Nghiên cứu lịch dùng vacxin cúm h5n1 cho ngan pháp thương phẩm tại trung tâm nghiên cứu gia cầm thuỵ phương

Luận văn, thạc sỹ, tiến sĩ, cao học, kinh tế, nông nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

KHUẤT THỊ TUYÊN

NGHIÊN CỨU LỊCH DÙNG VACXIN CÚM H5N1 CHO NGAN PHÁP THƯƠNG PHẨM TẠI TRUNG TÂM NGHIÊN

CỨU GIA CẦM THỤY PHƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : THÚ Y

Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ NGA

HÀ NỘI - 2010

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn

Tác giả luận văn

Khuất Thị Tuyên

LỜI CẢM ƠN

ðể hồn thành bản luận văn này, ngồi sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tơi luơn nhận được sự giúp đỡ, tạo điều kiện của các đơn vị tập thể:

Ban giám hiệu, Viện đào tạo sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa Thú y,

bộ mơn Vi sinh vật - truyền nhiễm - Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội

Ban giám đốc Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương, Ban lãnh đạo Trạm nghiên cứu gia cầm Cẩm Bình

Bộ mơn virus - Trung tâm chẩn đốn thú y TW - Cục thú y

ðặc biệt là sự chỉ bảo, giúp đỡ tận tình của các thầy cơ hướng dẫn và giúp đỡ khoa học: + TS Nguyễn Thị Nga -Trưởng phịng thú y - Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương- Viện Chăn Nuơi

+ TS Trần Thị Lan Hương - Giảng viên bộ mơn Vi sinh vật - truyền nhiễm Trường ðại Học Nơng nghiệp Hà Nội

Tơi cũng nhận được sự hợp tác giúp đỡ của, các anh chị đồng nghiệp trong Trạm nghiên cứu gia cầm Cẩm Bình

Nhân dịp này, cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc về những quan tâm giúp đỡ quý báu đĩ

Tơi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp và người thân, những người đã động viên, tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 11 năm 2010

Tác giả luận văn

Khuất Thị Tuyên

MỤC LỤC

1 MỞ ðẦU i

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài 1

1.2 Với mục tiêu ñề tài: 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Bệnh cúm gia cầm 3

2.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm và tình hình dịch cúm gia cầm .3

2.2.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 3

2.2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới 5

2.2.3 Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam 6

2.3 ðặc ñiểm sinh học của virus cúm týp A .8

2.3.1 ðặc ñiểm về hình thái và cấu trúc 8

2.3.2 ðặc tính kháng nguyên của virus cúm týp A 12

2.3.3 Thành phần hóa học và sức kháng của virus 14

2.3.4 Quá trình nhân lên của virus 15

2.3.5 ðộc lực của virus 16

2.4 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 18

2.5 Triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm .20

2.5.1 Triệu chứng lâm sàng ñiển hình của bệnh cúm gia cầm chủng ñộc lực cao (HPAI) 20

2.5.2 Triệu chứng lâm sàng ñiển hình của bệnh cúm gia cầm chủng ñộc lực thấp (LPAI) 21

2.6 Bệnh tích 21

2.7 Chẩn đốn bệnh cúm gia cầm 22

2.8 Miễn dịch cúm gia cầm 24

2.8.1 Miễn dịch khơng đặc hiệu 26

2.8.2 Miễn dịch đặc hiệu 26

2.8.3 Một số phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch cúm gia cầm 28

2.9 Vacxin 28

2.9.1 Sự cần thiết của tiêm vacxin phịng bệnh cúm gia cầm 28

2.9.2 Vacxin vơ hoạt đồng chủng: 30

2.9.3 Vacxin vơ hoạt dị chủng: 30

2.9.4 Vacxin tái tổ hợp: 30

3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ 35

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

3.1 ðối tượng 35

3.2 Nội dung nghiên cứu 35

3.2.1 Xác định kháng thể cúm gia cầm chủ động ở đàn ngan Pháp mẹ và thụ động ở đàn ngan con nuơi tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thuỵ Phương .35

3.2.2 Xác định thời điểm thích hợp để sử dụng liều vacxin cúm H5N1 lần 1 cho ngan con 35

3.2.3 Xác định hàm lượng kháng thể của đàn ngan con sau khi sử dụng vacxin cúm H5N1 lần 2 .35

3.2.4 Xác định hiệu lực của vacxin cúm H5N1 trên đàn ngan bằng phương pháp cơng cường độc .35

3.2.5 Khuyến cáo lịch dùng vacxin H5N1 phịng bệnh cúm cho ngan Pháp thương phẩm .35

3.3 Nguyên liệu 36

3.4 Phương pháp nghiên cứu 36

3.4.1 Bố trí thí nghiệm 36

3.4.2 Phương pháp lấy máu ngan con: 38

3.4.3 Phương pháp làm phản ứng HA 38

3.4.4 Phương pháp làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (Phản ứng HI) 40

3.4.5 Xử lý số liệu 42

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

4.1 Kết quả kiểm tra kháng thể cúm gia cầm chủ ñộng ở ngan mẹ và thụ ñộng ở ngan con nuôi tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thuỵ Phương 43

4.1.1 Tương quan giữa hàm lượng kháng thể cúm gia cầm chủ ñộng ở ngan mẹ và thụ ñộng ở ngan con 43

4.1.2 Diễn biến kháng thể thụ ñộng ở ngan con 47

4.2 Xác ñịnh thời ñiểm thích hợp ñể sử dụng liều vacxin cúm H5N1 lần 1 cho ngan con 54

4.3 Kết quả xác ñịnh lượng kháng thể của ñàn ngan con sau khi sử dụng vacxin cúm gia cầm H5N1 lần 2 .62

4.4 Kết quả xác ñịnh hiệu lực của vacxin cúm H5N1 trên ñàn ngan bằng phương pháp công cường ñộc 68

4.5 Khuyến cáo lịch dùng vacxin H5N1 phòng bệnh cúm cho ngan thương phẩm 77

5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 78

5.1 Kết luận 78

5.2 ðề nghị 79

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NXB : Nhà xuất bản

TCID50 : 50 percent tissue culture infective dose

4.2 Diễn biến hàm lượng kháng thể thụ ñộng cúm gia cầm ở ñàn

ngan con nở từ trứng của ngan mẹ có HI bình quân = 6,43 log2 và

4.3 Diễn biến hàm lượng kháng thể thụ ñộng cúm gia cầm ở ñàn

ngan con nở từ trứng của ngan mẹ có HI bình quân = 5,73 log2 và

4.4 Diễn biến hàm lượng kháng thể thụ ñộng cúm gia cầm ở ñàn

ngan con nở từ trứng của ngan mẹ có HI bình quân = 4,5 log2 và

lần 2 (nở từ trứng của ñàn ngan mẹ sau khi tiêm vacxin 1 tháng) 64

lần 2 (nở từ trứng của ñàn ngan mẹ sau khi tiêm vacxin 3 tháng) 65 4.10 Hàm lượng kháng thể của ngan khi sử dụng vacxin cúm H5N1

lần 2 (nở từ trứng của ñàn ngan mẹ sau khi tiêm vacxin 5 tháng) 67 4.11 Kết quả xác ñịnh hiệu lực của vacxin cúm H5N1 trên ñàn ngan

DANH MỤC HÌNH

4.3 Hiệu giá kháng thể của ngan con khi dùng vacxin cúm H5N1 lần

4.4 Hiệu giá kháng thể của ngan con khi dùng vacxin cúm H5N1 lần

4.5 Hiệu giá kháng thể của ngan con khi dùng vacxin cúm H5N1 lần

1 MỞ ðẦU 1.1 Tính cấp thiết của ñề tài

Dịch cúm gia cầm do virus cúm A (H5N1) thể ñộc lực cao (HPAI) ñã bùng phát ở Việt Nam cuối năm 2003, mặc dù ñã ñược khống chế nhưng dịch vẫn xẩy ra rải rác ở một số tỉnh Biện pháp khống chế ñến 9/2004 là tiêu hủy toàn ñàn nhiễm bệnh và có tiếp xúc với nguồn bệnh Biện pháp này ñã cho kết quả tốt nhưng tốn kém và gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho người chăn nuôi Mặt khác trong các ổ dịch cúm gia cầm xảy ra gần ñây có nhiều ổ dịch xảy ra trên thủy cầm (52,7%) và từ nhiều ñàn không tiêm vacxin phòng cúm gia cầm ở ngoài dân ðặc biệt có nhiều ổ dịch xảy ra ở mô hình chăn nuôi hỗn hợp (gà, vịt, ngan) và ñược báo cáo là phát ra trên thủy cầm trước sau ñó lây nhiễm cho gà

Trong chăn nuôi gia cầm, ngan cũng ñược nuôi rất phổ biến khắp cả nước Do vậy nếu ngan không ñược tiêm phòng vacxin phòng virus cúm gia cầm sẽ có nguy cơ nhiễm virus cúm, mắc bệnh, chết và lây lan mầm bệnh cho các ñối tượng gia cầm khác cũng như con người Biện pháp sử dụng vacxin cúm gia cầm là cần thiết ñể hạn chế sự phát tán mầm bệnh, giảm sự thải virus

ra ngoài môi trường

Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương là nơi giữ giống gốc các dòng ngan Pháp, trước ñây Trung tâm sử dụng vacxin H5N9 phòng cúm gia cầm cho ngan nhưng sau ñó vacxin H5N9 không ñược nhập gây khó khăn trong việc phòng cúm gia cầm cho ngan, do vậy chưa có vacxin chính thức nào phòng cúm gia cầm dành riêng cho ngan Do ñó, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu ñề tài “Nghiên cứu lịch dùng vacxin cúm H5N1 cho ngan Pháp

thương phẩm tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương”

1.2 Với mục tiêu ñề tài:

+ ðưa ra lịch sử dụng vacxin cúm H5N1 phòng bệnh cúm gia cầm cho ñàn ngan Pháp thương phẩm tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương

+ An toàn cho ngan của Trung tâm và giảm chi phí nhập vacxin

Trước ñây bệnh còn ñược gọi là bệnh dịch tả gà (Fowl plague), nhưng

từ Hội nghị Quốc tế lần thứ nhất về bệnh Cúm gia cầm tại Beltsville, Mỹ, năm 1981 ñã thay thế tên này bằng tên bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza-HPAI) ñể chỉ virus cúm týp A có ñộc lực cao (Cục thú y, 2004) [7]

OIE (Office internation des epizooties) xếp HPAI vào danh mục 1 trong

15 bệnh nguy hiểm ở ñộng vật

Bệnh cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, có tốc ñộ lây lan rất nhanh với tỉ lệ chết cao trong ñàn gia cầm nhiễm bệnh Virus gây bệnh cúm gia cầm chủ yếu là loại H5, H7 và H9, gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, ngan, các loại chim Virus còn gây bệnh cho cả con người và có thể trở thành ñại dịch, vì thế bệnh cúm gia cầm ñang ngày càng trở nên nguy hiểm hơn bao giờ hết (Cục thú y, 2005) [8], (Lê Văn Năm, 2004) [20]

Mỹ, Châu Phi, Trung Cận đông (theo Phạm Sỹ Lăng, 2004) [19] Năm 1963, virus cúm týp A ựược phân lập ở Bắc Mỹ do loài thủy cầm di trú dẫn nhập vào ựàn gà Từ năm 1960-1979 bệnh ựược phát hiện ở Canada, Mexico,ẦTheo thống kê của Alexander thì có các ổ dịch lớn: ở Australia (1975-1985), Anh (1974), Mỹ (1983-1984), Ireland (1983-1984), Mexico (1984) đặc biệt ở Hong Kong (1997) virus không chỉ gây bệnh cho gia cầm

mà còn lây nhiễm và gây tử vong cho người

Sự lây nhiễm loài chim hoang dã sang gia cầm ựã có bằng chứng từ trước năm 1970 nhưng chỉ ựược công nhận khi xác ựịnh ựược tỷ lệ nhiễm virus cúm cao ở một số loài thủy cầm di trú (theo Phạm Sỹ Lăng, 2004) [19]

Từ sau khi phát hiện ra virus cúm týpA các nhà khoa học thấy rằng virus cúm có ở nhiều loài chim hoang dã và gia cầm nuôi những vùng khác nhau trên thế giới Bệnh xảy ra nghiêm trọng nhất với gia cầm thuộc subtýp H5, H7 đến nay dịch cúm gia cầm liên tục bùng nổ khắp các châu lục trên thế giới và với mức ựộ nguy hiểm của nó từ ựó thúc ựẩy các nhà khoa học tổ chức các hội thảo chuyên ựề về bệnh cúm gia cầm Hội thảo lần ựầu tiên vào năm 1981 tại Beltsville (Mỹ), lần thứ hai tại Athen năm 1986, lần thứ ba tại Madison WI vào 1992, lần thứ tư tại Athen năm 1997 và lần thứ năm năm

2003 cũng tại Athen

Từ ựó tới nay trong các về dịch tễ bệnh cúm gia cầm luôn là một trong

những nội dung ựược coi trọng và ựược liên tục tổ chức ở nhiều nơi trên thế giới điều ựó cho thấy bệnh cúm gia cầm ngày càng trở nên nguy hiểm và gây nhiều thiệt hại về mặt kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm trên phạm vi toàn cầu đặc biệt và nguy hiểm hơn khi virus cúm gia cầm vượt Ổrào cản về loàiỖ thắch nghi gây bệnh trên người với tỷ lệ tử vong cao

2.2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới

Ở các nước Châu Á theo ựánh giá của các tổ chức quốc tế thì trong tháng 12/2003 và tháng 01/2004 dịch cúm gà ựã gây ra ựại dịch ở 11 nước và vùng lãnh thổ bao gồm: Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Indonexia, Trung Quốc, Hồng Kong, đài Loan, Pakistan mà tác nhân gây bệnh là virus cúm A

Hàn Quốc: Dịch cúm gia cầm xảy ra từ 12/12/2003 ựến 24/3/2004 do virus H5N1 gây ra và tổng số gia cầm bị tiêu huỷ là hơn 400 nghìn con và 1 ổ dịch do H5N2 gây ra vào 10/12/2004

Nhật Bản: dịch cúm gia cầm xảy ra từ 27/1/2004 ựến 5/3/2004 do virus H5N1 gây nên

Thái Lan: đợt 1 dịch cúm gia cầm xảy ra từ 23/1/2004 ựến giữa tháng 3/2004 ở 11 tỉnh thành, với tổng số gia cầm bị tiêu huỷ khoảng 30 triệu con; ựợt dịch thứ 2 tái bùng phát từ 3/7/2004 nguyên nhân do virus H5N1

Trung Quốc: virus H5N1 xuất hiện từ 27/1/2004 ở Quảng Tây sau ựó lan sang 15 tỉnh khác ựặc biệt ở các tỉnh biên giới với Việt Nam ựều có dịch Indonesia: Dịch cúm xuất hiện ựầu tiên vào tháng 1/2004 Ờ 11/2004 ở 16/33 tỉnh thành; dịch xuất hiện trở lại vào 23/3/2005 do virus H5N1

Giữa năm 2005 dịch cúm gia cầm do H5N1 bắt ựầu xuất hiện tại Kazakhstan, Nga rồi nhanh chóng lan rộng sang các nước khác ở khu vực Châu Âu như: Rumani, Hylap, Thổ Nhĩ Kỳ, Azerbaijan, rồi sang Châu Phi, các nước khác thuộc Châu Á như vùng Vịnh, Trung Quốc và Iraq

ðến ngày 02 tháng 08 năm 2006 chủng virus ñộc lực cao H5N1 ñã có mặt tại 51 quốc gia và vùng lãnh thổ trên hầu khắp các châu lục, tập trung chủ yếu ở Châu Á và Châu Âu Trong mấy năm gần ñây dịch cúm vẫn xẩy ra lẻ tẻ khắp nơi trên thế giới dù không gây thành dịch lớn nhưng vẫn gây ảnh hưởng lớn tới kinh tế và chăn nuôi gia cầm trên toàn thế giới ñặc biệt ở các khu vực, các nước ñang phát triển như ở châu Á, châu Phi

2.2.3 Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam

Dịch cúm gia cầm ở nước ta ñược thông báo ñầu tiên vào cuối tháng 12 năm 2003 ðến nay ñã dược ghi nhận xảy ra ở 4 ñợt chính sau

- ðợt 1: 12/2003 - 30/3/04 : Dịch xảy ra ở 2574 xã phường thuộc 381 huyện thị trấn, của 57/61 tỉnh- thành phố của Việt Nam Mắc bệnh và tiêu huỷ 43,9 triệu con (gà: 30,4 triệu ; thuỷ cầm: 13,5 triệu); 14,76 triệu chim cút và chim khác

- ðợt 2: Từ 4/2004 - 11/2004 Bệnh xuất hiện ở 46 xã phường tại 32

huyện, thị xã, thuộc 17 tỉnh

Thời gian cao ñiểm nhất là tháng 7, sau ñó giảm dần, ñến tháng 11 cả nước chỉ có 1 ñiểm phát dịch

Tổng số gia cầm bị tiêu hủy: 84.000 con (56.000 gà, hơn 8.000 vịt)

- ðợt 3: Từ 12/2004 - 6/2005 Bệnh xuất hiện ở 670 xã tại 182 huyện thuộc 36 tỉnh thành phố (15 tỉnh phía Bắc, 21 tỉnh phía Nam)

Thời ñiểm xuất hiện các ổ dịch nhiều nhất vào tháng 1/2005 (143 ổ dịch/31 tỉnh thành) Trong ñợt dịch này có: 470.000 gà, 825.000 vịt ngan, 551.000 chim cút ñã chết hoặc bị tiêu hủy

- ðợt 4: Từ 10/ 2005 - 1/2006, xảy ra ở 24 tỉnh thành Có 3.972.000 gia cầm (1.338.000 gà, 2.135.000 thủy cầm) ñã chết hoặc tiêu hủy

- ðợt 5: Từ tháng 12/ 2006 – 17/1/20007 Có 18.921gia cầm (671 gà, 18.250 vịt ngan) ñã chết hoặc tiêu hủy

Bên cạnh ñó từ 2008 ñến nay dịch cúm vẫn liên tục xảy ra lẻ tẻ ở các ñịa phương và vào các mùa khác nhau như năm 2007 dịch xảy ra vào cả mùa

hè tháng 4 - tháng 5; năm 2010 xẩy ra vào tháng 5 - tháng 6 gây chết các ñàn gia cầm ở xã Duy Thành Duy Xuyên Quảng Nam làm cho phải tiêu huỷ

9000 gia cầm trong ñịa bàn và nguyên nhân dịch nổ ra là do công tác tiêm phòng vaccin chỉ ñạt 40% Mặt khác còn do ý thức của người dân (như một

số nơi ở tỉnh Kiên Giang) có dịch vịt, gà chết không báo cáo, thậm chí còn

ăn cả vịt–gà chết không rõ nguyên nhân; một phần khác do cuộc sống của người nông dân quá khốn khổ họ nghĩ ăn vào chưa chết ngay trong khi dịch biết ñến khi nào mới nổ ra, năm 2010 hay 2015 Một vấn ñề khác là mỗi hộ gia ñình nuôi không nhiều, nhưng nuôi nhiều loại gia cầm và nhiều lứa tuổi; mạng lưới thú y xã chỉ có một người, vì vậy gia cầm không ñược giám sát tại chỗ một cách kịp thời

Bên cạnh gây thiệt hại về kinh tế (chỉ tính vụ dịch năm 2003 -2004 làm

giảm 1,5% mức tăng GDP của nền kinh tế khu vực đông Nam Á), cúm gia cầm còn lây sang người, qua số liệu thống kê người bị nhiễm và tử vong do cúm H5N1 thì từ năm 2003 - 2008 tổng số người chết do cúm H5N1 khu vực Châu Á và châu Âu là 234 người trong tổng 369 người nhiễm chiếm 63%; Indonesia ựứng ựầu với 129 ca nhiễm chiếm 34,96% và tỷ lệ chết/tỷ lệ nhiễm cao nhất là 81,39%, Việt Nam có 105 ca nhiễm chiếm 28,46% và số người

chết/số người nhiễm là 48,57%

2.3 đặc ựiểm sinh học của virus cúm týp A

2.3.1 đặc ựiểm về hình thái và cấu trúc

Virus cúm gia cầm thuộc virus cúm týp A, một trong 4 nhóm của họ

Orthomyxoviridae:- virus cúm A (Influenza virus A)

- virus cúm B (Influenza virus B)

- virus cúm C (Influenza virus C)

- nhóm Thogotovirus (Kawaoka, 1991)[50]

Hình 2.1: Ảnh virus dưới kắnh hiển vi ựiện tử [60]

đặc tắnh cấu trúc chung của tất cả 4 nhóm virus trong họ

Orthomyxoviridae là có hệ gen là axit ribonucleic (ARN) một sợi, cấu trúc sợi

âm , ký hiệu là ss(-)RNA (negative single stranded RNA), ựộ dài 10.000-15.000 nucleotit, không ựược nối với nhau tạo thành một sợi ARN hoàn chỉnh mà phân

chia thành 6 ñến 8 ñoạn (segment) có cấu trúc riêng biệt (Kawaoka, 1991) [50] Khác với các nhóm virus trong họ virus cúm týp A có nhiều biến chủng khác nhau ñặc biệt với khả năng thích ứng rộng rãi trên nhiều loại vật chủ, tính kháng nguyên luôn biến ñổi, sự sắp xếp tái tổ hợp lại các phân ñoạn gen nên virus cúm týp A ñược coi là nhóm virus nguy hiểm nhất trong họ Orthomyxoviridae Trong lịch sử những vụ dịch cúm kinh hoàng diễn ra ở người và trên gia cầm thì virus cúm týp A là thủ phạm chính

Hình 2.2: Mô phỏng cấu trúc virus cúm [54]

Hạt virus (virion) có cấu trúc hình cầu hoặc ñôi khi có dạng hình sợi kéo dài, ñường kính khoảng 80-120nm Phân tử lượng của một hạt virion vào khoảng 250 triệu Dalton Vỏ virus là những protein có nguồn gốc từ màng tế bào mà virus gây nhiễm, bao gồm một số protein ñược glycosyl hoá và một số protein dạng trần không ñược glycosyl hoá Protein bề mặt có cấu trúc từ các loại glycoprotein là các gai mấu có ñộ dài 10-14 nm, ñường kính 4-6 nm (Pastoret và cộng sự, 1997) [61]

Khi nghiên cứu sâu về cấu trúc hệ gen virus cúm týp A, Murphy và

Webster (1996) [59] cho thấy tất cả các thành viên của nhóm virus cúm A ñều

có hệ gen là ARN một sợi chứa 8 phân ñoạn kế tiếp nhau mang mật mã cho

10 loại protein khác nhau của virus, 8 phân ñoạn của sợi ARN có thể tách và phân biệt rõ ràng nhờ phương pháp ñiện di

- Phân ñoạn gen từ 1 - 3 mã hoá cho protein PB1, PB2, và PA là các protein có chức năng của enzim polymeraza, có vai trò bảo vệ sự sao chép và biên dịch ARN của hạt virus (Biswas và Nayak, 1996) [33]

- Phân ñoạn 4 mã hoá cho protein Hemagglutinin (HA) có chức năng bám dính vào thụ thể tế bào

Hình 2.4: Thông tin căn bản cơ chế chức năng của Hemagglutinin [54]

Theo Bosch và cộng sự (1979) [34], Very và cộng sự (1992) [66], HA là một polipeptit gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 nối với nhau bằng ñoạn oligopeptit ngắn ñặc trưng cho các subtýp H (H1- H16) trong tái tổ hợp tạo nên biến chủng

Mô típ của chuỗi nối oligopeptit chứa một số axít amin cơ bản làm khung, thay ñổi ñặc hiệu theo từng loại hình subtýp H Sự biến ñổi thành phần của chuỗi nối sẽ quyết ñịnh ñộc lực của biến chủng virus mới (Hoirmoto và Kawaoka, 1995) [43]

- Phân ñoạn 5 mã hoá cho protein Nucleoprotein (NP) (Buckler White

và Murphy, 1998) [36]

- Phân ñoạn 6 là gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein có vai trò như enzim là Neuraminidase (NA) có chức năng axit sialic, giúp giải phóng ARN virus từ endosom và tạo hạt virus mới (Castrucci và Kawaoka, 1993) [38]

Hình 2.5: Cấu trúc Haemagglutinin và Neuraminidase [60]

- Phân đoạn 7 mã hố cho 2 tiểu phần protein đệm (matrix protein) M1 và M2 (Holsinger và cộng sự, 1994) [42] trong đĩ M2 là một tetramer cĩ chức năng tạo khe H+, giúp cởi bỏ vỏ virus sau khi xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm, M1 cĩ chức năng tham gia vào quá trình tổng hợp và nảy chồi của virus

- Phân đoạn 8 với độ dài tương đối ổn định mã hố cho 2 tiểu phần protein khơng cấu trúc NS1 và NS2 cĩ chức năng: chuyển ARN từ nhân ra kết hợp với M1 kích thích phiên mã, chống interferon (Luong và Palese, 1992) [56]

2.3.2 ðặc tính kháng nguyên của virus cúm týp A

Kháng nguyên của virus cúm diễn biến hết sức phức tạp do hiện tượng biến đổi gen

Dựa trên cơ sở các loại protein kháng nguyên: protein nhân (Nucleoprotein - NP), protein Hemagglutinin (HA), protein đệm (matrix protein M1), protein enzim cắt thụ thể Neuraminidase (NA) là những kháng nguyên cĩ vai trị quan trọng trong miễn dịch bảo hộ và cĩ tính đa dạng cao của virus cúm týp A nên được nghiên cứu nhiều nhất [68]

Một đặc tính quan trọng của kháng nguyên virus cúm là khả năng gây ngưng kết hồng cầu của nhiều lồi động vật mà thực chất là sự kết hợp giữa mấu lồi kháng nguyên HA trên bề mặt virus với thụ thể cĩ trên bề mặt hồng cầu, tạo mạng ngưng kết qua các cầu nối virus Từ đặc tính này cĩ thể sử dụng các phản ứng ngưng kết hồng cầu (phản ứng HA = Hemagglutination test) trong chẩn đốn cúm gia cầm

Sự biến đổi trong chính nội bộ gen hay biến dị ngẫu nhiên (Drift) mà bản chất là sự thay đổi nucleotit trong đoạn gen là biến dị Chính nhờ sự biến đổi này cho phép virus cúm A tạo nên 16 biến thể gen HA (H1- H16) và biến thể gen NA (N1 – N9)

Cũng nhờ hiện tượng Drift của virus cúm có thể lý giải ñược không phải mọi H1, H5 hay Hx hoặc N1, N2 hay Nx ñều giống nhau Sự khác nhau trong chính các Hx hay Nx do biến dị ngẫu nhiên tạo nên tính thích ứng với từng loài vật chủ khác nhau ở mỗi loại hình thức tái tổ hợp HA và NA (Suarez

và cộng sự, 1998) [64]

Bên cạnh hiện tượng Drift, sự biến ñổi hệ gen của virus cúm A còn diễn

ra nhờ hiện tượng tái tổ hợp gen – hiện tượng Shift xảy ra khi hai hoặc nhiều virus cúm cùng nhiễm vào tế bào Tuy chỉ xuất hiện với tần xuất thấp nhưng khi hiện tượng tái tổ hợp gen xảy ra sẽ gây ra các vụ dịch lớn cho người và ñộng vật, với mức ñộ nguy hiểm không thể lường trước ñược Hiện tượng Shift ở virus cúm A cho thấy nguy cơ của sự lưu hành ñồng thời nhiều loại virus cúm với số lượng lớn trong cùng một không gian và thời gian kéo dài

Một ñiều nữa trong nghiên cứu về ñặc tính kháng nguyên của virus cúm là giữa các biến thể tái tổ hợp và biến chủng subtýp về huyết thanh học không hoặc rất ít có phản ứng chéo Vì ñặc ñiểm này sẽ gây nên một trở ngại lớn cho các nghiên cứu nhằm tạo ra vacxin cúm cho người và cho ñộng vật (Kawaoka, 1991)[50], (Ito và cộng sự, 1998) [47]

Khi xâm nhiễm vào cơ thể ñộng vật, virus cúm A sẽ kích thích tạo nên các kháng thể ñặc hiệu, trong ñó quan trọng hơn cả là kháng thể kháng HA, chỉ có loại kháng thể này mới có vai trò trung hoà virus cho bảo hộ miễn dịch Một số kháng thể khác có tác dụng kìm hãm sự nhân lên của virus: Kháng thể kháng NA có tác dụng ngăn cản giải phóng virus, kháng thể kháng M2 ngăn cản chức năng protein M2 không cho quá trình bao gói virion xảy ra (Lu và cộng sự, 1999) [55]

Hình 2.6: Sơ ñồ biến dị ñiểm

Hình 2.7: Sơ ñồ sự tái tổ hợp gen (shift)

2.3.3 Thành phần hóa học và sức kháng của virus

Bên cạnh các ñặc tính về cấu trúc và ñặc tính kháng nguyên thành phần hóa học của virus cúm gia cầm cũng ñược nghiên cứu khá kỹ: RNA của virus chiếm 0,8 - 1,1% ; protein: 70 - 75%; Lipit: 20 - 24% và 5 - 8% hyrocacbon

Lipit tập trung ở màng virus và chủ yếu là Lipit có gốc phốt pho, số còn lại là Cholesterol, glucolipit và một ít hyrocacbon gồm có galactose, manose, ribose, fruccose

Protein của virus chủ yếu là glycoprotein

Virus cúm gia cầm có sức ñề kháng yếu và bị “chết” dễ dàng trong môi trường bên ngoài nếu như không ñược bảo vệ bằng các chất hữu cơ có trong

nước bọt hoặc phân

- Virus rất mẫn cảm với nhiệt ñộ: ở 4oC virus có thể tồn tại ít nhất là 35 ngày; ở 37oC virus có thể tồn tại vài ngày; ở 56oC virus có thể tồn tại vài giờ;

ở 60oC virus có thể tồn tại 30 phút

- Virus dễ bị vô hoạt bởi: tia cực tím, các chất oxy hoá, sodium dodecylsunphat, lipid solvents (xà phòng); các chất tẩy trùng: Formalin và các hợp chất iod [45]

- ðiểm ñẳng ñiện của virus tương ứng với pH = 5,3 ở vùng pH thấp có tính axit ñộc tính của virus giảm nhanh hơn ở khu vực kiềm

Người ta ñã phân lập ñược virus từ nước ao, hồ là nơi các loài thủy cầm sinh sống Nếu nguồn nước này không ñược xử lý ñây sẽ là nguyên nhân lây nhiễm cho gia cầm

Trong phủ tạng gà, virus tồn tại 24-39 ngày, ánh nắng chiếu trực tiếp sống ñược 40 giờ còn chiếu thường thì sống 15 ngày (Peter van Beek, 2005) [22]

2.3.4 Quá trình nhân lên của virus

Theo Kingsburg quá trình nhân lên của virus ñược mô tả tóm tắt:

Virus ñược hấp thụ vào bề mặt tế bào nhờ có receptor bản chất là glycoprotein chứa axit sialic, từ ñó virus qua màng tế bào nhờ hiện tượng ẩm bào Trong khoảng ẩm bào khi nồng ñộ pH ñược ñiều hoà ñể giảm xuống mức thấp nhất sẽ xẩy ra sự hợp nhất giữa màng tế bào và virus Lúc này nucleocapxit của virus ñược vận chuyển vào nhân tế bào Nhờ hệ thống enzim sao chép của virus, ngay lập tức các sợi (-) ARN của virus ñược chuyển thành sợi (+) ARN ñể làm khuôn tổng hợp nhiều sợi (-) ARN mới là nguyên liệu của các hạt virion mới

Các sợi (-) ARN tổng hợp mới ñược bao gói trong protein M1, NS và

NP Sau ñó tổ hợp ribonucleoprotein này ñược vận chuyển qua màng nhân ra nguyên sinh chất và tiếp tục di chuyển ñến sát màng tế bào ở vị trí có sự biến

ñổi ñặc hiệu với virus

Song song với quá trình trên, một phần các sợi ARN thông tin của virus sau khi ñược sao chép trong nhân sẽ ñi ra nguyên sinh chất ñể ñiều khiển ribosom của tế bào tổng hợp nên protein cấu trúc và protein nguyên liệu Tiếp

ñó tất cả các protein cấu trúc này sẽ ñược vận chuyển xuyên qua hệ thống võng mạc nội mô (RE) và hệ thống Golgi rồi ñược cắm lên màng tế bào nhiễm

Sự kết hợp cuối cùng của tổ hợp ribonucleoprotein và các protein cấu trúc HA, NA và M2 sẽ tạo nên hạt virus hoàn chỉnh mới và theo hình thức

“nảy chồi” các hạt virion sẽ giải phóng ra khỏi tế bào nhiễm

Hình 2.8: Sự sao chép và tái tạo [60]

2.3.5 ðộc lực của virus

ðộc lực của virus cúm gia cầm có sự dao ñộng lớn, phụ thuộc vào nhiều yếu tố mà trước hết là protein HA Các nghiên cứu ở mức ñộ phân tử cho thấy khả năng lây nhiễm virus bị ảnh hưởng bởi tác ñộng của men proteaza của vật chủ ñến sự phá vỡ liên kết hoá học sau khi dịch mã của phân

tử ngưng kết Mà thực chất là sự cắt ñôi protein HA thành hai tiểu phần HA1

và HA2, nhờ thế virus có thể xâm nhập vào tế bào Tính thụ cảm của ngưng kết tố và sự phá vỡ liên kết của men proteaza lại phụ thuộc vào số lượng các amino axit cơ bản tại ñiểm bắt ñầu vỡ liên kết Các enzym giống trypsin có khả năng phá vỡ liên kết khi chỉ có 1 phần tử arginin, trong khi ñó các men proteaza khác lại cần nhiều amino axit cơ bản, vì thế ñánh giá ñộc lực của virus trên cơ sở gây nhiễm cho gia cầm và sau ñó phân tích sự sắp xếp các amino axit của các virus (Cục thú y, 2004) [7]

ðể giám ñịnh ñộc lực của virus cúm người ta phân tích một yếu tố quan trọng khác mang tính chất quyết ñịnh là phân tích trình tự Nucleotit của gen HA

Về lâm sàng người ta chia virus cúm gia cầm làm 2 loại: Loại virus có ñộc lực thấp: LPAI (Low Pathogenic Avian Influenza) và loại virus có ñộc lực cao: HPAI (High Pathogenic Avian Influenza)

ðể ñánh giá ñộc lực của virus cúm thuộc loại nào các nhà khoa học ñã thống nhất sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 4 - 6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch 0,2 ml nước trứng với tỷ lệ pha loãng 1/10 ñã ñược gây nhiễm virus và chia ra 3 loại ñộc lực:

- Loại virus có ñộc lực cao (HPAI): Nếu sau 10 ngày tiêm tĩnh mạch cho gà làm chết 75 - 100% gà thực nghiệm và phát triển tốt trên tế bào xơ phôi gà, tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có Trypsin

- Loại virus có ñộc lực trung bình: gây bệnh với triệu chứng lâm sàng

rõ rệt nhưng gây chết không quá 15% số gà bị nhiễm bệnh tự nhiên hoặc không quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm

- Loại virus có ñộc lực thấp (LPAI): virus phát triển trong cơ thể gà, có thể gây ra dịch nhưng không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt và không tạo ra bệnh tích ñại thể, không làm chết gà Tuy nhiên sự bội nhiễm vi khuẩn ñặc biệt là Steptococcuc, Staphylococcus hoặc các bệnh khác cùng với cúm có thể làm cho bệnh gây ra do virus ñộc lực thấp trở nên ñộc hơn và gây bệnh ác

liệt hơn Nguyên nhân là do các vi khuẩn bội nhiễm sản sinh enzim proteaza phá vỡ các liên kết của ngưng kết tố ngay cả khi không có axit amin cơ bản (Koike, 2007) [53]

Sau ñó ñánh giá mức ñộ nhiễm bệnh của gà ñể cho ñiểm (chỉ số IVPI) ðiểm tối ña là 3 ñiểm và ñó là virus có ñộc lực cao nhất

Theo qui ñịnh của tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) thì virus cúm nào có chỉ số IVPI từ 1,2 trở lên là thuộc loại HPAI [51]

Căn cứ vào tỷ lệ gây chết, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích: 4 nhóm + Virus có ñộc lực cao (highly virulent) : gồm các virus HPAI: H5 hoặc H7 gây bệnh cho gà, tỷ lệ gây chết cao với các triệu chứng thể hiện ở hầu hết các cơ quan, trong ñó có triệu chứng thần kinh và hệ tuần hoàn Tỷ lệ

ốm và tỷ lệ chết có thể lên ñến 100%

+ Virus có ñộc lực vừa (moderately virulent) : tỷ lệ gây chết từ 5-97% ở

gà con, gà ñẻ Bệnh tích ñặc trưng thường gặp ở ñường hô hấp, sinh sản, thận hoặc tụy Bệnh nặng hơn nếu như kế phát virus hoặc vi khuẩn gây bệnh khác

+ Virus có ñộc lực thấp (mildly virulent) : tỷ lệ gây chết thấp (<5%),

có triệu chứng nhẹ ở ñường hô hấp và giảm tỷ lệ ñẻ

+ Virus không có ñộc lực (avirulent) : gồm các chủng virus không gây

ra dịch cúm với các triệu chứng lâm sàng và không gây chết gà

- Virus cúm týp A gây bệnh chủ yếu cho gia cầm (ñặc biệt ở gà), người

Trước năm 1955, gia cầm thường nhiễm chủng virus cúm có ñộc lực thấp

dù ñã ñược phân lập nhưng ít ñược quan tâm như A/gà/ðức/N/49 (H10N7)

- Trong những năm gần ñây, các virus như vậy ñều thấy chủ yếu trên gà tây, hiếm thấy ở gà tại hầu hết các nước phát triển chăn nuôi gia cầm công nghiệp Tuy nhiên, các ổ dịch cúm gia cầm xảy ra nghiêm trọng lại do sự xuất hiện bất thường của một virus có ñộc lực thấp nhưng biến thể ñể trở thành một virus có ñộc lực cao gây thành bệnh cúm ñộc lực cao ở gia cầm HPAI (Bùi Quang Anh, Văn ðăng Kỳ, 2004) [3]

- Nhiều thông báo cho rằng vịt nuôi cũng bị nhiễm virus cúm nhưng ít phát bệnh do vịt có sức ñề kháng với virus bệnh, kể cả những chủng có ñộc lực cao gây bệnh nặng cho gà, gà tây, vịt từ khi bị nhiễm ñến khi bắt ñầu thải virus trong vòng 30 ngày và tiếp tục ñược tồn tại trong số ñông vịt trời cho ñến mùa sinh sản tiếp theo ñể truyền cho con non qua ñường tiêu hoá do virus bài thải theo phân gây ô nhiễm ao hồ Tuy nhiên, năm 1961, ở Nam phi ñã phân lập ñược virus cúm týp A (H5N1) gây bệnh cho cả gà và vịt (Cục thú y, 2004) [7] Thực tế diễn biến dịch cúm gia cầm ở Việt Nam cho thấy vụ dịch ñầu năm 2004 và ñến nay là ngược lại vịt nuôi bị nhiễm nhiều và phát bệnh nặng với tỷ lệ chết cao 70% - 100% Theo Lê Văn Năm (2004) [20] bệnh thường xảy ra ở gia cầm từ 4 – 66 tuần tuổi Gia cầm dễ bị bệnh và có tỷ lệ chết cao ở những nơi bệnh phát ra lần ñầu tiên và ở gia cầm sắp ñẻ hoặc ñang

ñẻ ñỉnh cao Gia cầm càng cao sản thì khả năng mẫn cảm càng lớn với bệnh, gia cầm mái mẫn cảm hơn con trống

Phần lớn các loài gia cầm non ñều mẫn cảm với virus cúm týp A

Hiện nay ñã phân lập ñược virus cúm từ vịt bầu, ngỗng, chim cút, gà nhật, gà gô, gà lôi

Phân týp của virus cúm týp A ñã gây dịch cho nhiều loài ñộng vật có vú như lợn, ngựa, chồn, hải cẩu và thú hoang dã ở nhiều nơi trên thế giới

2.5 Triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm

Thời kỳ ủ bệnh thường ngắn từ vài giờ ñến 3 ngày, tuỳ theo số lượng virus, con ñường xâm nhập, loài cảm nhiễm gây bệnh Một số nghiên cứu cho thấy thời gian ủ bệnh trong nhiều trường hợp có thể dài hơn ñến 7 ngày và lâu nhất có thể ñến 14 ngày (Lê Văn Năm, 2004) [20]

Biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài vật mắc và ñộc lực của virus gây bệnh, tuổi mắc và ñiều kiện môi trường, chế ñộ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch, sự bội nhiễm của một số vi khuẩn Trường hợp virus gây bệnh có ñộc lực cao, gà có thể mắc và chết tới 100%

2.5.1 Triệu chứng lâm sàng ñiển hình của bệnh cúm gia cầm chủng ñộc lực cao (HPAI)

Khi nhiễm các chủng virus ñộc lực cao (HPAI) gia cầm thường chết ñột ngột, tỷ lệ tử vong cao có khi lên ñến 100% trong vài ngày, theo Vũ Quốc Hùng,

2005 [15] khi theo dõi tỷ lệ chết của gà, ngan, vịt mắc cúm gia cầm ở Bắc Giang trong vụ dịch năm 2003 - 2005 sau 6 ngày theo dõi tỷ lệ chết ñều ñạt mức khá cao gà chết 75,59%, ngan chết cao nhất là 84,2%, ở vịt thấp nhất là 68,67%

Các triệu chứng về hô hấp thường xuất hiện ñầu tiên và khá ñiển hình như ho khẹc, hắt hơi, thở khò khè, vẩy mỏ, chảy nhiều nước mũi, nước mắt Tiếp theo là mi mắt bị viêm, mặt phù nề, sưng mọng, mào tích dầy lên do thuỷ thũng, tím tái, có nhiều ñiểm xuất huyết Thịt gà bị bệnh thường thâm xám, dưới da vùng chân có xuất huyết

Bên cạnh ñó con vật sốt cao, biểu hiện không bình thường ở hệ thống

tiêu hoá, sinh sản và thần kinh: Con vật giảm hoạt ñộng, giảm tiêu thụ thức

ăn, gầy yếu, tăng tần số ấp bóng ở ñàn ñang ñẻ, giảm sản lượng trứng Trường hợp nặng biểu hiện ñi lại không bình thường, run rẩy, mệt mỏi nằm li bì tụ ñống với nhau, lông xù, rối loạn thần kinh, ỉa chảy, một số con biểu hiện co

giật hoặc ñầu ở tư thế không bình thường (Cục thú y, 2004) [7]

2.5.2 Triệu chứng lâm sàng ñiển hình của bệnh cúm gia cầm chủng ñộc lực thấp (LPAI)

Gia cầm bị nhiễm các chủng virus có ñộc lực yếu hơn cũng có những triệu chứng tương tự như bệnh do những chủng có ñộc lực cao gây lên, nhưng mức ñộ biểu hiện nhẹ hơn và tỷ lệ chết thấp hơn

Tuy nhiên khi có sự cộng nhiễm với vi khuẩn hoặc virus khác có khả năng gây bệnh hoặc ñiều kiện môi trường bất lợi thì tỷ lệ tử vong có thể tới 60% - 70% và các triệu chứng lâm sàng cũng dần nặng hơn

2.6 Bệnh tích

Cũng như triệu chứng lâm sàng mức ñộ bệnh tích ñại thể của bệnh của bệnh cúm gia cầm cũng rất ña dạng, phụ thuộc rất nhiều vào ñộc lực của virus

và quá trình diễn biến của bệnh

+ Bệnh tích thường gặp: Mào và yếm (tích) sưng to, phù quanh mí mắt Chỗ da không có lông bị tím bầm Chân bị xuất huyết Xuất huyết vùng ñầu

và thâm tím; Niêm mạc phế quản phù nề có chứa chất nhầy; Viêm xoang bụng tích nước hoặc viêm dính; Xuất huyết ñốm ở trên bề mặt niêm mạc; Viêm xuất huyết hầu hết toàn bộ ñường tiêu hoá, ñặc biệt rõ ở manh tràng, dạ dầy tuyến nơi tiếp giáp với mề (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2007) [6]

+ Các ñặc trưng về tổ chức học bao gồm: Phù nề, xung huyết, xuất huyết và thâm nhập limpho ñơn nhân ở cơ vân, cơ tim, lách, phổi, tổ chức thần kinh ñặc biệt còn gây phản ứng viêm hoại tử

Nhiều tác giả ñi sâu nghiên cứu ñã nêu lên một số khác biệt về ñặc ñiểm bệnh tích do từng chủng virus cúm gây ra Khi bị nhiễm H5N9 sẽ có

xuất hiện hoại tử nặng ở hệ lâm ba và đốm hoại tử ở lách nhưng khi nhiễm H5N2, H5N1 lại khơng cĩ hoại tử nặng ở hệ lâm ba Gia cầm nhiễm H5N3 xuất hiện hoại tử cơ tim, viêm cơ tim trong bệnh tích Những chủng virus gây

ra các triệu chứng thần kinh thì bệnh tích thấy mạch vành sưng, hoại tử các tế bào thần kinh mà ít thấy tụ huyết, xuất huyết ở các mơ thần kinh

2.7 Chẩn đốn bệnh cúm gia cầm

Việc chẩn đốn cúm gia cầm do nhiễm virus týp A chủ yếu là phải phân lập và định danh virus kết hợp với chẩn đốn dựa trên triệu chứng lâm sáng, xác định bệnh tích đại thể, vi thể và dịch tễ học với một số phản ứng huyết thanh học theo chẩn đốn thường quy của Trung Tâm chẩn đốn thú y trung ương – Cục thú y, sơ đồ chẩn đốn phịng thí nghiệm của bênh cúm gia cầm hiện nay như sau:

Huyết thanh Dịch họng, ổ

nhớp

Tìm kháng thể cúm

* Phân lập virus

Là một chẩn đốn cơ bản, cĩ ý nghĩa quyết định ðể phân lập virus thường sử dụng mẫu bệnh phẩm là phổi, khí quản, não, lách Việc phân lập được thực hiên trên mơi trường tế bào thận chĩ (Madin – Darby Canine Kidney Cell - MDCK) hoặc trên phơi trứng gà

* Phân lập virus trên mơi trường tế bào

ðể cĩ thể lây nhiễm bệnh phẩm mơi trường tế bào trước hết phải thực hiện nuơi cấy trên chai T–25 trong mơi trường phát triển tế bào với các hố chất nguyên liệu cần thiết Sau khi thảm tế bào mọc từ 90% trở lên sau 24-72 giờ cĩ thể sử dụng để phân lập virus bằng việc tiêm truyền huyễn dịch bệnh phẩm đã được xử lý kháng sinh hoặc qua lọc lên bề mặt tế bào Quá trình lây nhiễm bệnh phẩm được bổ sung mơi trường nuơi cấy virus (D – MEM với TCPK treaed trypsin) trong tủ ấm CO2 Tiến hành quan sát bệnh tích tế bào (CPU) hàng ngày Cĩ thể sử dụng phản ứng HA để kiểm tra bằng cách thu hoạch dịch nổi trong chai tế bào đã cấy virus sau 1-7 ngày Nếu âm tính cĩ thể cấy chuyển trên tế bào thêm 2-3 lần, mẫu phân lập trên tế bào được bảo quản trong tủ âm 700C (-700C)

* Phân lập virus trên phơi trứng

Tiêm 0,1 - 0,3ml nước bệnh phẩm vào túi niệu của phơi gà 9 - 11 ngày tuổi, hàn kín, mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm cho 3 trứng và tiếp tục cho ấp ở nhiệt

độ 370C trong 7 ngày Một số ít chủng virus cĩ độc lực cao cĩ thể gây chết phơi khoảng 18-24 giờ trứng thu hoạch để ở nhiệt độ 40C qua một đêm Virus nhân lên trong nước trứng cĩ hiện tượng ngưng kết hồng cầu gà Nếu khơng gây ngưng kết hồng cầu thì cĩ thể lấy nước trứng thu được tiêm lần 2 cho phơi gà Phần lớn các phơi bị tạp khuẩn sẽ chết trước 24 giờ phải bỏ đi Những phơi sống sau 24h tiếp tục được theo dõi đến 72h Lấy nước phơi từ

những phôi chết trong khoảng 48h và sau 48h hoặc từ phôi chưa chết ựến 72h vào việc giám ựịnh virus đây là khoảng thời gian mà số lượng virus cúm (nếu có) ựã ựạt ựến mức lý tưởng (Trước khi thu hoạch nước trứng phải cất trứng vào tủ lạnh 40 C trong 4 giờ hoặc ựể tủ ấm trong 20 phút ở nhiệt ựộ -

200C Nước trứng (nước niệu mô phôi trứng) ựược cho vào ống nghiệm 10 ml

và bảo quản trong tủ âm -700C.)

Mẫu phân lập ựược kiểm tra bằng phản ứng HA nếu âm tắnh có thể cấy chuyển trên phôi trứng gà thêm 2-3 ựợt

* định danh virus

Sau khi phân lập ựược virus từ môi trường tế bào hoặc trên phôi trứng gà,

có thể giám ựịnh virus bằng các HI test ựể giám ựịnh subtype H; NI test ựể xác ựịnh subtype N hoặc bằng phương pháp RT Ờ PCR ựể xác ựịnh subtype H, N

2.8 Miễn dịch cúm gia cầm

Miễn dịch là khả năng của cơ thể nhận ra và loại thải các vật lạ ra khỏi

cơ thể (Vũ Triệu An, 1997) [1]

Khi một kháng nguyên (vi khuẩn, virus) xâm nhập vào cơ thể, cơ thể

sẽ ựáp ứng lại bằng ựáp ứng miễn dịch, khả năng này phải nhờ hệ miễn dịch của cơ thể; bao gồm miễn dịch không ựặc hiệu (miễn dịch tự nhiên) và miễn dịch ựặc hiệu

đáp ứng miễn dịch ựặc hiệu có thể là ựáp ứng miễn dịch dịch thể, tạo

ra kháng thể dịch thể, là các lớp glubulin miễn dịch (Ig), hoặc ựáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào tạo ra các lympho T mẫn cảm hoặc là cả hai đây là các kháng thể chủ ựộng, là cơ sở tạo ra miễn dịch chủ ựộng cho cơ thể

Với virus cúm gia cầm khi vào cơ thể sẽ kắch thắch sinh ra ựáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và ựáp ứng miễn dịch dịch thể

Sau khi virus nhược ựộc vào cơ thể chỉ sau 2-3 ngày ựáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào ựã xuất hiện Chắnh nhờ có quá trình ựáp ứng miễn

Ở bệnh cúm gia cầm, virus vào cơ thể lần ựầu sẽ gây ra ựáp ứng miễn dịch sơ cấp Trong quá trình ựáp ứng miễn dịch này, lớp kháng thể tạo ra ban ựầu chủ yếu là IgM, sau ựó là lớp IgY ựược tạo ra yếu hay trung bình Khi virus vào lần sau sẽ gây ra ựáp ứng miễn dịch thứ cấp, trong ựáp ứng miễn dịch này lớp kháng thể ựược tạo ra chủ yếu là IgY còn lớp IgM chỉ có số lượng rất ắt Cùng với các lớp glubulin miễn dịch có trong huyết thanh do tương bào của tổ chức lympho hạch, lách sản xuất ra còn có vai trò quan trọng của các lớp glubulin miễn dịch cục bộ do các tương bào của tổ chức lympho dưới niêm mạc tiết ra ựổ vào màng nhầy ựệm ở ựường hô hấp trên, ựường tiêu hoá của gà, tạo miễn dịch cục bộ cho cơ thể Thành phần của lớp glubulin miễn dịch này chủ yếu là lớp IgA tiết ngoài ra còn có một ắt là lớp IgY Trong ựáp ứng tiên phát mức ựộ kháng thể trong máu tăng chậm và giảm nhanh

đáp ứng miễn dịch thứ phát xuất hiện khi virus vào lần sau tiếp xúc với kháng nguyên cùng loại lần sau đáp ứng miễn dịch lần này nhanh, mạnh hơn lần thứ nhất rất nhiều và lớp kháng thể thường là IgY Trong lần ựầu tiếp

xúc với kháng nguyên thì các tế bào có thẩm quyền miễn dịch biệt hóa ñể trở thành 2 loại: 1 loại tế bào trực tiếp sản xuất ra kháng thể và 1 loại tế bào có trí nhớ miễn dịch Khi kháng nguyên vào lần sau và tiếp xúc với tế bào nhớ miễn dịch thì chúng chỉ việc nhớ lại và tiết kháng thể Kháng thể ñược sản xuất ra nhanh hơn, nhiều hơn và ñáp ứng miễn dịch kéo dài hơn với ñáp ứng miễn dịch tiên phát Cơ thể gia cầm tạo ñược trạng thái miễn dịch ñối với kháng nguyên và trí nhớ miễn dịch ñược duy trì

2.8.1 Miễn dịch không ñặc hiệu

Bất cứ một tác nhân nào muốn xâm nhập vào cơ thể thì phải qua hàng rào bảo vệ cơ thể hay ñó chính là hệ thống miễn dịch không ñặc hiệu

Gia cầm có cơ chế phòng chống tự nhiên rất phát triển Hệ thống miễn dịch không ñặc hiệu bao gồm: Da, niêm mạc, dịch tiết các tuyến, gan, lách, thận, mảng payer, phản ứng viêm, tế bào thực bào, các kháng thể tự nhiên không ñặc hiệu (bổ thể, propecdin, lyzozim, và opsonin)

2.8.2 Miễn dịch ñặc hiệu

Cũng như các bệnh truyền nhiễm khác miễn dịch chống bệnh cúm gia cầm gồm nhiều loại nhưng chúng tôi chỉ xin ñề cập miễn dịch ñặc hiệu tiếp thu chủ ñộng và tiếp thu bị ñộng - ñây là hai loại miễn dịch ñóng vai trò chủ ñạo

Miễn dịch bị ñộng

Ở gia cầm non hệ thống miễn dịch chưa phát triển hoàn thiện vì vậy ngay từ lúc sơ sinh cơ thể của chúng hoàn toàn không có khả năng chống lại tác nhân gây bệnh một cách chủ ñộng và ñặc hiệu Trạng thái miễn dịch ñặc hiệu chỉ có thể có ñược khi cơ thể gia cầm mẹ có miễn dịch và truyền kháng thể ñặc hiệu cho con non qua lòng ñỏ trứng ðây là kháng thể thụ ñộng, là cơ

sở tạo nên miễn dịch thụ ñộng ở gia cầm con Ở gia cầm con 1 ngày tuổi trong máu có kháng thể cúm gia cầm kháng thể này không tự bản thân gia cầm con sinh ra mà chúng ñược thừa hưởng từ gia cầm mẹ có miễn dịch truyền qua

bì vào máu của gia cầm con và tồn tại trong một thời gian

Lượng kháng thể thụ ñộng trong huyết thanh gia cầm con có liên quan ñến kháng thể có trong lòng ñỏ trứng và trong huyết thanh của gia cầm mẹ Ở gia cầm mẹ lượng kháng thể có trong huyết thanh cao hơn một ít so với lượng kháng thể có trong lòng ñỏ trứng Người ta có thể sử dụng kháng thể trong lòng ñỏ trứng ñể thay thế cho kháng thể có trong huyết thanh Trong huyết thanh gia cầm con có lượng kháng thể thụ ñộng thấp hơn so với lượng kháng thể của gia cầm mẹ và trong lòng ñỏ trứng Kháng thể này có xu hướng giảm dần cứ sau 4-5 ngày lượng kháng thể lai giảm ñi một nửa, thời gian tồn tại ngắn từ 15-24 ngày, tuy thời gian tồn tại ngắn nhưng có khả năng bảo hộ cho gia cầm trong những ngày tuổi ñầu Tuy vậy, khi dùng vacxin lần ñầu tạo miễn dịch chủ ñộng cho gia cầm thì kháng thể thụ ñộng sẽ trung hoà một lượng virus vacxin

Miễn dịch chủ ñộng

Miễn dịch chủ ñộng ñối với bệnh cúm gia cầm là loại miễn dịch thu ñược sau khi gia cầm mắc bệnh khỏi hoặc sau khi làm vacxin Vacxin sau khi vào cơ thể ñược ñưa ñến các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch như: hạch, lách, tổ chức lympho dưới niêm mạc kích thích sản sinh ra các kháng thể ñặc hiệu (kháng thể dịch thể và kháng thể tế bào)

Trong quá trình sử dụng vacxin, khả năng tạo miễn dịch chủ ñộng của ñàn gia cầm chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như kháng thể thụ ñộng, lượng kháng nguyên khi sử dụng, yếu tố dinh dưỡng

ðây là cơ sở chính của việc tiêm phòng vacxin cúm mũi 1 và nhắc lại

mũi 2 ở gia cầm

Vacxin có thể giảm sự nghiêm trọng của bệnh và sự lan truyền của virus trong thực tế, nhưng virus có thể sẽ không bị loại hoàn toàn khỏi ñàn gia cầm (Alexander et al 1996) [30]

2.8.3 Một số phương pháp ñánh giá ñáp ứng miễn dịch cúm gia cầm

Mức ñộ ñáp ứng miễn dịch cúm của gia cầm có thể ñược ñánh giá bằng phương pháp huyết thanh học và công cường ñộc

Khả năng bảo hộ của cơ thể chống virus cường ñộc có mối tương quan với hiệu giá kháng thể, có thể sử dụng phản ứng huyết thanh học ñể ñánh giá mức ñộ ñáp ứng miễn dịch của gia cầm như phản ứng AGID, phản ứng ELISA và phản ứng HI

Trong ñó phản ứng HI ñược sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm, phương pháp công cường ñộc ñược sử dụng với mục ñích xác ñịnh mức ñộ ñáp ứng miễn dịch của cơ thể sau khi sử dụng vacxin Phương pháp công cường ñộc ñánh giá ñúng mức ñộ bảo hộ của ñàn gia cầm nhưng do một

số khó khăn, ñặc biệt là vấn ñề dịch bệnh nên không phải lúc nào phương pháp này cũng ñược sử dụng (Bell, 1991) [31]

2.9 Vacxin

2.9.1 Sự cần thiết của tiêm vacxin phòng bệnh cúm gia cầm

Trong thực tế sản xuất, có nhiều nguyên nhân khác nhau làm cho các biện pháp an toàn sinh học không ñủ mạnh ñể khống chế sự lây lan của các chủng virus ñộc lực cao hoặc xuất hiện kẽ hở nào ñó mà bệnh có nguy cơ xâm nhập vào ñàn gây bệnh Do ñó việc sử dụng vacxin là một giải pháp có ích làm giảm thiệt hại kinh tế và góp phần khống chế bệnh có hiệu quả

Quan ñiểm OIE: Sử dụng vacxin trong phòng bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao là biện pháp hỗ trợ song song với các biện pháp tổng hợp khác như tiêu huỷ gia cầm bị nhiễm bệnh, an toàn sinh học, kiểm soát vận chuyển

và theo OIE sử dụng vacxin là dập dịch, hạn chế thiệt hại trực tiếp hạn chế sự lây lan của virus

Cuộc họp liên ngành của OIE, FAO, WHO tại Rome tháng 2 năm 2004

đã chỉ ra đối với cúm gia cầm việc sử dụng vacxin như một giải pháp, một cơng cụ tích cực để ngăn chặn, khống chế và tiến đến thanh tốn bệnh cúm gia cầm ở vùng bảo vệ Vacxin nên được sử dụng thành một chiến lược tồn diện phịng chống dịch cúm gia cầm, bao gồm năm cơng đoạn là: An tồn sinh học, năng cao nhận thức của người dân, giám sát và chẩn đốn, loại bỏ gia cầm bị nhiễm virus và sử dụng vacxin

Quan điểm của Trung Quốc: Trung Quốc tuân thủ các nguyên tắc phịng chống dịch cúm gia cầm của OIE khi dịch nổ ra Trung Quốc cịn cho việc sử dụng vacxin nhằm mục đích phịng bệnh ðiều đĩ xuất phát từ cơ sở Trung Quốc là nước cĩ lượng thuỷ cầm chiếm đại đa số trên thế giới, do vậy nếu tiêu huỷ các đàn gia cầm cĩ kháng thể kháng lại virus cúm gia cầm thì thiệt hại sẽ rất lớn Trung Quốc sử dụng các biện pháp đồng bộ song song với việc sử dụng vacxin trong tồn quốc nhằm khống chế các ổ dịch xảy ra và phịng lây lan từ nước ngồi, từ địa phương cĩ dịch sang địa phương khác

Theo Ilaria Capua và Stefano Marangon (2004) [47], một số vacxin phịng bệnh cúm gia cầm hiện nay:

Phịng hộ bệnh cúm gia cầm là kết quả của đáp ứng miễn dịch chống lại protein Haemaglutinin (HA) mà hiện nay đã xác định được 16 subtýp khác nhau từ H1-H16 và ở mức độ nào đĩ chống lại protein Neuraminidae (NA)

mà đã xác định được 9 subtýp từ N1-N9 Các đáp ứng miễn dịch kháng lại protein bên trong như Nucleoprotein (NP) và protein Matrix (M) của virus đã được chứng minh là khơng đủ để tạo phịng hộ trên thực địa Vì vậy khơng cĩ

1 vacxin nào chung cho tất cả các virus cúm gia cầm Trong thực tế sự phịng

hộ được tạo ra nhờ các subtýp Haemaglutinin cĩ trong vacxin

2.9.2 Vacxin vô hoạt ñồng chủng:

Ban ñầu ñược sản xuất như các vacxin tự phát (autogenous), nghĩa là vacxin chứa cùng những virus cúm giống như chủng gây bệnh trên thực ñịa Loại vacxin này ñược sử dụng rộng rãi ở Mehico và Pakistan Một trong những vacxin thuộc loại này ñang ñược sử dụng hiện nay là của Aventis Pasteur, Nobilis và Weike Harbin Nhược ñiểm của vacxin này là không phân biệt gia cầm ñược tiêm chủng với gia cầm nhiễm virus thực ñịa qua kiểm tra kháng thể

2.9.3 Vacxin vô hoạt dị chủng:

Vacxin này ñược sản xuất tương tự như vacxin vô hoạt ñồng chủng ðiểm khác biệt là chủng virus sử dụng trong vacxin có kháng nguyên H giống chủng virus trên thực ñịa còn kháng nguyên N dị chủng Khi nhiễm virus trên thực ñịa bảo hộ lâm sàng và giảm thải trừ virus ra ngoài môi trường ñược ñảm bảo bằng phản ứng miễn dịch sản sinh bởi kháng nguyên nhóm H ñồng chủng, trong khi kháng thể chống N sản sinh bởi virus thực ñịa có thể sử dụng như chất ñánh dấu sự lây nhiễm trên thực ñịa Vacxin dị chủng mức ñộ bảo hộ không tỉ lệ chặt chẽ với mức ñộ ñồng chủng giữa gen ngưng kết tố hồng cầu trong vacxin và chủng trên thực ñịa ðây là một ưu ñiểm lớn cho phép thành lập ngân hàng vacxin bởi vì giống gốc không chứa virus có mặt trên thực ñịa

Loại vacxin này ñược sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc, một số nước châu Mỹ, châu Âu Ở Việt Nam hiện nay ñang sử dụng vacxin cúm vô hoạt dị chủng với chủng H5N2 và vacxin cúm vô hoạt ñồng chủng với chủng H5N1 nhập từ Trung Quốc, Hà Lan

2.9.4 Vacxin tái tổ hợp:

ðể kịp thời có vacxin tiêm chủng phòng bệnh cho vật nuôi thì chiến lược sản xuất vacxin virus tái tổ hợp là một phương thức hiệu quả: một vài loại vacxin tái tổ hợp như virus ñậu gà chứa kháng nguyên H5, H7 ñã ñược sử