Nghiên cứu hiện tượng biến dị trong nuôi cấy in vitro cây chuối phục vụ công tác giống trên địa bàn tỉnh nghệ an

Luận văn, thạc sỹ, tiến sĩ, cao học, kinh tế, nông nghiệp

1 Mở đầu

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây chuối (Musa sp) là một trong 3 đối tượng cây ăn quả chính (chuối, dứa và cây có múi) được sản xuất với quy mô rất lớn trên toàn thế giới Theo thống kê của FAO (2003)[35], sản lượng chuối trên thế giới năm 2002 khoảng

80 triệu tấn và tăng liên tục từ 1980 tới nay với tốc độ 2,5%/năm, đạt tỷ lệ xuất khẩu cao nhất trong các loại quả (9 triệu tấn/năm)

Chuối là loại quả có giá trị dinh dưỡng cao và còn là lương thực, thực phẩm rất quan trọng tại một số nước ở châu á và châu Phi Theo Anon (1963), thành phần dinh dưỡng của quả chuối như sau: nước (75,7%); gluxit (22,2%); protein (1,1%); lipid (0,2%); tro (3,3%) và một số vitamin rất cần thiết cho cơ thể như: A, B, C, thiamin, riboflavin, niaxin, (Dẫn theo Nguyễn Khắc Anh, 1999) [1]

Về hiệu quả kinh tế, cây chuối có chu kỳ sinh trưởng ngắn, mức đầu tư không lớn, kỹ thuật trồng không phức tạp nên việc trồng chuối thu được hiệu quả kinh tế tương đối cao Theo tính toán, 1 ha trồng chuối thu được giá trị sản phẩm bằng 3,8 ha trồng lúa hoặc 2,0 ha trồng lạc (Dẫn theo Trần Thế Tục, 1998) [17]

ở nước ta nói chung và tỉnh Nghệ An nói riêng, cây chuối từ lâu đã gắn liền với cuộc sống gia đình của hàng triệu người dân và đã góp phần đem lại hiệu quả kinh tế trong cơ cấu thu nhập từ các sản phẩm nông nghiệp Theo định hướng phát triển kinh tế - xã hội của tỉnh giai đoạn từ nay tới 2010, cây chuối chiếm một vị trí quan trọng trong chuyển đổi cơ cấu cây trồng, dự kiến phát triển sản xuất thành vùng nguyên liệu tập trung phục vụ chế biến xuất khẩu tại một số địa bàn của tỉnh như Đô Lương, Thanh Chương, Nam Đàn, Trước mắt,

Nghệ An đang xây dựng vùng trồng chuối tập trung làm tiền đề cho việc phát triển vùng nguyên liệu chế biến với nguồn cây giống được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô, Trung tâm khoa học & công nghệ Nghệ An là đơn vị cung cấp giống Bởi vậy, trong vài năm gần đây, địa bàn và diện tích trồng chuối cấy mô ngày càng mở rộng (từ 2 ha năm 2000 tăng lên 10-15 ha năm 2003 và năm

2004 dự kiến đạt 45-50 ha) Tuy nhiên, theo một số kết quả nghiên cứu và đặc biệt qua thực tế sản xuất đã cho thấy có sự xuất hiện các biến dị ở các giống chuối cấy mô Đây là một vấn đề mới cần được nghiên cứu, đánh giá chính xác

và đề ra giải pháp khắc phục các biến dị có hại và khai thác biến dị có lợi phục

vụ phát triển sản xuất Tuy nhiên, vấn đề này còn chưa được quan tâm nghiên cứu ở Việt Nam nói chung và tỉnh Nghệ An nói riêng Vì lẽ đó, chúng tôi tiến

hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu hiện t ượng biến dị trong nuôi cấy in vitro cây chuối phục vụ công tác giống trên địa bàn tỉnh Nghệ An

1.2 Mục đích của đề tài

Nghiên cứu hiện tượng biến dị trong nuôi cấy mô cây chuối, phát hiện

được một số nguyên nhân liên quan, trên cơ sở đó đưa ra các giải pháp khắc phục nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống chuối bằng nuôi cấy mô cũng như khai thác những biến dị có lợi phục vụ công tác chọn tạo giống

1.3 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đóng góp những dẫn liệu về hiện tượng biến dị trong nhân nhanh in vitro cây chuối, góp thêm cơ sở lý luận về hiện tượng biến dị soma xuất hiện trong nhân giống vô tính cây trồng

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống chuối in vitro và các giải pháp khắc phục hiện tượng biến dị soma Bên cạnh đó, cũng có thể phát hiện những biến dị có lợi và khả năng khai thác phục

vụ công tác chọn giống chuối, trước mắt cho tỉnh Nghệ An

1.4 phạm vi nghiên cứu của đề tài

* Về chuyên môn:

Đề tài chỉ dùng lại ở các chỉ tiêu nghiên cứu về hình thái, sinh trưởng, phát triển, năng suất và bước đầu đánh giá sự sai khác ở mức độ phân tử thông qua ứng dụng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

* Về địa điểm:

+ Trung tâm khoa học công nghệ Nghệ An: Nghiên cứu quy trình nhân nhanh cây chuối bằng phương pháp nuôi cấy mô và ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới hình thành các biến dị soma

+ Các huyện Đô Lương, Thanh Chương, Nam Đàn: Tiến hành thu thập các mẫu giống chuối đưa vào nuôi cấy và là địa bàn triển khai trồng chuối nuôi cấy mô

2 Tổng quan tài liệu

2.1 giới thiệu chung về cây chuối

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại và phân bố của một số nhóm giống chính

a Nguồn gốc

Theo phân loại của Võ Văn Chi (1978)[5], các loài chuối thuộc ngành

ngọc lan (Mangolophyta), lớp hành (Liliopsida), phân lớp hành (Lilidae), bộ gừng (Zingiberales), họ chuối (Musaceae) Họ chuối gồm 2 chi với 70 loài, trong đó: chi Ensete gồm 10 loài, phân bố chủ yếu vùng châu Phi; chi Musa

gồm 60 loài phân bố ở các vùng nhiệt đới

Cây chuối có nguồn gốc từ Đông Nam á, sau đó được di thực sang châu

úc rồi tới các nước Trung và Nam Mỹ Một số tác giả còn cho rằng từ Đông Nam á, cây chuối được chuyển qua Madagasca vào lục địa châu Phi, sau đó, tới

các đảo Canari và Santodomigo (Champion J., 1976)[4]

b Phân loại và phân bố

Theo Simmond N.W (1962)[70], số lượng giống chuối hiện trồng trên thế

giới là 100 - 300 và tất cả các giống chuối ăn được đều thuộc nhóm Eumusa,

được hình thành do sự kết hợp di truyền giữa 2 loài chuối dại là M.acuminata (A) và M.balbisiana (B), trong đó: những kiểu gen đều có gen A và gen B Bên

cạnh một số ít ngoại lệ, đại bộ phận các giống chuối hiện nay là tam bội thể (AAA, AAB, ABB), nhị bội thể (AA, AB, BB), còn tứ bội thể thì rất hiếm (chỉ một giống ở Thái Lan)

Hệ thống phân loại của Simmond N.W dựa trên cơ sở số lượng nhiễm sắc

thể và cho điểm các đặc điểm hình thái của 2 loài M.acuminata (A) và

M.balbisiana theo 15 đặc điểm thực vật học Theo hệ thống phân loại này, các

nhóm giống chuối hiện nay có các kiểu gen như sau (Dẫn theo Nguyễn Thị Việt Nga, 1996)[7]:

Nhóm 1: Kiểu gen AA

Trong nhóm này có các giống chuối Ngự, chuối Cau, chuối Piasang Mass (Malaysia), Ladies Finger (Hawaii), với những đặc điểm chính: quả nhỏ, vỏ mỏng, chất lượng cao, năng suất thấp, chống chịu bệnh vàng lá Panama nhưng mẫn cảm với bệnh đốm lá Sigatoka

Nhóm 2: Kiểu gen AAA

Trong nhóm này bao gồm các giống chuối Tiêu, chuối Già, Piasang Embun (Malaysia), Chinese (Hawaii), Grom Isen, Robusta (Trung Mỹ),… với những đặc điểm chính: năng suất, chất lượng tốt, được trồng rất phổ biến, thị trường tiêu thụ lớn, thích hợp trồng những nơi có vĩ độ cao, mùa đông lạnh và

đòi hỏi nhiều dinh dưỡng trong đất, có khả năng chống chịu bệnh héo vàng Parama nhưng mẫn cảm với bệnh đốm lá Sigatoka

Nhóm 3: Kiểu gen ABB

Nhóm này bao gồm rất nhiều chủng loại, đa số là những giống chuối ưa nhiệt độ cao như chuối Tây, chuối Sứ, chuối Sừng, chuối Bom, chuối trà bột, Những giống này có đặc điểm chứa nhiều tinh bột, được trồng để ăn tươi và đôi khi nấu chín, chiên, đặc biệt, tại một số nước châu Phi, các giống này chỉ dùng

để lấy bột Nhóm này có đặc điểm cây cao, sinh trưởng khoẻ, không kén đất, có thể trồng không tưới, không bón phân trên những đồi dốc mới khai phá, đặc biệt

là chuối Bom Ngoài ra, thân non, hoa chuối ít vị chát, có thể dùng làm rau sống (chuối Tây)

Nhóm 4: Kiểu gen BB

Nhóm này bao gồm những giống chuối hột,… với những đặc điểm cây sinh trưởng khoẻ, chịu bóng, chịu hạn khá, chống chịu sâu bệnh rất tốt, quả

chuối có chứa nhiều hạt nhưng lại có hàm lượng tinh bột cao nên có thể thu

hoạch xanh để lấy bột Ngoài ra, thân và hoa chuối có thể sử dụng làm rau sống

chất lượng cao

Theo hệ thống phân loại của Simmond N.W., chi Eumusa gồm 9 - 10 loài,

số lượng nhiễm sắc thể cơ sở là 11, số lượng giống lên tới 131 và phân bố như

sau (Simmond N.W.,1962)[70]:

Scitamineae

Ingentimusa Australimusa Calimusa Eumusa Rhodochlamys

Bảng 2.1 Phân loại và sự phân bố của các chi thuộc Musa

(theo Simmond N.W.,1962)[70]

Australimusa 10 5-6 Queensland đến Philipine

Theo Trần Thế Tục (1995)[17], các giống chuối chính ở miền Bắc nước ta

có thể phân thành 4 nhóm như sau:

Nhóm chuối Tiêu: Nhóm này có 3 giống là Tiêu lùn, Tiêu nhỡ và Tiêu cao, có

đặc điểm về chiều cao cây từ thấp tới trung bình (2,0-3,5m), năng suất quả từ

trung bình đến rất cao; phẩm chất thơm ngon, thích hợp cho xuất khẩu quả tươi, sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện các vùng có khí hậu mùa đông lạnh Nhóm chuối Tây: Bao gồm các giống chuối Tây, Tây hồng, Tây phấn, Sứ,…

được trồng phổ biến ở nhiều nơi Những giống này có đặc điểm cao cây, quả to mập, ngọt đậm và kém thơm hơn so với các nhóm giống khác, sinh trưởng khoẻ, không kén đất, có khả năng chịu nắng hạn, chịu rét song dễ bị héo rụi (vàng lá Parama)

Nhóm chuối Ngốp: Bao gồm các giống Ngốp cao, Ngốp thấp, , có chiều cao cây trung bình 3-5 m, quả tương đối lớn, vỏ dày, vỏ nâu đen khi chín, thịt quả nhão, hơi chua Cây sinh trưởng khoẻ, chịu bóng, ít sâu bệnh, chịu hạn khá, hình thành buồng ở vị trí thấp nên rất thích hợp trồng ở vùng đồi

Nhóm chuối Ngự: Bao gồm các giống chuối Ngự, Ngự tiến, Ngự mắn, , có đặc

điểm quả nhỏ, màu vỏ sáng đẹp, thịt quả chắc, vị thơm đặc biệt, cho năng suất thấp, chiều cao cây trung bình 2,5- 3,0 m, thân mảnh

Bên cạnh các nhóm giống chính nêu trên, ở nước ta còn có một số giống khác như: Pome, Mỏ giang, Mắn bột, Lá, Hột, với số lượng trên 30 giống trên phạm vi cả nước với những đặc điểm khác nhau về hình thái, năng suất và phẩm chất quả

2.1.2 Giá trị dinh dưỡng và thương phẩm của chuối

a Giá trị dinh dưỡng

Chuối là một trong 5 loại quả trao đổi chủ yếu trên thị trường thế giới, bên cạnh giá trị là loại quả cho khối lượng sản phẩm lớn, chuối còn có hàm lượng dinh dưỡng khá cao, tại một số nước châu á, châu Phi, chuối là lương thực, thực phẩm chủ yếu, được sử dụng như khoai tây ở các nước có khí hậu ôn đới

Theo Anon (1963), thành phần dinh dưỡng trong quả tính theo khối lượng tươi và khô đối với chuối ăn và chuối nấu như sau (Dẫn theo Đặng Thị Mai, 2001)[6]:

Bảng 2.2 Thành phần dinh dưỡng quả trong chuối ăn và chuối nấu

Chuối ăn tươi (%) Chuối nấu (%) Thành phần

Theo khối lượng tươi

Theo khối lượng khô

Theo khối lượng tươi

Theo khối lượng khô

Theo một số tác giả, thành phần quả chuối có một lượng vitamin khá lớn,

đặc biệt là các vitamin nhóm A và C với hàm lượng thay đổi tùy theo giống: các

giống chuối ăn tươi thường giàu vitamin C và B6, còn các giống chuối trong

nhóm chuối nấu lại giàu vitamin A Nhìn chung, hàm lượng vitamin trong chuối

rất phong phú và cao hơn một số đối tượng quả khác như cam, táo,… (bảng 2.3):

Bảng 2.3 Hàm lượng vitamin trong một số loại quả

Tác giả Champion J cho rằng quả chuối có giá trị dinh dưỡng cao, thể

hiện khi ăn 100 gr thịt quả cho mức năng lượng 110 - 120 calo, trong khi đó,

100gr táo cho mức năng lượng 64 calo, 100 gr cam cho 52 calo, 100 gr đào cho

45 calo,… Mặt khác, các thành phần dinh dưỡng trong quả chuối được cơ thể hấp thụ rất nhanh, vì vậy, chuối được coi là loại quả lý tưởng cho người già, sức khoẻ yếu, suy dinh dưỡng, mệt mỏi, Ngoài ra, quả chuối cũng có vị trí đặc biệt trong khẩu phần ăn giảm mỡ, cholesteron và muối natri,…(Champion J.,1976)[4]

Thời gian gần đây, một số phát hiện đã cho biết chuối là sản phẩm có hiệu quả trong việc chữa các bệnh về phủ tạng như đường ruột,… ngoài ra, quả chuối rất có lợi cho những người nhiễm độc than chì, có tác dụng chống các vết loét gây ra bởi người bệnh dùng thuốc aspirin và có tác dụng làm lành các vết loét này, đồng thời, trong thành phần chuối còn có đầy đủ các axit amin (Dẫn theo

Đặng Thị Mai)[6]

b Giá trị thương phẩm

Vì lý do là loại quả có giá trị dinh dưỡng cao và giá thành rẻ nên chuối

được tiêu thụ với số lượng lớn trên thế giới Bên cạnh tiêu thụ quả tươi, sản phẩm chuối có thể là nguyên liệu sản xuất ra bột chuối và chuối sấy khô Bột chuối là loại dinh dưỡng quý cho trẻ em và người già yếu, người có bệnh tiêu hoá và đây

là sản phẩm có giá trị kinh tế rất cao, cụ thể như sau (Dẫn theo Đặng Thị Mai, 2001)[6]:

Khô đậu tương (45% protêin) : 300 USD/tấn

Bột sắn khô : 100 USD/tấn

Bột chuối (cho người) : 1000 USD/tấn

Bột chuối (cho gia súc) : 110 USD/tấn

Protein đậu tương : 664 USD/tấn

Theo một số tác giả, chuối sấy là một sản phẩm cho năng lượng cao, khối lượng nhẹ, dễ dàng vận chuyển và bảo quản Ngoài ra, chuối sấy còn được sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất bánh kẹo, tinh dầu Một số sản phẩm phụ

của chuối như nhựa mủ, có tầm quan trọng trong sản xuất tanin, bẹ chuối là nguyên liệu để sản xuất dây chão, lá chuối được sử dụng làm gói bọc,… Ngoài

ra, chuối còn làm nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất cồn, bia, rượu, Thời gian trước, vỏ chuối trong ngành chế biến thực phẩm thường bị loại bỏ dưới dạng phế thải, điều này gây tác hại lớn đến môi trường xung quanh, không đem lại hiệu quả kinh tế, nhưng gần đây, người ta đã tạo ra được ethanol từ vỏ chuối (Cohen J.I., 1990)[28]

So với nhiều loại cây trồng khác, toàn bộ sản phẩm của cây chuối có thể làm lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, thuốc nhuộm, công nghiệp chế biến thực phẩm, làm rượu, mứt và vì một lý do nào đó trong sản xuất kinh doanh, việc xuất quả tươi gặp trở ngại thì cũng dễ dàng sử dụng sản phẩm chuối vào những mục đích khác với trang thiết bị yêu cầu không cao như chuối sấy khô, làm bột,

ủ chua,…

Theo FAO (2003)[35], thị trường tiêu thụ chuối trên thế giới ngày càng

được mở rộng, sản lượng chuối sản xuất, xuất khẩu chỉ đạt 7,2 – 7,3 triệu tấn, trong đó, nhu cầu nhập đạt ở mức 7,6 triệu tấn, tập trung chủ yếu ở các nước như

Mỹ, Canada, châu Âu,… ở trong nước, lượng chuối tiêu thụ trên đầu người trong 1 năm còn rất thấp, chỉ đạt 1,5 kg quả/người/năm (Hà Nội) Đây là con số rất khiêm tốn so với một số nước khác như Đức (10,5kg/người/năm), Pháp (8,8 kg/người/năm), Mỹ (8,7 kg/người/năm), Anh (6,4 kg/người/năm), Nhật Bản (6,0 kg/người/năm),…

2.2 kỹ thuật nuôI cấy mô tế bào và việc ứng dụng trong chọn giống và nhân giống

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào được biết đến và nghiên cứu từ những năm

đầu của thế kỷ 20 dựa trên học thuyết tế bào của hai nhà sinh vật học người Đức

là Schleiden và Schwaun vào năm 1838: "Một cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm

nhiều các đơn vị tế bào hợp thành Các tế bào dù phân hoá đều mang thông tin

di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là tế bào trứng sau khi thụ tinh là những

đơn vị độc lập mà từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể"(Dẫn theo Lê Trần Bình, 1981)[2]

Theo Murashige T.(1974)[55], có hơn 300 loại cây trồng có thể nuôi cấy

và nhân giống trong điều kiện in vitro và có thể sử dụng kỹ thuật này với các mục đích chọn giống và nhân giống khác nhau

2.2.1 Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy in vitro

a Tính toàn năng của tế bào (Totipotence)

Theo Haberlandt, kỹ thuật nuôi cấy mô dựa trên tính toàn năng của tế bào,

đó là: Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng mang toàn bộ l ượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi

tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh, đây chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho đến nay, con người đã

hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh của mọi cơ thể hoàn chỉnh từ một

tế bào riêng rẽ Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là kết quả của sự phân hoá và phản hoá tế bào (Murashige T., 1977)[56]; (Dẫn theo Lê Trần Bình, 1997)[3]

b Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào

Mỗi cơ thể thực vật là một chỉnh thể thống nhất, bao gồm nhiều cơ quan khác nhau với những chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện những chức năng cụ thể, tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế bào phôi phân sinh Sự phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi phân sinh thành các tế bào của các mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau nhưng những tế bào đã phân hoá không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại

có thể trở về dạng tế bào phôi sinh, có khả năng phân chia mạnh mẽ và quá trình

này gọi là sự phản phân hóa tế bào, ngược lại với phân hoá tế bào (Murashige T., 1974)[55]

2.2.2 Các phương thức nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

a Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Trong kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, mẫu nuôi cấy được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước rất nhỏ (khoảng 0,1 mm) Những kết quả nghiên cứu cho biết: phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng có tác dụng rất tốt khi muốn làm sạch virus cho cây trồng và ở điều kiện thích hợp, đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển thành 1 hay nhiều chồi, các chồi này sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh (có

rễ, thân, lá đầy đủ) Có 2 phương pháp tạo cây hoàn chỉnh từ việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng như sau (Krul W.R., 1980)[47]:

- Từ đỉnh sinh trưởng phát triển trực tiếp thành cây: chủ yếu trên các đối tượng cây hai lá mầm như khoai tây, thuốc lá, cam, chanh, và một số loại cây một lá mầm như mía, dứa sợi,

- Từ đỉnh sinh trưởng phát triển qua giai đoạn dẻ hành (protocom): phương thức này chủ yếu gặp ở các loại đơn tử diệp (cây một lá mầm) như phong lan, hoa huệ, từ 1 đỉnh sinh trưởng tạo thành hàng loạt protocorm và các protocorm này lại tiếp tục phân chia thành các protocorm khác hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh Bằng phương thức này, trong một thời gian ngắn, người ta

có thể thu được hàng triệu cá thể và đây là phương pháp nhân giống áp dụng cho nhiều loại cây trồng

b Tái sinh cây hoàn chỉnh từ một số bộ phận của cây

Bên cạnh phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, có thể sử dụng một số

bộ phận của cây để phục vụ công tác nhân giống như đoạn thân, mảnh lá, cuống hoa, đoạn rễ, Những đối tượng cây trồng hay được sử dụng phương pháp này

là thuốc lá, cà chua, mía, bắp cải,…(Barz W., 1977)[23]

c Tái sinh cây qua giai đoạn mô sẹo

Trong nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, nhiều loại cây trồng đã được tái sinh trực tiếp từ mô nuôi cấy không qua giai đoạn tạo mô sẹo Với cách làm này, có thể nhân giống một số lượng lớn cây giống đồng nhất

về mặt di truyền, tuy nhiên, trong một số trường hợp, nhiều đối tượng nuôi cấy không tái sinh trực tiếp thành cây mà hình thành mô sẹo (callus), những khối mô này phải qua cấy chuyển mới tạo thành cây Quá trình tạo mô sẹo dễ gây cho khối mô không ổn định về mặt di truyền và để khắc phục, người ta chỉ sử dụng các mô sẹo vừa mới tạo thành để tái sinh cây (Banks M.S., 1979)[22]

2.2.3 Các bước trong quá trình nhân giống in vitro

Theo một số tác giả, kỹ thuật nhân giống in vitro bao gồm một số bước cơ bản như sau (Dẫn theo Anderson W.C., 1980[19]; Nguyễn Đức Thành, 2000 [8]):

a Giai đoạn khởi động

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro, trong giai đoạn này, cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, khối mô tồn tại

và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu, yêu cầu cần thiết là cần chọn đúng loại mô,

đúng giai đoạn phát triển của cây, những vật liệu thường được chọn là mô phân sinh đỉnh, chồi nách, các bộ phận gần hoa và cuối cùng là những đoạn thân, mảnh lá, đoạn rễ,…

b Giai đoạn nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thành chồi và vấn đề quan trọng là phải xác định được môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp để

có hiệu quả cao nhất theo nguyên tắc chung là hệ số tạo chồi phụ thuộc tỷ lệ hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng (auxin và xytokinin) trong môi trường nuôi cấy

c Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Là giai đoạn tạo kích thích cho chồi nuôi cấy hình thành rễ, tạo những cá thể hoàn chỉnh chuẩn bị đưa ra vườn ươm Đây là giai đoạn rất quan trọng có ý nghĩa quyết định tới kết quả nhân giống, một số kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình ra rễ phụ thuộc vào tỷ lệ hàm lượng auxin và xytokinin trong môi trường nuôi cấy

d Giai đoạn vườn ươm

Là giai đoạn đưa cây từ điều kiện nuôi cấy nhân tạo ra điều kiện tự nhiên, vì vậy, kết quả quá trình này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nhiệt độ, độ ẩm, dinh dưỡng, giá thể cho cây con

2.2.4 Một số kết quả ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào phục vụ công tác nhân giống cây trồng

a Một số kết quả nghiên cứu ngoài nước

Nhân giống vô tính cây trồng là hình thức nhân giống thông qua sử dụng các cơ quan sinh dưỡng (thân, lá, rễ, củ, ) để tạo ra những cá thể mới và cho tới nay, một số phương pháp nhân giống vô tính thường được sử dụng như giâm cành, chiết cành, ghép và nuôi cấy in vitro (Campbell R.S., 1975)[26]

Kỹ thuật nuôi cấy in vitro từ khi mới ra đời đã thể hiện ưu điểm là có thể tạo ra một quần thể cây con đồng đều, giữ nguyên được đặc tính của cây mẹ, có

hệ số nhân giống cao, sớm phát huy được hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích phục vụ cho nhân giống, khắc phục những điều kiện bất lợi của thời tiết, đặc biệt, đối với một số loại cây trồng rất khó nhân giống bằng con đường hữu tính, một số loại cây quý hiếm, có số lượng giống ban đầu hạn chế nhưng yêu cầu phát triển trong thời gian ngắn Bên cạnh đó, kỹ thuật nuôi cấy in vitro còn có lợi ích là có thể phục tráng những giống cây trồng đang thoái hoá, tạo các giống sạch bệnh, vì vậy, trải qua quá trình nghiên cứu, phát triển, kỹ thuật nuôi cấy mô

tế bào đã được nhiều tác giả nghiên cứu, ứng dụng trên các đối tượng cây trồng khác nhau (Boxus P.H., 1977)[24]

+ Trên cây hoa:

Theo Holgate D.P (1977)[40], những nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong nhân nhanh một số giống hoa quý là công việc đem lại hiệu quả kinh tế hàng đầu trong thời gian qua và cho tới nay, kỹ thuật này đã ứng dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm cũng như những công ty kinh doanh giống hoa thương phẩm

Một trong các đối tượng hoa sản xuất thương mại với số lượng lớn trên thế giới phải kể đến là phong lan, đây là loại hoa thường được nhân giống theo phương thức truyền thống từ hạt, tuy nhiên, việc nhân giống trong điều kiện tự

nhiên đã gặp một số hạn chế, đó là một số loại lan (Dendrobium, Epidendrum)

không hình thành hạt và việc nhân giống phải sử dụng một số bộ phận sinh dưỡng, bên cạnh đó, việc phát triển của một số giống lai dẫn đến sử dụng phương pháp nhân giống truyền thống sẽ cho kết quả cây không đồng đều và hệ

số nhân giống rất thấp (Oglesby R.P., 1978)[59]

Một số tác giả khi nghiên cứu nhân giống hoa lan đã cho rằng: nên sử dụng môi trường có thành phần dinh dưỡng đơn giản, có thể Knudson hoặc Vacin and Went, đây là môi trường tương đối phù hợp cho hầu hết các đối tượng

lan như Phalaenopsis, Dendrobium, Vanda,… ở giai đoạn khởi động, nên sử

dụng môi trường đặc (có agar), sau khi protocorm xuất hiện, có thể chuyển sang môi trường lỏng trên máy lắc với tốc độ 100- 200 vòng/phút, tuy nhiên, một số

tác giả khác lại cho rằng với giống lan Cymbidium, tốc độ vòng quay tối ưu lại

là 2 vòng/phút (Oglesby R.P., 1978)[59]

Irawati J (1977)[44] khi nghiên cứu nhân giống lan Cattleya đã có một số

nhận xét như sau: ở giai đoạn khởi động nên sử dụng môi trường cơ bản

(Knudsson) có bổ sung 0,1 ppm ∝-NAA; 0,2 ppm Kinetin; 15% nước dừa và 0,5

gr đường/lít môi trường; giai đoạn nhân nhanh cần bổ sung thêm 0,19 ppm NAA, 0,35 ppm GA3, 0,22 ppm Kinetin; 20 gr đường/lít môi trường và giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh nên sử dụng môi trường (Knudsson) không có chất kích thích sinh trưởng

∝-Tại một số nước châu Âu, Anthurium (Anthurium spp) là loại hoa có giá

trị kinh tế và sử dụng rất cao, tuy nhiên, cây giống và cây hoa thương phẩm thường có nguồn gốc nhân giống từ hạt, tỷ lệ phân ly rất lớn, dẫn tới chất lượng hoa bị suy giảm Để cải thiện chất lượng cũng như giảm giá thành cây giống cho sản xuất, Leffring L (1976)[49] đã nghiên cứu nuôi cấy thành công Anthurium trên môi trường MS có bổ sung 2iP (3 ppml), BAP (1 ppm) để tái sinh cây, sau

đó, tiến hành nhân chồi trên môi trường MS có bổ sung Kinetin (3ppm) và kết quả nghiên cứu này đã được ứng dụng để nhân giống thương phẩm

Theo Trần Thanh Vân (1974)[77], hoa Gesneriads có rất nhiều giống có thể nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật như Saintpaulia,

Sinningia,… và có thể tái sinh chồi trong điều kiện in vitro từ nhiều bộ phận của cây như đoạn thân, mảnh lá, … trên môi trường MS có bổ sung 2-3 ppm BAP; 0,5 ppm NAA

Wright N.A (1982)[82] khi nghiên cứu nhân giống hoa Tulip đã cho rằng

đây là đối tượng tương đối khó ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, tuy nhiên, vẫn có thể thu được kết quả tốt khi đảm bảo nghiêm ngặt những yêu cầu kỹ thuật theo 1 trong 2 phương pháp như sau:

- Mẫu nuôi cấy được lấy với kích thước rất nhỏ (3-5 mm) từ củ giống, sử dụng môi trường MS có bổ sung 0,12 ppm ∝-NAA và 4 ppm BAP

- Mẫu được lấy là đế hoa thành thục với kích thước 1 mm, nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 500 ppm casein hydrat, 1 ppm ∝-NAA, 1 ppm BAP,

sau 3- 4 tuần, lấy chồi hình thành trực tiếp trên các mẫu nuôi cấy lắc trong GA3(nồng độ 1 ppm) trong 15 giờ, sau đó, tiếp tục nuôi cấy thì sẽ thu được chồi số lượng chồi rất lớn

Kỹ thuật nuôi cấy in vitro cũng được nghiên cứu và ứng dụng thành công

trên giống hoa Cyclamen, một loại hoa mà cho tới nay vẫn duy trì hình thức

nhân giống bằng hạt, tuy nhiên, thời gian gần đây, một số giống lai chất lượng cao đã được chọn tạo, vì vậy việc nhân giống vô tính trở nên rất cần thiết Các tác giả Mayer L (1956)[51]; Stichel E (1959)[75] và Geier T (1982)[36] đã xây dựng quy trình nhân giống đối tượng này thông qua tái sinh mô sẹo lấy từ thân, hoa, lá của cây

Trên đối tượng hoa đồng tiền, kỹ thuật nuôi cấy mô tỏ ra là phương pháp hữu hiệu và rất có ý nghĩa trong việc phát triển những giống hoa mới, công nghệ này được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng trong thời gian hiện nay Một số tác giả đã đề xuất quy trình nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây hoa đồng tiền như sau: giai đoạn nhân cụm chồi sử dụng môi trường MS có bổ sung 0,5 ppm ∝-NAA,

10 ppm Kinetin với điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 27oC, ánh sáng 1.000 lux, thời gian chiếu sáng 12- 16 giờ; giai đoạn ra rễ: môi trường là MS bổ sung 10 mg/l

∝-NAA với cường độ ánh sáng 10.000 lux, tuy nhiên, theo Wozniak J.(1982)[81], giai đoạn khởi động mẫu có thể sử dụng 10 ppm Kinetin nhưng nồng độ này rất dễ gây ngộ độc cho mẫu, vì vậy, giai đoạn sau nên sử dụng Kinetin ở nồng độ 3- 5 ppm (tuỳ thuộc giống) và chất lượng cây càng được cải thiện thêm khi bổ sung ABA (2,6 ppm) trong giai đoạn ra rễ

Trên đối tượng hoa hồng, kỹ thuật nhân giống in vitro một số giống hoa hồng lai đã được tác giả Davies D.R (1980)[31] nghiên cứu và đề xuất: sử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trên môi trường MS có bổ sung thiamin HCl 0,5 ppm, sau đó cấy chuyển sang môi trường ra rễ có hàm lượng khoáng thấp và không có chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin

+ Trên cây công nghiệp, lâm nghiệp:

Theo Sondahl M.R.(1977)[72], có thể tạo phôi vô tính một số giống cà phê thông qua hình thành callus từ nguồn mẫu nuôi cấy là hạt hoặc mảnh lá trên môi trường MS có bổ sung 0,05 ppm ∝-NAA và 0,5 ppm Kinetin Trong một số trường hợp khác, có thể sử dụng tổ hợp 2,4 D và Kinetin ở nồng độ tương ứng là

1 và 4 ppm Tác giả Monaco L.C (1977)[53] còn cho rằng, có thể nuôi cấy đỉnh

sinh trưởng giống cà phê C.arabica từ chồi đỉnh của hạt nảy mầm trên môi

trường MS có bổ sung vitamin của môi trường B5 và 1-2 ppm BAP hoặc Zeatin

Trên các đối tượng cây lâm nghiệm, kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã tỏ ra có hiệu quả, được nhiều tác giả nghiên cứu, đề cập trên các đối tượng Eucalytus (De Fossard R.A., 1977[33]; McComb J.A., 1982[52]);Teak (Gupta P.K., 1980[38]); Tamarind (Mascarenhas A.F., 1982[50]);… và đều cho rằng nhân giống in vitro cây lâm nghiệp bằng nuôi cấy chồi đỉnh là rất có hiệu quả, cho hệ số nhân giống và hiệu quả kinh tế cao, có thể đạt công suất 15.000- 50.000 cây giống/năm trên 1 m2 phòng thí nghiệm

+ Trên cây rau:

Theo một số tác giả, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào được nghiên cứu và thành công trên hầu hết các loại rau như cà chua, bắp cải, ớt, dưa chuột, hành, tỏi, , tuy nhiên, theo Collin G.B (1982)[29], kỹ thuật này hầu như chỉ sử dụng phục vụ công tác chọn tạo giống và khi tiến hành nuôi cấy in vitro, cần lưu ý một số vấn đề như sau:

- Nếu mẫu nuôi cấy là hạt: Nên sử dụng môi trường nuôi cấy là MS có bổ sung 4- 5 ppm ∝-NAA và 0,1 - 0,5 ppm Kinetin

- Nếu mẫu nuôi cấy là mô thành thục: Nên sử dụng môi trường nuôi cấy

là MS có bổ sung 0,5-1,0 ppm IAA và 3-4 ppm BAP

- Nếu mẫu nuôi cấy là chồi hoa: Nên sử dụng môi trường nuôi cấy là MS

có bổ sung 1 ppm IBA và 2-11 ppm BAP

+ Trên cây ăn quả:

Trên các đối tượng cây ăn quả, ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro phục

vụ công tác nhân giống được rất nhiều tác giả nghiên cứu, tuy nhiên, bên cạnh

kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, một số phương pháp nhân giống vô tính (chiết, ghép, giâm cành) hiện vẫn được sử dụng và phát huy hiệu quả, vì vậy, người ta chỉ sử dụng nuôi cấy in vitro trong một số trường hợp như sau:

- Nhân nhanh giống mới

- Nhân nhanh những đối tượng mà việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro ít ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng giống

- Nhân nhanh giống làm cây gốc ghép

Theo Hutchinson J.F (1982)[41], giống táo Malus thường phát triển tốt

trên môi trường có thành phần đa lượng cũng như vi lượng theo MS, tuy nhiên, một số thành phần có giảm bớt, sau đó, ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh, vẫn sử dụng môi trường MS những không cần bổ sung thêm chất kích thích sinh trưởng

Trên các đối tượng cây có múi, việc nuôi cấy in vitro đã được Murashige

T (1969)[54] đưa ra và đề xuất sử dụng môi trường MS có bổ sung hàm lượng một số vitamin cao và ở giai đoạn ra rễ, cần giảm bớt hàm lượng sắt trong môi trường cơ bản

Green C.E (1978)[37] khi nghiên cứu nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của một

số giống cam đã cho biết nếu lấy nguồn mẫu giống từ những chồi của những cây quá già cỗi (40 năm tuổi), rất khó tạo ra sự phát sinh cụm chồi trên môi trường

MS, tuy nhiên, tác giả Kitto S.L (1981)[46] lại cho rằng có thể tái sinh cụm chồi

trên giống Carrizo citrange

Trên một số đối tượng cây ăn quả khác như: nho, dâu tây, đu đủ, đào ,…, cũng được nhiều tác giả nghiên cứu và đề cập (Hirabayashi T., 1976[39]; De Bruijne E., 1974 [32]; Boxus P.H., 1977[24]; Shingha S., 1980[69])

Đối với cây dứa, là loại cây ăn quả có hình thức sinh sản vô tính thì việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào phục vụ công tác nhân giống

có vai trò rất quan trọng, đặc biệt, trên các đối tượng có hệ số nhân giống tự nhân thấp (Cayen, dứa cảnh,…)

+ Trên cây chuối:

Chuối là đối tượng cây ăn quả có hình thức sinh sản vô tính với phương thức nhân giống truyền thống là sử dụng chồi nách làm giống trồng những thế

hệ kế tiếp, vì vậy, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào nhân giống chuối đã

được nghiên cứu, ứng dụng từ rất lâu tại nhiều nước trên thế giới

Theo Reuveni O.(1986)[63], kỹ thuật nuôi cấy in vitro chuối có một số ưu

điểm như sau:

- Nhân được số lượng lớn giống từ cây ban đầu đã xác định tính trạng

- Chất lượng cây giống sản xuất hoàn toàn sạch bệnh

- Tránh được những sâu hại gây ra qua nguồn đất (tuyến trùng), vì vậy, rất tiết kiệm được chi phí hoá chất cho xử lý đất

- Cây nuôi cấy mô có thể trồng 1 vụ với mức độ thâm canh cao, thời gian sinh trưởng ngắn, có thể điều khiển thời gian thu hoạch

- Tỷ lệ cây sống cao trên điều kiện đồng ruộng (> 98%)

- Cây giống in vitro có khả năng sinh trưởng nhanh hơn cây có nguồn gốc chồi nách

- Cây giống in vitro phát triển đồng đều, ra hoa đồng loạt

- Thời gian thu hoạch ngắn

- So với cây giống sử dụng chồi nách, cây nuôi cấy mô có giá thành rẻ và

dễ nhân giống, vận chuyển

- Tiện lợi trong việc trao đổi nguồn gen quốc tế

Theo HWang S.C (1992)[42], tại Đài Loan, Viện nghiên cứu chuối quốc

tế đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô chuối trên quy mô lớn để sản xuất cây thương mại từ năm 1983 và sau 10 năm, một số lượng là 15 triệu cây đã được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy in vitro cung cấp cho sản xuất

Theo Smith M.K (1992)[74], tại Australia, ngành công nghiệp sản xuất chuối đứng trước nguy cơ rất lớn về 3 loại bệnh hại, đó là: Bunchy top, Black Sigatoka và Fusarium Wilt, những bệnh hại này xuất hiện trên vùng rộng lớn từ phía Bắc của New South Wales tới phía Nam của Queen Land, tuy nhiên, bằng

kỹ thuật nhân giống in vitro, một lượng cây giống sạch bệnh rất lớn đã được sản xuất cung cấp cho các vùng nguyên liệu và kết quả đã hạn chế được sự phát sinh, phát triển và gây hại của bệnh

b Những kết quả nghiên cứu trong nước

ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy in vitro được bắt đầu từ năm 1975 và cho tới nay, tại nhiều phòng thí nghiệm, nhiều loại cây trồng đã được nghiên cứu và hoàn thiện quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào với kết quả thu được rất đáng trân trọng

Năm 1978, tác giả Nguyễn Văn Uyển đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nhân giống cây cà phê thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và tạo phôi vô tính (Nguyễn Văn Uyển, 1985)[18]

Theo Nguyễn Quang Thạch (1988), có thể nhân nhanh cây dứa sợi với hệ

số nhân 4,5 lần/tháng trên môi trường MS có bổ sung 0,5 ppm ∝-NAA và 1ppm BAP Trong khi đó, tác giả Lê Trần Bình (1989) lại cho rằng, có thể sử dụng môi trường MS có bổ sung 0,2 ppm 2,4 D, 0,5 ppm Kinetin để nhân dứa sợi (Dẫn theo Đặng Thị Mai, 2001)[6]

Năm 1979, khi nghiên cứu nhân nhanh giống nho không hạt, tác giả Nguyễn Văn Uyển đã đề xuất nên sử dụng môi trường MS có bổ sung 2- 5 ppm BAP; 0,1 - 0,5 ppm ∝- NAA là cho kết quả nhân giống tốt nhất(Nguyễn Văn Uyển, 1985)[18]

Nhân giống cây hoa loa kèn cũng được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu và

đều cho rằng: có thể sử dụng một số loại môi trường MS, White, B5, , tuy nhiên, môi trường hiệu quả hơn cả vẫn là MS Thời gian sau, một số đối tượng khác cũng

được nghiên cứu thành công như: hoa Hồng, hoa Tường Anh, hoa Trà, Hoa cúc, (Dẫn theo Đặng Thị Mai, 2001)[6]

Năm 1995, Nguyễn Thị Nhẫn đã nghiên cứu và xây dựng quy trình nhân giống dứa Cayen Phú Hộ bằng phương pháp nuôi cấy in vitro (Nguyễn Thị Nhẫn, 1995)[9]

Năm 1996, Nguyễn Phương Thảo [14] đã nghiên cứu và xây dựng thành công quy trình nhân nhanh giống cây hoa Loa kèn tím sạch bệnh được nhập nội

từ Pháp bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Thời gian gần đây, các nhà khoa học thuộc Viện Sinh học Nông nghiệp (Trường Đại học Nông nghiệp I) đã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống nhiều đối tượng cây trồng có giá trị kinh tế cao như dứa Cayen, một số giống hoa quý (phong lan, hoa chuông, đồng tiền,…), chuối,…, đã cung cấp một số lượng lớn cây giống chất lượng cao phục vụ sản xuất, mở ra hướng

đi mới cho sản xuất thông qua sử dụng cây giống có nguồn gốc nuôi cấy in vitro

(Nguyễn Quang Thạch, 2000 [10];[11];[12];[13])

Đối với cây chuối, những nghiên cứu nhân giống in vitro đầu tiên ở nước

ta phải kể đến là quy trình nhân giống chuối do tác giả Nguyễn Văn Uyển (1978) đề xuất, bao gồm 6 công đoạn chính sau: đưa mẫu vào nuôi cấy → tạo và nhân chồi chuối → tạo rễ cây → ươm chuối trong vườn ươm → bầu chuối và trồng ra ruộng sản xuất (Nguyễn Văn Uyển, 1985)[18]

Thời gian sau, các nhà khoa học Viện di truyền nông nghiệp (Bộ Nông nghiệp và PTNT) đã nghiên cứu và đề xuất quy trình sản xuất chuối Tiêu cho các tỉnh phía Bắc, kết quả nghiên cứu này đã được công nhận tiến bộ kỹ thuật

Năm 1995, trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu cấp Bộ, tác giả Phạm Kim Thu đã hoàn thiện thêm quy trình sản xuất giống, đã tổ chức và triển khai được hàng triệu cây giống cho các tỉnh phía Bắc (Nam Định, Thái Bình,…) (Phạm Kim Thu, 1997)[15]

Thời gian gần đây, quy trình nhân giống chuối bằng phương pháp nuôi cấy in vitro đã được chuyển giao tới nhiều cơ sở sản xuất và trong quá trình sản xuất hàng hoá, một số vấn đề đã nảy sinh và công tác nghiên cứu chuyển sang một hướng mới, đó là khắc phục những hạn chế của quy trình nhân giống và sử dụng quy trình phục vụ công tác chọn tạo giống

2.2.5 Hiện tượng biến dị soma trong nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

a Hiện tượng biến dị soma

Năm 1967, Butenco đã phát hiện và miêu tả những biến dị hình thành khi tái sinh cây cà chua thông qua nuôi cấy mô sẹo và cho tới năm 1981, thuật ngữ

“biến dị soma” được đưa ra lần đầu bởi Larkin & Scowcroft khi tác giả nghiên cứu sự tái sinh của thực vật bằng phương pháp nuôi cấy tế bào và đã phát hiện sự thay đổi kiểu gen và kiểu hình Những công trình của Larkin đã miêu tả và giải thích rất rõ hiện tượng và chỉ ra rằng đây là vấn đề cần nghiên cứu, là một phạm trù của kỹ thuật nuôi cấy in vitro và nhận định này đã được một số tác giả có những công trình nghiên cứu về vấn đề này làm sáng tỏ như Reisch B (1983)[62]; Scowcfort W.R (1983, 1985, 1987)[65][66][67]; Evans D.A (1984)[34] Thời gian sau (1990), hiện tượng biến dị soma đã được chúng minh

bằng những kết quả nghiên cứu, phân tích về ADN trên các đối tượng nghiên cứu

Theo Larkin P.J (1981)[48], hiện tượng biến dị soma xuất hiện trong điều kiện nuôi cấy mô sau nhiều lần nuôi cấy, điều này có nghĩa những mẫu đưa vào

điều kiện in vitro đã chịu ảnh hưởng của của điều kiện nuôi cấy, số lần tái sinh

và tỷ lệ xuất hiện những biến dị này phụ thuộc vào nguồn giống và điều kiện nuôi cấy

Về hình thái biến đổi, những biến dị có thể nhận biết qua những biểu hiện thay đổi tập tính sinh trưởng, hình thái (màu sắc thân,…) cũng như một số đặc

điểm về năng suất, chất lượng, ví dụ như ở cây cà chua trong điều kiện nuôi cấy,

đã phát hiện nhiều biến đổi về chiều cao cây, thời gian sinh trưởng,…

Theo một số tác giả, có 3 dạng biến dị soma xuất hiện trong quá trình

nhân giống vô tính, đó là: genetic, chimeral và epigenetic, … , những biến đổi

này xuất phát ở mức độ tế bào và thể hiện khi bắt đầu hình thành cây trong điều kiện nuôi cấy và những dạng biến đổi này có thể hoặc không thể nhận này bằng quan sát hình thái

Một số biến đổi hình thái xuất hiện do sự thay đổi của gene trong genom gây ra, tác động tới quá trình hình thành chất diệp lục, điều khiển lại và xuất hiện cây có dạng bạch tạng hoặc những vết trắng trên lá Những biến đổi này rất hay xảy ra và tương đối dễ phát hiện Một dạng biến dị khác cũng hay xuất hiện,

đó là tác động tới khả năng sinh trưởng, phát triển của cây, thường làm cho cây sinh dị dạng, không sinh trưởng được

Theo Murashige T (1974)[55], sở dĩ có những thay đổi nếu trên là do đã xảy ra quá trình thay đổi về kiểu gen của tế bào, có thể trong nhân hoặc lục lạp

và tỷ lệ xuất hiện càng cao khi thời gian và số lần nuôi cấy càng lớn Trong một

số trường hợp, những biến dị là kết quả của sự thay đổi về thành phần xelluloza

trong tế bào cây mẹ hoặc thay đổi số lượng nhiễm sắc thể trong quá trình nuôi cấy

Theo Skirvin R.M (1976)[71], các dạng biến dị xuất hiện trong điều kiện

tự nhiên cũng như nuôi cấy là nguồn tiềm năng rất lớn trong công tác chọn giống và một số nghiên cứu đã cho rằng một số cá thể biến dị mới hình thành có những đặc tính vượt trội về năng suất và chất lượng lại được đưa vào nuôi cấy để tạo ra thế hệ mới có chất lượng cao hơn

b Hiện tượng biến dị soma trong nuôi cấy mô chuối

Theo Arias O (1987)[20], hiện tượng biến dị soma xuất hiện trong nuôi cấy mô chuối khi tiến hành nhân giống với số lượng lớn, thời gian kéo dài và tại một số vùng sản xuất, tỷ lệ biến dị lên tới 40% Hiện tượng này được phát hiện tại hầu hết các nước trồng chuối in vitro như: Australia, Israel, Nam Phi, Đài Loan và các nước châu Mỹ Latin

Theo một số tác giả, những biến dị soma trong quá trình nhân giống in vitro xuất hiện với tần số phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên cũng như điều kiện nuôi cấy nhân tạo Một số kết quả nghiên cứu đã cho rằng tỷ lệ biến dị khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chuối là 0- 70% tuỳ thuộc vào giống Những biến dị này không chỉ xuất hiện trong quá trình nhân giống mà hình thành ngay cả khi lưu giữ nguồn gen trong điều kiện in vitro với dạng phổ biến là dạng cây lùn, sau đó tới một số dạng khác như thân cây, buồng, nải, quả, thon mảnh và một số dạng

có khả năng chống chịu bệnh (Israelli Y., 1995[45]; Smith M.K., 1988[73]; Vuylsteke D., 1991[78])

Tại Costa Rica, cây giống chuối nuôi cấy mô trồng trên đồng ruộng khi theo dõi quá trình sinh trưởng, phát triển đã phát hiện ra tỷ lệ cây xuất hiện biến

là 1- 10% Một số tác giả cho rằng tỷ lệ biến dị phát hiện trong sản xuất nêu trên

là ở mức thấp, vì lý do, nước này đã tiến hành kiểm tra nguồn giống trước khi trồng sản xuất

Theo Valverde J (1987)[76], tỷ lệ biến dị xuất hiện trên các giống chuối nuôi cấy mô trồng sản xuất tại Costa Rica là khác nhau, thể hiện giống Grande Naine 1 xuất hiện tỷ lệ biến dị là 8,0%, trong khi đó, tỷ lệ này trên các giống Grande Naine 2; Williams là 8,5% và 6,5%

Theo Azofeita P.W (1991)[21], một số dạng biến dị và tỷ lệ xuất hiện trên giống Grande Naine nuôi cấy mô trồng tại Hondurat như sau: dạng cây lùn (40%), dạng có đốm sáng trên lá (25%), dạng đường kính thân mảnh (12%), dạng phiến lá thay đổi (10%),… và những dạng này hoàn toàn có thể phát hiện

dễ dàng trong giai đoạn vườn ươm

Daniells J.W.(1992)[30] khi theo dõi cây chuối nuôi cấy mô trồng ở Queen Land (Astralia) từ năm 1986 đã cho biết: trong quá trình sinh trưởng, phát triển trên điều kiện đồng ruộng đã phát hiện tỷ lệ biến dị rất lớn, có những

điểm khảo sát cá biệt lên tới 90%, bao gồm 28 dạng biến dị: chiều cao cây thấp hơn bình thường 0,8- 1,0 m, thậm chí có cá thể còn thấp hơn tới 2,0 m; phiến lá hẹp,… Những dạng biến dị này được theo dõi các đặc tính nông sinh học trên

điều kiện đồng ruộng và đã chọn được một số dòng W&R1; W&R2, GL1, C4 có năng suất, chất lượng và thời gian sinh trưởng có ý nghĩa rất lớn phục vụ sản xuất

Theo Walduck G.D (1988)[79] khi nghiên cứu nhân giống chuối Giant Cavendish nuôi cấy mô và trồng tại Australia đã cho biết đã phát hiện một số dạng biến dị chính như sau: dạng cây lùn xuất hiện với tỷ lệ 7- 90%; dạng phiến lá hẹp xuất hiện với tỷ lệ 1- 67%; một số dạng khác từ 1- 10%, Tương tự, tác giả Novak, F.J (1995)[53] khi nghiên cứu các giống Williams, Lady Finger, Grande Naine đã cho biết dạng biến dị xuất hiện chính là thân lùn (8-20%) và các dạng khác là (1- 100%)

Vuylsteke D (1991)[78] khi nghiên cứu giống chuối Cavendish nuôi cấy mô trên đồng ruộng đã cho biết đã xuất hiện một số dạng biến dị như sau: xuất

hiện các đốm màu trên lá, thay đổi màu sắc thân giả, xuất hiện một số màu như: hồng, đỏ, xanh, đen,…, cây lùn hoặc nửa lùn, thay đổi hình dạng quả, buồng, hoa,…

Tại Nam Phi, tác giả Robinson J.C (1992)[64] đã nhận xét khi so sánh cây giống chuối nuôi cấy mô và các đối tượng chồi được nhân giống theo phương thức truyền thống là sau 3 vụ, năng suất trung bình của các giống đều tăng, thể hiện: Giant Cavendish 19,4%, Williams 15,0% và Graind Naine 13% Tuy nhiên, số cây biến dị xuất hiện với tỷ lệ 9,6%, phổ biến ở các dạng cây lùn

và có đốm lá

Tại Đài Loan, theo Ching Yan Tang (1992)[27], việc chọn các dạng biến

dị có tác dụng giảm chiều cao cho chuối là rất cần thiết vì 2 lý do sau: sẽ giảm

được thiệt hại về năng suất do mưa bão gây ra và giảm chi phí về công lao động Kết quả nghiên cứu từ năm 1986 đã cho biết đã chọn được một số dạng biến dị lùn (5 loại) từ cây giống nuôi cấy mô, trong đó dòng Cavendish B.F được đánh giá trong giai đoạn 1988- 1991 là rất tốt, đã nhân rộng phục vụ sản xuất, kết quả năng suất tăng 28,4%

Theo Hwang S.C (1992)[42], việc nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro với số lượng lớn bên cạnh những biến đổi hình thái đã xuất hiện nhiều dạng biến đổi khả năng chống chịu bệnh, kết quả đã phát hiện được 10 dòng chống chịu trong đó GCTCV-215-1 đã thể hiện tiềm năng cho sản xuất thương mại, thể hiện trên điều kiện đồng ruộng cho thấy bên cạnh việc duy trì năng suất, chất lượng, tỷ lệ nhiễm bệnh đã giảm còn 6,1% so với 33,6 % trên giống đối chứng

Theo Novak F.J.(1995)[58], chuối là loại cây trồng có nguồn gen rất đa dạng, việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đã gây ra tỷ lệ biến dị tương đối phong phú và có thể sử dụng những dạng biến đổi này phục vụ công tác chọn tạo giống có năng suất cao, chống chịu bệnh Một số nghiên cứu đã kết luận: những

dạng biến dị và tần số xuất hiện phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó, đối tượng giống có vai trò rất quan trọng và một số dạng biến dị có lợi thường xuất hiện trên các nhóm giống như sau:

+ Đối với giống thuộc nhóm AAA (thường dùng xuất khẩu tươi):

- Dạng biến dị thấp cây rất có lợi cho các vùng thường xảy ra mưa bão

- Dạng biến dị có khả năng chống chịu hạn

- Dạng biến dị có khả năng chịu được độ thấp rất cần cho các vùng khí hậu ôn đới

- Dạng biến dị có năng suất cao

- Dạng biến dị có một số đặc điểm chất lượng cao (hình thái và chất lượng)

- Dạng biến dị nâng cao thời gian bảo quản

+ Đối với giống thuộc nhóm AAB

- Những biến dị nâng cao năng suất

- Những biến dị nâng cao chất lượng quả

+ Đối với giống thuộc nhóm ABB:

- Những biến dị nâng cao năng suất

- Những biến dị thấp cây cho các vùng hay mưa bão

- Những biến dị nâng cao chất lượng quả cho chế biến

+ Đối với giống thuộc nhóm ABB và AAA:

- Những biến dị cao cây

- Những biến dị cải thiện năng suất

- Những biến dị nâng cao chất lượng

ở Việt Nam, thời gian qua, những nghiên cứu thường tập trung chủ yếu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào phục vụ công tác nhân giống trên một số

đối tượng cây trồng có hiệu quả kinh tế Thời gian gần đây, một số nghiên cứu

đã quan tâm tới việc một số biến dị xuất hiện trong nhân giống in vitro trên một

số đối tượng như cây dứa, cây chuối,… tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu còn mang tính bước đầu và cần được nghiên cứu sâu hơn trong thời gian tới

2.2.6 Chỉ thị di truyền và ứng dụng kỹ thuật RAPD

a Chỉ thị di truyền và một số phương pháp xác định

Như chúng ta đã biết, mỗi đối tượng sinh vật qua quá trình truyền giống

đều duy trì những đặc điểm về tính trạng cũng như hình thái cho thế hệ kế tiếp

và những đặc điểm này là những chỉ thị di truyền xác định, cho tới nay, có 3 loại chỉ thị di truyền được sử dụng phổ biến: các chỉ thị về hình thái, các chỉ thị isozym và các chỉ thị ADN

Theo một số tác giả, chỉ thị hình thái có thể phát hiện nhanh chóng bằng mắt thường, tuy nhiên, loại chỉ thị này rất chịu ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh, do vậy, mức độ tin cậy không cao Thời gian sau, chỉ thị isozym đã được

sử dụng nhưng hạn chế của phương pháp này là số lượng chỉ thị không nhiều, hơn nữa, kỹ thuật isozym phải tiến hành rất nhiều phản ứng, gây ra tốn kém thời gian và tiền bạc (Quiros C.F., 1988)[61]

Các chỉ thị ADN được nghiên cứu từ những năm 1980, đầu tiên bằng kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) với việc sử dụng những enzym cắt hạn chế, đây là những endonucleaza có tính đặc hiệu cao, có tác dụng cắt chuỗi ADN ở những vị trí đặc hiệu, được gọi là vị trí giới hạn có trật tự các nucleotit rất đặc trưng cho từng loại enzym Kết quả của quá trình này

là tạo ra những đoạn ADN có chiều dài khác nhau, sau đó, điện di trên gel và sử dụng kỹ thuật lai phóng xạ để quan sát (Patersson A.H., 1991)[60]

Thời gian gần đây, các nhà khoa học đã lợi dụng phản ứng PCR bằng cách sử dụng những đoạn mồi để phát hiện các đoạn đa hình ADN với ưu điểm của những phương pháp (RAPD, AFLP, SSR,…) này là có thể phát hiện các chỉ thị ADN nhanh chóng, không cần những nguyên liệu phóng xạ mà chỉ cần một lượng rất nhỏ ADN nguyên liệu ban đầu (Williams J.G.K., 1990)[80]

b Một số kết quả ứng dụng của kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD được ứng dụng phổ biến trong việc nghiên cứu mối quan

hệ tiến hoá giữa các giống tương đối gần nhau về mặt di truyền, một số kết quả ứng dụng thời gian qua đã cho biết (Nguyễn Xuân Thụ, 1998)[16]:

- Có thể nhận dạng và phân loại 21 giống cần Tây bằng cách sử dụng phản ứng PCR với 28 đoạn mồi của Operon Technologies để phát hiện những

đoạn ADN đa hình, sau đó sử dụng chương trình PAUP để tính hệ số đồng dạng giữa các cặp và lập cây phân loại của 21 giống

- Có thể xác định mối quan hệ di truyền của 21 giống nho với phản ứng PCR được thực hiện trên 21 đoạn mồi, sản phẩm của RAPD được điện di trên gel agaroza 1,5% và những băng đa hình là những băng không đồng thời xuất hiện hoặc vắng mặt ở tất cả các giống, sau đó, sử dụng chương trình Genstat 5.2

để xử lý kết quả và lập cây phân loại

- Thời gian gần đây, một số tác giả đã công bố hành loạt công trình đánh giá mối quan hệ di truyền trên các đối tượng: đu đủ (10 giống), cà phê (27 giống),… ngoài ra, một số ứng dụng khác của RAPD đã được kể đến như lập bản đồ chỉ thị di truyền, nhận dạng những gen quan tâm trên cơ thể thực vật,…

ở Việt Nam, những nghiên cứu tiên phong trong việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc nhân dạng di truyền phải kể đến là Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,… với những kết quả tương đối đa dạng trên nhiều đối tượng: cây ăn quả, cây rau, cây lương thực ,…

3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.1 Vật liệu

Đề tài được tiến hành trên một số giống chuối đặc sản Nghệ An như sau:

- Chuối Và Nghệ An (M Cavendishii Lamb): thuộc nhóm chuối Tiêu

(kiểu gen AAA), chiều cao trung bình 1,6-1,7 m

- Chuối Ngự Nghệ An (Musa sapientum L): thuộc nhóm chuối Tây (kiểu gen ABB), chiều cao trung bình 3,5- 3,7 m

- Chuối Tiến Nghệ An (Musa sapientum L): thuộc nhóm chuối Ngự (kiểu gen AA), chiều cao trung bình 2,4- 2,6 m

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số tác nhân gây biến dị trong nuôi cấy

in vitro của một số giống chuối trên địa bàn Nghệ An

a Phát hiện các cá thể biến dị và tỷ lệ xuất hiện

b ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng tới tỷ lệ xuất hiện các dạng biến dị

c ảnh hưởng của số lần cấy chuyển tới tỷ lệ xuất hiện các dạng biến dị

d ảnh hưởng của số lượng cá thể lấy mẫu nuôi cấy tới tỷ lệ xuất hiện các dạng biến dị

3.2.3 Nghiên cứu, theo dõi sinh trưởng, phát triển của các cá thể xuất hiện biến dị trong giai đoạn vườn ươm và giai đoạn đầu trên đồng ruộng

a Phát hiện các dạng biến dị trong giai đoạn vườn ươm và tỷ lệ xuất hiện

b Sinh trưởng, phát triển các cá thể xuất hiện biến dị trong điều kiện vườn

ươm

c Phát hiện các dạng biến dị trong giai đoạn đầu trên đồng ruộng và tỷ lệ xuất hiện

d Sinh trưởng, phát triển các cá thể biến dị giai đoạn đầu trên đồng ruộng

e Tình hình sâu bệnh hại trên những cá thể xuất hiện biến dị giai đoạn

- Miêu tả các dạng biến dị và xác định tỷ lệ xuất hiện

3.3.2 Đánh giá năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất và chất lượng của các cá thể xuất hiện biến dị

Những cá thể xuất hiện biến dị được tiếp tục theo dõi và đánh giá năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất và chất lượng quả trên điều kiện đồng ruộng

và phân tích thành phần sinh hoá tại Phòng Thí nghiệm Tổng hợp- Viện nghiên cứu Rau quả, cụ thể như sau:

3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số tác nhân gây biến dị trong nuôi cấy

in vitro của một số giống chuối trên địa bàn Nghệ An

a Phát hiện các cá thể biến dị và tỷ lệ xuất hiện

Trên cơ sở hướng dẫn những chỉ tiêu đánh giá hình thái của INIBAP (1993)[43], phát hiện các dạng biến dị xuất hiện trong điều kiện nuôi cấy in vitro (sau lần cấy chuyển thứ 8)

chuyển thứ 5 trên các công thức thí nghiệm có hàm lượng chất kích thích sinh trưởng khác nhau, cụ thể như sau:

CT1: MS + 0,3 mg ∝-NAA/lít môi trường + 1mg BAP/lít môi trường CT2: MS + 0,3 mg ∝-NAA/lít môi trường + 2mg BAP/lít môi trường CT3: MS + 0,3 mg ∝-NAA/lít môi trường + 3mg BAP/lít môi trường CT4: MS + 0,3 mg ∝-NAA/lít môi trường + 4mg BAP/lít môi trường CT5: MS + 0,3 mg ∝-NAA/lít môi trường + 5mg BAP/lít môi trường

c Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần cấy chuyển tới tỷ lệ xuất hiện các dạng biến dị

Trên cơ sở kết quả nghiên cứu mục b, tiếp tục tiến hành phát hiện các dạng biến dị và tỷ lệ xuất hiện trong điều kiện nuôi cấy in vitro sau các lần cấy chuyển, cụ thể như sau:

CT1: Sau 5 lần cấy chuyển

CT2: Sau 6 lần cấy chuyển

CT3: Sau 7 lần cấy chuyển

CT4: Sau 8 lần cấy chuyển

CT5: Sau 9 lần cấy chuyển

CT6: Sau 10 lần cấy chuyển

CT7: Sau 11 lần cấy chuyển

CT8: Sau 12 lần cấy chuyển

(Các công thức đều được nhân trên môi trường tối ưu đã được xác định)

d Nghiên cứu ảnh hưởng của số lượng cá thể lấy mẫu nuôi cấy tới tỷ lệ xuất hiện các dạng biến dị

Tiến hành theo dõi, phát hiện và xác định các dạng biến dị, tỷ lệ xuất hiện trên các công thức với số lượng mẫu đưa vào nuôi cấy khác nhau, cụ thể như sau:

a Nghiên cứu các dạng biến dị trong giai đoạn vườn ươm

Trên cơ sở hướng dẫn những chỉ tiêu đánh giá hình thái của INIBAP (1993)[43], phát hiện các dạng biến dị xuất hiện trong điều kiện vườn ươm (sau

c Nghiên cứu các dạng biến dị trong giai đoạn đầu trên đồng ruộng

Trên cơ sở hướng dẫn những chỉ tiêu đánh giá hình thái của INIBAP (1993)[43], phát hiện các dạng biến dị xuất hiện trong điều kiện giai đoạn đầu trên đồng ruộng (sau 20 tuần):

- Miêu tả các dạng biến dị

- Xác định tỷ lệ xuất hiện

e Sự sinh trưởng, phát triển các cá thể biến dị giai đoạn đầu trên đồng ruộng

Theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển (chiều cao cây, số lá TB/cây, chu vi thân) của các dạng biến dị trên điều kiện vườn ươm sau: 4; 8; 12; 16; 20 tuần

g Tình hình sâu bệnh hại trên những cá thể xuất hiện biến dị giai đoạn đầu trên đồng ruộng

Theo dõi tỷ lệ cây nhiễm một số đối tượng bệnh hại chính là Bunchy top; Sigatoka; Fusarium Wilt trên đồng ruộng sau 20 tuần trồng

3.3.5 Nghiên cứu bước đầu sự biến đổi ở mức phân tử của các thể biến dị

a Nghiên cứu tách chiết ADN

b Phản ứng PCR với các đoạn mồi ngẫu nhiên

3.3.6 Phương pháp nghiên cứu

a Trên điều kiện đồng ruộng:

- Điều tra phát hiện các dạng biến dị và tỷ lệ xuất hiện (sử dụng phương pháp điều tra, miêu tả các mẫu giống theo phương pháp thông dụng của

INIBAP):

+ Số lượng cá thể điều tra: > 500 cá thể/ giống

- Chỉ tiêu theo dõi:

+ Chiều cao cây

+ Số lá trung bình/cây

+ Chu vi thân

+ Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất

+ Tỷ lệ các chất và thành phần sinh hoá quả

- Môi trường nuôi cấy: Sử dụng môi trường MS (1962)

-Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: (25±1)oC, thời gian chiếu sáng 8/16, cường

c Thí nghiệm xác định mức độ sai khác ở mức phân tử trên các dạng biến dị

- Tách chiết ADN theo phương pháp CTAB của Saghai- Maroof (1994) cải tiến, cụ thể như sau: Lấy mẫu lá chuối tươi (khoảng 4 gr) nghiền trong nitơ

lỏng cho tới dạng bột mịn, sau đó, mẫu đ−ợc giữ ở – 200C ít nhất trong 2 giờ, bổ sung dung dịch đệm CTAB (Cetyltrimethylamonium bromide) (1,5% CTAB +

100 mM Tris-HCl (pH8) + 20 mM EDTA + 1,4 M NaCl) đã đ−ợc đun đến vừa sôi để đạt nồng độ CTAB cuối cùng là 1,0% và lắc ngay với tốc độ 97 vòng/phút

phản ứng gồm 45 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn: biến tính ở 940C/1phút, ủ mồi ở 360C/1phút, kéo dài đoạn mồi ở 720C/2phút

Sau khi phản ứng kết thúc, giữ ở nhiệt độ 40C, sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,1% ở điện áp 100 V trong 150 phút, sau đó nhuộm bằng ethidium brommide 0,1%, cuối cùng chụp bằng phim Polariod 667 dưới ánh sáng cực tím, mỗi phản ứng đều được lặp lại 3 lần

3.3.7 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

- Số liệu sơ cấp thu thập thông qua thành lập phiếu điều tra và tiến hành

điều tra tại địa bàn nghiên cứu

- Số liệu thứ cấp thu thập thông qua kết quả nghiên cứu của một số chương trình, đề tài và các cơ quan có liên quan trên địa bàn

Các số liệu trên được đưa vào chương trình phần mềm NTSYSpc để phân tích và đánh giá mức độ tương đồng giữa các mồi nghiên cứu và xây dựng cây phân loại cho các biến dị Hệ số tương động do phần mềm tính toán dựa trên công thức toán học của Nei và Li:

2Nxy

Sxy =

Nx + NyTrong đó:

2Nxy : Số băng chung xuất hiện ở cả 2 mẫu x và y

Nx : Số băng chỉ xuất hiện ở mẫu x

Ny : Số băng chỉ xuất hiện ở mẫu y

- Số liệu được xử lý trên máy tính theo chương trình EXCEL và IRRISTART

4 kết quả nghiên cứu

4.1 điều tra, phát hiện các dạng biến dị trên điều kiện sản xuất của một số giống chuối nuôi cấy mô được trồng tại Nghệ An

4.1.1 Tỷ lệ xuất hiện các dạng biến dị và một số nét miêu tả chính

Theo một số tác giả, chuối là đối tượng cây ăn quả có nguồn gen rất đa dạng và một trong những nguyên nhân dẫn tới hiện tượng trên do chuối là cây trồng có hình thức sinh sản vô tính, việc nhân giống truyền thống thường sử dụng chồi nách và trải qua nhiều thế hệ kế tiếp, những biến dị xuất hiện, dần dần phát sinh những dòng mới Vì lý do đó, công tác chọn giống chuối bằng phương pháp tuyển chọn cá thể được nhiều quốc gia có ngành công nghiệp sản xuất chuối phát triển sử dụng

Thời gian qua, việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong sản xuất giống chuối đã được nhiều nước sử dụng trong việc sản xuất cây giống cho các vùng nguyên liệu, ưu điểm của phương pháp này là có thể sản xuất một số lượng lớn cây giống hầu như đồng nhất phục vụ sản xuất, tuy nhiên, một tỷ lệ nhất định các dạng biến dị đã xuất hiện với những thay đổi kiểu gen cũng như kiểu hình, có tác động tích cực cũng như tiêu cực tới năng suất, chất lượng và khả năng chống chịu của giống trên đồng ruộng Vì vậy, trong khuôn khổ nội dung nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành điều tra, phát hiện các dạng biến dị và

tỷ lệ xuất hiện trên điều kiện đồng ruộng của cây giống chuối được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô thời gian qua trồng tại một số địa bàn thuộc tỉnh Nghệ An Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 4.1