Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆNSINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---***---HOÀNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN

SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT

SỐ NẤM ĐẢM TRONG SINH TỔNG HỢP EPS, KHÁNG VI SINH

VẬT, TẠO LACCASE

TỪ CÁC VÙNG SINH THÁI KHÁC NHAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2015

SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -HOÀNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT

SỐ NẤM ĐẢM TRONG SINH TỔNG HỢP EPS, KHÁNG VI SINH

VẬT, TẠO LACCASE

TỪ CÁC VÙNG SINH THÁI KHÁC NHAU

Chuyên ngành: Vi Sinh Vật

Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà

Hà Nội, 2015

Luận văn Thạc sĩ sinh

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS TS ĐặngThị Cẩm Hà đã kiên trì chỉ bảo, quan tâm hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quátrình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, giúp tôi có thêm nhiều kiến thức

và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinhvật, Ban giám hiệu Trường Đại học Thái Nguyên, cùng các Thầy cô giáo đã thamgia giảng dạy trong suốt khóa học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Đinh Thị Thu Hằng cùng tập thể cán bộcủa phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường và các nghiên cứu sinh đã tậntình giúp đỡ tôi lấy mẫu và trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin cảm ơn đến PGS TS Thành Thị Thu Thủy đã giúp đỡ tôi bổtrợ thêm những kiến thức mới Cảm ơn GS Bram Brouwer và công tyBioDetection Systems B.V- BDS, Hà Lan đã thực hiện các phân tích sử dụng côngnghệ DR-CALUX để có kết quả mới trong luận văn này

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn tới chồng và con trai - là chỗ dựa tinhthần và những người thân trong gia đình là chỗ dựa vững chắc, động viên, giúp

đỡ trong suốt thời gian qua

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó !

Hà Nội, tháng 12 năm

2015Học viên caohọc

Hoàng ThịNhung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được côngbố

trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Nhung

Luận văn Thạc sĩ sinh

MỤC LỤC

i LỜICAM ĐOAN ii

iiiBẢNG CHỮ VIẾT TẮT

viii DANH MỤC CÁCHÌNH ix MỞ ĐẦU 1

1.8.1 Tính kháng u, điều trị ung thư và miễn dịch của polysaccharide 16

1.8.2 Hạ lipid máu và hạn chế đường huyết

Luận văn Thạc sĩ sinh

2.2.6 Đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng

sinh trưởng và sinh tổng hợp polysaccharide và enzyme laccase 38

2.2.6.1 Đánh giá anh hưởng của pH 382.2.6.2 Đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 38

2.2.6.3 Đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ 39

2.2.6.4 Đánh giá ảnh hưởng của nguồn carbon 39

2.2.9 Xác định thành phần của polysaccharide

41

2.2.10 Xác định hoạt tính của EPS và sinh khối nấm lên một số chức năng

của tế bào 41PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 443.1 Phân lập và phân loại các chủng nấm nghiên cứu

Luận văn Thạc sĩ sinh

3.5 Hàm lượng carbonhydrate và protein của EPS thô thu được từ FPT31 vàFMD12 70

luận 774.2 Kiến nghị

78

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic

acid) AR Androgen Receptor

CALUX Chemical Activated Luciferase Gene Expression

COSY Corelated

Spectrscopy CVD

Cardiovascular Disease D2O

Deuterium oxide

dce Dried crude exopolysaccharide

DMEM/F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12DMSO Dimethylsulfoxide

HIV Human Immunodeficiency Virus

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum

Coherence HPLC High- Performance Liquid

Chromatography IC50 Concentration

Inhibiting 50% Of Groth

IFN Interferon

IL Interleukin

IPS Intracelular

Polysaccharide ITS Internal

transcribed spacer IZD

Internal Zone Diameter

Luận văn Thạc sĩ sinh

NEAA Non-Essential Amino Acid

MAE Microwave- Assisted

Extraction MIC Minimal Inhibitory

Concentration MMs Medicinal

Mushrooms

MRSA Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus

MRSE Methicillin-Resistant Staphylococcus

epidermidis MS Mass Spectrometry

MW Molecular Weight

NK Natural killer

NMR Nuclear Magnetic Resonance

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

Nrf2 Nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2

PBS Phosphate Buffered Saline

PDA Potato Dextro Aga

Supercritical Fluid Extraction TNF

Tumor Necrosis Factor

TSB Tryptone Soya Broth

UAE Ultrasonic- Assited Extraction

VREF Vancomycinresistant Enterococcus faecium

DANH MỤC CÁC BẢNG

TrangBảng 1.1 Một số phương pháp tách chiết polysaccharide từ nấm

10Bảng 1.2 Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của

14 dạng glucose và galactose

Bảng 1.3 Một số polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư từ các nấm điển

19 hình

Bảng 1.4 Một số DR- Calux thông dụng 30

Bảng 2.1 Thành phần thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế sự sinh trưởng của 36

Bảng 3.2 Hình thái các chủng nấm và khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp

44 polysaccharide và enzyme laccase của chúng

Bảng 3.3 Khả năng ức chế sự sinh trưởng 2 chủng vi khuẩn B cereus và M

50

luteus của dịch nuôi cấy chủng FMD12

Bảng 3.4 Sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp EPS theo thời gian của FPT31

55 và FMD12

Bảng 3.5 Khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp EPS và laccase của FPT31 62

trên môi trường chứa đường và cao nấm men ở nồng độ khác nhau

Bảng 3.6 Điều kiện nuôi cấy của 2 chủng nấm FPT31 và FMD12 với một số

64 nghiên cứu quốc tế

Bảng 3.7 Hàm lượng đường và protein trong EPS thô của FPT31 và FMD12 66

Bảng 3.8 Kết quả sàng lọc hoạt tính in vitro của EPS từ 2 chủng nấm FPT31

Luận văn Thạc sĩ sinh

DANH MỤC CÁC HÌNH

TrangHình 1.1 Cơ chế tham gia miễn dịch của β- glucan từ nấm 18

Hình 1.2 Sơ lược về DR- Calux 29

Hình 3.1 Cây phát sinh chủng loại của các chủng nấm thuộc chi Ganoderma

41

trong nghiên cứuHình 3.2 Cây phát sinh chủng loại của các chủng nấm trong nghiên cứu 42

Hình 3.3 Khả năng kháng Bacillus cereus và Micrococus luteus của dịch

49 nuôi từ nấm FPT31 và FMD12Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp

53 enzyme laccase và EPS của FPT31 và FMD12Hình 3.5 Hoạt tính enzyme laccase của chủng FPT31 theo thời gian nuôi

54 cấyHình 3.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp

57 enzyme laccase và EPS của FPT31 và FMD12Hình 3.7 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh trưởng, sinh tổng

59 hợp laccase và EPS của FPT31 và FMD12Hình 3.8 Ảnh hưởng của nguồn nồng độ glucose đến khả năng sinh trưởng,

61 sinh tổng hợp laccase và EPS của FPT31 và FMD12Hình 3.9 Phổ HSQC của EPS sinh từ chủng FMD12 68

Hình 3.10 Phổ HSQC của EPS sinh từ chủng FPT31 69

MỞ ĐẦU

Giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài tuy nhiên chỉ có 14.000 loài trong đó là

nấm đảm Basidomycetes Một vài trong số những chi này đã được trồng trên quy

mô công nghiệp trên toàn thế giới bao gồm Pleurotus (nấm sò), Lentinula (nấm hương), Auricularia (mộc nhĩ), Agaricus (nấm Thiên Chúa), Flammulina (nấm kim châm), Hypsizygus (nấm ngọc châm), Ganoderma (nấm Linh Chi), Inonotus obliquus (nấm đen), Coprinus (nấm đùi gà), Agrocybe (nấm trân châu) và Volvariella (nấm rơm) Nấm được sử dụng cho rất nhiều ứng dụng trong công nghệ

sinh học đặc biệt là trong các ngành sản xuất thực phẩm, enzyme, bổ sung cho chế

độ ăn kiêng, các hợp chất có dược tính, thực phẩm bổ sung [111] và nhiều ứngdụng khác

Một thành phần quan trọng của nấm chiếm được sự quan tâm lớn của khoa

học là polysaccharide Các polysaccharide từ nấm được thu nhận từ Ganoderma, Lentinus, Oyster, Flammulina, Cordyceps, Coriolus và Pleurotus đều đã được

chứng minh là có nhiều hoạt tính sinh học bao gồm miễn dịch, kháng u, chống ungthư, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, các đặc tính liên quan đến đườnghuyết và tim mạch Ngoài ra các enzyme laccase cũng đang được chứng minh vaitrò quan trọng của nó trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe con người

Nấm được sử dụng chủ yếu thông qua ăn trực tiếp (nấm ăn) và sắc lấy nướcuống hoặc dùng hàng ngày cũng ở dạng sản phẩm uống (thực phẩm chức năng vàthuốc) được tách chiết từ các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm Cho đếnnay hầu hết các sản phẩm từ nấm đều được thu nhận trực tiếp từ quả thể của nấm

tự nhiên hay nấm trồng thông qua quá trình tách chiết phức tạp và sử dụng nướcnóng hay các dung môi hữu cơ khác nhau Lên men chìm là một giải pháp đượcđưa ra để khắc phục những nhược điểm của một số phương pháp tách chiết truyềnthống như thời gian thu nhận, hiệu suất tách chiết, khả năng kiểm soát mức độ antoàn thực phẩm trong suốt quá trình sản xuất và sự phức tạp của quá trình thunhận sản phẩm cuối cùng để tạo hàng hóa thương mại Vì vậy,

Luận văn Thạc sĩ sinh

việc lựa chọn môi trường thích hợp cho nấm sinh tổng hợp một lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học mà quan trọng là polysaccharide có ý nghĩa lớn

Các hoạt tính sinh học của polysaccharide bị ảnh hưởng bởi các đặc điểm

về cấu trúc của chúng như thành phần hóa học, khối lượng phân tử, các liên kếtglycosidic và dàng cấu hình Vì vậy, việc nghiên cứu các đặc điểm về cấu trúc củapolysaccharide có ý nghĩa trong việc xác định các hoạt tính sinh học của chúng

từ đó ứng dụng chúng vào các mục đích thích hợp

Công nghệ phân tích sàng lọc bằng CALUX đã trở thành một công cụ sinhhọc mới bắt đầu được sử dụng trong việc phát hiện các chất hay các cụm chất cótác dụng ở mức độ tế bào từ các mẫu sinh phẩm và môi trường dựa vào sự biểuhiện của gen đích gắn với promoter chỉ thị là luciferase Hiện nay, CALUX làphương pháp hữu hiệu để không chỉ xác định nồng độ dioxin hay các chất đíchđang được mong muốn tìm mà công cụ này còn được ứng dụng trong các lĩnh vựcnhư an toàn thực phẩm cho người Các lĩnh vực như nước uống, chất lượng môitrường, dược phẩm/ hóa chất, thức ăn chăn nuôi, sản phẩm tiêu dùng, các phépthử ở bệnh viện, các sản phẩm sinh học tế bào, các nguyên liệu đối chứng thamkhảo và các sản phẩm khác v.v là đối tượng mà công nghệ CALUX có thể phântích Việc đánh giá các chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ nấm lên cácchức năng của tế bào giúp định hướng một cách rõ ràng hơn về khả năng ứngdụng của chúng để tạo thuốc, thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung chongười, vật nuôi và cây trồng

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sàng lọc và các đặc tính sinh học của một số nấm đảm trong sinh tổng hợp EPS, kháng vi sinh vật, tạo laccase từ các vùng sinh thái khác nhau” đã được tiến hành Nội

dung chính của đề tài bao gồm:

- Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn nấm có khả năng sinh tổng hợpEPS và enzyme laccase từ các mẫu nấm thu thập từ Vườn Quốc gia XuânSơn- tỉnh Phú Thọ; Vườn Quốc gia Ba Vì- thành phố Hà Nội; rừngkeo tỉnh Bình

Phước; rừng bị rải chất độc hóa học là A Lưới- tỉnh Thừa Thiên Huế và Mã

Đà- tỉnh Đồng Nai;

- Phân loại 2 chủng nấm bằng phương pháp xác định trình tự vùng ITS;

- Lựa chọn môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng, sinh tổng hợp

EPS và laccase của 2 chủng nấm Ganoderma sp FMD12 và Earliella sp

Luận văn Thạc sĩ sinh

đã được mô tả Số lượng các loài nấm trên trái đất hiện nay ước tính khoảng 150

00 – 160 000 Chưa hết, có lẽ chỉ có 10% số loài có tên được khoa học biết đến[133] Một phân tích về nguồn gốc của các loài nấm mới cho khoa học đã được

mô tả và công bố trong cuốn Biên lục về Nấm xuất bản 10 năm trước cho thấykhoảng 60% các loài nấm mới được mô tả là từ các vùng nhiệt đới

Nấm được tiêu thụ trên toàn thế giới không chỉ do đặc tính cảm quan màcòn thu hút được nhiều sự quan tâm do lợi ích của chúng đối với sức khỏe conngười Hiện nay nấm được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng cũng như dược lýcủa chúng Nấm có thể được coi là một loại thực phẩm tốt cho sức khỏe vì chúng

có hàm lượng protein và hàm lượng chất xơ cao, với một lượng vitamin vàkhoáng chất đáng kể và lượng chất béo thấp Chúng là một nguồn dược phẩmlớn, mới nhưng chưa được khai thác Hơn nữa, nấm ngày càng thu hút sự quantâm bởi chúng có thể được ứng dụng để tạo thực phẩm chức năng và là nguyênliệu cho sự phát triển của các loại thuốc và các sản phẩm dinh dưỡng do để bổsung vào chứa một loạt các phân tử có hoạt tính sinh học như β- glucans,polyphenol, phytosterol, tecpen Quan trọng nhất đối với y học hiện đại là nấmdược liệu (MMs) là nguồn polysaccharide vô hạn (đặc biệt là β- glucan) vàcác phức hợp polysaccharide- protein có khả năng chống ung thư và tăng khả

năng miễn dịch Hầu hết các Basidiomycetes bậc cao đều chứa nhiều hợp chất có

hoạt tính sinh học với phân tử lượng thấp hoặc cao (triterpenes, lactones,alkaloids và các hợp chất khác) trong quả thể nấm, sợi nấm và dịch nuôi cấy [133],[128], [8], [27]

MMs được so sánh với thuốc thảo dược và được xác định có thể là các nấmlớn, hầu hết thuộc nấm đảm và một vài thuộc nhóm nấm sợi Chúng được sử dụng

ở dạng chiết xuất hoặc dạng bột để ngăn ngừa, giảm thiểu hay chữa trị bệnh, và/hoặc bổ sung cho người một chế độ ăn uống khỏe mạnh và cân bằng

Nấm dược liệu và nấm ăn có khoảng 130 chức năng để có thể sử dụng làmthuốc do có khả năng kháng ung thư, tăng khả năng miễn dịch, chống lão hóa,kháng các bệnh tim mạch, chống tăng cholesterol, kháng vi rút, kháng khuẩn,kháng ký sinh trùng, kháng nấm, khử độc, bảo vệ gan, chống các ảnh hưởng củađái đường Nấm được sử dụng vào các liệu pháp tăng miễn dịch, và đã được chứngminh là có hiệu quả như chống viêm, chống oxy hóa, kháng u, hoặc là kháng virus

và là các nhân tố kháng khuẩn

Rất nhiều, nếu không nói là tất cả, các nấm mũ bậc cao chứa các hợp chất

có hoạt tính sinh học không chỉ có trong quả thể nấm, trong sợi nấm qua nuôi cấy

mà còn có trong môi trường nuôi cấy Các polysaccharide từ nấm đang được quantâm đặc biệt bởi các đặc tính hữu ích của chúng Các dữ liệu khoa học về cácpolysaccharide từ nấm và các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp lạikhoảng 700 loài Số lượng các polysaccharide có hoạt tính sinh học hoặc các phứchợp polysaccharide- protein từ các nấm thuốc có mặt để tăng cường các phản ứngmiễn dịch bẩm sinh và phản ứng miễn dịch thu được và tạo ra hoạt tính kháng ungthư ở người và động vật Cho đến nay các cơ chế về hoạt động kháng ung thư củachúng vẫn còn chưa được hiểu một cách rõ ràng Polysaccharide và các sản phẩmchuyển hóa thứ cấp có khối lượng phân tử thấp giữ vai trò đặc biệt quan trọng dođặc tính kháng ung thư và tăng khả năng miễn dịch của chúng [134]

1.2 Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Việc sử dụng các loài nấm trong các liệu pháp điều trị đã xuất hiện ít nhất

từ thời kì đồ đá mới Trải qua hàng nghìn năm, các loài nấm được đánh giá là cógiá trị cho con người là nấm ăn và nấm dược liệu Các nghiên cứu hiện đại xácnhận và ghi nhận nhiều

Luận văn Thạc sĩ sinh

Linh chi (Ganoderma lucidum), nấm hương (Lentinus edode) Nấm cũng đóng vai

trò quan trọng trong điều trị các bệnh ảnh hưởng đến dân cư vùng nông thôn ở

các nước châu Âu Các loài quan trọng nhất là Inonotus obliquus, Fomitopsis officinalis, Piptoporus betulinus, Fomes fomentarius Những loài này được sử

dụng trong điều trị rối loạn tiêu hóa, các dạng ung thư khác nhau, hen phếquản, đổ mồ hôi đêm …Từ lâu, nấm đã được sử dụng trong điều trị bệnh ở Trung

Mỹ (đặc biệt là chi Psilocybe), ở châu Phi, Algeria và Ai Cập Vai trò đặc biệt của

nấm hương bay được tìm thấy trong Shaman giáo ở Siberia và Tây Tạng, trongPhật giáo và huyền thoại Celtic [107], [129], [133], [18]

Ngày nay, nấm dược liệu được sử dụng trong các lĩnh vực như làm thựcphẩm ăn kiêng (sản lượng nấm thế giờ là 30 tấn vào năm 2012); sản phẩm bổsung vào chế độ ăn uống (sản phẩm của lĩnh vực này phát triển mộtt cách nhanhchóng và có giá trị hơn

18 tỷ USD/ năm); một loại thuốc mới được gọi là “dược phẩm nấm”; nhân tố kiểmsoát sinh học tự nhiên trong bảo vệ thực vật với các hoạt tính kháng côn trùng,diệt nấm, diệt khuẩn, diệt cỏ, diệt tuyến trùng, kháng vi rút ở thực vật Trong mỹphẩm, các hợp chất khác của MMs, bao gồm polysaccharide như β-glucans,glucuronoxylomannan (GXM ), sacchachitin, tyrosinase và các enzyme khác đượccác công ty mỹ phẩm sử dụng do khả năng tạo màng của chúng, kích hoạt cácyếu tố tăng trưởng biểu bì, chống oxy hóa, chống dị ứng, kháng khuẩn, va hoạttính kháng viêm, kích thích hoạt động của collagen, ức chế bạch biến tự miễn dịch

và điều trị mụn trứng cá [133], [134], [54]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt

Nam

Từ xưa, người Việt Nam đã sử dụng nấm Linh chi dùng làm dược liệu Từthời Lê Quý Đôn (1726-1784), nấm Linh chi được đánh giá rất cao Các chế phẩm

từ Linh chi (Ganoderma) được sử dụng để điều trị nhiều bệnh như: gan, tiết niệu,

tim mạch, ung thư, AIDS, suy nhược cơ thể, tiểu đường, giảm đau, giải độctrong cơ thể, đào thải chất phóng xạ, giảm cholesterol trong máu, mất ngủ, loét

dạ dày, làm tăng hệ thống miễn nhiễm của cơ thể, tê thấp v.v Tuy nhiên nhữngnghiên cứu về nấm dược liệu và nấm ăn cũng chủ yếu dừng lại ở thống kê, đánhgiá và xác định sự đa dạng và giá trị tài nguyên của loại nấm này ở các khu vựckhác nhau như Thừa Thiên Huế [1], Vườn Quôc gia Bù Gia Mập [6], vùng Thanh-Nghệ Tĩnh [5], tỉnh Tây Ninh [4]

Một nghiên cứu của Lê Xuân Thám và đtg (2011) đã xác định được thành

phần hóa học của mẫu nấm Linh Chi đen Amauroderma subresinosum Murr phân

lập từ Vườn Quốc Gia Cát Tiên bằng kỹ thuật sắc ký khí (GC) Nghiên cứu đã xácđịnh được 14 axit béo, trong đó axit béo chưa bão hòa 11-octadecaenomic cónồng độ cao nhất (khoảng

51,01% tổng lượng axit béo đã được xác định) Ngoài ra, các axit béo làlignoceric, 14- methylpentadecaenoic, 8,11-octadecenoic cũng đã được xác định

sự hình thành khối u tế bào ung thư gan (Hep-G2) thể hiện bằng việc giảm kíchthước khối u xuống

24,4% và mật độ hình thành khối u 61,5% so với đối chứng âm

[2]

Tuy nhiên, những nghiên cứu được tổng hợp ở trên mới chỉ tập trung vào

chi Ganoderma và ứng dụng của chúng trong y học Trong khuôn khổ luận văn

thạc sỹ này học viên cao học không chỉ nghiên cứu, khảo sát về khả năng

Luận văn Thạc sĩ sinh

sinh tổng hợp polysacchride của một số Ganoderma mà còn tập trung nghiên cứu

khả năng sinh trưởng,

sinh tổng hợp expolysaccharide và enyme laccase của dịch lên men từ nấm phânlập mới từ rừng ở các vùng khí hậu khác nhau Đồng thời đánh giá khả năngkháng một số vi sinh vật kiểm định; xác định thành phần và cấu trúc củapolysaccharide trong dịch nuôi cấy của 2 chủng nấm lựa chọn; đánh giá một số

hoạt tính in vitro lên các chức năng của tế bào Từ đó, có hướng ứng dụng thích

hợp cho mỗi chủng nấm, đặc biệt trong lĩnh vực thực phẩm bố sung cho người vàgia súc, gia cầm

1.3 Polysaccharide từ nấm- nguồn carbonhydrate có hoạt tính sinh học

tự nhiên

Trong số các hoạt chất sinh học có trong nấm, polysaccharides chiếmđược sự quan tâm hơn cả chủ yếu là do đặc tính tuyệt vời của trong miễn dịch,các chất chống oxy hóa, chống viêm, hoặc kháng u Polysaccharide là mộtpolymer mà trong đó monomer là các phân tử đường đơn Một vàipolysaccharide đã được phân lập từ các nấm nguyên liệu Khi tất cả cácmonosaccharide tạo thành carbohydrate cùng loại thì các polymer này được gọi

là homopolysaccharide hoặc homoglycan Tuy nhiên, nếu có nhiều hơn một loạimonosaccharide có mặt trong cấu trúc, chúng được gọi là heteropolysaccharidehoặc heteroglycan Như vậy, các heteropolysaccharide được hình thành bởi cácloại đường khác nhau [22], [120] và phức hợp polysaccharide-protein [11] cũng cóthể được tìm thấy trong một số nấm nhất định

Các đặc điểm về cấu trúc như tính chất của monomer, các loại hình liênkết và vị trí liên kết, cũng như số lượng và vị trí của các nhánh có trong chuỗipolymer sẽ ảnh hưởng mạnh đến cấu trúc không gian 3 chiều cùng với kích thướcphân tử từ đó sẽ xác định các tính chất và hoạt tính của polysaccharide [16].Tương tự, các tính chất vật lý như khả năng hòa tan, độ nhớt, độ đông đặc, có thểảnh hưởng đến các hoạt tính sinh học vì chúng có thể làm thay đổi tính sẵn sàngsinh học của polysaccharide [95] Do đó, việc xác định một cách rõ ràng cáccấu trúc và tính chất vật lý phân tử của các polysaccharides có trong nấm là

vô cùng quan trọng để dự đoán các hoạt tính sinh học của chúng

Luận văn Thạc sĩ sinh

1.4 Tách chiết và xác định các đặc tính của polysacchride từ nấm

Việc tách chiết polysaccharide liên quan đến việc phân tách cáccarbohydrate từ nấm nguyên liệu Các phương pháp tách chiết thông thườngthường khuấy mẫu vào dung môi [27] Các dung dịch thường được sử dụng là nước

ở nhiệt độ phòng, nước sôi, thậm chí là dung dịch NaOH, KOH (2%) Phần còn lạiđược tách ra bằng cách ly tâm còn polysaccharides được kết tủa với ethanol theo

tỷ lệ 2: 1 ( v / v )

Trong một số trường hợp, nước hoặc dung môi cơ bản không đủ mạnh đểtách các polysaccharide không tan thì giải pháp có thể sử dụng các dung dịch cótính axit mang tính khả thi cao Một số axit, bao gồm acetic, formic, clohydric,axit phosphoric, đã được thử nghiệm trong quá trình phân tách β- (1-3)-glucanskhông tan [94]

Các kỹ thuật tách chiết bằng dung môi thường sử dụng một lượng lớn cácdung môi hữu cơ độc hại, thường là mất nhiều thời gian, và có sản lượng thu nhậnthấp và độ chọn lọc cũng thấp Thêm vào đó, với các phương pháp tách chiết này,các chất cần tách chiết có thể tiếp xúc với nhiệt độ quá cao,cần ánh sáng và oxy,đòi hỏi phải có thời gian tách chiết dài, dẫn đến sự hoạt động của các enzymephân hủy glucan Trong thời gian tách chiết, một số hợp chất có hoạt tính sinhhọc có thể dễ dàng bị mất do sự ion hóa, thủy phân và oxy hóa Do đó, các kỹthuật phức tạp hơn như tách chiết bằng áp suất chất lỏng (PLE), tách chiết có siêu

âm hỗ trợ hoặc dùng vi sóng có thể là một giải pháp tốt để phân tách cácpolysaccharides Bảng1.1 tổng hợp các kỹ thuật chính và các điều kiện cần thiếtcho việc chiết xuất các polysaccharide từ nấm

Bảng 1.1 Một số phương pháp tách chiết polysaccharide từ nấm

10.1 MPa; 28°C; 70 phút - Thân thiện với môi trường;

- Lượng dung môi sử dụng ít, thường là nước;

- thời gian thực hiện ngắn;

- Là phương pháp tự động và sử dụng oxy, ánh sáng từ môi trường

Lentinus edodes

[112]

Chiết xuất dòng

siêu tới hạn (SFE)

35 MPa; tốc độ dòng 10kg/h CO2; 25°C ; 4 giờ - Sử dụng CO2 như các dung môi

sự phân hủy các thành phần có hoạttính sinh học;

Ganoderma lucidum

- Lượng dung môi sử dụng ít;

- Quá trình chuẩn bị mẫu nhanh chóng

Agaricus blazei

[29], [21]

Luận văn Thạc sĩ sinh

Theo Lindequist và đtg (2005) thì 80- 85% các sản phẩm từ nấm dượcliệu được thu nhận từ quả thể và chỉ 15- 20% được thu nhận từ sợi nấm và dịchnuôi cấy thông qua lên men chìm [121] Tuy nhiên, lên men chìm đã đượcchứng minh là có hiệu quả và khả năng kiểm soát tốt hơn cho quá trình sinh

tổng tổng hợp các hợp chất có dược tính từ Basidomysetes [33], [12], [8] Bước

đầu tiên để thành công trong lên men chìm là chọn lọc môi trường thích hợpcho mỗi chủng nấm để sinh tổng hợp một lượng lớn các chế phẩm sinh học.Ngoài ra, quá trình thu nhận exopolysaccharide từ lên men lỏng cũng có nhiều

ưu điểm hơn so với thu nhận từ quả thể Thời gian lên men chỉ khoảng 10-15ngày so với nuôi cấy để thu quả thể có thể kéo dài đến 3 tháng [66] Dịch lênmen chỉ qua bước kết tủa với ethanol ở 4oC trong khi một số polysaccharideđược thu nhận từ quả thể nấm tốn nhiều thời gian, qua nhiều bước phức tạp đểtách chiết và tách phân đoạn như tủa đường trong ethanol, lặp lại các bướctách chiết bằng nước nóng và dung dịch ammonium oxalate của NaOH, sau đócác polysaccharide đã được tách chiết lại trải qua nhiều bước làm sạch để sửdụng cho các nghiên cứu tiếp theo Hiệu suất tách chiết từ dịch lên men cũngcao hơn so với các phương pháp tách chiết từ quả thể [56] Với những ưuđiểm này, lên men chìm để thu một lượng lớn các hợp chất có hoạt tínhsinh học đang lựa chọn và nghiên cứu nhằm tìm ra phương pháp khả thi nhất

1.5 Đặc điểm cấu trúc của polysaccharide phân lập từ nấm

Các phân tích về cấu trúc của các polysaccharide giúp xác định các đặcđiểm phân tử như khối lượng phân tử, thành phần chuỗi, cấu hình và các dạngđồng phân, trình tự các monosaccharide, sự có mặt và vị trí các nhánh, sự cómặt của các liên kết interglycosidic Ngày nay, có một loạt các kỹ thuật đặctrưng để có được các thông tin chi tiết về cấu trúc của các polysaccharide

Kích thước phân tử thường được xác định bằng phương pháp sắc ký loạitrừ kích thước (size-exclusion chromatography- SEC) bằng cách so sánh với cácvật liệu tiêu chuẩn

Thành phần monosaccharide có thể được nghiên cứu bằng cách thủyphân các polysaccharide trong axit và sau đó phân tích các loại đường tạothành bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high- performance liquid HPLC ) bằng sắc ký khí ( gas- chromatography- GC ) [14].

chromatography-Sự có mặt và vị trí xuất hiện của các nhánh có thể được xác định thôngqua sự hình thành các dẫn xuất như methyl acetate alditol, trimetylsilyl, acetyl,trifluoroacetyl, methaneboronate, acetal hoặc sự kết hợp của chúng và cácphân tích tiếp theo có thể làm sáng tỏ bằng sắc ký khí khối phổ (GC/MS) [13]

MS là một kỹ thuật vô cùng hữu ích vì nó chỉ đòi hỏi một lượng mẫu tươngđối thấp (picograms hoặc ít hơn) và không cần polysaccharide quá tinh khiết.Mặc dù các phân tích về cấu trúc của polysaccharide bằng MS có thể đượcthực hiện đối với nhiều olygosaccharides không dẫn xuất và các phức glyconhưng các polysaccharides được O- methyl hóa vẫn được sử dụng để tăng tính

ổn định của các ion và độ nhạy của MS GC/MS cung cấp thông tin về vị trí củaliên kết glycosid, sự có mặt của các nhánh và thành phần monosaccharide trongcác carbohydrate phức tạp

Polysaccharide có mặt trong tự nhiên ở cả 2 dạng cấu hình α và β; tuynhiên các tính chất vật lý về cơ bản khác nhau phụ thuộc vào loại liên kết Do

đó, việc làm sáng rõ các cấu hình liên kết là một vấn đề quan trọng trongnghiên cứu cấu trúc của polysaccharide Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là mộtcông cụ ưu việt để có được các thông tin về thành phần các monosaccharide

và cấu hình anomeric, các liên kết trong chuỗi và xa hơn nữa là các kết quảphân tích sự methyl hóa [72]

1.6 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance- NMR)

trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide

Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân đã được sử dụng rộng rãi trongphân tích cấu trúc và cấu hình không gian của các polysaccharide trong dungdịch Giá trị độ dịch chuyển hóa học và các hằng số tương tác thu được từ phổNMR sẽ cung cấp các thông tin về loại đường và cấu hình anomeric

Phổ 1H-NMR của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết củamẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid).Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng protonanomer thông qua các tín hiệu trong khoảng 4,3 đến 5,8 ppm Nếu các cấuhình là α thì sự thay đổi hóa

Luận văn Thạc sĩ sinh

học là lớn hơn so với β Khi tín hiệu xuất hiện ở vùng 5,0- 5,8 ppm, cấu hìnhanomer là α và nếu xuất hiện ở vùng 4,3- 5,0 ppm, thì đó là anomer β Như vậydựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của các cộng hưởng anomer cũng có thểđánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide Về mặt này kết quả phân tíchhoá học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H-NMR Nhìn chung, kết quảtính tích phân NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hoá học Nhiềunhóm thế có thể được xác định hoặc sự có mặt của chúng được dự đoán dựavào phổ 1D 1H-NMR Tiếp theo, số lượng chính xác của các monosaccharide cóthể được khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng anomer của phổ 2chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC

Độ dịch chuyển hoá học của proton anomer (4,4 –5,8 ppm) được tách biệtmột cách không hoàn toàn rõ rệt khỏi các cộng hưởng 1H ở các vị trí khác (3,2–4,5 ppm) trong khi độ dịch chuyển 13C anomer (95 – 110 ppm) lại tách biệt rất

rõ, không hề trùng chập với các cộng hưởng 13C ở các vị trí còn lại (60 – 85ppm)

Dạng vòng (hexose hay furanose) và các cấu hình anomer được suy ra từcác thông tin kết hợp có giá trị từ độ dịch chuyển hoá học 1H (H cộng hưởnggiữa 5,0 và

5,8 ppm trong khi H cộng hưởng trong khoảng 4,4 và 5,2 ppm) với hằng sốtương

tác vô hướng của C-1, H-1 (1JC-1, H-1 165-175 Hz đối với  trong khi 1JC-1, H-1158-165

Hz đối với ) Tương tác dị hạt nhân liên kết 1JC-1,H-1 có thể thu được từ phổ1H – 13C HSQC không khử tương tác

Ở phổ 13C-NMR, các carbon trong vòng được tìm thấy trong khoảng50- 85 ppm trong đó các carbon gắn với nitơ xuất hiện ở trong khoảng 65- 75ppm Các carbon tham gia vào quá trình glycosyl hóa dịch chuyển xuống mộtkhoảng 5-10 ppm Các nguyên tử C6 không thế được tìm thấy quanh vùng 60-

63 ppm và các carbon C6 liên kết với các đường dư khác xuất hiện quanh vùng

Luận văn Thạc sĩ sinh

Bảng 1.2 Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của

dạng glucose và galactose

5,160,3599,13,1

4,680,26103,52,4H-2

72,51,0

3,310,0574,11,1

3,890,1268,91,3

3,530,1771,72,1H-3

73,80,4 3,550,0776,31,4 3,930,1670,21,7 3,800,1673,51,7H-4

70,70,6

3,510,1370,41,0

4,120,1968,61,9

4,080,1867,92,0H-5

72,90,5

3,550,0976,01,3

4,110,2971,02,0

3,740,2075,51,1H-6a

61,40,4

3,770,0561,51,0

3,730,0761,70,8

3,740,0561,80,7

Các vị trí được thế của monosaccharide được gọi là vị trí aglycon tươngứng với các nguyên tử C ở các vị trí không phải anomer của liên kết glycoside

Từ dữ liệu NMR, vị trí liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> + 3ppm)

về độ dịch chuyển hoá học của 13 C so với độ dịch chuyển hoá học của cácmonomer không thế Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống vớinhững phân tích khi methyl hoá Trật tự các đơn phân trong mạch củapolysaccaride được xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiệnthông tin cấu trúc chính cần xác định thu được từ hai loại phổ HMBC vàNOESY

Kỹ thuật NMR hai chiều (2D) bao gồm phổ tương quan (COSY), phổtăng cường định kỳ Overhauser (ROESY), hiệu ứng quang phổ hạt nhânOverhauser (NOESY) và sự kết hợp lượng tử đa dị nhân (HMQC) làm sáng tỏcấu trúc của polysaccharide gồm thành phần monosaccharide, liên kếtglycosidic

1.7 Tính chất vật lý của polysaccharide

Luận văn Thạc sĩ sinh

hết các nghiên cứu về tính chất vật lý của các polysaccharide đã được thựchiện đối với các β - glucans từ ngũ cốc, tuy nhiên ngày nay cácpolysaccharide phân lập từ nấm đang chiếm được tầm quan trọng ngày cànglớn với số lượng các nghiên cứu tăng đáng kể

1.7.1 Khối lượng phân tử của

polysaccharide

Khối lượng phân tử (MWS) của các polysaccharide khác nhau tùy thuộcvào phương pháp xác định Các β- glucan tan trong nước từ nấm có khối lượngphân tử trong khoảng 105-106 Da Phương pháp sắc ký kích thước loại trừ kếthợp với tán xạ ánh sáng laser đa góc (SEC-LLS) thường được sử dụng để đo kíchthước các phân tử Theo đó, khối lượng phân tử của polysaccharides từ

Auricularia auricula-judae là

2,15- 106 Dal [143], các carbohydrate từ Ganoderma lucidum là 1,24- 105 Dal [132] và từ Pleurotus tuber-regium là 3.14- 105 Dal [124] Các kỹ thuật tương

tự được kết hợp với các kỹ thuật dò khác nhau, chẳng hạn như chỉ số khúc xạ

(HPLC - RI , đã chứng minh rằng các polysaccharides từ Calocybe indica có

khối lượng phân tử là

2-105 Dal [80] , từ bào tử của Ganoderma lucidum là 1,26- 2-105 Dal [9], và một carbohydrate phân lập từ quả thể của Pleurotus Sajor - caju có khối lượng

3) hoặc β- (1 → 4) có xu hướng tổng hợp các liên kết trong chuỗi thông qua cácliên kết hydro mạnh mẽ do đó có thể góp phần làm tăng độ cứng của các phân

tử trong dung dịch và độ hòa tan thấp hơn Sự kết hợp của các liên kết tiếpgiáp β- (1 → 4) hay β- (1 → 3) tạo nên các liên kết dài giống như cellulose vàkết quả là các polysaccharide không tan Curdlan và các liên kết β- (1 → 3)glucan khác thường không tan trong nước, rượu, và hầu hết các dung môi

(1 → 6) glucose - thường rất cứng, hình que, có hình

Luận văn Thạc sĩ sinh

xoắn ba trong dung dịch nước Ba sợi xoắn được giữ với nhau và ổn định bằngcác liên kết hydro mạnh Một số điều kiện có thể phá vỡ các chuỗi xoắn ba,chẳng hạn như nồng độ DMSO ≥ 87%, nhiệt độ ≥ 135°C, hoặc bổ sung natrihydroxide > 0,2 mol /L để xoắn ba phân ly gần như hoàn toàn thành các chuỗiđơn và làm tăng khả năng tăng khả năng hòa tan

Sự hiện diện của các mối liên kết khác nhau trong cấu trúc phá vỡ tínhcân đối của các trình tự và làm cho các phân tử hòa tan và linh hoạt hơn Cáckhoảng cách bất thường trong chuỗi β– glucan chịu trách nhiệm tạo nên hìnhdạng tổng thể cho polysaccharide và do đó các chuỗi không thể sắp xếp chặtchẽ trên các vùng mở rộng, tăng độ tan trong nước của các polysaccharide Tuynhiên, sự hiện diện của một mô hình lặp đi lặp lại xen kẽ các mối liên kết như

ba phần cellotriosyl liên tiếp có thể tạo thành hình dạng ổn đinh Phần đã đượcsắp này có thể áp đặt một số cấu hình không đều đặn lên chuỗi β – glucan và

do đó hình thành mức độ tổ chức cao hơn của các polyme trong dung dịch dẫnđến khả năng hòa tan thấp [122]

Sự xuất hiện của các monosaccharide khác nhau trong chuỗi có thể điềuchỉnh độ hòa tan Sự hiện diện của monosaccharide khác nhau như nhóm thếarabinosyl, xuất hiện để ngăn chặn sự kết hợp này và làm cứng các phân tử lạibằng cách duy trì khung xylan trong một cấu hình mở rộng hơn [95]

1.8 Vai trò của polysaccharide từ nấm đối với

Nhiều polysaccharide có hoạt tính kháng u đã được tìm thấy trong quảthể, trong khuẩn ty hoặc trong dịch lên men của một số nấm đảm

Basidiomycetes Những chất này tuy khác nhau về thành phần hóa học, cấu

trúc không gian và hoạt tính kháng u nhưng phần lớn thuộc nhóm glucan Hoạt tính kháng u ở nấm phần lớn do các polysaccharide có đơn phân

b-1,3/1,6-tử là glucose và được gọi chung là glucan Trong các phân b-1,3/1,6-tử glucan có tươngđối nhiều kiểu liên kết, và phần nhiều trong số đó là heteroglycan Các phân tửglucan này tập trung chủ yếu ở vách tế bào nấm cùng với một sốpolysaccharide khác như chitin, cellulose, galactomannan-protein,glucuromannan-protein v.v.Tuy nhiên, chitin, chitosan hay cellulose không cóhoạt tính kháng u

Các cơ chế hoạt động kháng u của các polysaccharide không hoàn toàn rõràng; người ta tin rằng hoạt động gây nguyên phân của các polysaccharide từnấm gồm nhiều phản ứng miễn dịch thông qua việc kích hoạt các tế bào miễn dịch cụ thể để tăng cường một loạt các chức năng của tế bào Chúng bao gồm việc kích hoạt các đại thực bào, tế bào lympho T và các tế bào diệt tự nhiên (NK)- là các tế bào có khả năng tiết chất trung gian gây kích thích và các cytokine như các yếu tố hoại tử khối u α (TNF - α), interferon γ (IFN - γ), hoặc 1β interleukin (IL - 1β) Các polysaccharide cũng có thể ức chế các

protein E - selectin và sự biểu hiện gen, ức chế tế bào ung thư bám dính tế bào (tumoral cell-to-cell adhesion) [148] Các cơ chế khác bao gồm các hiệu ứng chống tăng sinh (antiproliferative), sự cảm ứng cơ chế gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis), và sự khác biệt của các tế bào ung thư [130]

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng các polysaccharide được phân lập

từ các chi nấm khác nhau đa số có khả năng cung cấp các hoạt tính khángung [51], [66], [71] [130] [148] Một số nghiên cứu lâm sàng đã làm rõ được

tác dụng ức chế ung thư của Lentinus edodes [149] [48], Grifola frondosa [15], Schizophyllum commune [15] [48], Ganoderma lucidum [69] [78], Trametes versicolor [48], Inonotus obliquus [91], Phellinus linteus [50], Flammulina velutipes [82], Hypsizygus marmoreus [83] Ophicordyceps (Cordyceps), [49] Agaricus brasiliensis [136] và Tremella mesenterica [71] [64] Bảng 1.3 trình

bày một số polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư từ nấm điển hình

Luận văn Thạc sĩ sinh

Hình 1.1 Cơ chế tham gia miễn dịch của β- glucan từ nấm

Các hợp chất miễn dịch được tách từ hơn 30 loài nấm thuốc đã chứngminh hoạt động kháng u trong điều trị ở động vật Tuy nhiên, chỉ một số ít đãđược thử nghiệm tiềm năng chống ung thư ở người Một vài nghiên cứu trong

số đó đã được tiến hành mà đối tượng là β-d-glucans hoặc phức hợp β-d-glucansliên kết với protein Hơn nữa, các thử nghiệm cũng cho thấy hoạt tính miễndịch của phức hợp β-d- glucan- protein cao hơn so với glucan tự do Hình 1.1minh họa cơ chế miễn dịch đơn giản của β- glucan [8]

Các hoạt chất miễn dịch hoạt động chủ yếu bằng cách cải thiện hệ thốngmiễn dịch của vật chủ Như đã đề cập ở phần trên, quá trình này bao gồm kíchhoạt các tế bào đuôi gai, tế bào tiêu diệt tự nhiên (NK), tế bào T, đại thực bào,

và sinh ra các cytokine Một số sản phẩm của nấm thuốc, chủ yếu là cácpolysaccharide (đặc biệt là β-glucans), được phát triển cho mục đích lâm sàng

và thương mại như Krestin (PSK) và PSP (Polysaccharide peptide) từ T versicolor; Lentinan được phân lập từ L edodes; Schizopyllan (Sonifilan, Sizofiran, hoặc SPG) từ S commune; Befungin từ I.

obliquus; D-fraction, từ Gr frondosa; GLPS polysaccharide phần từ Ga

lucidum;.

hexose hoạt động tương quan hợp chất (AHCC); và nhiều hoạt chất khác

Bảng 1.3 Một số polysaccharide có hoạt tính kháng

ung thư từ các loài nấm điển

hình

Loài Trị u hay ung

thư

Nguồngốcphân

Cấu trúc hóa học Tên gọi

C versicolor Ung thư hệ tiêu

hóa, phổi và vú Sợi nấm

Chuỗi β glucan

-1,3-có nhánh β-1,4 và

PSK và PSP

L edodes Ung thư dạ dày Quả thể β1,3/1,6-glucan Lentinan

S commune Ung thư cổ tử

cung Dịch lên men

β1,3/1,6-glucan Schizophylla

n

G lucidum Chữa ung thư Quả thể,Sợi nấm

β-glucan, heteropolysaccarit

glycoprotein

GanoderansProtein LZ8GLP

A blazei Chữa ung thư Quả thể,

1.8.2 Hạ lipid máu và hạ đường huyết

Hầu hết các polysaccharide có hoạt tính sinh học từ nấm có thể ví như

là chất xơ, vì vậy chúng không được tiêu hóa trong hệ tiêu hóa ở người[40] Theo các nghiên cứu trên một vài động vật và ở người, glucan từ các nấm

L endodes, G lucidum, S commune, P ostreatus, G frondosa, A blazei, C sinensis và C miltaris có khả năng làm giảm lượng đường trong máu và

cholesterol trong huyết thanh [ 65], [70] Tác dụng hạ đường huyết có đượcthông qua việc gắn các polysaccharide khó tiêu hóa vào biểu mô ruột làm giảmtốc độ hấp thu glucose trong khi hiệu ứng hypolipidemic là do sự gián đoạntuần hoàn ruột gan của các axit mật [40], [65]

Bệnh tim mạch (Cardiovascular Disease- CVD) là một trong nhữngnguyên nhân chính gây tử vong ở các nước đang phát triển Bệnh tim mạch donhiều nguyên nhân gây ra và bệnh sinh của các hình thức động mạch của bệnhtim mạch có liên quan đến xơ vữa động mạch Một số dấu hiệu sinh học có

Luận văn Thạc sĩ sinh

nguy cơ tiềm ẩn liên quan

đến bệnh tim mạch đã được xác định, như sự chuyển hóa lipid và lipoprotein (mật

độ lipoprotein thấp [LDL] và mật độ lipoprotein cao [HDL], hàm lượng

cholesterol và triacylglycerol), chức năng đông máu, tổn thương oxy hóa, chuyển hóa homocysteine, huyết áp [89] Polysaccharides từ nấm đã được chứng minh

có khả năng bảo vệ và chống lại bệnh tim mạch và các biến chứng của chúng Ởđường ruột, β-glucans làm giảm sự hấp thu cholesterol và các chuỗi axit béo dài [30] Chuột đực được cho ăn 2% cholesterol và 1% polysaccharide loại β-glucan

ngoại bào tách chiết từ Volvariella volvacea (nấm rơm) cho thấy cholesterol

tổng số trong huyết thanh giảm đáng kể, LDL-cholesterol trong gan và

cholesterol toàn phần cũng giảm ở các mức độ khác nhau Trong khi đó không

có thay đổi nhiều triacylglycerol trong huyết thanh; HDL- cholesterol và lipid

gan tổng số [23] Tương tự như vậy, các polysaccharide từ Agaricus auricula

có hiệu quả đáng kể làm giảm cholesterol và HDL cholesterol tăng trong chuột được nuôi với chế độ ăn giàu cholesterol [19] Các phân đoạn

polysaccharide từ nấm Pleurotus nebrodensis đã được chứng minh có khả năng

làm giảm huyết áp tâm thu ở những chuột mắc chứng tăng huyết áp tự nhiên

[90] Ảnh hưởng của dịch chiết từ Cordyceps sinensis trong nước nóng được

đánh giá ở chuột với chế độ ăn uống không chứa cholesterol và chuột với chế độ

ăn giàu cholesterol Lượng cholesterol huyết thanh tổng của tất cả các nhóm chuột giảm sau khi có sự tác động của polysaccharide Trong số chuột được nuôivới chế độ ăn giàu cholesterol, mức HDL cholesterol tăng nhưng giảm mật độ lipoprotein xuống rất thấp (VLDL) và giảm mức cholesterol LDL [62]

Ngoài ra, các polysaccharide có hoạt tính sinh học từ nấm cũng có tácdụng hạ đường huyết thông qua sự điều tiết quá trình chuyển hóacarbonhydrat và tổng hợp insulin Các polysaccharide đường uống có vai tròrất quan trọng vì chúng có thể được sử dụng làm thực phẩm chức năng chongười bệnh tiểu đường

1.8.3 Tính chống oxy hóa của polysaccharide từ nấm

Các polysaccharide được chiết xuất từ các nấm G lucidum, T versicolor, L endodes, P linteus và Agaricus có khả năng khử và đặc tính tạo

phức và có thể ức chế sự oxy hóa lipid hoặc stress oxy hóa- khử Những tácdụng trên có liên quan đến

Luận văn Thạc sĩ sinh

khử và ức chế peroxy hóa lipid [47], [127] Saltarelli và đtg (2009) đã nhận

thấy trong số các polysaccharide khác nhau được chiết từ sợi nấm của G lucidum thì các polysaccharide khối lượng phân tử thấp có hoạt tính chống oxy

hóa cao nhất, dựa vào hoạt tính tạo phức với Fe2+, xác định lipoxygenase vàgốc tự do1,1- diphenyl- dipicrylhydrazyl (DPPH) trong khi đó cácpolysaccharide nội bào không có tác dụng chống oxy hóa [110] Tương tự, các

nghiên cứu in vitro đã chỉ ra rằng peptidedoglucan từ G lucidum có tác dụng

bảo vệ ty thể, lưới nội chất và các tiên mao của các đại thực bào khỏi các tácdụng tie cực từ hóa chất và các biến cố [146] Thêm nữa, dịch chiết trong

methanol của các glucan và proteoglucan từ G lucidum và G tsugae cũng thể

hiện hoạt tính chống oxy hóa bằng cách thu các yếu tố của phản ứng oxy hóa[65]

Một cơ chế chống oxy hóa khác là khả năng của các polysaccharidetrong việc hạn chế quá trình sản xuất các gốc oxy tự do từ nấm và hoạt độngcủa các tế bào đơn nhân ngoại vi ở các đại thực bào có gai, điều này liên quanđến quá trình suy hô hấp và lão hóa [142], [146], hoặc làm tăng hoạt tính củacác enzyme chống oxy hóa trong huyết thanh [141] Các dịch chiết trong

methanol từ sợi nấm của các loài G frondosa, M esculenta và Termitomyces albuminosus cũng thể hiện các hoạt tính chống oxy hóa nhưng chủ yếu liên

quan đến sự có mặt của các hợp chất phenolic trong dịch chiết [84] Cácpolysaccharide khác từ nấm bao gồm các polysaccharide được chiết bằng nước

từ quả thể của G lucidum, Auricularia auricula và Cordyceps militaris cho

thấy có các đặc tính thu dọn, tạo phức và tính khử do đó làm tăng hiệu quảchống oxy hóa tổng số [22], [75], [140], [92] Không chỉ các dịch chiết từ quảthể, một số nghiên cứu đã tìm thấy hoạt tính chống oxy hóa của dịch nuôi cấy

và sinh khối nấm thu được trong điều kiện lên men lỏng Trong môi trường nuôi

cấy Hericium enrinaceum có bổ sung các nguồn selen (sodium selenite và

selol), một exopolysaccharide chứa selen được sinh tổng hợp

năng chống oxy hóa tuyệt vời, dựa trên sự khử và ức chế quá trình peroxy hóalipid và thu dọn các gốc tự do DPPH [79] Hai mươi lăm chủng nấm thuộc các

chi Agaricus, Lentinus, Schizophyllium, Pleurotus sinh tổng hợp các hợp chất

có hoạt tính chống oxy hóa với hoạt tính thu được từ 753 đến 9.384 %quercetin/l/ngày theo một công bố của Umeo và đtg [202]

1.8.4 Prebiotic từ

nấm

Prebiotic là các chất tiền trợ sinh học tạo ra thức ăn và môi trườngthuận lợi cho vi khuẩn có lợi (probiotic) phát triển trong đường ruột Các chấttiền trợ sinh học này góp phần duy trì sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường ruột,kích thích miễn dịch đường tiêu hóa, giảm khả năng ung thư ruột kết, giảmcholesterol trong máu Các tác dụng prebiotic từ các polysaccharide từ nấmcũng đã được mô tả trong nhiều nghiên cứu Vì các enzyme tiêu hóa của ngườikhông thể thủy phân liên kết β-glucosid nên nhiều polysaccharide nấm có thểhoạt động như là các nguồn prebiotic [8] Synytsya và đtg (2009) đã đánh giá

hiệu quả prebiotic của các glucan được phân lập từ quả thể của P ostreatus

và P eryngii trên một vài chủng probiotic như Lactobaciluss, Bifidibacterium và Enterococusii [123] Cả 2 dạng glucan tan trong nước β-

1,3/β-1,6- glucan và gtan trong kiềm α-1,3-glucan của các loài nấm nói trênđều được đánh giá là có khả năng kích thích sự tăng trưởng của các vi khuẩn

probiotic, đặc biệt là các glucan từ P eryngii Trong một nghiên cứu khác, các β- glucan từ màng cứng của P tuber-regium đã được đánh giá hiệu quả của chúng đối với Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, và Bifidobacterium adolescentis trong môi trường dịch thể, sử dụng inulin như là

chất kiểm soát prebiotic [150] Người ta nhận thấy rằng sau 24 giờ lên men,quần xã vi khuẩn có ích có bổ sung glucan từ nấm có mức tăng trưởng gấp 3-4lần tương tự như sự tăng trưởng khi bổ sung inulin [150] Gần đây, Chou và đtg(2013) đã chỉ ra rằng các polysaccharide từ các phần bỏ đi của nấm như

cuống của L.endodes, gốc của P.eryngii, và gốc của F.velutipes có thể làm tăng tỷ lệ sống sót của Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus casei , và B longum trong sữa chua [25] Các tác giả cũng quan sát thấy tác dụng hiệp

đồng của các polysaccharide với các peptide và amino acid có trong môi trườngsữa chua để duy trì số lượng vi khuẩn có lợi trên 107 CFU/ml ở điều kiệnlạnh Họ cũng phát hiện ra rằng các