Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản in vitro nguồn giống khoai tây sạch bệnh

Luận văn, thạc sỹ, tiến sĩ, cao học, kinh tế, nông nghiệp

Bộ giáo dục và đào tạo trường đại học nông nghiệp I

Người hướng dẫn khoa học: ts nguyễn thị kim thanh

Hà Nội - 2006

i

Lời cam Đoan

Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận văn này là trung thực và ch−a đ−ợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã

đ−ợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Hà Thị Hân

ii

Lời Cảm ơn

Để hoàn thành báo luận văn, trong quá trình thực tập tôi đã nhận

được sự giúp đỡ tận tình và điều kiện thuận lợi của trường Đại Học Nông Nghiệp I - Hà Nội, Khoa Nông học, Bộ môn Sinh lý thực vật

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo TS Nguyễn Thị Kim Thanh, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập và hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới toàn thể các thầy giáo, cô giáo, các cán bộ công nhân viên chức trong Bộ môn Sinh lý thực vật, Bộ môn Công nghệ sinh học - Khoa Nông Học - Trường Đại Học Nông Nghiệp I

Hà Nội

Nhân dịp này, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ động viên và khuyến khích tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn

Tác giả luận văn

Hà thị Hân

iii

Mục lục

1.1 Đặt vấn đề x

2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam xvii

2.3 Thực trạng về tình hình giống khoai tây ở Việt Nam xxii

2.4 Kỹ thuật bảo quản in vitro nguồn gene thực vật xxviii

2.5 Tình hình nghiên cứu bảo quản in vitro trong và ngoài nước xxxiv

3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu xxxix

4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của việc giảm dinh dưỡng trong môi trường

nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh trưởng cây khoai tây in vitro xlvi

4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng khác

nhau đến khả năng làm chậm sinh trưởng cây khoai tây in vitro xlvi

4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của việc giảm hàm lượng dinh dưỡng môi

trường MS đến khả năng làm chậm sinh trưởng cây khoai tây in vitro li

4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng

làm chậm sinh trưởng cây khoai tây in vitro lvi

4.3 Nghiên cứu sử dụng các chất gây áp suất thẩm thấu trong môi trường

nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh trưởng cây khoai tây in vitro lx

iv

4.3.1 Nghiên cứu sử dụng nồng độ đường cao trong môi trường nuôi cấy

đến khả năng làm chậm sinh trưởng cây khoai tây in vitro lxi

4.3.2 Nghiên cứu sử dụng manitol trong môi trường nuôi cấy đến khả

năng làm chậm sinh trưởng cây khoai tây in vitro lxvi

4.3.3 Nghiên cứu sử dụng sorbitol trong môi trường nuôi cấy đến khả

năng làm chậm sinh trưởng cây khoai tây in vitro lxx

4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhịêt độ thấp đến khả năng làm chậm

4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Chlor cholin chlorit (CCC) trong

môi trường nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh trưởng cây khoai

4.6 Nghiên cứu khả năng bảo quản nguồn giống khoai tây thông qua

v

Danh Môc C¸c tõ ViÕt t¾t

ABA : AxÝt abscisic

vi

Danh mục bảng

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất, sản lượng khoai tây thế giới trong một số

Bảng 2.2 Diện tích, năng suất, sản lượng khoai tây từ 1976 - 2002 xx

Bảng 4.1 Thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây

in vitro trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau xlviii

Bảng 4.2 Chiều cao, số lá của cây khoai tây in vitro trong các môi trường

dinh dưỡng khác nhau (sau cấy 8 tuần) xlix

Bảng 4.3 Thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây

in vitro trong môi trường giảm hàm lượng dinh dưỡng lii Bảng 4.4 Chiều cao, số lá của cây khoai tây in vitro trong môi trường giảm

hàm lượng dinh dưỡng (sau 8 cấy tuần) liii

Bảng 4.5 Thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây

in vitro trong môi trường có hàm lượng agar khác nhau lvii

Bảng 4.6 Chiều cao, số lá cây khoai tây in vitro trong môi trường có hàm

lượng agar khác nhau (sau cấy 8 tuần) lviii

Bảng 4.7 Thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây

in vitro trong môi trường nuôi cấy có nồng độ đường cao lxii

Bảng 4.8 Chiều cao, số lá cây khoai tây in vitro trong môi trường có nuôi

cấy có nồng độ đường cao (sau cấy 8 tuần) lxiii

Bảng 4.9 Thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây

in vitro trong môi trường có bổ sung manitol lxvii

Bảng 4.10 Chiều cao, số lá cây khoai tây in vitro trong môi trường nuôi

cấy có bổ sung manitol (sau cấy 20 tuần ) lxviii

Bảng 4.11 Thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây in

vitro trong môi trường có bổ sung sorbitol với các nồng độ khác nhau lxxi

Bảng 4.12 Chiều cao, số lá cây khoai tây in vitro trong môi trường có

bổ sung sorbitol với các nồng độ khác nhau (sau cấy 20 tuần) lxxii Bảng 4.13 ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến thời gian mọc mầm, số chồi

và trạng thái chồi của cây khoai tây in vitro lxxvi Bảng 4.14 ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến sự sinh trưởng chiều cao,

số lá của cây khoai tây in vitro (sau cấy 20 tuần) lxxvii Bảng 4.15 ảnh hưởng của nồng độ CCC trong môi trường nuôi cấy đến thời

gian mọc mầm, số chồi và trạng thái của cây khoai tây in vitro lxxxi Bảng 4.16 ảnh hưởng của nồng độ CCC trong môi trường nuôi cấy đến sự sinh

trưởng chiều cao, số lá cây khoai tây in vitro (sau cấy 20 tuần) lxxxii Bảng 4.17 Đánh giá khả năng duy trì nguồn giống khoai tây bằng tạo và

lưu giữ củ siêu bi trên môi trường nuôi cấy lxxxvi

Danh mục hình

Hình 1 ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau đến

tốc độ tăng trưởng chiều cao cây khoai tây in vitro xlviiHình 2 Tốc độ tăng trưởng chiều cao cây khoai tây in vitro trong môi

trường giảm hàm lượng dinh dưỡng livHình 3 Tốc độ tăng trưởng chiều cao cây khoai tây in vitro trong môi

Hình 4 Tốc độ tăng trưởng chiều cao cây khoai tây in vitro trong môi

Hình 5 Tốc độ tăng trưởng chiều cao cây khoai tây in vitro trong môi

Hình 6 Tốc độ tăng trưởng chiều cao cây khoai tây in vitro trong môi

Hình 7 ảnh hưởng của nhịêt độ thấp đến tốc độ tăng trưởng chiều cao

Hình 8 ảnh hưởng của nồng độ CCC trong môi trường nuôi cấy đến

tốc độ tăng trưởng chiều cao cây khoai tây in vitro lxxxiii

ix

x

1 Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong bốn loại cây trồng

quan trọng (khoai tây, lúa nước, ngô và lúa mì) trong hệ thống cây trồng của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Trong thành phần củ khoai tây có chứa nhiều chất dinh dưỡng quan trọng như protein, lipit, các loại vitamin và các chất khoáng (Tạ Thu Cúc, 2000) [10] Vì vậy khoai tây được coi là cây lương thực, thực phẩm chính, quan trọng của nhiều nước trên thế giới

Khoai tây là cây trồng có nhiều đặc tính nông sinh học quý như: thời gian sinh trưởng ngắn, thích nghi được với nhiều vùng sinh thái và nhiều chân

đất khác nhau, năng suất củ cao nên được trồng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới Từ năm 1988 đã có 130 nước trồng khoai tây với tổng diện tích 18,3 triệu

ha và tổng sản lượng là 295,1 triệu tấn, năng suất trung bình là 16 tấn /ha (Trương Đích,1997) [12]

ở Việt Nam, khoai tây được đưa vào trồng ở Đồng Bằng Sông Hồng từ những năm 1890 do người Pháp mang đến (Trương Văn Hộ và cộng sự, 2002) [14] Sau khi vụ đông ra đời cây khoai tây được coi là cây trồng mang lại thu nhập cao và được trồng trong 11 công thức luân canh khác nhau (Đỗ Kim Chung, 2003) [7] Hiện nay với phong trào “cánh đồng 50 triệu đồng/ha/năm” thì sản xuất khoai tây có ý nghĩa rất quan trọng Một vụ khoai tây có thể cho năng suất 20 tấn/ha, với giá bán bình quân 2000 đồng/kg đã cho thu nhập khoảng 40 triệu đồng/ha [12]

Tuy nhiên, ở nước ta hiện nay sản xuất khoai tây chưa phản ánh đúng tiềm năng của nó Trong khi nhu cầu về tiêu dùng khoai tây ngày càng tăng nhưng năng suất và sản lượng khoai tây vẫn còn rất thấp chỉ đạt khoảng 8- 10 tấn/ha trong khi đó một số nước trên thế giới năng suất đạt tới 40 - 50 tấn/ha, vì thế, sản xuất khoai tây ở nước ta vẫn chưa đáp ứng nhu cầu tiêu dùng khoai

Trên thế giới, đối với các nước có nền nông nghiệp phát triển do đã tổ chức được một hệ thống sản xuất giống khoai tây quốc gia chặt chẽ nên đã khắc phục hiện tượng này, nhờ đó năng suất khoai tây tăng lên liên tục và nền sản xuất khoai tây phát triển khá ổn định

Cây khoai tây có đặc điểm rất dễ bị lây nhiễm virus Theo nghiên cứu của Vũ Triệu Mân (1978)[16], khoai tây thường bị nhiễm 6 loại virus làm cho cây sinh trưởng chậm, còi cọc, biến dạng và củ nhỏ dẫn đến giảm năng suất từ

30 - 90% Đặc biệt, virus có các đặc tính nguy hiểm như: không thể chữa

được, truyền cho đời sau qua củ, lây lan qua côn trùng truyền bệnh và xây xát cơ giới Tốc độ tái nhiễm virus rất nhanh, khi nhiễm bệnh virus mà không có cách khắc phục thì sẽ bị lây lan đến mức tối đa (Trần Văn Ngọc, Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển, 1993)[19] Do vậy khi củ giống có tỷ lệ nhiễm virus khoảng 10% là đã gây ảnh hưởng đáng kể đến sinh trưởng phát triển và năng suất khoai tây, vì vậy lúc này cần phải thay thế giống sạch bệnh (Nguyễn Thị Kim Thanh,1998) [28]

Hiện nay để có giống sạch bệnh người ta bắt nguồn từ kỹ thuật nuôi cấy Meristen, một cơ quan gần như không có virus Bằng các phương pháp kiểm tra hiện đại kết hợp với nuôi cấy mô người ta sẽ tạo được cây sạch bệnh virus,

đưa vào hệ thống sản xuất giống được kiểm tra chặt chẽ từ khâu đầu cho tới khi sản phẩm cuối cùng đưa ra sản xuất là các củ giống khoai tây sạch bệnh (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 1991) [22]

Song khâu đầu tiên cần phải có nguồn vật liệu sạch bệnh Với kỹ thuật

“lọc sạch” virus bằng nuôi cấy Meristem thì tỷ lệ thành công thấp và tốn nhiều

thời gian Do vậy, xu hướng chiến lược của các nước trồng khoai tây trên thế giới hiện nay là cần chủ động lưu giữ nguồn vật liệu ban đầu sạch virus để cung cấp cho hệ thống sản xuất giống, nhằm rút ngắn và tăng hiệu quả của hệ thống sản xuất giống để thường xuyên cung cấp nhanh nhất nguồn giống khoai tây sạch bệnh thay thế lượng giống khoai tây đã bị thoái hoá trong sản xuất

Trên thế giới, nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu kỹ thuật bảo quản, duy trì nguồn vật liệu khoai tây sạch bệnh bằng các phương pháp khác nhau (insitu, exsitu) Trong đó, phương pháp bảo quản insitu (bảo quản tại chỗ) có hiệu quả không cao vì cây khoai tây là cây dễ bị lây nhiễm virus trong

điều kiện tự nhiên Sau một vụ trồng, tỷ lệ nhiễm virus có thể 50% đến 100 (Vũ Triệu Mân, 1986) [17] Vì vậy, đối với cây khoai tây cần được áp dụng phương pháp bảo quản exsitu (bảo quản trong điều kiện nhân tạo) Trong đó, phương pháp bảo quản in vitro là phương pháp bảo quản có hiệu quả cao đối

với cây khoai tây Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản in vitro nguồn giống khoai tây sạch bệnh”

1.2 Mục đích, yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu một số yếu tố tác động làm chậm sinh trưởng của cây khoai tây in vitro hoặc duy trì củ khoai tây in vitro với mục đích kéo dài thời gian giữa hai lần cấy chuyển bằng cây hoặc củ in vitro Trên cơ sở đó có thể cung cấp một cách chủ động nguồn cây hoặc củ khoai tây in vitro sạch bệnh cho hệ thống sản xuất khoai tây

1.2.2 Yêu cầu

- Xác định được ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ thấp, các chất làm tăng áp suất thẩm thấu (saccarose, sorbitol và manitol), môi trường nghèo dinh dưỡng, nền môi trường, chất ức chế sinh trưởng CCC (chlor cholin chlorit axit) trong môi trường nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh trưởng của cây khoai tây in vitro nhưng vẫn đảm bảo chất lượng cây tốt

Cung cấp thêm những dẫn liệu cơ bản về lĩnh vực duy trì nguồn giống sạch bệnh làm tài liệu cho nghiên cứu giảng dạy

1.3.2 ý nghĩa thực tiễn

Xác định kỹ thuật bảo quản nguồn giống khoai tây sạch bệnh in vitro

để chủ động cung cấp nguồn vật liệu sạch bệnh ban đầu cho hệ thống sản xuất khoai tây giống ở nước ta nhằm góp phần thúc đẩy nền sản xuất khoai tây giống trong nước để thay thế dần khoai tây giống nhập nội

2 Tổng quan tài liệu

2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại cây khoai tây

Cây khoai tây có nguồn gốc ở vùng núi cao Ander thuộc Lack Tinicaca Nam Mỹ Trong quá trình thuần hoá khoai tây được lan rộng khắp vùng núi Ander Vào thế kỷ XVI người Tây Ban Nha chinh phục châu Mĩ, nông dân đã trồng nhiều giống khoai tây dọc miền núi bây giờ là Bolivia, Columbia, Ecuador và Peru Từ Tây Ban Nha khoai tây đã lan truyền tới nhiều nước châu

á vào thế kỷ XVII, cho tới thế kỷ XVIII lan truyền khắp các nước châu Âu và

được trồng rộng rãi (Tạ Thu Cúc, 2000) [10]

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) thuộc họ cà (Solanaceae), bộ

cà (Solanales), phân lớp bạc hà (Limiidea), lớp ngọc lan (Magnoliophyta) (Võ

Văn Chi, Vũ Văn Chuyên, 1969, Dương Đức Tiến, 1978) [3] [4]

Có nhiều cách phân loại khác nhau, nhưng theo Haward H W (1990), Hawkes J.G (1982) [43] [45] thì khoai tây được phân loại theo số lượng nhiễm sắc thể như sau:

- Loại nhị bội thể (2n=24) gồm 4 loài là: S Xajanhuiri, S goniocalyx, S phureja, S setenotonum

- Loại tam bội thể (3n=36) gồm 2 loại là: S.xchaucha, S.xjuzeperukii

- Loại tứ bội thể (4n=48) phân bố rộng rãi nhất chiếm 70%, loại này gồm

2 loài phụ là Solanaceae tuberosum spp.tuberosum và spp andigena

- Loại ngũ bội (5n=60) gồm S xcurtilobum

- Loại lục bội (6n=72) gồm S demissium

2.1.2 Giá trị dinh dưỡng và ý nghĩa kinh tế của cây khoai tây

Khoai tây là một cây lương thực và thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao Trong củ khoai tây có chứa rất nhiều dinh dưỡng quan trọng như: protein,

đường, lipit, các loại vitamin, caroten, B1, B2, B3, B6, PP và đặc biệt là vitamin C, ngoài ra còn có các chất khoáng quan trọng như K, P và Mg Trong 100g khoai tây luộc có ít nhất 5% nhu cầu protein, 3% năng lượng, 7 - 12%

Fe, 10% vitamin B6 và 50% nhu cầu vitamin C cho người /ngày (Tạ Thu Cúc,

Hồ Hữu An, 2000) [10]

Theo Beukema, Vanderzaag (1979), trong số các cây trồng của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới từ 30° vĩ Bắc đến 30° vĩ Nam thì khoai tây là cây sinh lợi hơn cả, do có năng suất năng lượng và năng suất protein cao nhất Nếu protein của trứng là 100% thì của khoai tây là 71% cao hơn ngô, đậu tương, bột mì và đậu Hà Lan [28]

Giá trị dinh dưỡng của một số sản phẩm như sau:

Sản phẩm Tỷ lệ protein sử dụng (% so với trứng)

Theo Ngô Đức Thiệu (1978,) [33], thì ở các nước phát triển khoai tây

được sử dụng làm thức ăn gia súc Nếu năng suất khoai tây 150 tạ củ và 80 tạ thân lá/ha có thể đảm bảo 5.500 đơn vị thức ăn gia súc ở Việt Nam sản xuất khoai tây cũng góp to lớn cho chăn nuôi nhất là chăn nuôi lợn (90% hộ trồng khoai tây sử dụng củ nhỏ làm thức ăn cho chăn nuôi) (Nguyễn Công Chức, 2001) [8] Bên cạnh giá trị làm lương thực, thực phẩm, thức ăn cho gia súc, khoai tây còn là nguồn nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp chế biến Tinh bột khoai tây có thể sử dụng trong ngành công nghiệp dệt, gỗ ép, giấy và

đặc biệt là trong công nghiệp chế biến axit hữu cơ (lactic, xitric), dung môi hữu cơ (Etanol, Butanol), axit cacbonic và nhiều sản phẩm phụ khác ước tính

1 tấn khoai tây củ có hàm lượng tinh bột là 17,6% chất tươi thì sẽ cho 112 lít rượu, 55 kg axit hữu cơ và một số sản phẩm phụ khác, hoặc là 170 kg tinh bột hoặc là 80 kg glucoza cùng nhiều sản phẩm khác [28] Do vậy khoai tây được lưu thông trên thị trường thế giới với khối lượng rất lớn hàng năm và là một trong những mặt hàng nông sản bán chạy nhất Giá 1 tấn khoai tây lên đến

265 - 270 USD năm 1986 tại Anh (Lê Hưng Quốc, 2002) [21] ở Việt Nam, theo kết quả điều tra tại các tỉnh: Bắc Giang, Hà Tây, Thái Bình cho thấy lãi ròng trên một hecta khoai tây thương phẩm chính vụ dao động từ 3,83 đến 10,90 triệu đồng (1999) Sản xuất giống cho giá trị cao hơn sản xuất khoai tây thương phẩm từ 2 - 4 lần Lãi ròng đối với sản xuất khoai tây cao hơn từ 1,7 - 3,8 lần so với khoai lang và ngô (Nguyễn Công Chức, 2002) [9]

Khoai tây có vai trò kinh tế xã hội to lớn, hiện nay sản xuất khoai tây

đóng góp từ 42 - 87% thu nhập từ cây vụ đông, 4,5 - 34,5% thu nhập từ trồng trọt, 4,5 - 22,5% trong tổng thu nhập của hộ trồng khoai tây Với diện tích khoai tây như hiện nay khoảng trên dưới 30.000 ha, ngành sản xuất này đã tạo

ra việc làm cho 120.000 - 180.000 lao động nông nghiệp trong vụ đông xuân [9] Vì vậy, hiện nay khoai tây được xác định là một trong những cây chủ yếu

nằm trong chương trình tạo công ăn việc làm, nâng cao thu nhập, đảm bảo an toàn lương thực và cải thiện chế độ dinh dưỡng cho người dân vùng đồng bằng

và miền núi phía Bắc (Nguyễn Tiến Hưng, 2003) [15]

Ngoài ra sản xuất khoai tây còn đem lại lợi ích lâu dài và đáng kể khác như: làm tăng năng suất các cây trồng sau đó, tăng độ phì nhiêu và màu mỡ của đất, giảm chi phí làm đất và làm cỏ [10]

2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam

2.2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới

Do có vai trò kinh tế và dinh dưỡng to lớn nên cây khoai tây được trồng rộng rãi trên thế giới với 130 nước khác nhau, từ 71° vĩ Bắc đến 40° vĩ Nam Tuy nhiên, do các điều kiện về khí hậu tự nhiên, điều kiện kinh tế và các điều kiện về khoa học kỹ thuật khác nhau nên diện tích trồng khoai tây và sản lượng khoai tây khác nhau giữa các châu lục và các nước (FAO , 2001) [1]:

Châu á có số nước trồng khoai tây nhiều nhất so với các châu lục khác

là 42 nước với tổng diện tích năm 2001 là 7,7 triệu ha, năng suất bình quân là 15,2 tấn, sản lượng là 116,853 triệu tấn (FAO, 2001) [1]

Châu âu có số nước trồng khoai tây nhiều thứ hai thế giới là 38 nước với tổng diện tích năm 2001 là 8,966 triệu ha (đứng thứ nhất thế giới ), năng suất bình quân là 15,3 tấn/ha, sản lượng là 137,272 triệu tấn (FAO, 2001) [1]

Châu Phi có số nước trồng khoai tây nhiều thứ ba thế giới là 37 nước với tổng diện tích là 1,185 triệu ha, năng suất bình quân là 11,3 tấn/ha (thấp nhất thế giới), sản lượng là 13,407 triệu tấn (FAO, 2001) [1]

Bắc và Nam Mỹ có 18 nước trồng khoai tây với tổng diện tích là 0,764 triệu tấn, năng suất trung bình là 34,5 tấn/ha (cao nhất thế giới), sản lượng 26,372 triệu tấn (FAO, 2001) [1]

Nam Mỹ có 10 nước trồng khoai tây với tổng diện tích là 0,914 triệu ha, năng suất bình quân là 14,9 tấn/ha, sản lượng 13,648 triệu tấn (FAO, 2001)[1]

Châu Đại Dương là châu lục có diện tích và sản lượng khoai tây thấp nhất so với các châu lục khác: tổng diện tích trồng khoai tây là 0,052 triệu ha, sản lượng là 1,753 triệu tấn, tuy nhiên năng suất khoai tây ở đây khá cao đứng thứ hai thế giới sau Bắc và Trung Mỹ, trung bình đạt 33,5 tấn/ha, đặc biệt ở châu lục này có New Zealand là nước có năng suất khoai tây cao nhất so với các nước trên thế giới là 50 tấn/ha (FAO, 2001) [1]

Trong đó Trung Quốc là nước đứng đầu thế giới về diện tích trồng khoai tây đạt 4,602 triệu ha (năm 2001), Nga đứng thứ hai thế giới về diện tích trồng khoai tây là 3,211 triệu ha (FAO, 2001) [1]

Theo kết quả công bố của FAO (2000) [39] các nước đứng đầu thế giới

về sản lượng khoai tây là Trung Quốc đạt 62036 triệu tấn/năm, sau đó là Hà Lan đạt 24232 triệu tấn/năm, ấn Độ đạt 23500 triệu tấn/năm và Mỹ là 23404 triệu tấn/năm

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất, sản lượng khoai tây thế giới

trong một số năm gần đây

( triệu ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

2.2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam

Khoai tây được du nhập vào Việt Nam từ năm 1890 do người Pháp mang tới (Tạ Thu Cúc, 2000) [10] Tuy nhiên cho đến đầu thập kỷ 70 với sự

áp dụng rộng rãi về giống lúa mới có năng suất cao, thời gian sinh trưởng ngắn hơn so với các giống truyền thống, nông dân vùng đồng bằng sông Hồng

có điều kiện trồng thêm vụ đông sau khi thu hoạch vụ lúa xuân và lúa mùa trong một năm Thời kỳ này cây khoai tây được coi là cây lương thực trong hệ thống các cây lương thực thực phẩm của Việt Nam (Trương Văn Hộ, Nguyễn Văn Kim, 2002) [14]

Hiện nay khoai tây được trồng rộng rãi ở hầu hết các tỉnh trong cả nước,

đặc biệt là các tỉnh vùng đồng bằng châu thổ sông Hồng, Đà Lạt, Lâm Đồng Với hệ thống canh tác tiên tiến trong những năm gần đây thì khoai tây là cây

vụ đông quan trọng trong công thức luân canh: lúa mùa - khoai tây - luá xuân của các tỉnh vùng đồng bằng châu thổ sông Hồng và miền núi phía Bắc Mặt khác cây khoai tây có khả năng thích nghi với nhiều loại đất khác nhau, do đó

có khả năng mở rộng diện tích trồng ở Việt Nam (Hồ Hữu An, Đinh Thế Lộc, 2005) [1]

Tuy nhiên trong thực tế sản xuất khoai tây ở Việt Nam chưa phát triển mạnh, diện tích trồng và sản lượng lại có xu hướng giảm Tổng diện tích sản xuất khoai tây đã giảm dần từ 93.900 ha, với năng suất 9,3 tấn/ha (năm 1890) xuống còn 32.100 ha với năng suất 8,1 tấn/ha (năm 1993) và khoảng 30.000ha với năng suất 11 tấn/ha (năm 2001) (Đào Huy Chiên, Trương Văn Hộ, Peter Vanderzaag và ctv, 2001 - 2002) [5] [6] Trong một vài năm trở lại đây (từ

2000 đến nay) diện tích trồng khoai tây lại có xu hướng tăng dần vào đầu niên

vụ 2002 - 2003, đạt khoảng 35.000 ha Sự tăng lên về diện tích trồng khoai tây chủ yếu là do nhu cầu sử dụng khoai tây và tiến bộ kỹ thuật áp dụng trong sản xuất khoai tây, đặc biệt là các tiến bộ kỹ thuật kỹ thuật về giống Sản lượng khoai tây dao động từ 260.100 tấn - 361.638 tấn giai đoạn 1976 - 1990, từ

243.348 tÊn - 382.296 tÊn giai ®o¹n 1991 - 2000 vµ t¨ng tíi 400.000 - 421036

tÊn niªn vô 2002 - 2003 (§ç Kim Chung, 2003) [7] (B¶ng 2.2)

B¶ng 2.2 DiÖn tÝch, n¨ng suÊt, s¶n l−îng khoai t©y tõ 1976 - 2002

N¨m DiÖn tÝch (ha) N¨ng suÊt

Yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến năng suất khoai tây ở Việt Nam hiện nay là chất lượng củ giống Hiện nay trên thị trường giống khoai tây của Việt Nam còn có nhiều bất cập: giống nhập từ Trung Quốc có chất lượng thấp (chủ yếu là khoai tây thịt và không được kiểm dịch chặt chẽ), các giống nhập khẩu

từ Đức và Hà Lan có chất lượng cao thì giá thành lại quá đắt nông dân không

có khả năng đầu tư, hệ thống sản xuất giống tốt ở trong nước còn thiếu, giống

do nông dân tự để đã thoái hoá nghiêm trọng (Nguyễn Kim Chung, 2003)[7] Ngay cả ở nơi có trình độ thâm canh, có truyền thống sản xuất khoai tây lâu

đời như Hạ Hồi - Thường Tín thì năng suất khoai tây cũng chỉ đạt từ 12 - 13 tấn/ha Các giống khoai tây mà người nông dân sử dụng hiện nay hầu hết là do nông dân tự duy trì từ vụ này qua vụ khác, hoặc là các giống nông dân tự mua không rõ nguồn gốc Do vậy hầu hết là các giống đã bị thoái hoá nghiêm trọng, tỷ lệ nhiễm bệnh virus cao từ 54 - 65% và hao hụt trong bảo quản lớn từ

45 - 60% Khoai tây là cây trồng nhân giống chủ yếu bằng con đường vô tính,

có tỷ lệ tái nhiễm virus cao Hơn nữa trong điều kiện sản xuất của Việt Nam,

củ giống khoai tây phải bảo quản qua thời gian dài (khoảng 9 tháng, từ tháng

2 - tháng 10), dưới điều kiện nóng ẩm của mùa hè làm cho sự hao hụt về khối lượng do thối hỏng lên tới 50%, củ giống bị già sinh lý nhanh chóng, khi trồng cây mọc sớm, thời gian sinh trưởng ngắn, tỷ lệ củ bi lớn, số củ thương phẩm giảm, năng suất thấp (Nguyễn Quang Thạch, 1993) [24]

Theo Ngô Đức Thiệu (1984) [34] thoái hoá là quá trình làm giảm dần năng suất gieo trồng của khoai tây biểu hiện ở chỗ củ khoai tây ngày một nhỏ

đi cả về kích thước lẫn trọng lượng, chất lượng củ xấu dần, hàm lượng các chất dinh dưỡng giảm dần so với trước Nếu quá trình này diễn ra lâu dài mà không được cải tạo sẽ đưa đến tác hại là tiêu diệt hoàn toàn giống khoai tây nào đó

Hiện tượng thoái hoá giống khoai tây ở Việt Nam hiện nay cũng là hiện tượng chung của tất cả các nước trồng khoai tây Sau một số vụ trồng khoai

củ giống Như vậy cây khoai tây có hai nguyên nhân gây thoái hoá chính là:

- Thoái hoá do virus (nguyên nhân bệnh lý)

- Thoái hoá do sự già hoá củ giống (nguyên nhân sinh lý)

Trong đó virus là nguyên nhân chính dẫn tới hiện tượng thoái hoá giống khoai tây, hiện tượng này đã được Parmentier phát hiện từ năm 1876 Sau đó khoảng một thế kỷ người ta mới xác định đặc tính của virus và khẳng định chúng là nguyên nhân chính gây thoái hoá khoai tây Cho đến năm 1913 thì bệnh thoái hoá khoai tây mới chính thức được đề nghị bởi Quanjer - Viện bảo

vệ thực vật Wageningen (Nguyễn Quang Thạch, 1993) [24]

Do đó để khắc phục bệnh virus cần tiến hành sử dụng giống sạch bệnh bằng các biện pháp sau:

+ Sử dụng giống sạch bệnh bằng con đường nhập nội giống khoai tây từ các nước: Hà Lan, Pháp, Đức

+ Xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh trong nước

Đây là giải pháp chủ động, tích cực nhưng cần được đầu tư và tổ chức thực hiện tốt

2.3 Thực trạng về tình hình giống khoai tây ở Việt Nam

2.3.1 Cơ cấu giống khoai tây

Theo kết quả điều tra của dự án hợp tác Việt - Đức "Thúc đẩy sản xuất khoai tây ở Việt Nam" (Đỗ Kim Chung, 2003) [7] thì hiện nay trong sản xuất của chúng ta có 5 nhóm giống khoai tây là: giống Thường Tín (Akasagen),

các giống khoai tây nhập từ châu Âu, giống khoai tây hạt lai (TPS), giống khoai tây cải tiến KT3 và các giống nhập khẩu từ Trung Quốc

Nông dân miền Bắc trồng chủ yếu là giống khoai tây Thường Tín, niên

vụ 2002 - 2003 giống này được trồng với khoảng 8,5% diện tích khoai tây cả nước Đặc biệt ở các tỉnh Thái Bình, Hải Dương, Nam Định, Ninh Bình giống khoai tây Thường Tín chiếm từ 5 - 30% diện tích khoai tây của các tỉnh Hạn chế lớn nhất của giống khoai tây Thường Tín là dễ bị nhiễm bệnh, nhất là bệnh héo xanh và bệnh mốc sương nên năng suất thường thấp [7]

Các giống khoai tây nhập khẩu từ Châu Âu được nông dân chấp nhận một cách rộng rãi, đặc biệt với các giống xác nhận Hiện nay các giống Diamant, Mariella, Nicolla đang được trồng ở Đồng Bằng Sông Hồng với khoảng 15,19% diện tích và dao động từ 3 - 27% diện tích tuỳ theo từng nơi Trong số các giống này Diamant được trồng phổ biến nhất chiếm tới 14% tổng diện tích Song trong thực tế hầu hết các vật liệu trồng đều bị thoái hoá sau 2 -

3 năm và nông dân phải mua giống với giá rất đắt khoảng 10.000 đồng/1 kg

củ giống Mặt khác các giống này có khả năng nhiễm bệnh (đặc biệt là bệnh

do virus PVX và PVY) cao trong thời gian bảo quản dài [7]

Các giống khoai tây cải tiến KT2 và KT3 cũng được trồng khoảng 4% diện tích khoai tây cả nước trong niên vụ 2002 - 2003 và dao động từ 2 - 14% tuỳ theo từng tỉnh Đặc điểm nổi bật của các giống khoai tây cải tiến (đặc biệt KT3) là có khả năng kháng lại một số bệnh virus, nhờ đó nông dân có thể để giống một số vụ mà năng suất không giảm [7]

Các gống hạt lai TPS (Hồng Hà 2, Hồng Hà 7) được trồng khoảng 8% diện tích khoai tây cả nước niên vụ 2002 - 2003 Riêng ở tỉnh Thái Bình diện tích trồng hai giống khoai tây hạt lai lên tới 40% diện tích

Các giống khoai tây Trung Quốc như: Việt Dẫn, Kim Quan, VT2 và Xuyên Vu được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi, Trung du phía Bắc và đồng

bằng sông Hồng Hiện nay có khoảng 66% diện tích khoai tây cả nước là các giống khoai tây Trung Quốc, đặc biệt là giống VT2, trừ tỉnh Thái Bình có diện tích ít nhất là 20% còn lại các tỉnh khác đã trồng từ 70 - 87% Nguyên nhân chủ yếu là các giống khoai tây Trung Quốc có giá rất rẻ, chỉ có 2500 - 3000

đồng/1kg giống [7]

Nhìn chung cơ cấu giống khoai tây hiện nay của nước ta là rất phức tạp, trong sản xuất có ít nhất 10 giống khoai tây khác nhau cùng tồn tại và dẫn tới các vấn đề về giống như:

+ Khó kiểm soát chất lượng củ giống

+ Giống không được xác nhận dẫn đến thoái hoá giống, dễ nhiễm bệnh + Hao hụt nhiều khi vận chuyển và marketing

+ Sản phẩm lẫn nhiều giống khác nhau nên không suất khẩu được

2.3.2 Nhu cầu khoai tây giống ở Việt Nam hiện nay

Theo kết quả điều tra của dự án khoai tây Việt - Đức (Đỗ Kim Chung) [7] thì mức giống trung bình trồng trên 1ha ở Việt Nam hiện nay là 1100 kg/ha Do đó với diện tích khoai tây là khoảng 35000 ha niên vụ 2002 - 2003, khoảng 39000 ha năm 2005 và sẽ tăng tới 45000 ha vào năm 2010 thì mức khoai tây giống cần thiết cho niên vụ 2002 - 2003 là 38500 tấn (1,1 tấn x

35000 ha) và sẽ tăng lên đến 46800 tấn vào năm 2005 và 49500 tấn vào năm

2010 Trong đó khoảng 37% lượng giống cần được cung cấp vào cuối tháng 9

và trong suốt cả tháng 10, 63% còn lại cần được cung cấp vào tháng 11

Do tập quán và trình độ canh tác khác nhau giữa các vùng miền mà thị hiếu của người nông dân về nguồn cung cấp giống và đặc điểm giống là khác nhau:

Đối với nguồn cung cấp thì có khoảng 75% nông dân mua giống toàn

bộ hay một phần từ các nguồn khác nhau, 25% số nông dân còn lại hoàn toàn

sử dụng giống do nhà tự để Nguồn giống mà nông dân thích mua bao gồm

giống của các viện nghiên cứu (54,1%), giống của các hợp tác xã (34,4%) và giống của các cơ quan khuyến nông (11,5%) Thực trạng này cũng khác nhau giữa các tỉnh (Đỗ Kim Chung) [7]

Đối với đặc điểm của giống thì khoảng 45% số nông dân ưa thích giống khoai tây có cỡ củ từ 30 củ/kg Tất cả nông dân ở hai tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang đều mong muốn củ giống có cỡ củ từ 30 - 40 củ/kg, trong khi nông dân

ở tỉnh Hải Dương muốn mua giống với cỡ củ là từ 20 - 30 củ/kg và nông dân ở tỉnh Thái Bình muốn mua giống có cỡ củ từ 10 - 15 củ/kg Về mầu của vỏ củ thì ở Bắc Ninh, Bắc Giang có hơn 70% nông dân muốn giống có vỏ củ mầu vàng đậm, trong khi đa số nông dân ở Thái Bình lại thích giống có vỏ củ mầu vàng nhạt Về ruột củ và chất lượng củ giống thì hầu hết nông dân ở các nơi

đều thích khoai giống có ruột củ mầu vàng và được bảo quản lạnh [7]

2.3.3 Tình hình sản xuất khoai tây giống ở Việt Nam

Trải qua nhiều bước thăng trầm, sản xuất khoai tây Việt Nam trong những năm gần đây có chiều hướng tăng lên do nhu cầu tiêu dùng trong nước, nguyên liệu cho chế biến và hàng hoá xuất khẩu và đặc biệt là do có nguồn giống phong phú hơn

Khoai tây không phải là cây có nguồn gốc bản địa lại được trồng ở Việt Nam từ hơn 100 năm nay nên giống để sản xuất chủ yếu là nguồn giống nhập khẩu Các giống sau khi nhập khẩu thường được người dân duy trì bằng kho tán xạ và thường được sử dụng trong một thời gian dài Mặt khác do có nguồn gốc ôn đới và được nhân giống chủ yếu theo phương pháp vô tính nên giống thường bị thoái hoá theo thời gian đồng thời kéo theo sự giảm sút về năng suất Năng suất khoai tây giảm do giống bị thoái hoá và do giai đoạn sinh lý không phù hợp Củ giống bị thoái hoá chủ yếu do nhiễm bệnh virus và vi khuẩn và tỷ lệ nhiễm bệnh năm sau thường cao hơn năm trước Chính vì vậy

hàng năm Việt Nam thường phải nhập khẩu một lượng giống nhất định để thay thế giống bị thoái hoá (Nguyễn Quang Thạch) [26] [27]

ở các nước sản xuất khoai tây truyền thống với việc áp dụng các tiến bộ

về khoa học và công nghệ đặc biệt là công nghệ sinh học nên năng suất khoai tây đạt khá cao Năng suất khoai tây tiềm năng theo tính toán của các nhà khoa học có thể đạt 140 tấn/ha Tại các nước sản xuất khoai tây truyền thống năng suất có thể đạt 60 tấn/ha [7]

ở Việt Nam, do đặc điểm địa hình và khí hậu, khoai tây chỉ có thể trồng vào vụ Đông - Xuân ở miền Bắc và có thể trồng cả năm ở một số vùng của tỉnh Lâm Đồng Do đó theo các nhà khoa học thì năng suất khoai tây tiềm năng ở Việt Nam khoảng 30 đến 40 tấn/ha nếu có giống tốt Tuy nhiên năng suất khoai tây bình quân của nước ta hiện nay chỉ đạt 11 - 12 tấn/ha mà nguyên nhân chủ yếu là do chất lượng củ giống kém ( Hồ Hữu An, 2005) [1]

Trong khi đó sản xuất khoai tây giống trong nước còn gặp nhiều bất cập: ở Đồng Bằng Sông Hồng do có khí hậu nóng ẩm, có nhiều tác nhân gây bệnh nhất là các bệnh do virus X, Y, vi khuẩn gây bệnh héo xanh và bệnh mốc sương làm ảnh hưởng lớn đến năng suất Vì vậy để sản xuất giống ở vùng này cần phải có một số kho lạnh và nhà lưới Còn nếu sản xuất ở vùng núi thì có

ưu điểm hơn về cách ly không gian và thời gian sản xuất song cũng có những khó khăn nhất định như dễ bị héo xanh vi khuẩn, nông dân ít kinh nghiệm và

kỹ năng sản xuất khoai tây giống và khó khăn trong việc vận chuyển [7]

Vậy để đáp ứng những yêu cầu về giống khoai tây cho sản xuất hiện nay chúng ta cần phải phát triển nhanh hệ thống sản xuất khoai tây giống tại chỗ sử dụng công nghệ sinh học Với những tiến bộ về khoa học và kỹ thuật mới có thể sản xuất một lượng lớn củ giống siêu bi và củ bi trong phòng thí nghiệm và trong nhà lưới và là nguồn giống ban đầu phục vụ cho việc nhân giống ở những đời tiếp theo cho đến giống xác nhận (Nguyễn Quang Thạch và

Ctv, 2004) [26] Trong hệ thống này điều mấu chốt cơ bản là chúng ta phải luôn luôn có nguồn giống sạch bệnh, sẵn sàng nhân lên khi cần để đáp ứng yêu cầu sản xuất một cách nhanh chóng và chủ động Do vậy bảo quản in vitro là không thể thiếu trong hệ thống sản xuất giống sạch bệnh

2.3.4 Hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh

Theo Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2004) [26] thì hệ thống sản xuất giống khoai tây tiêu chuẩn quốc tế được thể hiện ở sơ đồ sau:

Sơ đồ nhân giống khoai tây

từ vật liệu nuôi cấy mô đến giống xác nhận

Theo sơ đồ, trước hết cần có nguyên liệu sạch bệnh đó là các củ giống

đã được đánh giá là sạch virus qua các phương pháp đánh giá chuẩn xác (thường dùng là kỹ thuật ELISA) Cũng có thể sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh (meristem) để tạo cây sạch bệnh virus làm nguyên liệu ban

đầu Sau khi có nguyên liệu sạch bệnh thì sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân nhanh cây sạch bệnh với số lượng lớn Cây cấy mô sạch bệnh có thể đem

Củ hoặc cây sạch bệnh Vật liệu ban đầu sạch bệnh

Vùng chuyên sản xuất giống

G0

tạo củ trực tiếp trong ống nghiệm để thu được củ siêu bi (microtuber) hoặc

đem trồng trong nhà màn cách ly với nguồn bệnh và môi giới truyền bệnh Củ thu được từ cây trồng trong nhà màn thường có kích thước nhỏ nên được gọi là

củ bi (minituber) Củ siêu bi tạo nên cũng sẽ được trồng trong nhà màn và kết quả cũng cho củ bi Các củ bi tạo nên có độ sạch bệnh rất cao (0%) và được xem là giống gốc hay còn gọi là giống siêu nguyên chủng Các củ bi lại tiếp tục được trồng ở những vùng cách ly cao với nguồn bệnh và môi giới truyền bệnh, thường là các vùng miền núi nơi có mật độ môi giới truyền bệnh thấp hoặc vùng ven biển có tốc độ gió cao ngăn cản sự di chuyển của môi giới truyền bệnh để sản xuất ra củ giống nguyên chủng 1 Từ củ giống nguyên chủng 1 đem trồng ở những vùng chuyên sản xuất giống sẽ thu được củ giống nguyên chủng 2 và thế hệ sau đó là giống xác nhận Giống xác nhận sẽ được cung cấp cho các vùng trồng sản xuất khoai tây thương phẩm [26]

2.4 Kỹ thuật bảo quản in vitro nguồn gene thực vật 2.4.1 Khái niệm chung

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (nuôi cấy in vitro) đang thực sự được ứng dụng một cách có hiệu quả trong nhiều lĩnh vực như nhân giống vô tính cây trồng, tạo cây sạch bệnh, tạo dòng thuần, lai tế bào, chọn dòng tế bào và một lĩnh vực rất quan trọng và có ý nghĩa lớn đó là nuôi cấy bảo quản in vitro nguồn tài nguyên di truyền thực vật quý hiếm và sạch bệnh (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997) [2]

Mục đích cơ bản của bảo quản nguồn tài nguyên di truyền thực vật là duy trì sự phong phú, đa dạng di truyền trong loài, giữa các loài và trong hệ sinh thái nói chung, đồng thời có sự hiểu biết về chúng để làm cơ sở cho việc khai thác, sử dụng chúng trong hiện tại và trong tương lai (Khanna và ctv, 1991) [2]

Nguồn gene cây trồng thường được bảo quản theo hai phương thức : + Phương thức in-situ (bảo quản tại chỗ): loại bảo quản này cho phép cây trồng sinh trưởng trong điều kiện sinh thái tự nhiên Phương thức bảo quản

Trong bảo quản ex-situ nguồn gene bất kỳ của loại cây trồng nào cũng

có thể được duy trì, lưu giữ Có những hình thức bảo quản ex-situ khác nhau (Khanna và cs, 1991) [2]:

- Trên vườn ươm, tạo thành Field genebank

- Bảo quản hạt trong kho lạnh tạo thành seed genebank

- Bảo quản in vitro tạo thành in vitro genebank

- Bảo quản DNA, acid nucleic, chất mang thông tin di truyền

Vấn đề lựa chọn hình thức bảo quản nào thì tuỳ thuộc vào bản chất cây trồng, điều kiện kinh tế và sự phát triển khoa học công nghệ của từng quốc gia Hawkes (1982) [44] đã tổng kết về các hình thức bảo quản phụ thuộc vào bản chất cây trồng như sau:

Bản chất cây trồng quyết dịnh các giải pháp bảo quản

Yếu tố sinh học Phương pháp bảo quản

Cây lâu năm (cây gỗ) Insitu, ngân hành gene đồng ruộng, in

vitro (hạt và hạt phấn) Cây hàng năm Ngân hàng gene đồng ruộng, in vitro

Cây nhân vô tính với hạt vô sinh Ngân hàng gene đồng ruộng, in vitro, bảo

Cây thích hợp nuôi cấy mô Tìm các phương pháp bảo quản thích hợp,

bảo quản in vitro Cây có hạt phấn với sự sống cao Bảo quản hạt phấn

(Nguồn: Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997)

2.4.2 Bảo quản in vitro nguồn gene thực vật

Bảo quản nguồn gene in vitro sử dụng hai phương pháp: bảo quản bằng nuôi cấy in vitro và bảo quản bằng kỹ thuật đông khô (Cryopreservation) Giải pháp công nghệ bảo quản in vitro được phát triển trong vòng 10 - 15 năm trở lại đây Nó được bắt đầu với việc nuôi cấy, bảo quản mô sẹo, tế bào, phục vụ mục đích nghiên cứu sinh lý, sinh hoá và tổng hợp các chất thứ cấp sau đó chúng được chuyển sang kỹ thuật bảo quản in vitro chồi, mầm, phôi và cây con hoàn chỉnh phục vụ công tác nhân nhanh sản xuất cây giống quý hiếm, chất lượng cao, sạch bệnh và xây dựng nguồn gene cây trồng

Bảo quản in vitro tồn tại và phát triển đồng thời với việc sử dụng các nguồn gene cổ truyền Trong tương lai gần bảo quản in vitro sẽ cho ra đời các ngân hàng gene in vitro (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997) [2]

Bảo quản in vitro nguồn gene thực vật nhằm thực hiện hai nhiệm vụ: + Bảo quản các tập đoàn hoạt động, nhằm cung cấp vật liệu phục vụ công tác nghiên cứu và trao đổi nguồn gene giữa các ngân hàng gene trên thế giới

+ Bảo quản tập đoàn cơ bản, bảo tồn nguồn gene lâu dài, bổ sung vật liệu cho các tập đoàn hoạt động

2.4.3 Kỹ thuật bảo quản in vitro

Bảo quản nguồn gene trong điều kiện in vitro được coi là giải pháp công nghệ có triển vọng, cơ bản đối với các loại cây trồng nhân giống vô tính và cây có hạt mất sức nảy mầm cũng như cây có tỷ lệ nhiễm virus cao [2]

Mẫu đưa vào bảo quản rất đa dạng, có thể là tế bào đơn, mô sẹo, đoạn thân, đoạn rễ hoặc cây con hoàn chỉnh

Bảo quản in vitro dựa trên hai nguyên lý khoa học sau:

+ Duy trì sinh trưởng tối thiểu (trong bảo quản ngắn hạn) + Tạm ngừng sinh trưởng (trong bảo quản dài hạn)

2.4.3.1 Duy trì sinh trưởng tối thiểu

Duy trì sinh trưởng tối thiểu được áp dụng nhiều cho bảo quản cây con

hoàn chỉnh, đối với nhóm cây nông nghiệp nhân giống vô tính như khoai lang, khoai tây, sắn, chuối, dứa Cây con được đặt trong điều kiện ánh sáng, nhiệt

độ và chế độ dinh dưỡng đặc biệt

Duy trì sinh trưởng tối thiểu dựa trên cơ sở của kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro nhưng duy trì kéo dài thời gian giữa hai lần cấy chuyển nhờ vào việc làm chậm sinh trưởng của mẫu cấy Trong thời gian bảo quản tốc độ sinh trưởng phát triển của cây con thường giảm đi nhiều lần (khoảng từ 15 - 20 lần)

so với tốc độ sinh trưởng trong điều kiện bình thường nhờ vào việc sử dụng những yếu tố sinh trưởng khác nhau phụ thuộc vào bản chất cây trồng bao gồm: nhiệt độ thấp, chất ức chế sinh trưởng (ABA), những chất gây áp suất thẩm thấu cao (manitol, đường saccaroza, dầu phủ, ), hoặc làm nghèo dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy (Hồ Hữu Nhị, 1993) [20]

Mẫu được đưa vào nuôi cấy là những cơ quan ít xảy ra biến dị dinh dưỡng trong quá trình tạo cây con (phôi, chồi, mầm, )

Cây con đưa vào bảo quản in vitro phải được làm sạch bệnh, cây khoẻ Trong bảo quản in vitro, hình thức nuôi cấy bảo quản sinh trưởng tối thiểu được áp dụng nhiều và trở thành một giải pháp không thể thiếu được trong các ngân hàng gene cây trồng

Trên thế giới, hơn mười năm qua theo số liệu thống kê của ban tài nguyên cây trồng thế giới, nguồn gene của 20 loài cây trồng khác nhau được lưu giữ bằng con đường này như: dứa, cà phê, cao su, khoai lang, khoai tây, chuối, đu đủ, dừa, khoai mài, ca cao, nho, cam, gừng, nghệ, cọ dầu (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội, 1997) [2]

Thành công đầu có ý nghĩa thực tiễn là việc ứng dụng bảo quản nguồn gene các tập đoàn cây lấy củ trong nông nghiệp Sử dụng các yếu tố kìm hãm

sinh trưởng cây con trong quá trình nuôi cấy (điều kiện bảo quản bao gồm nhiệt độ, ánh sáng, ) đã làm kéo dài thời gian giữa các lần cấy chuyển

Điều kiện bảo quản của một số loại cây trồng

Cây trồng Điều kiện bảo quản Thời gian

24 tháng

(Nguồn: Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, 1997)

2.4.3.2 Bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời

Phương pháp này được áp dụng cho nhiều loại cây trồng nhưng chủ yếu cho loại cây có hạt không bảo quản được trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thấp

Mẫu đưa vào bảo quản phôi, mô, tế bào Trước khi đưa vào bảo quản mẫu phải được xử lý qua một số công đoạn:

- Chất làm giảm sinh trưởng: xử lý 5 - 10 % prolin và 3 - 6% manitol

- Chất chống đông: dung dịch DMSO 1M + glycerol 1M + sacaroza 2M

- Bảo quản ở nhiệt độ -196 0C

Trong quá trình bảo quản mẫu được để ở nhiệt độ -1960C, các quá trình trao đổi chất, quá trình sinh trưởng, phát triển đều tạm ngừng hoạt động Phương pháp bảo quản này có thể lưu giữ mẫu vài chục năm (khoảng 20 - 30 năm) Khi cần phục hồi sinh trưởng, mẫu được lấy ra nuôi cấy tạo cây con hoàn chỉnh (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997) [2]

2.4.3.3 Bảo quản quỹ gene in vitro khoai tây

Khoai tây là cây trồng nhân giống vô tính có tỷ lệ nhiễm bệnh vi khuẩn, virus rất cao, các bệnh này được lan truyền từ đời này sang đời khác qua vật liệu nhân giống như thân, củ Hơn nữa nhiều khi triệu chứng bệnh lại đang ở dạng tiềm ẩn làm cho khó có thể loại bỏ hết cây bệnh trong thời gian sinh trưởng phát triển (Nguyễn Quang Thạch) [24] Vì vậy cần bảo quản tập đoàn giống khoai tây sạch bệnh để chủ động cung cấp nguồn giống sạch cho sản xuất Việc bảo quản tập đoàn khoai tây sạch bệnh trên đồng ruộng (field genebank) rất tốn kém lại không an toàn áp dụng phương pháp bảo quản in vitro

là ít tốn kém, an toàn và chủ động

Trong bảo quản in vitro, khoảng thời gian giữa các lần cấy chuyển là quan trọng quyết định đến hiệu quả và chi phí trong bảo quản, khoảng thời gian càng dài thì chi phí bảo quản càng giảm và càng giảm sự già hoá của cây (Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển, 1994) [18] Vì vậy, người ta đã tìm mọi cách làm giảm sự sinh trưởng phát triển của cây in vitro Có thể sử dụng nhiệt thấp và hoá chất để làm chậm sinh trưởng của cây Chúng ta biết rằng mỗi phản ứng sinh hoá diễn ra trong quá trình sinh trưởng phát triển của cây thì

đều được điều khiển bởi enzym Mỗi emzym lại có nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính xúc tác của mình và đa số các enzym đều bị giảm hoạt tính ở nhiệt độ thấp Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã vận dụng điều này để bảo quản in vitro

Đối với cây khoai tây, nhiều tác giả cho biết nhiệt độ dưới 3oC và trên

28oC đều không có lợi cho sự sinh trưởng phát triển của cây khoai tây in vitro,

có thể làm cây chết Nhiệt độ 6oC đã được xác định là nhiệt độ thích hợp để kìm hãm sinh trưởng tối thiểu nhưng vẫn đảm bảo sự sống của cây (Harney H.A, 1966; A Schaf- Menuhr, E Muller and Mix-Wagner và ctv, 1996) [42] [37]

Ngoài biện pháp nhiệt độ thấp, nhiều tác giả cũng nghiên cứu sử dụng hoá chất trong môi trường nuôi cấy Với yêu cầu hoá chất đó không được làm tổn thương cấu trúc gene hoặc gây đột biến cho cây Saccaroza được bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy để làm tăng áp suất thẩm thấu của môi trường

sẽ làm giảm sự hấp thu dinh dưỡng của cây, do đó làm cây chậm sinh trưởng Sorbitol, manitol là những chất hoàn toàn trung tính, không xâm nhập vào tế bào nhưng có tác dụng làm tăng áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy, cây khoai tây in vitro có thể tạm ngừng sinh trưởng khoảng 5 - 6 tháng trong môi trường bổ sung 4% manitol (Hồ Hữu Nhị, 1993) [20]

2.5 Tình hình nghiên cứu Bảo quản in vitro trong và ngoài nước

2.5.1.Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Phương pháp duy trì và bảo quản quỹ gene là một lĩnh vực được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu

ở nước ta để bảo quản tốt hơn nguồn gene các cây nhân giống vô tính nhất là những cây lấy củ, rễ và cây ăn quả, thời gian qua chương trình quỹ gene đã tạo điều kiện cho bộ môn công nghệ sinh học của Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam bước đầu nghiên cứu nuôi cấy in vitro bảo quản

có kết quả tốt một số tập đoàn cây trồng: 107 mẫu giống từ tập đoàn khoai lang trên đồng ruộng đã được bảo quản an toàn trong điều kiện in vitro ở nhiệt

độ 18 - 20oC với thời gian cấy chuyển từ 6 - 9 tháng Các giống cây trồng khác

như khoai tây, chuối, dứa, mít và cam chanh đã và đang được đưa vào bảo quản trong điều kiện in vitro và kiểm tra lại sự ổn định di truyền của chúng bên ngoài đồng ruộng (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội, 1997) [2]

Theo Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (1994) [19] thì khi hàm lượng

đường trong môi trường nuôi cấy tăng (1 - 100 g/l) thời gian duy trì cụm chồi chuối in vitro tăng (6 - 14 tuần) trên 100g/l thì cụm chồi hoá đen Kết quả tương tự với manitol Sự phối hợp giữa saccarose (50 g/l) và manitol (60 g/l)

có hiệu quả rõ rệt với thời gian duy trì là 36 tuần khi môi trường nuôi cấy có

BA (3 mg/l) và NAA (0,1 mg/l); kết quả tương tự khi BA (1 mg/l)

Các kết quả nghiên cứu ban đầu của Hà Thị Hân (2003) [13] cho biết nồng độ đường 7% trong môi trường nuôi cấy có tác dụng làm chậm sự sinh trưởng của cây so với đối chứng là điều kiện cấy nhân thông thường Khả năng tăng trưởng về chiều cao cây giảm so với đối chứng là 35,89 - 44,68% và

số lá giảm bằng 66,24 - 78,29% so với đối chứng Cây có hiện tượng già hoá nhanh (cây phân nhánh nhiều, vàng lụi sớm)

Tác động phối hợp nhiệt độ thấp 6oC và nồng độ đường cao thì 7% và 2% đường saccaroza đều có tác dụng làm chậm sinh trưởng của cây khoai tây

in vitro Sau 7 tuần nuôi cấy sự tăng trưởng về chiều so với đối chứng từ 83,33

- 104,5%, số lá từ 86,25 - 103,68% so với đối chứng, cây mập, lá xanh tốt

Việc bổ sung manitol vào môi trường nuôi cấy có tác dụng làm giảm sự sinh trưởng của cây khoai tây in vitro Nồng độ manitol 3% có tác dụng làm chậm sinh trưởng nhất Cây khoai tây sau 7 tuần nuôi cấy có sự tăng chiều cao

và số lá không đáng kể (chiều cao từ 1,22 - 1,41 cm, số lá từ 5,2 - 6,4) mà vẫn giữ được trạng thái cây mập, lá xanh tốt [13]

Theo Nguyễn Thị Kim Thanh (2004)[29][30],[31] thì các nhân tố có tác dụng làm chậm sinh trưởng của cây khoai tây in vitro là nhiệt độ thấp 6oC và

3% manitol, saccaroza 5% hoặc glucoza 5% Tuy nhiên các nhân tố khác nhau

có hiệu quả tác động làm chậm sinh trưởng khác nhau

Nhiệt độ thấp 6oC và manitol 3% có tác dụng làm chậm sinh trưởng tốt hơn saccaroza 5% và glucoza 5% Sau 8 tuần bảo quản, cây khoai tây ở công thức hiệt độ thấp 6oC và manitol 3% chỉ cao 3 - 4 cm trong khi đó các công thức saccaroza 5% và glucoza 5% cây khoai tây đều cao trên 10 cm cần được cấy chuyển và trạng thái chồi cũng kém, đạt từ mức trung bình đến xấu và cây

có biểu hiện già hoá Trong điều kiện nhiệt độ thấp 6oC và manitol 3%, cây khoai tây có khả năng bảo quản được thời gian dài, sau 12 tuần cây vẫn duy trì mức sinh trưởng thấp đồng thời đảm bảo trạng thái cây tốt [31]

2.5.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Sự duy trì và thời gian duy trì dài của các giống khoai tây là khía cạnh quan trọng của nhiều chương trình nuôi cấy Theo Espiroza và ctv (1884) (Kenneth C Tores, 1988) [46] cho rằng lóng thân khoai tây có thể được bảo quản trong một chu kỳ dài trên môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 4% manitol, 3% saccaroza và 8 gr agar/1 lít Môi trường này áp dụng nguyên lý thẩm thấu để làm giảm tỷ lệ sinh trưởng và kích thích sự phân chia tế bào của

đỉnh sinh trưởng lóng, có thể cung cấp nhiều lóng cho sự nhân trở lại khi cần thiết Giảm nhiệt độ bảo quản xuống 8oC là ngưỡng nhiệt độ tin cậy làm giảm

tỷ lệ sinh trưởng của cây khoảng cách giữa hai lần cấy chuyển ở ngưỡng nhiệt

độ này đạt từ 2 - 3 năm

Theo A Schafer-Muhr & ctv (1996) [37] thì phương pháp làm lạnh đơn giản đã phát triển cho bảo quản đông khô, một trong các phương pháp thu thập in vitro của các giống khoai tây cũ Đã có trên 15 giống và kiểu gene

được làm lạnh và giữ trong nitơ lỏng Hầu hết các giống đều có tỷ lệ sống cao, trung bình 80%, tỷ lệ cây tái sinh thấp hơn trung bình 40% Nguồn gene khoai tây thường được duy trì bằng nuôi cấy in vitro dưới hình thức bảo quản sinh

trưởng chậm Bảo quản in vitro đặc biệt tốt với bảo quản ngắn hạn và bảo quản dài hạn đặc biệt vì nó có thể chủ động giống Tuy bảo quản dài hạn không đáp ứng kịp thời nhu cầu sử dụng nhanh chóng Nhưng bảo quản đông khô, bảo quản trong nitơ lỏng vẫn chiếm ưu thế

Cùng hướng nghiên cứu với A Schafer-Muhr các tác giả Deutsche Sammlung Von, Mikroorganis Men Und, Zellkulturen Gmbh (1998) [38] cũng khẳng định phương pháp bảo quản lạnh khô meistem khoai tây bằng kỹ thuật nhỏ giọt là phương pháp cần thiết để thu thập nguồn gene trong bảo quản insitu

Theo Sodar Uddin Siddiqui và ctv (2006) [48] thì đỉnh sinh trưởng của cây khoai tây in vitro cấy trên môi trường Murashige skoog 1962 được bảo quản ở nhiệt độ từ 17 - 25oC với chất gây stress là manitol có nồng độ từ 1 - 3% thì chu kỳ bảo quản là trên 6 tháng Giữa nhiệt độ và chất gây stress có

ảnh hưởng riêng rẽ đến sự sống và sự sinh trưởng của chồi đỉnh Trong đó, hàm lượng chất gây stress ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chồi, nhiệt độ

ảnh hưởng đến sự sống sót của chồi Tỷ lệ cây nuôi cấy sẽ sống cao hơn và chu kỳ bảo quản sẽ dài hơn ở điều kiện nhiệt độ là 25oC

Các tác giả Gopal.J, Chamail, Anjali, Sarkar, Debabrata (2004) [41] công bố các kết quả nghiên cứu về kỹ thuật duy trì nguồn giống khoai tây bằng bảo quản củ minituber là những củ giống minituber được tạo ra trên môi trường không có ABA nhưng có hàm lượng đường saccaroza cao và có 44,38Mm benzyn-adenin có thể bảo quản được 12 tháng ở điều kiện ánh sáng yếu và nhiệt độ là 6 ± 10C

Banerjee & Delanghe (1985) (Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển, 1985) [18] đã duy trì và bảo quản chuối dưới dạng cụm chồi qua phương thức bảo quản sinh trưởng chậm in vitro thời gian kéo dài trên một năm ở nhiệt độ

15oC, cường độ ánh sáng yếu (500 - 1000) lux và trong môi trường nuôi cấy

có BA (10Mm) Zamova và ctv (1986, 1987) đã dùng áp suất thẩm thấu để

kìm hãm sinh trưởng với sorbitol hay manitol (0,025 hay 0,25 Mm ) Mora và ctv (1986) thực hiện việc kìm hãm 50% sinh trưởng bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy 4% manitol, 3,9% saccaroza giữ được 18 tháng [18]

Tại một số trung tâm nghiên cứu nông nghiệp quốc tế như: CIP (Trung tâm nghiên cứu khoai tây) ở Pêru lưu giữ nguồn gene khoai tây và khoai lang với một khối lượng lớn trong điều kiện in vitro; IITA bảo quản in vitro nhiều tập đoàn khoai mài, sắn, vạc; CIAT (Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp nhiệt

đới) chịu trách nhiệm duy trì nguồn gene cây sắn và INIBAP (Mạng lưới cải tạo giống chuối thế giới) có ngân hàng gene in vitro chuối tại Bỉ Ngoài ra nhiều tập đoàn cây trồng nhân giống vô tính khác cũng được bảo quản in vitro trong hệ thống ngân hàng gene của nhiều quốc gia như ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, vv ( Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997) [2]

Viện nghiên cứu Nông nghiệp quốc tế đã đưa ra bảng tổng kết kết quả bảo quản in vitro của một số loại cây trồng như sau:

Bảng tổng kết duy trì, bảo quản in vitro của một số cây trồng chính ở

Viện nghiên cứu Nông nghiệp quốc tế

Nơi bảo quản Loại cây

trồng

Tổng số mẫu tập

đoàn

Bảo quản in vitro

IITA (Nigena)

Khoai lang Sắn

(Nguồn: Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997)

3 Vật liệu, Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.1 Vật liệu nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành trên một số giống khoai tây đang được nhân và nuôi dưỡng tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Sinh lý thực vật - Khoa Nông học - Trường Đại Học Nông Nghiệp I Hà Nội Đây là những giống trong tập đoàn giống đã được xác nhận là sạch bệnh của Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống cây trồng Trung ương (Phụ lục 3)

Số TT Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của việc giảm dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh trưởng cây khoai tây in vitro

* Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau

đến khả năng làm chậm sinh trưởng cây khoai tây in vitro

Thí nghiệm tiến hành nuôi cấy cây khoai tây in vitro trên các môi trường dinh dưỡng tiêu chuẩn:

CT1: môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) (ĐC)