch chiết nội tạng Kết tủa bằng các tác nhân

Xác định hoạt tính enzyme Chọn tỷ lệ tác nhân tủa / dịch chiết thích hợp

Nội tạng (đã nghiền)

Chiết rút với tỷ lệ, dung môi thích hợp

trong thời gian (phút)

Xác định hoạt tính enzymeChọn thời gian chiết thích hợp

Với ba loại tác nhân tủa enzyme là muối sulphate amoni, cồn và acetone tiến hành giữ ổn định lượng dịch chiết cho vào mỗi mẫu là 10ml dịch chiết và chỉ tiến hành thay đổi tỷ lệ dung môi đưa vào Với dung môi là muối sulphate amoni, thay đổi lượng muối (NH4)2SO4 bão hòa lần lượt là 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% Với dung môi tủa là cồn và aetone, tiến hành thí nghiệm tương tự, giữ ổn định lượng dịch chiết đưa vào là 10ml ở tất cả các mỗi, và thay đổi lượng dung môi sao cho tỷ lệ dung môi / dịch chiết lần lượt là 1:1, 2:1, 3:1…,10:1 Chế phẩm thô sau khi được kết tủa bằng (NH4)2SO4 với các nồng độ được loại muối bằng phương pháp sắc ký

b Lựa chọn tác nhân kết tủa thích hợp

Với các tác nhân khác nhau, khả năng kết tủa thu protein – enzyme là khác nhau Do vậy, sau khi xác định được các tỷ lệ (nồng độ) tác nhân tủa / dịch chiết thích hợp ta tiến hành so sánh hoạt tính enzyme của chế phẩm thô được kết tủa bằng aceton, cồn, (NH4)2SO4 thẩm tích để chọn tác nhân tủa thích hợp

3.5.3.3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của chế phẩm thô thu được từ nội tạng cá ngừ

a Xác định ảnh hưởng của pH

pH là yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme Mỗi enzyme có pH hoạt tính thích hợp nhất định Việc nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease được thực hiện bằng cách:xác định hoạt tính protease dịch chiết và chế phẩm thô của nội tạng ở các giá trị pH = 2, 3, 4, …, 12

Hình 3.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease

Protease chế phẩm thô nội tạng Tác dụng với casein ở các pH

Xác định hoạt tính enzyme Chọn pH thích hợp

b Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ

Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính protease của chế phẩm thô nội tạng bằng cách cho tác dụng với casein trong 60 phút Sau đó nhanh chóng làm lạnh, tiến hành xác định hoạt tính enzyme tương tự phương pháp Amano

Hình 3.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính

enzyme protease

c Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối ăn

Tiến hành xác định hoạt tính enzyme chế phẩm thô của nội tạng ở các nồng độ muối: 1%, 3%, 5%,…25%, 27%, 30 %, bằng các tiến hành pha loãng chế phẩm enzyme thô bằng dung dịch muối ăn ở các nồng độ khác nhau Tiến hành xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Amano

Hình 3.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt

tính enzyme protease

Protease chế phẩm thôTác dụng với casein + NaCl