Xác định gen kháng thuốc của các chủng salmonella gây ngộ độc thực phẩm được phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở hà nội

NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊNXÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁ

NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN

XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC

CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ

NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2017

NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN

XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC

CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nghiêm Ngọc

Minh

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếpthực hiện với sự giúp đỡ của cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh -Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Namdưới sự hướng dẫn khoa học của PGS TS Nghiêm Ngọc Minh Các số liệu,kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được công

Nguyễn Thị Nhã Quyên

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơnchân thành và sâu sắc nhất của mình tới PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh -Trưởng phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hànlâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã tận tình chỉ bảo, hướngdẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu; phòng Đào tạo; khoa Côngnghệ sinh học Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, cácquý thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập,nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Võ Thị Bích Thủy, ThS Nguyễn Hoài

Thu và các anh chị em, cán bộ phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu

hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tìnhhướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thànhluận văn này

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè cùng tất cả các thầy côluôn luôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình tôi họctập và làm luận văn này

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôimong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi

có thể có

được kết quả tốt hơn

Thái Nguyên, tháng 5 năm

2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Nhã Quyên

MỤC LỤC

i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC

1.4.2 Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella

15

1.5 Gen kháng kháng sinh 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu 192.1.1 Thu thập và phương pháp lấy

mẫu 19

2.1.2 Hóa chất nghiên cứu

19

2.2 Phương pháp nghiêncứu 20

2.1.1 Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

263.1 Thu thập mẫu ở một số loại thịt tươi

26

3.2 Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp trên các môi trường

cơ bản 27

3.1.1 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp trong

mẫu thịt lợn, gà, bò

27

3.1.2 Kết quả giám định các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn

Salmonella spp phân lập được

29

3.2 Kết quả định type vi khuẩn Salmonella phân lập được

30

Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được

323.4 Kết quả phát hiện và đánh giá gen kháng thuốc của các

chủng

Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được

35

3.4.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số: Lựa chọn 3 chủng Salmonella

Typhimurrium S181, S360, S384 để tiến hành tách chiết RNA 35

3.4.2 Kết quả RT-PCR phát hiện các gen kháng kháng sinh của

2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO

45

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

bp : Base

pair cs :

Cộng sự

dH2O : Nước khử ion

DNA : Deoxyribonucleic acid

dNTP : deoxyribonucleotide

triphosphates EDTA : Ethylene Diamine

Tetraacetace Axit EtBr : Ethidium

Bromide

Kb : Kilobase

OD : Optical density

PCR : Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribonucleic acid

RT-PCR : Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction

TAE : Tris-acetate-EDTA

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự mồi và nhiệt độ gắn mồi của các gen sử dụng trong

nghiên cứu 24Bảng 3.1 Danh sách thu thập mẫu thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội 26

Bảng 3.2 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp từ các mẫu thịt

27

Bảng 3.3 Kết quả giám định đặc tính nuôi cấy và hình thái khuẩn lạc của

các chủng Salmonella spp trong quá trình phân lập

29Bảng 3.4 Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi

khuẩn Salmonella spp phân lập được

30Bảng 3.5 Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn

Salmonella

spp 31Bảng 3.6 Tổng hợp kết quả kháng các nhóm kháng sinh của 3 type

Salmonella Typhimurium (ST) phân lập được

33Bảng 3.7 Kết quả đánh giá gen kháng kháng sinh của các chủng

Salmonella Typhimurium S181, S360, S384

41

Hình 3.3 Kết quả mức độ kháng các nhóm kháng sinh của 3

type

Salmonella Typhimurium (ST) phân lập được

33Hình 3.4 Kết quả điện di đồ sản phẩm RNA tổng số của 3

chủng

Salmonella 1,2,3: S181, S360, S384

35

Hình 3.5 Kết quả RT-PCR phát hiện sự có mặt của gen 16S (550 bp)

của chủng Salmonella Typhimurium S181, S360,S384 36

Hình 3.6 Kết quả RT-PCR phát hiện sự có mặt của gen tetA (494bp),

sull II (434bp, avrA (192bp), aadA (228bp), blaTEM (310bp), gyrB (219bp), prmA (187bp) của chủng Salmonella

Typhimurium S181, S360, S384 M: thang chuẩn (DNA1Kb) 37

Hình 3.7 Tỷ lệ biểu hiện gen tetA, sull II, avrA, aadA, blaTEM, gyrB,

prmA/16S rRNA của chủng Salmonella Typhimurium

được phân tích bằng phương pháp RT-PCR Gen 16S

39

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càngtrở nên cấp thiết, các báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thựcphẩm là do vi sinh vật Đã có nhiều cảnh báo nhưng ngộ độc thựcphẩm vẫn đang gia tăng và ngày càng nghiêm trọng Theo số liệu thống

kê của Cục vệ sinh An toàn thực phẩm, Bộ Y tế, mỗi năm Việt Nam cóchừng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân và 100

- 200 ca tử vong Tính riêng năm 2008, có 205 vụ ngộ độc thực phẩm,với 7828 người mắc, 161 người chết, trong đó 7,8% số vụ do nguyênnhân vi sinh vật gây ra Sáu tháng đầu năm 2014, có 67 vụ ngộ độcthực phẩm với 2048 người mắc, 24 trường hợp tử vong

Có rất nhiều loài vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm như Clostridium

butolinum, Escherichia coli, Listeria monocytogenes Trong đó, Salmonella được biết đến là vi khuẩn hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm

trên thế giới với các triệu chứng như buồn nôn, nhức đầu, sốt nhẹ, sau đóxuất hiện nôn mửa và tiêu chảy nhiều lần, có thể lẫn máu Thường thì bệnhnhân có thể tự khỏi, nhưng đối với trẻ em, người già hoặc người bị suygiảm miễn dịch bệnh có thể gây nguy hiểm đến tính mạng Mặc dù nhiễm

trùng đường ruột do các chủng Salmonella thường tự khỏi, nhưng việc

điều trị kháng sinh để ngăn chặn quá trình lây lan nhiễm trùng vẫn làđiều cần thiết

Việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị cả người và động vật có

thể ảnh hưởng đến khả năng kháng thuốc của Salmonella Các chủng

Salmonella gây ngộ độc thực phẩm kháng thuốc phân lập được là mối

đe dọa trực tiếp đến sức khỏe của con người do các chủng kháng thuốcnày sẽ cản trở việc điều trị và là mối đe dọa gián tiếp khi sự kháng có thểđược chuyển giao cho các mầm bệnh khác ở người Do vậy việc giám sáttính mẫn cảm kháng sinh là quan trọng và cần thiết

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và tầm quan trọng của việc bảo vệ

sức khỏe con người chúng tôi đã tiến hành đề tài "Xác định gen kháng thuốc của các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm được phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được gen kháng thuốc của chủng Salmonella gây ngộ

độc thực phẩm phân lập từ thịt tươi tại một số địa điểm ở Hà Nội

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella trong các mẫu thịt tươi

Typhymurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập được

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Xác định được các gen kháng thuốc của chủng vi khuẩn

Salmonella gây ngộ độc thực phẩm giúp cho việc nghiên cứu các bộ kit

chẩn đoán nhanh vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn

Vi khuẩn Salmonella được phân lập từ thịt lợn chết bởi bệnh phó thương hàn thường gặp ở miền Tây của nước Mỹ là S choleraesuis var kunzendorf, S typhimurium và S typhisuis [28] Trong một vài trường hợp, ở lợn còn tìm thấy S dublin và S enteritidis Hai serotype S dublin

và S enteritidis cũng gặp ở lợn con đang theo mẹ.

Từ những năm 1990 trở lại đây tỷ lệ nhiễm Salmonella ở Châu Âu

đều không giảm, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm

Salmonella trên người được phát hiện tuy nhiên con số thực tế có thể cao

gấp 10 lần Salmonellosis là bệnh nhiễm trùng đường ruột phổ biến thứ haitại Hoa Kỳ Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC)ước tính có hơn

1 triệu người nhiễm Salmonella, ơ Mỹ mỗi năm và trung bình có

khoảng

20.000 ca nhập viện và gần 400 trường hợp tử vong do nhiễm Salmonella,

theo một báo cáo năm 2011 [60] Tháng 11/2013, tại thành phố Brisbanecủa Queensland (Australia) cũng xảy ra vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm

trọng do vi khuẩn Salmonella khiến 1 phụ nữ 77 tuổi thiệt mạng và hơn

220 người nhiễm bệnh Nguyên nhân gây ra vụ việc do vi khuẩn

Salmonella có trong trứng, thịt gia cầm và các loại thịt chưa được nấu chín

[40] Theo thông tin mới nhất được công bố vào 2/4/2015 bởi tổ chức Y tếthế giới (WHO), cho thấy mối đe dọa từ các bệnh truyền nhiễm qua thựcphẩm do vi khuẩn gây lên Những con số được

công bố khiến người tiêu dùng trên toàn thế giới không khỏi hoang mang.Bao gồm 582 triệu các ca mắc phải một trong 22 căn bệnh truyền quathực phẩm;

351.000 số ca tử vong liên quan đến an toàn thực phẩm trong đó có

52.000 ca tử vong do vi khuẩn Salmonella gây nên, 37.000 số ca tử vong

do vi khuẩn E.coli, 35.000 người chết do norovirus (loại virus là nguyên

nhân hàng đầu gây nên dịch bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm tại Hoa Kỳ), và40% là tỷ lệ người ở độ tuổi dưới 5 mắc các bệnh truyền nhiễm qua thựcphẩm

Điều đáng chú ý nhất ở vi khuẩn Salmonella là sự gia tăng khả năng

kháng thuốc của vi khuẩn này Trong những năm gần đây, tốc độ gia tăng

tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella đã được báo cáo nhiều ở

các nước phát triển và cả những nước đang phát triển (Báo cáo của Bộ Y tế,2008) Các nhà nghiên cứu của Wellcome Trust đã lập bản đồ mã gen

trên 1.832 đối tượng nhiễm khuẩn Salmonella typhimurium thu thập từ

63 quốc gia trong khoảng thời gian từ năm 1992 đến 2013 cho thấy gầnmột nửa số vi khuẩn không hề bị tiêu diệt bởi những loại kháng sinh theoquy chuẩn Trong nghiên cứu mô tả các dữ liệu từ các chương trình giámsát tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc trong thịt gà của Brazil (PREBAF) từ thờigian tháng 9/2004 đến tháng

7/2006 cho thấy trong 2.679 mẫu thịt gà thu thập được tại 15 bangthuộc 5 khu vực địa lý của đất nước có tới 8,9% (trung bình 2,7%) mẫu

nhiễm Salmonella spp Trong đó chủ yếu nhiễm 4 loài Enteritidis (48,8%),

Infantis (7,6%), Typhimurium (7,2%) và Heidelberg (6,4%), nhưng nguyhiểm là các chủng đa kháng thuốc xuất hiện với tỷ lệ cao 53,2% (133chủng/250 chủng thử nghiệm kháng thuốc) [43] Trong nghiên cứu 236

mẫu nước sông ở Đài Loan, có 54 mẫu (chiếm 22,9%) nhiễm Salmonella ssp, 15 chủng Salmonella được phân lập xuất hiện cả một số typ thường

gây nhiễm trùng cho người và gia súc, bao gồm Albany (27,8%), Newport(14,8%), Bareilly (13,0%), Derby (11,1%) và Typhimurium (7,4%) Đặcbiệt 51,9% các mẫu kháng với ít nhất 1

trong 8 loại kháng sinh được thử nghiệm do trong các chủng vi khuẩn nàytồn tại các gen kháng thuốc [43].

Các nhà khoa học cũng đã chứng minh rằng trong bộ gen của các

loài vi khuẩn Salmonella gây bệnh có một loạt các gen liên quan đến việc

ứng phó với điều kiện thiếu dưỡng chất, sức đề kháng kháng sinh, sự trao

đổi chất sắt và các phản ứng sốc nhiệt [58] Một số gen hilA, prgH, invF

được phát hiện có mối quan hệ rất lớn đến khả năng kháng tetracycline

của 2 chủng vi khuẩn Salmonella Typhimurium DT 104 và DT 193 [32].

Ngoài ra, amR là một yếu tố phiên mã của protein Rama, một yếu tố đakháng quan trọng cũng được tìm thấy trong vi khuẩn [72] hoặc các gen

kháng thuốc của Salmonella Typhimurium và Salmonella Newport thường

được đặt trên plasmid CMY-2 [39] Sahu (2013) cũng đã phát hiện ra 1

vùng đột biến tại locus 1 có khả năng đa kháng thuốc ở vi khuẩn S.

typhimurium [59]

Hiện nay, trên thế giới vẫn tiếp tục có các nghiên cứu về các genkháng thuốc của vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là vi khuẩn

Salmonella nhằm xác định chính xác cơ chế đa kháng thuốc của các vi

khuẩn Salmonella gây ngộ độc thực phẩm.

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong

40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây các bệnh về đường tiêu hóa.

Vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra cho người và gia súc

cũng đã được bắt đầu từ những năm 50 Viện Parteur Sài gòn trongnhững năm 1951-

1953 đã phân lập được 6 chủng Salmonella ở người (4 chủng từ máu, 2

chủng từ nước tiểu) Cũng ở Sài gòn, trong thời gian này cũng đã phân lập

được 35 chủng từ 360 lợn, trong đó có 23 mẫu là S choleraesuis [1].

Lê Văn Tạo và Nguyễn Thị Vui (1994) đã phân lập và xác

định serotype của vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn, kết quả cho thấy: 50% các chủng được phân lập thuộc S Choleraesuis; 12,5% S Enteritidis; 6,25% S Typhimurium và một số loại còn lại thuộc các serotype khác

[18]

Trần Xuân Hạnh (1995) đã phân lập và giám định vi khuẩn

Salmonella

ở lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả: S Typhisuis ở lợn bệnh là

16,9%; ở lợn bình thường 6-16 tuần tuổi là 4,2%; S Paratyphi ở lợn 6-16

tuần tuổi là 2,8% [6]

Năm 2003, Võ Thị Bích Thủy nghiên cứu tình hình nhiễm

Salmonella trên thực phẩm tại Hà Nội thấy tỷ lệ nhiễm cao nhất ở giò

sống là 46,67%, tiếp theo là thịt bò 40%, thịt gà 39,29%, thấp nhất là thịtlợn 33,33% [25] Cũng trong năm này, Lê Minh Sơn đã xác định tỷ lệ

nhiễm Salmonella trong thịt lợn giết mổ tiêu dùng nội địa từ

10,91-16,67% và thịt lợn xuất khẩu trung bình 1,42% [15] Tô Liên Thu (2005)

đã xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella của các mẫu thịt gà ở Hà Nội là rất cao

33% các mẫu lấy tại siêu thị, 40% các mẫu lấy tại chợ [22]

Tại các lò mổ là một trong những địa điểm rất quan trọng có nguy

cơ cao ô nhiễm Salmonella vào thân thịt sau khi giết mổ Trần Thị Hạnh và

cs (2009) đã công bố tỷ lệ nhiễm Salmonella tại các cơ sở giết mổ lợn công

nghiệp và cho kết quả: Chất chứa manh tràng của lợn là 59,18%, ở mẫulau thân thịt là 70%, mẫu lau hậu môn là 66%, mẫu lau nền chuồng nhốtlợn chờ giết mổ là 40%, mẫu lau sàn nhà giết mổ là 28%, còn các mẫu

nước kiểm tra không phát hiện Salmonella Tại các cơ sở giết mổ lợn theo phương thức thủ công cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chất chứa

manh tràng của lợn chờ giết mổ là 87,5%, ở các mẫu lau thân thịt là75%, mẫu lau hậu môn là 55%, mẫu lau nền chuống nhốt lợn chờ giết

mổ là 70%, mẫu lau sàn giết mổ là

80%, mẫu nước là 50% [7]

Ở nước ta, chăn nuôi lợn, gia cầm và thủy sản thường được bổ sungnhiều loại kháng sinh với mục đích kích thích tăng trưởng, phòng bệnh

và điều trị, do vậy nồng độ kháng sinh tồn dư trong thịt thường cao gấpvài lần so với các quốc gia khác Các nhà nghiên cứu Nhật Bản và Việt

Nam đã thực hiện nghiên cứu về sự lan tràn của các chủng Salmonella

kháng kháng sinh trong thịt lợn và thịt gia cầm bán lẻ ở miền Bắc Việt

Nam Kết quả phát hiện được 118 mẫu dương tính với vi khuẩn Salmonella

phân lập từ 283 mẫu thịt bán lẻ (135 mẫu thịt lợn, 148 mẫu thịt gà) [65]

Cùng với các quá trình nghiên cứu chi tiết về vi khuẩn, các biệnpháp phòng bệnh đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu,trong đó có vacxin phòng bệnh Nguyễn Văn Lãm (1968) đã tiến hành

nghiên cứu chế vacxin phó thương hàn lợn con từ chủng Salmonella chuẩn

của Trung Quốc Hiện nay, các loại vacxin phòng bệnh phó thương hàn đãđược một số công ty, xí nghiệp thuốc thú y sản xuất như vacxin nhược độcchủng TS-177, vacxin có bổ trợ như vacxin keo phèn hay vacxin nhũ hóa

có bổ trợ dầu [8]

Trong những năm gần đây, ở Việt Nam hầu hết các nghiên cứuchỉ tập trung vào tìm hiểu tính kháng kháng sinh và các gen khángkháng sinh ở các vi sinh vật gây bệnh phân lập từ các mẫu bệnh phẩmhoặc động vật Các nghiên cứu về gen cũng như cơ chế kháng khángsinh của các vi si nh vật gây bệnh phân lập từ thực phẩm chưa được đề

cập nhiều, đặc biệt là nhóm vi khuẩn Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm Như vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn Salmonella

Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm một cách toàn diện để từ đó đề rabiện pháp phòng chống bệnh hiệu quả, giữ gìn vệ sinh an toàn thựcphẩm, bảo vệ sức khỏe con người là một y êu cầu cần thiết

1.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột do Salmon

và

Smith phát hiện vào năm 1886 khi xác định Salmonella

Choleraesuis là

nguyên nhân gây bệnh dịch tả lợn (Hog Cholera) [17] Trực khuẩn

Salmonella thuộc bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae Giống Salmonella gồm hai loài: S Enterica và S Bongori đã được phân

chia thành trên 3000 serotype theo bảng phân loại Kauffmann-Whitetrên cơ sở cấu trúc của kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H vàđôi khi có cả kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K)

1.2.1 Đặc điểm hình

thái

Vi khuẩn Salmonella là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có

kích thước khoảng 0,4 - 0,6 x 1 - 3 m, không hình thành giáp mô và nha

bào, có lông và di động được (trừ Salmonella Pullorum-gallinarum).

Hình 1.1 Vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn bắt màu gram âm Vi khuẩn có cả kháng nguyên thân

O (Ohne Hauch) và kháng nguyên lông H (Hauch), chỉ có một số loài như

Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi, Salmonella Dublin có thể

chứa kháng nguyên Vi (là loại kháng nguyên có khả năng ngưng kếtkháng thể O khi nó phát triển nhiều)

1.2.2 Đặc tính nuôi

cấy

Salmonella là trực khuẩn vừa hiếu khí vừa yếm khí, nhiệt độ thích

hợp cho sự phát triển là 37oC, độ pH 7,2 - 7,6 Vi khuẩn có sức chịuđựng tốt

trong các điều kiện nuôi cấy Chúng có thế sống sót trong môi trườngthạch ở nhiệt độ -10oC trong 115 ngày, sống từ 4-8 tháng trong thịt ướpmuối với tỷ lệ

29% ở nhiệt độ 6-12oC Có rất nhiều môi trường dinh dưỡng chọn lọc được

dùng trong phân lập Salmonella, hiện nay thường dùng như Brilliant

Green Agar (BGA), Bismuth Sulfite Agar (BSA), Triple Sugar Ion (TSI),Xylose Lysine Deroxycholate (XLD), Mueller Kaufmann, Xylose LysineTetrathionate 4 (XLT4), Modified Semisolid Rappaport Vassiliadis (MSRV),Rambach, Kligler [58]

Khi nuôi cấy vi khuẩn Salmonella trong môi trường nước thịt: Sau

vài giờ đã vẩn đục, sau 18 giờ canh trùng đục đều Nếu nuôi lâutrong ống nghiệm thì đáy có cặn, trên bề mặt môi trường có màng mỏng

Trên môi trường BSA: Sau 18 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn

Salmonella mọc lên những khuẩn lạc đặc trưng, xung quanh khuẩn lạc

màu nâu thẫm, càng vào giữa khuẩn lạc càng đậm chuyển gần sangmàu đen, khuẩn lạc có màu ánh kim

Trên môi trường thạch thường: Khuẩn lạc dạng S (smooth) tròn,trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, rìa gọn và hơi lồi ở giữa, đườngkính từ 1 -

1,5mm, thi thoảng thấy khuẩn lạc dạng R (rough), nhám, mặt trong

Trên môi trường MSRV: Là môi trường chọn lọc những Salmonella có

khả năng di động, vi khuẩn di động ra xung quanh môi trường tạo thànhvòng màu trắng có thể quan sát được

Trên môi trường XLT4: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trung bình,màu đen, bóng, hơi lồi.

Trên môi trường Rambach: Vi khuẩn hình thành những khuẩn lạctrung bình, màu đỏ tím, bóng

Trên môi trường Kligler: Mặt nghiêng môi trường không đổi màu do

vi khuẩn không lên men đường lactose, phần thạch đứng môi trường đổimàu do vi khuẩn lên men đường glucose làm thay đổi pH của môi trường

và sinh H2S có màu đen

1.2.3 Đặc tính hóa sinh

Không len men đường : lactose, sucrose, andonitol,

Lên men sinh hơi các loại đường: glucose, mannitol, sorbitol, Phản ứng indol âm tính (-), urease âm tính (-), Voges - Proskauer (VP)

âm tính (-), H2S dương tính (+), Metyl - Red (MR) dương tính (+)

Khả năng trao đổi chất đặc trưng của Salmonella là phân hủy

nitrat thành nitrit, phân hủy đường glucose sinh hơi, phân hủy H2S và sửdụng citrat làm nguồn cung cấp cacbon duy nhất

Đặc tính sinh hóa có ý nghĩa lớn trong quá trình phân lập và giámđịnh vi khuẩn, chính vì vậy khi xét nghiệm mẫu vật xác định sự có mặt của

Salmonella cần thiết phải tiến hành các phản ứng sinh hóa.

1.2.4 Cấu trúc của Salmonella

Vi khuẩn Salmonella có 3 loại kháng nguyên, đó là những chất khi

xuất hiện trong cơ thể thì tạo ra kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợpđặc hiệu với những sản phẩm của sự kích thích đó, gồm: kháng nguyênthân O, kháng nguyên lông H và kháng nguyên vỏ K Vi khuẩn thương

hàn (S Typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực bào

giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu

* Kháng nguyên thân O (O - Antigen)

Kháng nguyên thân O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúclipopolysaccharide (LPS) là thành phần chính cấu tạo nên lớp màng ngoàicủa

thành tế bào vi khuẩn gram âm Kháng nguyên O chịu nhiệt và kháng cồn, bị biến tính khi xử lý bằng formaldehyde Kháng nguyên O gồm 2 nhóm chính:

- Polysaccharid không có nhóm hydro, không mang tính đặc trưngcủa kháng nguyên và chỉ tạo sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng Ssang dạng R và dẫn đến giảm độc lực của vi khuẩn [61]

- Polysaccharid nằm ở ngoài có nhóm hydro quyết định tính khángnguyên và đặc trưng cho từng serotype

Kháng nguyên O được xem như một nội độc tố mà nó được cấu tạobởi nhóm hỗn hợp glyco - polypeptip có thể tìm thấy ở màng ngoài của

vỏ bọc vi khuẩn

* Kháng nguyên lông H (H - Antigen)

Kháng nguyên lông H là protein nằm trong thành phần lông của vikhuẩn, là loại kháng nguyên không chịu nhiệt, rất kém bền vững so vớikháng nguyên O, bị phá hủy ở nhiệt độ 600C sau 1 giờ, dễ phá hủy bởicồn và axit yếu [19] Kháng nguyên H gồm 2 pha:

- Pha 1: có tính đặc hiệu, gồm 28 loại kháng nguyên được biểu thịbằng chữ mẫu Latint thường: a,b,c, ,z

- Pha 2: Không có tính đặc hiệu, gồm 6 loại được biểu thị bằng chữ số

Ả rập: 1,2,3,4,5,6 hay Latinh thường: e,n,x,

* Kháng nguyên vỏ K (K - Antigen)

Theo Quinn và cs (2004), kháng nguyên vỏ chỉ có ở một số loài như

S Typhi, S Paratyphi, S Dublin cũng có thể mang kháng nguyên vỏ.

Kháng nguyên K có thể làm che các kháng nguyên thân O Cũng theo

tác giả, nếu đun sôi huyễn dịch của các loài Salmonella này trong 10 - 12

phút sẽ phá hủy được kháng nguyên vỏ

Kháng nguyên vỏ là một loại kháng nguyên có khả năng ngưng kếtkháng thể O khi phát triển nhiều Kháng nguyên này chỉ gặp ở 2

serotype là: S Typhi và S Paratyphi C.

1.2.5 Các yếu tố gây bệnh của Salmonella

* Các yếu tố không phải là độc tố

Các yếu tố không phải là độc tố bao gồm: kháng nguyên O, khángnguyên H và kháng nguyên K, yếu tố bám dính, khả năng xâm nhậpvào tế bào, khả năng tổng hợp sắt, khả năng kháng kháng sinh Các yếu

tố này với cơ chế, phương thức tác động khác nhau tạo điều kiện bất lợicho cơ thể vật chủ và tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tác động gâybệnh Chính vì thế các yếu tố không phải là độc tố đóng vai trò hết sức

quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella.

Khả năng kháng kháng sinh: Việc sử dụng rộng rãi các loạithuốc kháng sinh để phòng trị bệnh, kích thích sinh trưởng của gia súc,gia cầm đã tạo ra nhiều giống vi khuẩn có khả năng kháng thuốc, mangplasmid kháng kháng sinh, tồn tại rất lâu trong cơ thể người, vật nuôi vàmôi trường Khi vi khuẩn có sẵn những yếu tố gây bệnh thì khả năng khángkháng sinh sẽ làm tăng tính gây bệnh của vi khuẩn lên nhiều lần Khảnăng kháng kháng sinh có thể thay đổi, phụ thuộc vào địa phương, thờiđiểm làm kháng sinh đồ và loại vật nuôi

* Các yếu tố độc tố

Vi khuẩn Salmonella sản sinh ra các độc tố chính là độc tố đường

ruột

(enterotoxin), nội độc tố (endotoxin) và độc tố tế bào (cytotoxin) [35]

Quá trình gây bệnh trong đường tiêu hóa của Salmonella lần đầu

tiên được mô tả bởi một thí nghiệm trên chuột lang vào năm 1967[71] Thí nghiệm cho thấy qua một quá trình sinh sản trên bề mặt

thành ruột, Salmonella sẽ xuyên qua lớp màng và xâm nhập vào bên

trong tế bào biểu mô, đặc biệt ở đoạn hồi tràng Tại đây nó gây tổn thươngcho các tế bào biểu mô ruột Trong giai đoạn này, vi khuẩn bị thực bào,song các đại thực bào không phá hủy được vi khuẩn hoàn toàn Kết quả làsau 24 giờ xâm nhập, vi khuẩn đã phát triển trong đại thực bào và môlympho ruột Đồng thời với sự

phát triển nhanh về số lượng vi khuẩn là việc xuất hiện thể bệnh cấp tính,

sự tập trung các đại thực bào, phản ứng viêm tạo thành huyết khối, gây rốiloạn tuần hoàn cục bộ vi mạch ở lớp dưới niêm mạc Hậu quả là dẫn tới hoại

tử ở niêm mạc ruột tại điểm bị vi khuẩn tấn công Ngoài ra, quá trình gâybệnh của vi khuẩn luôn bắt đầu bằng chứng nhiễm trùng huyết sau và 24 -

72 giờ bệnh nhân mới xuất hiện triệu chứng tiêu chảy dữ dội Khả năng

gây bệnh, tăng độc tố của vi khuẩn Salmonella sẽ tăng lên khi sức đề

kháng của cơ thể giảm

Thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt bò, thịt lợn, thịt gà vàcác sản phẩm được chế biến từ chúng rất khó kiểm soát về độ an toàn vệsinh, trong khi đó lại có nhiều người sử dụng và sử dụng thường xuyênnên nguy cơ ngộ độc có thể xảy ra bất cứ lúc nào và mọi nơi Theo báocáo của Bộ Y tế (2001), hơn 60% thức ăn đường phố và thực phẩm chế biếnsẵn bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh đường ruột Hiện nay thực phẩm được xácđịnh là nguồn lan truyền chủ yếu, ước tính 70% trường hợp tiêu chảy cóliên quan đến thực phẩm ô nhiễm [42] Trong nhóm các vi khuẩn gâybệnh truyền qua thực phẩm, các nhà khoa học đã đặt ra mối quan tâm

nhiều nhất tới vi khuẩn Salmonella.

1.3.2 Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella sống trong phủ tạng của gia cầm, gia súc và

vấy nhiễm vào thịt khi giết mổ Chúng có mặt ở phân và dễ dàng nhiễmvào trứng gia cầm qua những lỗ nhỏ li ti ở vỏ Những thức ăn giàu chất

dinh dưỡng như thịt, cá, trứng, sữa rất dễ bị nhiễm Salmonella trong

quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển nếu không đảm bảo vệ sinh Nhưvậy bất cứ nguồn thực phẩm tươi sống nào có nguồn gốc động vật như thịtgia súc, gia cầm, các sản phẩm bơ sữa, trứng và hải sản và một số loại trái

cây, rau quả đều có thể bị nhiễm Salmonella.

Thông thường, 12-24 giờ sau khi ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩnbệnh nhân thấy đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, đi ngoài phân lỏng, nhứcđầu, nôn nao, khó chịu, ra mồi hôi, mặt tái nhợt, sốt 38-40oC trong 2-4

ngày Salmonella là một trong những thủ phạm chính gây ngộ độc thực phẩm vào mùa hè Ngộ độc do Salmonella có thể biểu hiện từ nhẹ cho tới rất nghiêm trọng và thậm chí gây tử vong Salmonella có khả năng gây

ngộ độc thực phẩm với hậu quả không lường [49]; [64] Chính vì

Salmonella là vi khuẩn nguy hiểm với sức khỏe của con người như vậy

nên yêu cầu vệ sinh tối thiểu đặt ra cho tất cả các loại thực phẩm là khôngđược có loại vi khuẩn này trong

25 gram mẫu thực phẩm [34]

Trong 10 năm trở lại đây, nhiều thông báo trong và ngoài nướccho thấy nguy cơ gia tăng nhanh số người bị bệnh và ngộ độc thực phẩm

do Salmonella Tuy nhiên việc loại bỏ chúng ra khỏi dây truyền sản xuất

chăn nuôi cũng như thực phẩm là vấn đề hết sức khó khăn Nhiều nướctiên tiến trên thế giới có những chương trình phòng chống tích cực, songcho tới nay vấn đề này vẫn chưa thực sự có hiệu quả

Đặc biệt các vụ ngộ độc thường gặp chủ yếu nhất do

Salmonella Typhimurium gây ra Salmonella Typhimurium gây viêm ruột,

thời kỳ ủ bệnh từ 12-24 giờ, có khi ngắn hơn hoặc kéo dài vài ngày Cácdấu hiệu đầu tiên là bệnh nhân thấy nhức đầu, buồn nôn, choáng váng khóchịu, thân nhiệt tăng, sau đó xuất hiện nôn mửa, tiêu chảy nhiều lần, phântoàn nước, đó là triệu chứng của viêm ruột cấp tính do nội độc tố đượcthoát ra khi vi khuẩn bị phân hủy trong máu cũng như trong ruột

Ở Việt Nam, bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở gia súc, gia cầm

đã được biết đến từ lâu nhưng cho đến nay vẫn chưa được nghiên cứunhiều, đặc biệt trong lĩnh vực vệ sinh thực phẩm

1.4 Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella

1.4.1 Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn

Kháng sinh là những hợp chất đặc biệt do vi sinh vật, động vật vàthực vật hay do con người tổng hợp Có tác dụng tiêu diệt, ức chế vi sinhvật với nồng độ rất thấp mà không gây độc cho người và vật chủ [1]

Thuốc kháng sinh được coi là một giải pháp trong việc điều trị cácbệnh do nhiễm vi khuẩn Nhờ có thuốc kháng sinh mà chúng ta có thểkiểm soát được nhiều dịch bệnh Tuy nhiên, hiện nay con người đang sửdụng thuốc kháng sinh chưa hợp lý, chính điều này đang dẫn đến hiệntượng kháng kháng sinh của vi khuẩn

Sự kháng lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn về cơ bản là do gen.Nhờ có gen kháng thuốc mà vi khuẩn có đủ khả năng để chống lại tác dụngcủa thuốc kháng sinh, từ đó mà chúng có thể tồn tại và tiếp tục gây bệnh[68]

1.4.2 Hiện tượng kháng kháng sinh của Salmonella

Trong quá trình liên kết lâu dài với vật chủ, Salmonella có cơ chế tinh vi để điều biến chức năng của tế bào vật chủ Salmonella đã thu

nhận rất nhiều gen liên quan đến tính độc trong quá trình tiến hóa loài,đồng thời các type này

cũng thu nhận các gen kháng kháng sinh từ các loài vi sinh vật khác

Do đó, việc điều trị cho các bệnh nhân bị ngộ độc thực phẩm càng trở nên khó khăn

Vi khuẩn Salmonella có các gen kháng thuốc nằm trong plasmid,

chúng có thể nhân lên và phát tán rộng rãi trong quần thể vi sinh vật.Theo thống kê năm 2000, trong số 27.000 người bị nhiễm khuẩn

Salmonella ở Châu Âu, có tới 43% người nhiễm chủng vi khuẩn kháng lại

với kháng sinh

1.5 Gen kháng kháng sinh

Hiện tượng kháng kháng sinh xảy ra khi mầm bệnh hay vi khuẩnkhông bị diệt bởi thuốc kháng sinh, chúng vẫn tồn tại, sinh sản ra nhữngthế hệ con cháu không có tính cảm ứng với một hay nhiều loại thuốckháng sinh nào đó Có rất nhiều nguyên nhân, như việc sử dụng thuốckháng sinh một cách bừa bãi, không đúng cách, không tôn trọng liềulượng và thời gian trị liệu, cũng như không uống hết số thuốc như bác sĩ đã

kê đơn Ngoài ra việc lạm dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi thú y,ngư nghiệp cũng như đóng góp một phần không nhỏ trong sự hình thànhhiện tượng kháng kháng sinh ở người Cuối cùng là vấn đề dùng các chấtdiệt khuẩn để chùi rửa quá thường xuyên, không đúng chỉ dẫn cũng có thểgiúp sản sinh ra các dòng vi khuẩn có tính kháng thuốc Vi khuẩn tiếpnhận tính kháng thuốc từ nhiều cách Từ các vi khuẩn khác có mang sẵntính chất này hoặc do hiện tượng đột biến tự nhiên nhằm để bảo vệ sự sốngcòn của một sinh vật Tính đề kháng được gắn trên gen của vi khuẩn hoặccũng có thể nằm trong những đơn vị phụ thuộc của nhiễm sắc thể, gọi là

những plasmides Đây là những vòng DNA cực nhỏ và di động Khi vi

khuẩn chết đi, các plasmides này sẽ được thải vào môi sinh và từ đó nhiễmvào các vi khuẩn khác Còn đối với virus khi sinh sản chúng cần phải xâmnhập vào vi khuẩn để trích lấy plasmides và đem truyền sang cho những

vi khuẩn khác Hiện tượng kháng thuốc có thể xảy ra theo một trongnhững cơ chế sau đây: Làm thay đổi mục tiêu tác động của thuốctrên vi khuẩn, vô hiệu hóa thuốc bằng enzyme β-lactamase hoặc làmgiảm độ thẩm

thấu của màng tế bào vi khuẩn lên thuốc không tác động được Cóbằng chứng cho thấy vi khuẩn mang tính kháng thuốc có thể vượt hàngrào chủng loại để truyền đặc tính này sang cho những vi khuẩn của mộtchủng loại khác, thí dụ vi khuẩn gốc ở động vật truyền tính đề kháng sangcho vi khuẩn gốc ở người Ngoài ra, đa số thuốc kháng sinh bên thú yđều có cùng một cơ cấu hóa học như thuốc đồng loại bên người Bởi lý donày cho nên khi một vi khuẩn đề kháng với một loại thuốc thú y thì nócũng có thể đề kháng với các loại thuốc cùng nhóm bên người.

Nhưng không phải “tự nhiên” mà vi khuẩn xuất hiện đoạn gen nguyhại này Theo bác sĩ Yên Lâm Phúc (2011), việc có được gen kháng thuốc

là do một trong những cách thức sau:

Do đột biến, tức là chính thuốc kháng sinh đã làm đột biến hệ vậtchất di truyền của vi khuẩn làm cho hệ vật chất này bị biến đổi Cụ thể ởđây là DNA của vi khuẩn bị biến đổi Sự biến đổi này theo hướng kháng lạithuốc kháng sinh và gen bị biến đổi này được gọi là gen kháng thuốc.Không phải dễ dàng có được sự biến đổi này Sự đột biến chỉ xảy ra khithuốc được sử dụng với liều lượng không đúng quy chuẩn và vi khuẩn cóthể sống sót sau đợt điều trị Những “con” vi khuẩn sống sót này sẽ nhậnbiết và biến đổi DNA để chống lại tác dụng của thuốc kháng sinh vàgen kháng thuốc được tạo thành Tuy nhiên, sự đột biến tự thân của vikhuẩn chưa phải là cách chủ đạo gây ra sự kháng thuốc lan nhanh [65]

Do sự lai tạo của dòng vi khuẩn động vật với vi khuẩn trên người Vikhuẩn gây bệnh trên người có được gen kháng thuốc là do tiếp nhận đượcnhững gen kháng thuốc từ hệ vi khuẩn trên động vật Quá trình nàydiễn ra như sau: ban đầu, vi khuẩn trên động vật kháng thuốc Sau đó,

vì một lý do nào đó, những vi khuẩn này thâm nhập được vào cơ thểngười Những vi khuẩn bị đột biến này sẽ truyền tải gen kháng thuốc theo

cơ chế chuyển gen cho vi khuẩn trên người Vật mang gen kháng thuốc

từ vi khuẩn động vật

sang vi khuẩn người là một “bán sinh thể sống” có tên gọi là plasmid Kết quả là vi khuẩn trên người có khả năng kháng thuốc [65].

Do sự chuyển gen kháng thuốc giữa những vi khuẩn trên lãnh thổquốc gia này sang lãnh thổ quốc gia khác thông qua những chủ thể người

đi du lịch Những người đi du lịch có những vi khuẩn kháng thuốc Họ đisang một quốc gia khác mang theo luôn cả vi khuẩn này Những vi khuẩnnày sẽ truyền gen kháng thuốc cho những vi khuẩn lành ở quốc gia bị tạpnhiễm Kết quả cuối cùng là tạo ra một dòng vi khuẩn kháng thuốc ở chínhquốc gia thứ hai này và từ đó có thể lan ra toàn cầu

Gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào nghiên cứu gen

kháng kháng sinh DT104 của vi khuẩn Salmonella Chủng đa kháng thuốc Salmonella Typhimurium DT104 được phát hiện lần đầu tiên ở người

mắc Salmonellosis tại Anh vào năm 1980 Sau đó được quan sát thấy cả ởngười cũng như vật nuôi trên khắp thế giới vào những năm 90 và hiệnđang là mối quan ngại hàng đầu đối với sức khỏe cộng đồng Gen này

thường xuất hiện ở các chủng S Typhimurium và ít thấy ở các chủng khác Một tổ hợp kháng thuốc điển hình của S Typhimurium DT104 là kháng

đồng thời 5 loại kháng sinh, bao gồm: ampicilin, chloramphenicol,streptomycin, sulfonamide và tetracyline (ACSSuT) [44] Tuy nhiên,không có điều ngược lại, tức là nếu các kết quả xác định lâm sàng chothấy một chủng vi khuẩn kháng với cả 5 loại kháng sinh này thì chưa đủcăn cứ để kết luận là chủng vi khuẩn này có mang gen kháng kháng sinh

DT104 [44] Cũng theo tác giả, có 61,5% số chủng thuộc serotype S.

typhimurium có mang gen DT104.

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Salmonella.

2.1.2 Hóa chất nghiên

cứu

* Các loại hóa chất nghiên cứu và giám định vi khuẩn Salmonella

spp bao gồm: Bufered Peptone Water (CM0509), Muller - KaufmannTetrathionate Broth Base (CM0343), XLT-4 (Xylose Lactose TergitolTM4) Agar (CM1061), Modified Semi-solid Rappaport - Vassiliadis (MSRV)Agar (ISO) (CM1112), Kligler Iron Agar (CM0033), Rambach Agar, BrainHeart Infusion Broth (BHI) (CM1136), Mueller-Hinton Agar (CM0337) củahãng Oxoid Ltd., Basingstoke, United Kington Nutrient Agar (Merck1.05450, Germany)

* Bộ kháng huyết thanh Salmonella polyvalent O, Salmonellamonovalent O6, O7, O3, O10 và monovalent Hf,g; He,h và Hl,w (SIFIN,Berlin, Germany)

* Các loại khoang giấy kháng sinh gồm: Streptomycine 68798), Ampicillin (AMN 2-67288), Cephalothin (CF-66218),Amoxicillin (AMX-

(SPT-66138), Gentamycin (GME 30-67318), Tetracycline (TE-67448),Ciprofloxacin (CIP-68648), Ceftazidime (CAZ-66308),Trimethoprime/Sulfamethoxazol (SXT-68898) (Biorad, France)

* Các loại hóa chất dùng trong tác chiết RNA, tổng hợp cDNA, chạyphản ứng RT-PCR và thực hiện các phản ứng sinh học phân tử, bao gồm:TRIZOL® Reagent (Cat No 15596-018, Ambion RNA - Life Technologies,

CA, USA); Isopropyl alcohol (Cat No Darmstadt, Germany); Ethanol(Cat

No M1705), Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Cat.

No N2515), Random Primers (Cat No C1181), dNTP Mix (Cat No.U1515) của hãng Promega Corporation (Madison, WI, USA); i-TaqTMDNAPolymerase (Cat No 25022, iNtRON Biotechnology, Inc., Korea); DEPC-treated water (Cat No AM9916, Ambion RNA - Life Technologies, CA,USA), RNase- free water

* Các cặp mồi xuôi, mồi ngược: 16S, tetA, sull II, avrA, aadA,

blaTEM, gyrB, prmA (nguồn gốc do phòng nghiên cứu hệ gen thiết kế).

* Các vật tư tiêu hao dùng trong các phản ứng sinh học phân

-Các chủng Salmonella spp dương tính được giữ giống trên môi

trường

BHI có bổ sung glyxerin, bảo quản ở -20oC

2.2.2 Định type vi khuẩn Salmonella

Tiến hành xác định serovar của các chủng Salmonella spp phân lập

được bằng các phản ứng ngưng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm,

sử dụng kháng huyết thanh O và H chuẩn (của hãng Denka Seiken Co.,Ltd Tokyo, Nhật Bản), sau đó đối chiếu theo bảng phân loại củaKaufmann and White Popof (2001)

Bước thứ nhất là kiểm tra khả năng tự ngưng kết của vi khuẩn bằngcách nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên phiến kính sạch Sau đó, dùngque cấy vòng lấy một lượng sinh khối vừa đủ trên môi trường thạchthường, trộn đều nhẹ nhàng trong vòng 30 - 60 giây thành huyễn dịch,quan sát kết quả trên nền tối, tốt nhất là sử dụng kính lúp Nếu huyễndịch vẫn đục đều thì tiến hành thực hiện phản ứng kháng huyết thanh vớikháng nguyên O và H Chỉ thử phản ứng ngưng kết kháng nguyên vớinhững khuẩn lạc thuần không có khả năng tự ngưng kết Quy trình thửngưng kết kháng nguyên O thực hiện giống như thử nghiệm tự ngưngkết, nhưng thay thế giọt nước muối sinh lý bằng kháng huyết thanh Ohoặc H Phản ứng dương tính khi xuất hiện những hạt nhỏ trắng li ti ở đáycủa huyễn dịch, phản ứng âm tính khi huyễn dịch vẫn đục

2.2.3 Thử khả năng kháng kháng sinh

Tất cả các chủng Salmonella Typhimurium phân lập được thử khả

năng mẫn cảm kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch.Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành thử tính mẫn cảm kháng sinhvới 7 loại kháng sinh bao gồm: Tetracyline, Sulfonamides,Chloramphenicol, Aminoglycosides, Aminoglycosides, Betalactams,

Quinolones, Colisin Các chủng Salmonella Typhimurium phân lập được

thực hiện kháng sinh đồ trên thạch, sử dụng các khoanh giấy kháng sinh

có kích thước 6mm đặt lên đĩa thạch, nuôi cấy ở

37oC/24h Đo đường kính của vòng vô khuẩn và so sánh với tiêu chuẩnđánh giá của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và phòng thí nghiệm, Mỹ (TheClinical an Laboratory Standards Institute, CLSI: 2013).

2.2.4 Phương pháp xác định một số gen kháng kháng sinh của chủng

Salmonella Typhimurium bằng phương pháp

RT-PCR

* Tách chiết RNA tổng số:

Chủng vi khuẩn Salmonella được lựa chọn, nuôi cấy trên môi

trường thạch dinh dưỡng Nutrient Agar Tăng sinh trong môi trườngBrain Heart Infusion Broth (BHI) để thu được canh khuẩn đạt nồng độ 108dùng tách RNA

Quy trình tách RNA thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.Tóm tắt quả trình đó như sau:

- Lấy 1ml dịch canh khuẩn đạt nồng độ 108 vào ống Eppendorf 1,5ml,

ly tâm 14.000 rpm/10 phút/ 4oC Đổ phần dịch ở trên, giữ lại phần cặndưới đáy ống

- Thêm 1ml dung dịch TRIzol vào ống Eppendorf 1,5ml Nghiền cặnbằng máy sonicate trong 1 phút để hòa tan hoàn toàn

- Thêm 0,2 ml chloroform/1ml TRIzol Trộn đều phần dịch tron 15giây bằng máy vortex