Nghiên cứu tạo hạt nano polymer bọc alpha mangostin và bước đầu đánh giá hoạt tính kháng ung thư in virtro của hạt tạo được

-Hiện nay, các loại thuốc điều tri ung thư thường không mang lại hiệuquả mong muốn do một số nguyên nhân như tính hướng đích đặc hiệu chưacao và hiệu quả thâm nhập khối u kém vì khả

Luận văn Thạc sỹ Khoa

LỜI CẢM ƠN

Trong qua trình thực hiện luận văn khoa học, tôi đa nhận được rất nhiều sư giúp đỡ, khích lê va động viên của cac Thầy, Cô giao, cac bạn đồng nghiêp, bạn bè va những người thân trong gia đình Qua đây, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình đến những ca nhân va tập thể đa hết lòng giúp đơ để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này.

-Trước hết, tôi xin bày to lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thi Mai Phương, phòng Sinh hóa Thực vật, Viên Công nghê sinh học, Viện Han lâm Khoa học va Công nghê Viêt Nam đa tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể tìm hiểu, nâng cao kiến thức trong suốt qua trình học tập, thực hiên nghiên cứu va hoan thiên bản luận văn này.

Tôi xin cảm ơn Đảng ủy, lãnh đạo, chỉ huy va can bô phòng Kỹ thuật hình sư - Công an thanh phố Ha Nội đa tạo điều kiên giúp đơ trong thời gian tôi đi học.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình thân yêu, bạn bè, người thân va đồng nghiệp - những người đa luôn luôn ở bên tôi, luôn động viên, khích lê

va la chô dựa vững chắc cho tôi trong suốt qua trình học tập va nghiên cứu.

Ha Nội, thang năm 2017

Học viên

Luận văn Thạc sỹ Khoa

AMG Alpha – magostin

DLS Dynamic light scattering

EPS Exopolysaccharide

FESEM Field emission scanning electron microscopy

HPLC High performance liquid chromatography

NMG Nanomagostin

NMR Nuclear magnetic resonance

TLC Thin layer chromatography

FBS Fetal Bovine Serum

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 Bệnh học ung thư 9

1.1.1 Các giai đoạn phát triển của bệnh ung thư 10

1.1.2 Nguyên nhân gây ung thư 11

1.1.3 Các liệu pháp điều tri ung thư 11

1.1.4 Tình hình bệnh ung thư trên thế giới và Việt Nam 13

1.2 Công nghệ nano và ứng dụng 15

1.2.1 Hệ dẫn thuốc cấu trúc nano 16

1.2.2 Đặc điểm của hạt nano 17

1.2.3 Nghiên cứu về vật liệu nano phục vu y học tại Viêt Nam 18

1.3 Khái quát về β-cyclodextrin 19

1.3.1 Cấu trúc của β-cyclodextrin 19

1.3.2 Tính chất của β-cyclodextrin 20

1.3.3 Ứng dụng của β-cyclodextrin 22

1.4 Alpha-mangostin, chất kháng ung thư tiềm năng tư vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) 23

1.4.1 Đặc điểm sinh học 23

1.4.2 Các chất xathone trong măng cụt 24

1.4.3 Tác dụng sinh học của các chất xanthone trong cây măng cut 25

1.4.4 Alpha- mangostin tư vỏ của quả măng cụt (Garcinia mangostana L) 27

1.5 Y tưởng nghiên cứu của đề tài 28

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

2.1 Dòng tế bào ưng thư và các điều kiện nuôi 29

2.2 Nguyên liệu thực vật 30

2.3 Hóa chất, thiết bị 30

2.3.1 Hóa chất 30

2.3.2 Thiết bi 30

2.4 Phương pháp nghiên cứu 31

Luận văn Thạc sỹ Khoa

2.4.1 Tinh sạch AMG tư vỏ quả măng cụt 31

2.4.2 Tạo hạt nano polyme micelle bọc AMG (nanomangostin) và đánh giá các đặc trưng của hạt 32

2.5 Hoạt tính gây độc lên dòng tế bào ung thư phổi A549 33

2.6 Đánh giá sự thâm nhập của hạt NMG vào tế bào 34

2.7 Đánh giá ảnh hưởng của NMG đến kích thước nhân tế bào 34

2.8 Xư ly thống kê 34

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Nghiên cứu quy trình tinh sạch AMG tư vỏ quả măng cụt 34

3.1.1 Tách chiết phân đoạn có chứa AMG tư vỏ quả măng cụt 34

3.1.2 Tinh sạch AMG tư vỏ quả măng cụt 37

3.2 Chế tạo hạt nano polymer bọc mangostin (nanomangostin)-NMG 46

3.2.1 Tổng hợp hạt NMG 46

3.2.2 Tối ưu hóa các thông số tạo hạt NMG 48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56

KẾT LUẬN 56

ĐỀ NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

Tài liệu tiếng Việt 57

Tài liệu tiếng Anh 58

Nguồn trích dẫn URL 61

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BÔ CỦA TÁC GIẢ 62

PHỤ LỤC 64

DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 1.1 Công thức hóa học một số xanthone có trong vỏ quả

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của ti lệ trộn của chất mang β - cyclodextrin

Luận văn Thạc sỹ Khoa

DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

Hình 3.1 Sắc ky đô phân đoạn chiết vỏ quả măng cụt trong ethanol

Hình 3.2 Sắc ky đô phân đoạn n-hexane sư dụng phương pháp sắc

Hình 3.3 Sắc ky cột silica gel phân đoạn chiết n-hexane của vỏ quả

Hình 3.4 A Sắc ky đô AMG tinh sạch tư vỏ quả măng cụt với hệ

Hình 3.6 Phô Proton (A) và 13C (B) của chất AMG đo trên máy

Hình 3.7 Phô MS của chất AMG đo trên máy LC-MS, Avance

Hình 3.10 Dung dịch NMG thu được sư dụng chất mang

β-cyclodextrin

49

Hình 3.14 Hoạt tính gây độc tế bào của NMG tan trong nước lên

dòng tế bào ung thư A549

Luận văn Thạc sỹ Khoa

MỞ ĐẦU

Theo thống kê của Bô Y tế, hàng năm, Việt Nam có khoảng 150.000 200.000 người mắc bệnh ung thư mới và khoảng 75.000 - 100.000 người tưvong vì căn bệnh này Công bố của tô chức Y tế thế giới (WHO) 4/2014 chothấy Việt Nam thuộc thuộc nhóm thư hai các quốc gia dẫn đầu về ti lệ mắcbệnh này Phần lớn các bệnh nhân ung thư ở Việt Nam (khoảng 70%) chi đếnbệnh viện điều tri khi đa quá muộn, khiến cho cơ hội chữa khỏi bệnh rất thấp.Theo thống kê, tỷ lệ chữa khỏi bệnh ung thư ở Việt Nam là 35% Ung thưđang là nguyên nhân thư hai gây tư vong ở Việt Nam và thực sự là mối quantâm của cả quốc gia

-Hiện nay, các loại thuốc điều tri ung thư thường không mang lại hiệuquả mong muốn do một số nguyên nhân như tính hướng đích đặc hiệu chưacao và hiệu quả thâm nhập khối u kém vì khả năng hòa tan của thuốc thấp.Đặc biệt, những thuốc tự nhiên đang được sư dụng hiện nay trong điều triung thư như paclitaxel, doxorubixin, curcumin, có tính tan rất kém (ví ducurcumin chi đạt

0,001%), vì thế khả năng xâm nhập khối u cũng như điều tri bệnh rất hạnchế

Ứng dụng công nghệ nano vào y học bằng cách dùng các dạng vật liệu

ở kích thước nano để tương tác với yếu tố sinh học ở mức tế bào hay xuốngthấp hơn nữa ở cấp phân tử, ví du dẫn thuốc đến các tế bào bệnh và chẩnđoán bệnh ở mức phân tư đa được chứng minh là tăng tính sinh khả dụng,hướng đích, giảm liều dùng nhờ khả năng bảo vệ dược chất và giảm thải trưthuốc trong cơ thể

Luận văn Thạc sỹ Khoa

minh là có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm và ức chế sự phát

triển của các dòng tế bào ung thư rất cao Phân tích in vitro cũng khẳng định

6–12 μM đồng thời làm giảm sự biểu hiện của BcL-2 DNA β-catenin AMGcảm ứng apoptosis ở các tế bào ung thư đa được nhiều nghiên cứu khăngđịnh AMG đưa vào cơ thể theo đường uống cũng làm giảm sự phát triển củakhối u ở chuột Các nghiên cứu gần đây của Nguyen và cộng sự [20] cho thấyAMG có khả năng ức chế có hiệu quả sự hình thành biofilm của vi khuẩn

gây sâu răng ở người là Streptococcus mutans Ngoài ra, AMG còn có tác

M Vì thế, việc nghiên cứu và ứng dụng chất này đa và đang thu hút sựquan tâm của rất nhiều nhà khoa học trong suốt hơn một thập kỷ qua Tuynhiên, cũng giống như curcumin và paclitaxel, khả năng hòa tan chất nàytrong nước rất thấp (chi đạt 0,0002%), do đó đa hạn chế lớn hoạt tính sinhhọc của nó Cho đến nay, ngoài việc nghiên cứu tổng hợp những dẫn suấtmới của nó để tăng cường tính tan và hiệu quả tác dụng thì cũng đa bắt đầuxuất hiện một số nghiên cứu trên thế giới về việc nâng cao tính tan của AMG

sư dụng phương pháp tạo hạt nano (nanomangostin) để xư ly các bệnh liênquan đến ung thư Các kết quả thu được là rất khả quan nhưng vẫn cần phải

có những nghiên cưu tiếp tục đi sâu hơn nữa nhằm tạo được hệ hạt tối ưu, cótính sinh, khả dụng cao, có khả năng ứng dụng thực tiễn

Đề tài luận văn này nhằm tạo hạt nano polymer bọc mangostin(nanomangostin) để làm tăng tính tan và sinh khả dụng của chất AMG, tạo

cơ sở để ứng dụng chúng trong xư ly các bệnh ung thư

Ung thư là căn bệnh của tế bào, đơn vi của cơ thể sống Đây là một thuậtngữ để chi một nhóm các bệnh liên quan đến việc các tế bào tăng trưởng mộtcách bất thường, thoát khỏi mọi cơ chế kiểm soát của cơ thể, gây tổn hại đếncác tế bào bình thường và cuối cùng khiến cơ thể bi tư vong [14].

Bình thường, các tế bào của cơ thể phát triển, phân chia và chết một cáchtrật tự theo quy định của cơ thể (gọi là chết theo chương trình - Apoptosis).Khi bi ung thư, tế bào phân chia bất thường, không kiểm soát tạo thành cáckhối u, di căn khắp cơ thể gọi là ung thư [12]

Ung thư là vấn đề sức khỏe của con người trên toàn thế giới và là mộttrong nguyên nhân hàng đầu gây tư vong trên toàn câu Hiện nay đa phânthành

5 loại ung thư theo nguồn gốc tế bào: i)Ung thư biểu mô Carcinoma: là loại

ung thư phô biến nhất, chiếm tới 80% tổng số loại ung thư Chúng được sinh

ra tư các tế bào biểu mô, là loại tế bào bao phủ các bề mặt của da và cơ quan

nội tạng; ii)Ung thư Sarcoma:là loại ung thư xuất hiện tư những thay đổi trong tế bào của cơ bắp, xương, mỡ, hoặc mô liên kết; iii)Ung thư Leukaemia:

là dạng ung thư các tế bào bạch câu ác tính; iv)Ung thư Lymphoma va Myelmas: là dạng ung thư của tế bào thuộc hệ thống miễn dịch như hệ bạch huyết, tủy xương; v)Ung thư hê thống thần kinh: là dạng ung thư bắt nguồn tư

các mô của nao và tủy sống [12]

1.1.1 Các giai đoạn phát triển của bệnh ung thư

-Giai đoạn khởi phát

Bắt đầu tư khi tế bào gốc tiếp xúc với các tác nhân gây đột biến Quátrình này diễn ra rất nhanh, hoàn thành trong một vài giây và không thay đổiđược Trong cuộc đời, con người có rất nhiều tế bào cơ thể trải qua giai đoạnnày, nhưng không phải tế bào nào cũng phát sinh bệnh Đa số các tế bào khởiphát hoặc là không tiến triển hoặc là chết đi, hoặc bi hệ miễn dịch của cơ thể

vô hiệu

hóa

Luận văn Thạc sỹ Khoa

học -Giai đoạn tăng trưởng, thúc đẩy, chuyển biển Nguyễn Trung Hợp

Ở giai đoạn này các tế bào ung thư còn ở mức đô nhỏ, cư trú ở một mônào đó trong cơ thể.

-Giai đoạn lan tràn

Giai đoạn này có thể kéo dài vài tháng hoặc vài năm Các khối u tăngsinh, gia tăng có thể tư 100 đến 1 triệu tế bào Tuy nhiên khối u trong giaiđoạn này cón quá nhỏ để phát hiện bằng phương pháp phân tích được

-Giai đoạn tiến triển – xâm lấn – di căn

Giai đoạn này là sự tăng lên kích thước của khối u Đây là giai đoạn khối

u phát triển nhanh Trong giai đoạn này các tế bào ung thư không chi pháttriển ở cơ quan đầu tiên xuất hiện, mà còn xâm lấn, di căn sang khác mô, tôchức khác của cơ thể

1.1.2 Nguyên nhân gây ung thư

Có rất nhiều tác nhân gây ung thư, tất cả đều liên quan đến sự đột biếncủa các tế bào trong cơ thể dẫn đến sự tăng sinh mất kiểm soát của các tế bàonày

Các tác nhân gây đột biến như hóa chất độc hại, tia phóng xạ, các virusung thư làm cho các tế bào bình thường bi đột biến gen hoặc nhiễm sắc thể.Đâu tiên tế bào bi mất khả năng kiểm soát sự phân chia và liên kết tế bào Vậtliệu di truyền (DNA) của một tế bào bi thay đổi hoặc hư hỏng, làm tăng sinh

vô tô chức các tế bào “lỗi”- tế bào ung thư Các tế bào ung thư này không chết

đi theo chương trình được lập trình sẵn (apoptosis) như các tế bào bình thường

mà tiếp tục tăng sinh và nhân lên mất kiểm soát tạo thành một khối lớn gọi làkhối u Các khối u có khả năng di căn sang các phần khác gọi là u ác tính hay

là ung thư

1.1.3 Các liệu pháp điều tri ung thư

Điều tri ung thư có nhiều phương pháp, tùy thuộc vào từng loại ung thư

mà sư dụng phương pháp cho phù hợp hay kết hợp nhiều phương pháp điều tricùng một lúc Theo Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI), hiệp hội ung

Luận văn Thạc sỹ Khoa

thư Hoa Kỳ (ACS) điều tri ung thư có thể chia thành một số nhóm lớn phươngpháp sau [32]:

-Phương pháp phẫu thuật: Phẫu thuật có thể được sư dụng để chuẩn

đoán, điều trị, hoặc thậm chí ngăn ngừa ung thư trong một số trường hợp Hâuhết những người bi ung thư sẽ có một số loại phẫu thuật Đây là phương phápphô biến và đem đến cơ hội lớn nhất để chữa bệnh, đặc biệt là nếu ung thưchưa ở giai đoạn di căn đến các bô phận khác của cơ thể

-Phương pháp xạ trị: Xạ tri sư dụng các hạt năng lượng cao hoặc sóng

để tiêu diệt tế bào ung thư Nó là một trong những phương pháp điều tri phôbiến nhất đối với một số bệnh ung thư ở dạng không thể phẫu thuật hoặc hóatrị Phương pháp này có thể sư dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với các hình thứcđiều tri khác

-Phương pháp hóa trị: là sư dụng các loại thuốc để điều tri bệnh ung

thư Hóa tri hoạt động bằng cách ngăn hoặc làm chậm, làm ngưng sự tăngtrưởng của tế bào ung thư Hóa tri tiềm ẩn nhiều tác dụng phụ, không chi giếtchết tế bào ung thư mà còn có thể giết hoặc làm ảnh hưởng nghiêm trọng tớihoạt động của các tế bào khỏe mạnh

-Phương pháp miễn dịch: Liệu pháp miễn dịch điều tri là sư dụng hệ

thống miễn dịch của cơ thể để chống lại bệnh ung thư Có một số loại liệupháp miễn dịch, bao gồm các kháng thể đơn dòng (rituximab) và trastuzumab(Herceptin), miễn dịch không đặc hiệu (interferon, interleukins, các cytokine)

và vắc xin ung thư

-Phương pháp hướng đích: là một loại mới hơn của điều tri ung thư, sư

dụng thuốc để tấn công trực tiếp vào các tế bào ung thư, thường là không gâytổn hại đến các tế bào bình thường Liệu pháp này là nền tảng của y học chính

Luận văn Thạc sỹ Khoa

đơn dòng Thuốc phân tư nhỏ là đủ nhỏ để dễ xâm nhập vào bên trong tế bào,

vì vậy chúng được sư dụng cho các đích bên trong tế bào Ngược lại, cáckháng thể đơn dòng là loại thuốc mà không xâm nhập vào tế bào một cách dễdàng Thay vào đó, chúng gắn với các mục tiêu cu thể trên bề mặt ngoài của

tế bào ung thư

Hiện nay, trên thế giới có một số hệ nano polymer mang thuốc điều triung thư đa và đang được thư nghiệm lâm sàng pha III được sư dụng trongtiêm truyền tĩnh mạch như: Genexol-PM® là một dạng nano polymermethoxypoly (ethylene glycol)-block-poly(D,L-lactic) (mPEG-PDLLA) (dùngtrong điều tri ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt) đa vàđang được thư nghiệm ở lâm sàng pha II đối với ung thư tuyến tụy Kết quảbước đầu cho thấy, Genexol PM làm tăng hàm lượng paclitaxel trong máu,

hệ nano polymer dẫn truyền leuprolide acetate dùng để tiêm dưới da trênnhững bệnh nhân ung thư tuyến tụy và ung thư vú Các kết quả lâm sàng phaIII cũng đang được theo dõi [30] Paclitaxel poliglumexvới tên thương mại làOpaxio® đang sư dụng trong điều tri ung thư buồng trứng, ung thư phổi tế bàokhông nhỏ và ung thư não là một loại thuốc dạng nano được tạo nên tư sự kếthợp các phân tư paclitaxel với các phân tư polymer polyglutamate tan đượctrong nước cũng đang được thư nghiệm lâm sàng ở pha III [33]

1.1.4 Tình hình bệnh ung thư trên thế giới và Việt Nam

Ung thư là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tư vong trên thếgiới, với khoảng 14 triệu trường hợp mới vào năm 2012.Số ca bệnh mới sẽtăng khoảng 70% trong vòng 2 thập kỷ tới.Ung thư đa gây tư vong cho 8,8

Tác động kinh tế của ung thư là rất đáng kể và đang gia tăng Tổng chi phíkinh tế hàng năm cho ung thư trong năm 2010 ước tính khoảng 1,16 nghìn tỷ

đô la Mỹ [35]

Một điểm đáng lưu y khác là ti lệ người mắc bệnh ung thư ở các nướcphát triển (nước giàu) và các nước đang phát triển và các nước nghèo đa dầndân thay đổi theo thời gian Các nước nghèo có ti lệ mắc ung thư tăng dân lên

và giảm đi ở các nước giàu Trong đó các loại ung thư đại trực tràng, tiền liệttuyến thường gặp ở các nước giàu Nhưng ở các nước đang phát triển chủ yếugặp các loại ung thư cô tư cung, vòm họng, gan, thực quản…Một số loại ung

thư thường gặp xếp theo thư tự phô biến như sau: i) Ung thư phổi: (chiếm khoảng 12,4% các loại ung thư); ii) Ung thư dạ day: ước tính có khoảng 934.000 bệnh nhân loại ung thư này mới mắc hàng năm; iii) Ung thư vu: là loại

ung thư thường gặp nhất ở nữ (chiếm khoảng 23% tổng số các loại ung thư);

iv) Ung thư đại trực trang: chiếm khoảng 9,4% tổng số các loại ung thư; v) Ung thư gan: chiếm khoảng

5,7% tổng số các loại ung thư và có liên quan mật thiết với tiền sư viêm ganvirus B và C

Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc và tư vong hàng năm do căn bệnh này rất đáng báođộng Theo thống kê, có đến hơn một nửa số bệnh nhân ung thư đi khám đa ởgiai đoạn muộn (khoảng 80%) hoặc quá muộn

Tại Việt Nam, các loại bệnh ung thư hiện nay có tỷ lệ mắc và tư vong tùythuộc vào giới tính Theo đó, ở nam giới 10 căn bệnh ung thư thường hay mắcphải nhất đó là: ung thư phổi, dạ dày, da, đại trực tràng, thực quản, máu, tuyếntiền liệt, khoang miệng Còn ở phu nữ, 10 loại ung thư có tỷ lệ mắc cao nhất

đó là: ung thư vú, ung thư đại trực tràng, phế quản - phổi, cô tư cung, dạ dày,giáp trạng, gan, buồng trứng, hạch và máu [31]

Tóm lại, tư những dẫn liệu trên có thể thấy rằng tỷ lệ mắc ung thư trên thếgiới cũng như ở nước ta ngày một gia tăng Việc nghiên cứu đưa ra các kỹ

Luận văn Thạc sỹ Khoa

thuật và áp dụng các phương pháp điều tri mới, cũng như việc phát hiện sớm,chẩn

đoán đúng và tăng cường công tác phòng chống căn bệnh này là rất cần thiết, có

y nghĩa thực tiễn cao

1.2 Công nghệ nano và ưng dung

Công nghệ Nano là công nghệ sư dụng kỹ thuật phân tư để xư ly nhữngyếu tố mang tính chất siêu vi mô Nói cách khác, công nghệ nano được coi làcông nghệ siêu nhỏ Thậm chí, chúng được sư dụng chi với tỷ lệ bằng1/80.000 so với bề dày của một sợi tóc Công nghệ nano được coi như mộtbước ngoặt của khoa học kỹ thuật thế giới

Ứng dụng công nghệ nano vào y học bằng cách dùng các dạng vật liệu ởkích thước nano để tương tác với yếu tố sinh học ở mức tế bào hay xuống thấphơn nữa ở cấp phân tử, ví du dẫn thuốc đến các tế bào bệnh và chẩn đoán bệnh

ở mức phân tư đa được chứng minh là tăng tính hướng đích, giảm liều dùngnhờ khả năng bảo vệ dược chất và giảm thải trư thuốc trong cơ thể (Hình 1.1)[8, 16]

Hình 1.1 Các ưu điểm của hê dẫn thuốc nano [16]

Nhằm kéo dài hiệu lực của thuốc và hạn chế các tác dụng phu do thuốcgây ra, người ta có nhiều giải pháp khác nhau, trong đó có giải pháp quantrọng là đưa thuốc vào các chất mang Việc đưa thuốc vào chất mang sẽ cho

các ưu điểm sau: i) Có khả năng vận chuyển chọn lọc đến các tế bào mang bệnh; ii)

Luận văn Thạc sỹ Khoa

Tăng thời gian bán thải của thuốc do vậy giảm số lần sư dụng thuốc; iii) Đôi

khi làm xuất hiện những tác dụng sinh học mới so với thuốc ban đầu (Hình1.2)

Hình 1.2 Cac yếu tố ảnh hưởng tới hê dẫn thuốc: vật lý (kích thước, hình thai, phân hủy của polyme), dược động học (tương tác thuốc-chất mang) va

sinh học (hấp phụ protein, tương thích, hướng đích).

1.2.1 Hệ dẫn thuốc cấu trúc nano

Các kết quả của các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy:quá trình vận chuyển thuốc có thể được nâng cao hiệu quả nhờ những chấtmang thuốc (drug delivery system) có kích thước nano như polymer cấu trúcnano, micelle, dendrimer, liposome, cấu trúc virut, và ống nano carbon (Hình1.3) Để đảm bảo an toàn, những chất mang phải có dung lượng thuốc manglớn, thời gian lưu thông trong hệ tuần hoàn đủ dài và thuốc tập trung đượctrong những khu vực có triệu chứng bệnh ly

Hình 1.3: Hình ảnh minh họa cấu truc cac loại nano dẫn thuốc

Có rất nhiều nghiên cứu đa được thực hiện để phát triển các chất mangdạng keo cho các dược chất, bao gồm polymer cấu trúc nano, micelle,liposome và nhu tương lipid nhằm mở rộng các lợi ích của thuốc cho các ứngdụng lâm sàng Mặc dù vậy, nhu tương lipid và liposome không thể giữ thuốctrong cơ thể trong thời gian dài Ngược lại, hạt micelle và polymer thể hiện làchất mang có triển vọng hơn trong việc ổn định thuốc [17,28]

1.2.2 Đặc điểm của hạt nano

Để dẫn thuốc đến đích (ví du như khối u) hiệu quả thì các hạt nano phải

có khả năng tồn tại trong mạch máu với thời gian tương đối dài mà không biđào thải Các hạt nano có bề mặt không được biến đổi thường bi bắt giữ bởi hệlưới nội mô (reticuloendothelial) ở thận và lá lách Mức đô bi bắt giữ phuthuộc vào kích cỡ và bề mặt của hạt nano Nghĩa là sự phân bố của các hạtnano sau khi tiêm vào cơ thể phu thuộc vào kích thước và cấu trúc bề mặt củahạt

Một trong những ưu điểm của hạt nano là có thể chủ động điều chỉnhkích cỡ Chúng cần phải đủ lớn để tránh dò ri ra ngoài mao mạch nhưng phải

đủ nhỏ để thoát khỏi hoạt động của đại thực bào trong hệ Res ở gan, thận.Kích cỡ của vòng huyết quản (sinusoid) trong lá lách và khe (fenestra), trong

tế bào Kuffer ở gan biến đổi tư 150 đến 200 nm và khoảng cách giữa các tế

Luận văn Thạc sỹ Khoa

bào của lớp nội

mô trong khối u khoảng 100 đến 400 nm Do đó, kích thước hạt nano phải nằm trong khoảng kích cỡ này để có thể tiếp cận khối u.

Đặc điểm bề mặt của hạt nano cũng là yếu tố quan trọng xác định tuổi thọ

và sự phân bố của chúng trong hệ tuần hoàn liên quan đến sự bắt giữ của cácđại thực bào Hạt nano ly tưởng phải có bề mặt ưa nước để phân tán tốt trongmôi trường cơ thể Điều này có thể đáp ứng bằng cách bọc trên bề mặt của hạtnano một lớp polymer ưa nước như PEG (polyethylene glycol), Vitamin E-TPGS, O-carboxylmethyl chitosan, alginat, glucan hoặc BSA (Bovine serumalbumin) để bảo vệ chúng khỏi sự opsonine hóa [17]

1.2.3 Nghiên cưu về vật liệu nano phuc vu y học tại Việt Nam

Tại Việt Nam, một số cơ sở nghiên cứu trong nước đa và đang nghiêncứu, ứng dụng thư nghiệm các cấu trúc nano phục vu điều tri trong y học Cóthể kể đến là Viện Khoa học vật liệu, Viện Hóa học, Viện Công nghệ sinhhọc, Viện Khoa học vật liệu ứng dụng… thuộc Viện Hàn lâm Khoa học vàCông nghệ Việt Nam; Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại họcQuốc gia Hà Nội; Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Sinh y dược học thuộcHọc viện Quân Y [13] Điều này mở ra triển vọng nghiên cứu phát triển vàứng dụng công nghệ nano cho các nguồn nguyên liệu tự nhiên sẵn có khác tạiViệt Nam

Đặc biệt, gần đây Phạm Hữu Ly và cộng sự (Viện Hoá học) đa sản xuấtthành công ở quy mô pilot nanocurcumin tư củ nghệ vàng (sư dụng sóng siêu

âm cao tân biến curcumin thành những phân tư kích thước nano và dùng cácpolyme thân nước như Poly L- glutamic acid (PLGA) tương thích sinh học đểbảo vệ các hạt curcumin, giữ chúng ở kích thước khoảng 100 nm, phân tán tốttrong môi trường nước, hấp thu tới 95% Sản phẩm viên nang mềmCumarGold đa được thư hoạt tính sinh học trên các dòng tế bào ung thư tạiTrung tâm ung thư thực nghiệm, Đại học Quốc Gia Hà Nội trước khi đượccông ty Cô phần Dược Mỹ phẩm CVI tiếp thi và phân phối đưa ra thi trường

Luận văn Thạc sỹ Khoa

Nghiên cứu ứng dụng hạt Nano-Y dược (Redox Nano Particles – RNP)trong điều tri bệnh viêm đại tràng, bệnh ung thư, bệnh tim mạch… cũng đađược nhóm nghiên cứu của Vòng Bính Long, Trường Đại học Khoa học và Tựnhiên Thành phố Hô Chí Minh thục hiện trong thời gian qua

1.3 Khái quát về β-cyclodextrin

1.3.1 Cấu trúc của β-cyclodextrin

β-cyclodextrin là một trong những cyclodextrin thuộc họ oligosaccharidevòng với lỗ hổng trung tâm ưa chất béo và bề mặt ngoài ưu nước Phân tư β-cyclodextrin chưa số lượng hydro cho và nhận tương đối lớn β-cyclodextrinđược mô tả đâu tiên bởi Villier vào năm 1891 Các tên khác thường sư dụng làcyclomylose, cyclomalto oligosaccharide, cyclomaltose hoặc Schardingerdextrin

Phân tư β-cyclodextrin chứa bảy đơn vi α-D-glucopyranose được liên kếtbằng liên kết α-1,4-glucoside Cấu trúc của phân tư β- cyclodextrin được trìnhbày ở hình 1.4

Hình 1.4: Hình ảnh minh họa cấu truc phân tử β-cyclodextrin

Do sự hình thành cấu tạo ghế của các đơn vi glucopyranose, phân tư

β-đường Vi trí lỗ hổng hẹp của β-yclodextrin có các nhóm hydroxyl bậc một vàđược gọi là mặt thư nhất Ngược lại, vi trí lỗ hổng rộng của β-cyclodextrin cócác nhóm hydroxyl bậc hai và được gọi là mặt thư hai Sự khác nhau giữa cácnhóm hydroxyl bậc một và bậc hai cho phép hình thành chưc năng chọn lọctrên rìa bậc một và bậc hai Đường kính mặt ngoài của phân tư β-cyclodextrin

là 1,54 nm, đường kính lỗ hổng 0,60- 0,65nm

1.3.2 Tính chất của β-cyclodextrin

1.3.2.1 Tính chất lý-hóa của β-cyclodextrin

β-cyclodextrin ổn định về mặt hóa học trong các dung dịch kiềm, dễ bithủy phân trong điều kiện acid mạnh Tuy nhiên, β-cyclodextrin có nhiều khảnăng chịu được sự thủy phân được xúc tác với acid hơn so với dextrin tuyếntính Sự thủy phân trong acid của β-cyclodextrin được nghiên cứu bởi

Schonberger et al (1988) Liên kết glycoside trong β-cyclodextrin ổn định

giống như liên kết glycoside trong oligosaccharide tuyến tính

β-cyclodextrin có đô hòa tan trong nước thấp hơn nhiều so với dextrintuyến tính hay nhánh và thấp hơn so với saccharide không vòng Điều này là

do sự liên kết tương đối mạnh của các phân tư β-cyclodextrin ở trạng thái tinhthể (năng lượng mạng tinh thể tương đối cao) Hơn nữa, β-cyclodextrin hìnhthành liên kết hydro nội phân tư giữa các nhóm hydroxyl bậc hai, chính điềunày làm giảm số lượng các nhóm hydroxyl có khả năng hình thành các liênkết hydro với các phân tư nước xung quanh Các lực tương tác này làm ổnđịnh vòng lớn của β-cyclodextrin và là nguyên nhân ngăn ngừa sự hydrate hóacác phân tư nước Tuy nhiên, khi nhiệt đô tăng thì đô tan tăng nhanh Sự thaythế bất kỳ liên kết hydro hình thành nhóm hydroxyl, thậm chí bằng nhómchứa methoxy ưa chất béo, đưa đến kết quả là cải thiện đô tan trong nước củachúng

1.3.2.2 Độc tính của β-cyclodextrin

Các nghiên cứu độc tính đa chứng minh rằng β-cyclodextrin được phân

Luận văn Thạc sỹ Khoa

phối bằng đường uống thực tế là không độc hại Gân đây β-cyclodextrin được

sư dụng phô biến trong các công thức dược phẩm và do đó, có lẽ β-cyclodextrinđược nghiên cứu tốt nhất ở người.

1.3.2.3 Tính tạo phức

Đặc trưng quan trọng nhất của β-cyclodextrin là khả năng tạo thành phứcchất thành phân lồng nhau ở trạng thái dung dịch và rắn (loại chủ thể- kháchthể) với một phạm vi rất rộng của các chất ưa chất béo dạng rắn, lỏng, khíbằng hiện tượng tạo phức phân tử

β-cyclodextrin có khả năng bao các phân tư khách vào trong lỗ hổng của

nó Bởi vì các nhóm hydroxyl trên phân tư β-cyclodextrin ở cả hai mặt sắp xếp

ở mặt ngoài của lỗ hổng và mặt trong của lỗ hổng là môi trường rất nhỏ kỵnước, β-cyclodextrin có thể bắt lấy các phân tư khách kỵ nước thích hợp vào

lỗ hổng kỵ nước trong môi trường nước

Trong các phức này, phân tư khách được giữ trong lỗ hổng của cyclodextrin Sự hình thành phức là sự phù hợp không gian giữa lỗ hổng củachủ thể và phân tư khách thể Lỗ hổng ưa chất béo của β-cyclodextrin cungcấp một môi trường rất nhỏ mà một phân ưa chất béo có thể đi vào để tạothành phức chất thành phần lồng nhau Không có liên kết cộng hóa tri bi phá

β-vỡ hoặc được hình thành trong quá trình tạo phức Động lực chính đối với quátrình tạo phức là sự thay thế của các phân tư nước giàu enthalpy chứa trong lỗhổng với sự có mặt phân tư khách kỵ nước trong dung dịch để đạt sự kết hợpliên hợp không cực- không cực và làm giảm sự căng vòng β-cyclodextrin đưađến kết quả trạng thái năng lượng ổn định thấp hơn, liên kết hydrogen, tươngtác Vander Waals, tương tác tĩnh điện,…Liên kết của các phân tư khách vớiβ- cyclodextrin chủ không phải là vĩnh viễn và được đặc trưng bằng trạng tháicân bằng động, đô mạnh liên kết phu thuộc vào phức chủ thể- khách thể phùhợp với nhau và trên các tương tác cục bô đặc biệt giữa các nguyên tư trên bềmặt Phức có thể được hình thành cả trong dung dịch hoặc trong trạng tháitinh thể

Luận văn Thạc sỹ Khoa

1.3.3 Ứng dụng của β-cyclodextrin

β-cyclodextrin được sư dụng trong nhiều nghiên cứu vì kích thước lỗhổng của nó (0,60-0,65 nm) lớn hơn và ít độc hơn so với các cyclodextrin tựnhiên khác β-cyclodextrin làm tăng sự dẫn truyền thuốc cục bô khi có mặtcủa nước Vì vậy, β-cyclodextrin có thể được sư dụng trong nhiều lĩnh vực:thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, bảo vệ môi trường, chuyển hóa sinh học,đóng gói và ngành công nghiệp dệt Trong lĩnh vực dẫn truyền thuốc, nhờ vàokhả năng hình thành phức với nhiều phân tư thuốc khác nhau mà β-cyclodextrin và các dẫn xuất của nó được ứng dụng rộng rai trong dẫn truyềnthuốc Sự tương thích không gian của β-cyclodextrin làm cho nó có khả năngbao lấy các phân tư lạ khác nhau tương thích với kích thước lỗ hổng của nó.β-cyclodextrin cũng có thể tăng cường sinh khả dụng của thuốc bằngcách ổn định các phân tư thuốc ở bề mặt màng sinh học Ví dụ, cyclodextrin

Luận văn Thạc sỹ Khoa

màng sinh học Đây là hiệu quả ổn định mà thường liên quan để cải thiện tínhdẫn truyền thuốc Tuy nhiên, vì β-cyclodextrin có thể nâng cao và cản trở sựdẫn truyền thuốc qua màng sinh học, điều này vô cùng quan trọng để tối ưuhóa sự hình thành công thức β-cyclodextrin chứa thuốc liên quan đến việc dẫntruyền thuốc tư các công thức

β-cyclodextrin làm tăng đô hòa tan của các thuốc ít tan và có khả năng

làm tăng sự hấp thu của thuốc tạo phức trong hệ thống in vivo Bên cạnh đó,

việc cải thiện sinh khả dụng của thuốc là đo đô hòa tan thuốc tăng lên, cảithiện tỷ lệ và phạm vi phân hủy, khả năng ổn định của thuốc ở vi trí hấp thuvùng dạ dây- ruột hoặc giảm bớt sự kích thích do thuốc gây ra và giấu mùi

1.4 Alpha-mangostin, chất kháng ung thư tiềm năng tư vỏ quả măng cut

(Garcinia mangostana L.)

1.4.1 Đặc điểm sinh học

Măng cụt có tên khoa học là

Garcinia mangostana L

thuộc họ Clusiaceae (Guttiferae).

Măng cụt là loại cây gỗ to,

có thể cao tới 20 m, lá dày,

màu lục sẫm, hình thuôn dài 15-20cm,

rộng 7-10 cm Quả măng cụt hình cầu, to

Hình 1.5: Qua măng cụt (Garcinia mangostana L.)

bằng quả cam trung bình, vỏ ngoài màu đỏ sẫm, dày, phía dưới có lá dài, phíađỉnh có đầu nhụy Trong quả có tư 6 đến 18 hạt, quanh hạt có áo hạt ăn được(Hình 1.4 ) Măng cụt được trồng rộng rai ở Nam Bộ Ở nhiều nước nhưMalaysia,Indonesia, Philipine và Campuchia, nước sắc vỏ quả măng cụtthường được dùng để chữa bệnh đi ngoài hay bệnh lỵ [1]

1.4.2 Các chất xathone trong măng cut

Măng cụt có chứa nhiều chất hóa học khác nhau và thành phần của chúngthay đổi tùy theo từng bô phận của cây Ví dụ, hàm lượng tannin ở vỏ cây làkhoảng 9-13% nhưng ở vỏ quả chi khoảng 5,5% Các chất hóa học chính đượctìm thấy trong đối tượng này là tannin, chất nhựa (resin), pectin và các dẫnxuất xanthone

Măng cụt là thực vật giàu các chất xanthone nhất được phát hiện cho đếnnay Trong số hơn 200 dẫn xuất xanthone được phát hiện ở thực vật thì có đếnhơn 60 dẫn xuất được tìm thấy ở măng cụt và tập trung nhiều ở phần vỏ quả.Với những tính chất sinh học đặc biệt quy, các chất xanthone, đặc biệt làxanthone tư măng cụt đang được các nhà khoa học hết sức quan tâm Bảng 1giới thiệu một số xanthone chính có trong vỏ quả măng cụt

Bảng 1.1 Công thức hóa học một số xanthone có trong vo qua măng cụt [10]

hoạt tính sinh học quy Chính vì thế, việc tìm thấy các xanthone trong măngcụt được coi là một trong những phát hiện lớn của y học.

µg/ml, thấp hơn nhiều so với giá tri MIC của chất kháng sinh vancomycin với

vi khuẩn này (3,13 – 6,25 µg/ml) [2,10,11,15] Không những thế, AMG của

vỏ quả măng cụt còn có tác dụng ức chế hoạt tính enzyme HIV-1 protease vớinồng đô ức chế 50% hoạt đô enzyme (IC50) là 5,1 µM

1.4.3.2 Hoạt tính kháng nấm

Mangostin của măng cụt có khả năng kháng được một số loài vi khuẩn

gây bệnh ngoài da như Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum

và Epidermophyton floccosum ở nồng đô 1µg/ml, nhưng không có tác dụng trên nấm Candida albicans[10,11] Ngoài ra, một số xanthone tách tư vỏ măng

cụt còn có hoạt tính chống các loại nấm gây bệnh cho lúa mì và các cây nông

nghiệp như Fusarium oxysporum, Alternaria tenuis và Dreschlera oryzae.

1.4.3.3 Tác dung chống oxi hóa

Mangostin trong măng cụt được chứng minh là có khả năng chống oxihóa, thậm chí còn mạnh hơn gấp nhiều lần so với các vitamin nhóm C và

nhóm E Các nghiên cưu in vitro đa cho thấy mangostin trong măng cụt có tác

dụng làm ức chế sự oxi hóa các lipoprotein có tỷ trọng thấp (low densitylipoprotein

– LDL) Chúng đóng vai trò như là các chất săn lùng gốc tự do để bảo vệ các

LDL khỏi bi tổn thương oxi hóa, vì thế ngăn ngừa được hội chứng xơ vữa động mạch và có tác dụng làm chậm sự lao hóa [10,11].

1.4.3.4 Tác dung chống viêm (anti-inflamation)

Peres và cộng sự [24] đa chứng minh được γ-mangostin trong măng cụt

là chất ức chế mạnh của COX (cyclooxgenase)-2 Enzyme COX-2 là tác nhângây viêm trong cơ thể người Các enzyme này thường có mặt ở các bệnh nhân

bi đau khớp hay bi viêm khớp Các tác giả đa phát hiện thấy chất này làmgiảm rõ rệt sự hình thành enzyme COX-2 Hội chứng viêm kinh niên là mộttrong những căn nguyên hàng đầu dẫn đến bệnh tiểu đường tuyp 2, các chấtxanthone có thể giúp ngăn ngừa bệnh này thông qua việc làm giảm và điềuhòa lượng đường trong máu, tăng sinh lực cho cơ thể người bệnh

1.4.3.5 Hoạt tính chống ung thư

Hoạt tính chống ung thư của các dẫn xuất xanthone trong măng cụt đượcđặc biệt quan tâm trong thời gian gần đây do chúng có khả năng ức chế sựphát triển của các dòng tế bào ung thư khác nhau Sato và cộng sự [26] khinghiên cứu tác dụng gây apoptosis của 8 dẫn xuất xanthone khác nhau trên tếbào ung thư ưa crôm (pheochromocytoma) ở chuột đa phát hiện thấy các dẫnxuất này đều có tác dụng gây ra hiện tượng apoptosis nhưng AMG có tácdụng mạnh nhất Nhóm nghiên cứu cũng phát hiện thấy garcinone-E có hoạttính diệt mạnh các tế bào ung thư người thuộc các dòng ung thư dạ dày, phổi

và gan Đặc biệt, Matsumoto và cộng sự [18] khi nghiên cứu tác dụng của 6xanthone khác nhau tư vỏ quả măng cụt lên sự phát triển của dòng tế bào ungthư bạch câu HL-60 ở người đa thu được một kết quả hết sức thú vi là tất cảcác dẫn xuất xanthone nghiên cứu đều có tác dụng ức chế, trong đó AMG có

1.4.4 Alpha- mangostin tư vỏ của quả măng cut (Garcinia mangostana L)

AMG là xanthone đầu tiên được phân lập tư quả măng cụt Công thứcphân tư là C24H26O6 (M=410,46), công thức cấu tạo được trình bày ở hình 1.5

Hình 1.6 Công thức cấu tạo alpha – mangostin

-Danh pháp quốc tế:

1,3,6-trihydroxy-7-methoxy-2,8-bis-(3-methyl-2-butenyl)-xanthen-9-one

-Tính chất: Tinh thể màu vàng (tư benzen), nhiệt đô nóng chảy:

181,6-182,6°C Thực tế không tan trong nước, tan trong alcol, ether, aceton,chloroform, ethyl acetat

Trong số các xanthone, hoạt chất được nghiên cứu sâu, rộng nhất lànhững mangostin, trong đó có AMG Tác dụng dược ly chính của AMG vàdẫn chất của nó gồm có:

- Tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương: AMG tạo ra những phản

ứng ức chế thần kinh trung ương gây các triệu chứng như giảm đau, giảm hoạtđộng của hệ thân kinh vận động, tăng cường hoạt tính gây ngủ và gây mê

- AMG có hoạt tính chống viêm: Tác dụng này được phát hiện khi dùng

tiêm vào phúc mạc hay khi cho uống với chuột bi gây viêm phù chân bằngcarrageenan, hay bằng cách cấy cục bông dưới da AMG cũng có có hoạt tínhchống loét dạ dày khi thư trên chuột

- Hoạt tính kháng khuẩn: AMG ức chế Bacillus subtilis ở nồng đô

3,13µg/ml, tác dụng này tăng lên khi kết hợp với vancomycin AMG được phát

hiện ức chế vi khuẩn lao Mycosporum tuberculosis với giá tri MIC là 6.25

µg/ml [9,10]

-Hoạt tính chống nấm: AMG kháng được Trichophyton

mentagrophytes, Mycosporum gypseum và Epidermmphyton floccsum ở nồng

đô 1 µg/ml [9,10]

- Hoạt tính chống ung thư: AMG có tác dụng phòng ngừa tiền ung thư

ở ruột già, ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư bạch cầu HL60 của người

ở nồng đô 10µM bằng cách cảm ứng apoptosis (chết theo chương trình)[9,10]

- Tác dụng chống dị ứng: AMG có khả năng chống di ứng thông qua

việc ức chế sự co của động mạch chủ trên ngực thỏ đa bi histamin và serotonintác động [9,10]

- Tác dụng ức chế HIV: AMG ức chế HIV-1 protease với nồng đô ức

1.5 Y tưởng nghiên cưu của đề tài

Hóa tri liệu là một trong ba phương pháp phô biến nhất hiện nay để điềutri ung thư có hiệu quả nhất Đây là liệu pháp sư dụng thuốc hay dược phẩm

để tiêu diệt, ngăn chặn hay làm chậm sự phát triển của các tế bào ung thư.Tuy nhiên, các loại thuốc điều tri ung thư thường không mang lại hiệu quảmong muốn do một số nguyên nhân như tính hướng đích chưa cao và hiệu quảthâm nhập khối u kém vì khả năng hòa tan của thuốc thấp Do đó, khả năngđiều tri bệnh rất hạn chế Để giải quyết vấn đề này, một trong những bước độtphá là sư dụng công nghệ nano để tạo dạng vật liệu có kích thước nano có khảnăng tan trong nước, khuyếch tán tốt nên tương tác hiệu quả với yếu tố sinhhọc ở mức tế bào hay xuống thấp hơn nữa ở mức phân tử

ngoài việc nghiên cứu tổng hợp những dẫn suất mới của nó để tăng cườngtính tan và hiệu quả tác dụng thì cũng đa bắt đầu xuất hiện một số nghiên cứutrên thế giới về việc nâng cao tính tan của AMG sư dụng phương pháp tạohạt nano để xư ly các bệnh liên quan đến ung thư Vì thế, nghiên cứu củachúng tôi sẽ nhằm mục đích sư dụng công nghệ nano để tạo hạt nanoAMG(nanomangostin) có khả năng phân tán tốt trong nước nhưng vẫn duy trì đượchoạt tính sinh học của nó.

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP2.1 Dòng tế bào ưng thư và các điều kiện nuôi

Dòng tế bào ung thư phổi A549 được mua tư bô sưu tấp giống của Hoa

Kỳ (American Type Culture Collection- ATCC Manassas, Hoa Kỳ) Tế bàoung thư phổi A549 được nuôi trong môi trường DMEM có bô sung L-

glutamine 2 mM, HEPES 10 mM, natri pyruvate 1.0 mM và huyết thanh phôi

2.2 Nguyên liệu thực vật

Vỏ quả măng cụt được thu mua tư tỉnh Bình Dương và được Viện sinh

thái và Tài nguyên vi sinh vật giúp định tên khoa học là Garcinia mangostana

đó được ngâm chiết trong ethanol 96% theo ti lệ 1 nguyên liệu: 3 thể tích dungmôi Dịch chiết rút sau đó được cô chân không và sư dụng như nguyên liệukhởi đầu cho các bước tinh sạch tiếp theo

2.3 Hóa chất, thiết bị.

2.3.1 Hóa chất

-Bản silica gel tráng sẵn (Silicagel 60 F254) được mua tư hang Mecrk(Đức)

-Hạt Silica gel cho chạy cột sắc ky (Grade 7734, 63-200 μm,

70-230 mesh) được mua tư hãng Mecrk (Đức)

-Alpha, Beta và Hydroxy - β cyclodextrin được mua tư hang Sigma (HoaKỳ) Eudragit RS 100 và RL 100 mua tư hãng Evonik (Singapore)

-Các dung môi dùng trong sắc ky có đô sạch phân tích và có nguồn gốc

tư Trung Quốc

-Môi trường nuôi cấy tế bào (Invitrogen, Hoa Kỳ)

-Tất cả các hoá chất đều đạt đô tinh khiết cho phân tích

2.3.2 Thiết bi

- Cân phân tích

- Máy soi bản gel sắc ky lớp mỏng

- Box cấy laminare

- Máy quay cất khô chân không

- Máy khuấy tư

- Thiết bi sắc ky lỏng hiệu năng cao

- Kính hiển vi đồng tu quét laser

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tinh sạch AMG tư vỏ quả măng cut

2.4.1.1 Tách các hợp chất polyphenol bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

Việc phân tích được thực hiện trên các bản sắc ky đa được chuẩn bi sẵn

có đô dày 1mm (Silicagel 60 F254, Merck) Các hệ dung môi phân tích được sư

dụng gồm có: i) Toluene: ethyl acetate: acetone: formic acid (TEAF) theo ti lệ 5: 3: 2: 1; ii) n- Hexane: acetone theo ti lệ 3:1 và 2:1; iii) n-Hexane: ethyl

acetate theo ti lệ 3:1 Sau khi chạy sắc ky xong, bản sắc ky được làm khô ởnhiệt đô phòng Màu sắc các vạch được quan sát dưới ánh sáng thường hoặcxông hơi NH3

2.4.1.2 Sắc ký cột silica gel

Sắc ky là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân

bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh Đối với sắc ky cột:

- Pha tĩnh: là chất rắn, thường là alumin hoặc silica gel đa được xư ly,

được nạp nén vào trong một cột có kích thước xác định được tính toán dựatrên lượng mẫu sẽ nạp lên cột

- Pha động: là chất lỏng, được gọi là dung môi rửa giải.

Trong thí nghiệm này, phân đoạn chứa chất quan tâm được phân táchtrên các cột sắc ky nhồi hạt silica có kích thước 70 - 230 mesh (Merck) sư