Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng diệt tế bào ung thư của lá xạ đen (ehretia asperula zoll mor)

Luận văn được tiến hành dưới sự hỗ trợ của đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được từ cây Xạ đen tại tỉnh Hoà Bình.. Một số

NGUYỄN THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT

TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ XẠ ĐEN

(Ehretia asperula Zoll & Mor)

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2017

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT

TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ XẠ ĐEN

(Ehretia asperula Zoll & Mor)

CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN TIẾN ĐẠT

HÀ NỘI - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác Nếu không đúng như đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về

đề tài của mình

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thu Thủy

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt, Trung tâm nghiên cứu và Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Y sinh nhiệt đới – Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga và các bạn đồng nghiệp phòng Thích nghi và Y học quân sự đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện, bảo vệ luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, thầy cô giáo Viện Sinh thái

và Tài nguyên Sinh vật, các cán bộ nghiên cứu của phòng Hoạt tính Sinh học

- Viện Hóa sinh biển, phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành bản luận văn này

Luận văn được tiến hành dưới sự hỗ trợ của đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được

từ cây Xạ đen tại tỉnh Hoà Bình Thử nghiệm tạo chế phẩm làm thực phẩm chức năng từ các cao chiết tiềm năng”, do GS TS Đặng Đình Kim, Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam làm chủ nhiệm Tôi xin chân thành cảm ơn GS TS Đặng Đình Kim, ThS Vũ Thị Nguyệt đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành bản luận văn này

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình thân yêu, bạn bè, người thân và đồng nghiệp – những người đã luôn ở bên tôi, luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2017

Học viên

Nguyễn Thị Thu Thủy

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vi

KÝ HIỆU VIẾT TẮT vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về lá Xạ đen 3

1.1.1 Đặc điểm sinh thái và sự phân bố 3

1.1.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các hợp chất của cây xạ đen 4

1.1.3 Tác dụng sinh học 12

1.1.4 Một số bài thuốc y học cổ truyền: 13

1.2 Giới thiệu chung về các phương pháp Sắc kí 13

1.2.1 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM) 13

1.2.2 Phương pháp sắc ký cột 17

1.3 Sơ bộ các phương phác xác định cấu trúc 19

1.3.1 Phổ khối lượng MS 20

1.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 21

1.3.3 Phổ 1H-NMR 22

1.3.4 Phổ 13C-NMR 22

1.3.5 Phổ DEPT 23

1.3.6 Phổ 2D-NMR 23

1.4 Giới thiệu một số phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 25

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 27

2.1 Mẫu thực vật 27

2.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 28

2.2.1 Dụng cụ và thiết bị chiết tách mẫu 28

2.2.2 Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc 29

2.2.3 Hoá chất 29

2.2.4 Dòng tế bào (cell lines) 30

2.3 Chiết phân đoạn 30

2.4 Phân lập một số hợp chất trong cây xạ đen 32

2.4.1 Phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5 33

2.4.2 Phân lập hợp chất Ed 17.3 35

2.4.3 Phân lập hợp chất Ed 11.4 36

2.5 Hằng số vật lý và các số liệu phổ nghiệm 37

2.5.1 Hợp chất Ed 3.2 37

2.5.2 Hợp chất Ed 5.5 37

2.5.3 Hợp chất Ed 17.3 38

2.5.4 Hợp chất Ed 11.4 38

2.6 Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity) 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Hợp chất 1: Ed 3.2 42

3.2 Hợp chất 2: Ed 5.5 44

3.3 Hợp chất 3: Ed 17.3 47

3.4 Hợp chất 4: Ed 11.4 50

3.5 Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào 54

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

4.1 KẾT LUẬN 56

4.2 KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC PHỔ 62

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Ehretia asperula Zoll & Mor 3

Hình 1.2: Cấu trúc một số hợp chât theo tài liệu 8

Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu 9

Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu 10

Hình 1.5: Cấu trúc một số hợp chất theo tài liệu 11

Hình 1.6: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu 12

Hình 2.1 Mẫu Xạ đen thu được tại Hòa Bình 27

Hình 2.2 Mẫu tiêu bản Xạ đen đã được giám định 28

Hình 2.3 Sơ đồ chiết phân đoạn, phân lập cao xạ đen 32

Hình 2.4 Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5 34

Hình 2.5 Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 17.3 35

Hình 2.6 Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 11.4 36

Hình 3.1 Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 3.2 42

Hình 3.2: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 5.5 44

Hình 3.3 Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 5.5 45

Hình 3.4 Phổ DEPT của hợp chất Ed 5.5 45

Hình 3.5 Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 17.3 47

Hình 3.6 Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 17.3 48

Hình 3.7 Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 11.4 50

Hình 3.8 Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 11.4 51

Hình 3.9 Phổ hai chiều HSQC của hợp chất Ed 11.4 52

Hình 3.10 Phổ hai chiều HMBC của hợp chất Ed 11.4 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của các cắn chiết xạ đen trên vi khuẩn Gram dương Gram âm 5 Bảng 3.1 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR của Ed 3.2 với số liệu phổ 1H-NMR của caffeic acid 43Bảng 3.2 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 5.5 với số liệu phổ 1H-NMR của Methyl caffedte 46 Bảng 3.3 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 17.3 với số liệu phổ 1H-NMR của Rosmarinic acid 49 Bảng 3.4 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 11.4 với số liệu phổ 1H-NMR của Methyl rosmarinate 53Bảng 3.5: Kết quả hoạt tính gây độc tế bào 54

KÝ HIỆU VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon (13) Nucleaedr

Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13)

1H-NMR Hydro (1) Nucleaedr Magnetic

Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1)

DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT

HMBC

Polarization Transfer Heteronucleaedr Multiple Bond Coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

HSQC Heteronucleaedr Single

Quantum Correlation

Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

s Singlet

d Doublet

dd Double of doublet

Rf retardation factors Phát triển chậm

Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Tế bào Ung thư gan

LU-1 Human lung adenocarcinoma Tế bào Ung thư phổi

MCF-7 Human breaedst

HeLa HeLa cervical cancer cells Tế bào Ung thư cổ tử cung HeLa

LỜI MỞ ĐẦU

Vai trò quan trọng của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đã được khẳng định từ các nền y học cổ truyền cho đến y học hiện đại Giá trị của chúng không chỉ có công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà còn có thể dùng làm nguyên mẫu hoặc cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát triển nhiều dược phẩm mới Việt Nam được đánh giá có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú và có nhiều kinh nghiệm sử dụng nguồn dược liệu này nhờ vào nền y học cổ truyền lâu đời Theo thống kê ở Việt Nam hiện có hơn

13000 loài thực vật trong đó khoảng 4000 loài được sử dụng làm thuốc Đây

là một lợi thế để chúng ta khai thác nguồn dược liệu này phục vụ cho cuộc sống Các nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học là con đường ngắn nhất và hiệu quả nhất để tìm kiếm có chọn lọc các hoạt chất từ nguồn tài nguyên thiên nhiên

Ung thư được coi là một trong những căn bệnh nan y do khả năng kháng thuốc, gây di căn mạnh của các tế bào ung thư Chính vì thế, việc phát triển những loại dược phẩm mới đặc trị hoặc ngăn ngừa quá trình di căn ung thư đang là vấn đề cấp thiết của y học hiện đại Cây xạ đen có tên khoa học là

Ehretia asperula Zoll & Mor, họ Vòi Voi (Boraginaceae) Xạ đen phân bố

chủ yếu tại các tỉnh Sơn La, Hà Nam, Quảng Ninh, Hòa Bình, chúng mọc tự nhiên trong rừng Xạ đen là cây thân gỗ mọc leo thành bụi, nhánh non tròn, không lông Dài trung bình 5-7m có khi tới hàng chục mét, thân già vỏ nâu đốm trắng, chồi và lá non có màu tím đỏ Tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về cây Xạ đen như: Lê Thế Trung và cộng sự (1999) đã nghiên cứu về khả năng chữa ung thư của cây xạ đen Hòa Bình; Nguyễn Huy Cường (2008) nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học cây xạ đen

Dựa trên kết quả sàng lọc hoạt tính trên tế bào ung thư cho thấy cao chiết lá xạ đen có tác dụng diệt tế bào ung thư mạnh Chính vì vậy việc lựa

chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng diệt tế bào ung thư của lá Xạ đen (Ehretia asperula Zoll & Mor)” là một việc cấp thiết

có ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn

Đề tài được thực hiện với các mục tiêu chính sau:

Phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ lá xạ đen (Ehretia asperula Zoll & Mor) và đánh giá được tác dụng diệt tế bào ung thư của chúng

Để đạt được mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

 Nghiên cứu về thành phần hóa học:

- Phân lập các chất sạch

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được

 Nghiên cứu về tác dụng sinh học:

- Khảo sát khả năng gây độc tế bào của các hợp chất đối với bốn dòng

tế bào ung thư: Hep-G2, LU-1, MCF-7, HeLa

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về lá Xạ đen

1.1.1 Đặc điểm sinh thái và sự phân bố

Hình 1.1 Ehretia asperula Zoll & Mor

Xạ đen có tên khoa học là Ehretia asperula Zoll & Mor thuộc họ

Vòi voi cây thân gỗ, bụi hay cây thảo có hình trụ, lá đơn mọc so le, không

có lá kèm, trên thân và cả lá bao phủ những lông cứng hoặc mềm Hoa hầu như luôn đều, đài hợp nhiều hoặc ít, tồn tại trên quả, sau đó lớn lên Nhị luôn dính với ống tràng, nhưng có phần chỉ nhị hoặc lớn hoặc nhỏ rời nhau Nhụy gồm 2 lá noãn và lúc đầu là bầu trên, 2 ô, với 2 noãn trong mỗi ô Nhưng ngay sau đó, ở đa số các cây họ Vòi voi, mỗi ô của bầu lại được sớm phân chia bằng một vách ngăn giả Do đó bầu nhụy trở thành có 4 ô chứa mỗi ô một noãn Do sự phát triển của các vách trong mỗi ô của bầu làm cho bầu chở lên có 4 thùy, còn vòi nhụy đâm ra ở chỗ lõm giữa 4 thùy của bầu đó Vòi nhụy thường mag ở phía trên một đầu nhụy, và đầu nhụy hơi lõm, đôi khi cũng có 2 đầu nhụy Khi quả chín thì các thùy của bầu

tách nhau ra thành 4 quả hạch nhỏ riêng biệt có một hạt Hạt thường kông

có nội nhũ hay rất ít khi có nội nhũ [1]

Ở Việt Nam Ehretia asperula Zoll & Mor còn được gọi là Dót, Thân

cây gỗ nhỏ cao đến 1m Lá có phiến bầu dục thon, 4 – 10 x 2-5cm, đáy tròn, mép có răng hay nguyên, gân phụ 6 cặp, cuống dài 1,7cm Chùm sim ở đầu cành, có vài lá nhỏ ở đáy Hoa ống ngắn, bộ nhị 5 bầu không lông, quả tròn,

to 4-5mm, có 4 cạnh, có 4 hột Loài phân bố chủ yếu ở Indonesia và Việt

Nam (Quảng Ninh, Hà Nam, Hà Nội, Hòa Bình) [ 1]

Về phân bố, họ Vòi voi là một họ khá lớn phân bố rộng rãi ở khắp nơi trên thế giới, nhưng chủ yếu ở vùng ôn đới phía bắc, đặc biệt là vùng Địa Trung Hải, Tây và Trung Á và Thái Bình Dương thuộc Bắc Mỹ, ở nước ta loài

mọc khắp cả nước Ehretia asperula Zoll & Mor phân bố chủ yếu ở Indonesia

và ở Việt Nam cây phân bố chủ yếu ở các tỉnh Quảng Ninh, Hà Nam, Hà Nội, Hòa Bình

 Sơ lược về chi Ehretia

Cây bụi hoặc gỗ, lá nguyên hay có răng cưa ở mép, cụm hoa ngù hay chùy, đài chia làm 5 phần, tràng hoa hình ống hay hình chuông, hiếm khi hình phễu, hoa mẫu 5 chỉ nhị thò ra, bao phấn hình trứng hay thon dài Bầu nhụy hình trứng, chia làm 2 ngăn, mỗi ngăn chứa 2 noãn Vòi nhụy chẻ 2, có 2 đầu nhụy, hình tròn hay thon dài Quả hạch màu vàng, cam, hay đỏ nhạt, hình cầu, nhẵn, khi chín vỏ quả trong chia làm 2 thùy mỗi thùy có 2 hạt hoặc chia làm 4 thùy mỗi thùy có 1 hạt, hạt cứng.[5]

1.1.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các hợp chất của cây xạ đen

Xạ đen được biết đến bởi mang trong mình nhiều hoạt tính sinh học quý giá như điều trị mụn nhọt, ung thư, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng và đặc biệt trong chữa trị ung thư Có tác dụng thông

kinh lợi niệu, cây dùng trị kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan, bệnh lậu Điều trị ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư, tiêu hạch, tiêu độc, thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm đau, an thần, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể Ở Việt Nam cũng như trên thế giới

đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây Xạ đen nhằm khai thác triệt để tiềm năng y học của cây thuốc này Dưới đây là một số công trình khoa học, nghiên cứu trong và ngoài nước đối với cây xạ đen

Năm 2012 nhóm nghiên cứu Phạm Thị Lương Hằng, Đoàn Thị Duyên, Nguyễn Thị Yến, Ngô Thị Trang thuộc khoa Sinh học của trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội tiến hành thử hoạt tính sinh học của cây xạ đen bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Họ thử nghiệm bốn loại dịch chiết của xạ đen là dịch chiết n-Hexane, dịch chiết EtOAc, dịch chết MeOH và dịch chiết nước trên vi khuẩn Gram dương

(Bacillus subtilis và Sarcina sp), vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC

25922 và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) Kết quả hoạt tính sinh học

được tổng hợp ở (Bảng 1.1) [3]

Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của các cắn chiết xạ đen trên vi khuẩn

Gram dương Gram âm

D-d (mm) Dịch chiết

Trong luận án tiến sĩ hóa học của Nguyễn Huy Cường năm 2008 với đề

tài Nghiên cứu thành phần hoá học và thăm dò hoạt tính sinh học cây Xạ đen[2, 10], đã phân lập được một số hợp chất trong cây xạ đen và khảo sát hoạt tính

sinh học của chúng trên một vài dòng tế bào ung thư Trong luận án có bốn

chất khung friedelan: 3α-friedelanol (1), 3-friedelanon (2),

D:A-friedo-olednon-3,21-dion (3), canophyllol (4); năm hợp chất có khung lupan là:

lup-20-en-3β-ol (5), lup-12-en-3β-ol (6), lup-20-en-3-ol (lupenon, 7),

lup-12-en-3-on (8), lup-20-en-3β, 11β-diol (9); và hai hợp chất khác là clilup-12-en-3-onasterol (10),

axit glucosyringic (11) Kết quả thử hoạt tính trên hai tế bào ung thư gan G2) và ung thư phổi (Lu-1) cho thấy các hợp chất thử (1, 2, 3 và 9) đều không

(Hep-thể hiện hoạt tính đối với hai dòng tế bào ung thư này Một số hợp chất của xạ đen có cấu trúc như sau:

Hình 1.2: Cấu trúc một số hợp chât theo tài liệu [2, 10]

Năm 2000 Huangvà cộng sựđã phân lập và xác định cấu trúc của celahin

D: 1β,2β,6α,15β-tetracetoxy-8β,9α-dibenzoyloxy-β-dihydroagarofuran (12),

1β-

acetoxy-8β,9α-dibenzoyloxy-4α,6α-dihydroxy-2β(α-methylbutanoyloxy)-β-dihydroagarofuran (13), 1β-acetoxy-8β,9α-dibenzoyloxy-6α-hydroxy-2β (a-methylbutanoyloxy)-β-dihydroagarofuran (13), emarginatine-E (15),

lupenone (16), friEdelinol (17) có trong cây xạ đen bằng phổ 1H-NMR,

13C-NMR, phổ COSY, HMBC, HMQC và thử hoạt tính sinh học của các

hợp chất này Kết quả cho thấy emarginatine-E (15) gây độc tế bào chống

lại tế bào ung thư hầu họng (ED50 = 1,7 µg/ml), và tế bào ung thư ruột kết (ED50 = 4,1 µg/ml), ngược lại các giá trị ED50 cho các hợp chất 12, 14, 16

tất cả vượt 10 µg/ml [14]

Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu [14]

Năm 2007 nhóm nghiên cứu gồm Trần Văn Sung, Nguyễn Huy Cường, Trịnh Thị Thủy, Phạm Thị Ninh, Lê Thị Hồng Nhung thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã phân lập và xác địch cấu trúc của một phenolic glycoside và ba hợp chất triterpenes trong cây xạ đen Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR và một số phổ hai chiều, phổ phân giải cao Các hợp chất phân lập được là glucosyringic acid

(18), 20(29)-ene-3β,11β-diol (19), 20(29)-ene-3-one (20) và 5,20(29)-diene-3-one (21).[8, 10]

lup-Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu [8,10]

Vào năm 1995 một số nhà khoa học của Trung quốc tên là Yao-Haur

Kuo, Chieh-Fu Chen và Li-Ming Yang Kuo[16] đã phân lập được hai hợp chất từ cây xạ đen, một hợp chất là celahinine A (22) và một hợp chất

alkaloid mới tên của nó là sesquiterpene pyridine alkaloid emarginatine A

(23) Hợp chất mới này có tác dụng gây độc tế bào mạnh đối với tế bào

Hepa-2 (hepatoma), Hela, Colo Hepa-205 và các tế bào ung thư biểu mô KB (in-vitro), có

ED50 (KB)=4,0 µg/ml Công thức hóa học của chúng được các tác giả xác định bằng các phương pháp phổ 1H, 13C-NMR, COSY, NOESY và HMBC

Hình 1.5: Cấu trúc một số hợp chất theo tài liệu [16]

Vào năm 1997 Kuo YH và Kuo LM đã phân lập được bốn hợp chất triterpene là celasdin A, celasdin B, celasdin C và maytenfolone A từ xạ đen Trong bốn hợp chất hai hợp chất celasdin A và celasdin C là hai hợp chất mới, celasdin B Hợp chất maytenfolone A có tác dụng gây độc tế bào,

Maytenfolone A được tiếp tục nghiên cứu X-ray và kết quả sinh học đã cho thấy Maytenfolone A gây độc tế bào chống lại gan (HEPA-2B ED50 = 2,3 µg/ml) và ung thư vòm họng (ED50 = 3,8 µg/ml).[15]

Hình 1.6: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu [12]

1.1.3 Tác dụng sinh học

 Theo Đông y:

Cây xạ đen có vị đắng chát, tính hàn, có tác dụng hữu hiệu trong điều trị mụn nhọt, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng và đặc biệt trong chữa trị ung thư Có tác dụng thông kinh lợi niệu Cây dùng trị

kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan, bệnh lậu [22]

Điều trị, ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư, tiêu hạch, tiêu độc, thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm

đau, an thần, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể [22]

 Về Tây y:

Từ năm 1987 GS Lê Thế Trung và các bác sĩ của Học viện Quân y đã

đi tiên phong trong nghiên cứu, tìm hiểu về cây xạ đen Sau nhiều năm nghiên cứu, hiện Học Viện Quân Y đã chiết xuất được từ loài cây này một loại tinh

thể thuộc nhóm Fanavolnoid có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [22, 23]

Qua nghiên cứu về thực vật học, hoá dược, dược lý, nghiên cứu thực nghiệm trên động vật được gây ung thư, các bác sĩ đã phát hiện ở loài cây này tác dụng hạn chế sự phát triển của khối u ác tính Hơn nữa, theo GS Trung, một số hợp chất lấy từ xạ đen nếu được kết hợp với chất Phylamin có thể kéo

dài tuổi thọ trung bình của động vật bị ung thư [22, 23]

Nghiên cứu cho thấy trong xạ đen có các hoạt chất Fanavolnoid ; Quinon (có tác dụng phòng chống Ung thư và làm cho tế bào Ung thư hóa lỏng dễ tiêu), hợp chất Saponin Triterbenoid (có tác dụng chống nhiễm

khuẩn) [22, 23]

1.1.4 Một số bài thuốc y học cổ truyền:

Bài thuốc hỗ trợ điều trị ung thư từ xạ đen lưu truyền trong dân gian là: Dùng 50g cây xạ đen khô, 40g cây bạch hoa xà và 20g cây hoàng cầm râu, tất

cả các nguyên liệu trên đem sắc với 1,5 lít nước, sắc đến khi còn khoảng 1 lít

thì chắt ra uống [24]

Điều trị các bệnh về gan, giúp thanh nhiệt, giải độc: Dùng 50g cây xạ

đen khô, 10g cây bá bệnh và 30g cây cà gai leo đem sắc với nước uống [24]

Để giúp điều trị mụn, tiêu viêm lấy lá cây xạ đen đem rửa sạch rồi đun sôi dùng thay trà uống hàng ngày, nó còn giúp cho tăng cường sức khỏe, cải

thiện giấc ngủ hiệu quả [24]

1.2 Giới thiệu chung về các phương pháp Sắc kí

1.2.1 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM)

a Nguyên tắc

Dựa vào hệ số phân tích khác nhau của chất cần phân tích giữa pha động và pha tĩnh Chất cần phân tích được hấp phụ (hoặc phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc

vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động) trên pha tĩnh trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu chất được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Dựa vào hệ số phân bố khác nhau của mỗi chất đối với pha động và pha tĩnh ta có thể tách riêng từng thành phần trong hỗn hợp phân tích Các thành phần sau khi phân tách riêng biệt ra khỏi hỗn hợp được lưu trữ trên pha

tĩnh.[6]

Sau đó có thể nhận biết các chất cần phân tích bằng ánh sánh thường (nếu chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở bước sóng 254 nm, 365

nm hay phun thuốc thử hiện màu[6]….tùy thuộc bản chất chất cần phân tích

mà sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tách

b Đại lượng đặc trưng

 Hệ số lưu trữ Rf. [6]

Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số

di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

R f = (a/b)

Trong đó:

- a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm)

- b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết (cm)

- Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l

 Hệ số lưu giữ tương đối Rr

Rr = dx/dc

Trong đó:

- dx là đường đi của chất phân tích (cm)

- dc là đường đi của chất chuẩn (cm)

Giá trị Rr càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất

- Máy ảnh thích hợp có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày

- Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng

- Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các ống mao quản

- Bản mỏng tráng sẵn silica gel

c Cách tiến hành

Chuẩn bị bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ, có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của các bản mỏng sử dụng.Hệ dung môi thích hợp được cho vào bình triển khai sắc kí cho bão hòa

dung môi.[6]

Chấm một lượng chất phân tích vừa phải lên bản mỏng, nếu lượng chất quá lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf gần nhau sẽ bị chồng lấp còn nếu lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do độ nhạy của thuốc thử không đủ Lượng mẫu thông thường cần đưa lên bản mỏng là 0,1 - 50 mg ở dạng dung dịch trong ether, c1oroform, nước hay dung môi thích hợp khác Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều chế Ðối với các dung dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần chấm

Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm - 2 cm và kẻ vạch xuất phát cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1cm, vạch tiền tuyến dung môi

là vạch kết thúc đường đi của dung môi Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 - 6 mm và cách nhau 15 mm Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ Với những trường hợp phân tích bán định lượng phải dùng các mao quản định mức chính xác Khi không cần định lượng dùng micropipet hoặc ống mảo quản thường

Triển khai sắc ký: Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng chạy tới vạch tiền tuyến đã định sẵn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi hiện vết chất

Việc sắc ký lớp mỏng được tiến hành trong điều kiện chuẩn hoá cho kết quả có độ tin cậy cao hơn Hiện nay người ta thường tiến hành sắc ký với sự giúp đỡ của hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp đối với dung môi rửa cột mà mỗi chất được lấy ra trước hoặc sau

Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng là Al2O3, silica gel Dung môi dùng có thể là 1 hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp Dung môi sử dụng rửa cột thường có độ phân cực tăng dần Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên hở để tiếp thêm dung môi, có nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ khác nhau Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng Thông thường cột có đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách

càng tốt[6]

b Cách tiến hành

 Chuẩn bị cột[6]:

- Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô

- Cho bông gòn vào đáy cột

- Kẹp cột thẳng đứng trên giá

- Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột:

Nhồi cột ướt: Dùng các chất hấp phụ có khả năng trương phình như Silicagel, Sephadex

Nhồi cột khô: Dùng các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như Al2O3, CaCO3

 Đưa chất phân tích vào cột[6]:

- Khi đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt thoáng phẳng

- Có nhiều phương pháp để đưa chất phân tích vào cột:

 Cho thẳng hỗn hợp dung dịch lên cột

 Trộn hỗn hợp chất với một lượng chất hấp phụ: Trộn dung dịch cần phân tích với một lượng nhỏ chất hấp phụ, trộn đều, quay khô dung môi rồi cho vào cột bằng cách trải thành một lớp đều trên mặt cột

c Rửa cột (giải li chất)

Có hai cách rửa cột là rửa áp suất thường và áp suất nén[6]:

- Rửa cột bằng áp suất thường: Dung môi chảy xuống nhờ trọng lực

- Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen hoặc không khí) vào đầu cột

Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén Việc lựa chọn các phương pháp rửa cột khác nhau tùy thuộc vào việc sử dụng kích thước hạt silicagel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào

độ phân cực của dung môi giải ly và của chất cần giải li

Thông thường người ta sử dụng dung môi có độ phân cực tăng dần để giải li các chất Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển

từ từ bằng cách pha tỉ lệ tăng dần hoặc giảm dần Nếu tăng tính phân cực nhanh và đột ngột thì sẽ làm gãy cột Nguyên nhân do các chất hấp phụ như Al2O3 hoặc silicagel khi được trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng sẽ sinh ra nhiệt làm cho dung môi bốc hơi cục bộ sẽ tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột, hiệu quả tách sẽ không tốt

 Theo dõi quá trình rửa cột

Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể được theo dõi bằng mắt thường Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thiên nhiên không màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cột thường bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Trước khi tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu tham khảo để chọn chất hấp phụ và dung môi, thăm dò bằng SKLM để chọn hệ dung môi tách tốt nhất Khi chọn được chất hấp và hệ dung môi thích hợp, việc quyết định thể

Tích của mỗi phân đoạn hứng hay thể tích của mỗi loại dung môi giải

ly cột tùy thuộc vào thực nghiệm và kinh nghiệm của người thực hành

Trong trường hợp sắc ký cột khô hay cột ngược, những chất hay nhóm chất được tách ra không được rửa giải ra khỏi cột mà được cắt thành các

“khoang” và giải hấp bằng dung môi để thu các chất

Trang bị cho sắc ký cột rất đơn giản, không tốn kém nên hiện nay vẫn là phương tiện chủ yếu để tách các chất có trong thành phần hóa học của dược liệu Hiện nay, sắc ký cột cổ điển và các kỹ thuật cải tiến của nó vẫn đóng vai trò chính trong việc chiết tách và phân lập các chất tinh khiết

từ dược liệu

1.3 Sơ bộ các phương phác xác định cấu trúc

1.3.1 Phổ khối lượng MS

Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hóa học của hợp chất Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, một số phương phấp chủ yếu

được nêu ra dưới đây[11]:

 Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70Ev

 Phổ ESI (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun

mù điện tử.Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ

 Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử

 Phổ khối lượng phân giải cao (Hight Resolution Mass spectroscopy) cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao, kết quả phổ khối lượng phân giải cao cùng với kết quả phân tích nguyên tố sẽ cho phép khẳng định chính xác công thức cộng của các hợp chất hữu cơ

Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc

kí kết hợp với khối phổ, phương pháp này đặc biệt hiệu quả khi sử dụng thư viện phổ để so sánh nhận dạng cấc hợp chất Có thể dùng GC-MS (sắc kí khí-khối phổ) cho các hợp chất dễ bay hơi như tinh dầu hay LC-MS (sắc kí lỏng-khối phổ) cho các hợp chất khác Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt

hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc

trong ngành dược) [11]

1.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cùng với phổ khối và nhiễu xạ đơn tinh thể tia X hiện là những công cụ mạnh và thường được sử dụng nhất hiện nay trong xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là tần số cộng hưởng của các hạt nhân trong phân tử Tuy nhiên, tần số hấp thu của hạt nhân thay đổi theo từ trường ngoài B0 Để thuận tiện và loại bỏ ảnh hưởng của B0 trong số liệu phổ, người ta chia sự chênh lệch tần số cộng hưởng của hạt nhân so với một chất chuẩn (thường dùng nhất là trimethyl silan, TMS) cho tần số cộng hưởng của chất chuẩn đó Vì kết quả thu được (Hz/MHz) là rất nhỏ (phần triệu) nên người ta dùng ppm để thể hiện giá trị cộng hưởng của các hạt nhân Giá trị này thường được gọi là chuyển dịch hoá học Giá trị chuyển dịch hoá học của các proton

thường nằm trong khoảng 0 - 14 ppm, còn của cacbon-13 là từ 0 - 240 ppm.[11]

Có 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này:

- Cách thứ nhất là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng, cách này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân quét

- Cách thứ 2 là ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân Kỹ thuật này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier transform - NMR, FT– NMR) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay

Như đã trình bày ở trên, tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào

từ trường của máy Từ trường càng cao, dải tần số dùng để kích thích các hạt nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao

Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz là theo tần số dùng để kích thích các proton

Có nhiều kỹ thuật xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân khác nhau được áp dụng Mỗi kỹ thuật dùng để xác định những đặc tính cộng hưởng từ nhất định của hạt nhân Tuỳ vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, người ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau Người ta có thể xác định phổ của cùng một loại hạt nhân (1H hay 13C) như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ 2 chiều (COSY, HETCOR, Long-range HETCOR, NOESY )

Trong phổ 1H-NMR độ chuyển dịch hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng từng phần Mỗi proton cộng hưởng ở một trường khác nhau.Vì vậy chúng được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học khác nhau.Ví dụ, các proton của liên kết với cacbon thơm hay liên hợp thường chuyển dịch trong vùng 6 - 8 ppm, các proton trong alkan thường chuyển dịch trong vùng 0 - 2 ppm Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hoá học (như 3 proton của nhóm CH3) thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh Đỉnh này có thể là đỉnh đơn, đôi, ba tới 7 đỉnh thành phần (đỉnh 7) Diện tích của mỗi đỉnh tỉ lệ với số lượng proton của đỉnh Dựa vào diện tích đỉnh có thể biết số proton của đỉnh đó Một thông số quan trọng khác của phổ proton là hằng số ghép (J) tính bằng Hz, cho biết tương tác của proton với các proton kế cận Dựa vào những đặc trưng của độ chuyển dịch hóa học và tương tác spin

mà ta có thể xác định được cấu trúc của hợp chất.[11]

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230 ppm Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hoá học

của cacbon Cacbon lai hoá sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0 - 60 ppm Cacbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45 - 85 ppm Cacbon lai hoá sp2 chuyển dịch trong khoảng 100 -

150 ppm; nếu có liên kết (đôi) với oxy có thể chuyển dịch tới 240 ppm Với

kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của cacbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một cacbon (hơn 1 cacbon nếu chúng có chung môi trường hoá học)

của phân tử.[11]

1.3.5 Phổ DEPT

Kỹ thuật này giúp xác định số lượng proton trên cacbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi cacbon Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau Nói cách khác, nó cho biết cacbon đó là C, CH, CH2 hay CH3, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử Trong phổ DEPT-

153, cacbon bậc IV không xuất hiện, cacbon bậc II là các đỉnh âm, C bậc III

và bậc I là các đỉnh dương, ở phổ DEPT-90, chỉ còn các C bậc III là các đỉnh dương trong phổ Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất, tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ

DEPT 135 Trên phổ DEPT 90 chỉ xuất hiện tín hiệu của nhóm CH.[11]

1.3.6 Phổ 2D-NMR

Đây là các kĩ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kĩ thuật chủ

yếu thường được sử dụng như sau[11]:

- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ các tương tác trên phổ này

- Phổ 1H-1H COSY(1H-1H Chemical Sift Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của các phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc

- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử

Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kĩ thuật phổ NOE differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử Bằng việc đưa vào một xung bằng đúng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn

Ngày nay còn sử dụng nhiều kĩ thuật phổ hai chiều hiện đại khác như:

kĩ thuật xóa tương tác trên các phổ nhất định, ví dụ trên phổ proton, xóa tương tác của một proton nào đó xác định có thể xác định được vị trí của các proton bên cạnh

Ngoài các phương pháp phổ nêu trên, trên thế giới còn có loại phổ RAY (nhiễu xạ Ronghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử

X-Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết hợp với các chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp phân tích so sánh kết hợp khác Đặc biệt, đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều khó khăn xã định chính xác được chiều dài các mạch, cũng như đối với các phân tử có đơn vị đường, thì việc xác định chính xác các loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thủy phân rồi sử dụng bằng phương pháp so sánh bằng LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến

1.4 Giới thiệu một số phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Một vài phép thử so màu đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, trong đó hiện nay người ta thường sử dụng hai phương pháp là: phương pháp MTT và phương pháp SRB

 Phương pháp MTT:

Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann

trên tạp chí Immunological Methods năm 1983 [18] Theo tác giả, muối

tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật Nguyên lý của phép thử

là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào

 Phương pháp SRB

Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm

1990[19] để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển

của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein¸ SRB nhuộm bằng cách

phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm

Phương pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng amino acid của các protein Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và đo mật độ quang của dịch chiết

từ tế bào một cách định lượng

Việc nghiên cứu cấu trúc hóa học của chất phân lập từ lá Xạ đen sẽ góp phần bổ sung những thông tin khoa học về cây Xạ đen Đồng thời, mở ra hướng mới để đánh giá tác dụng sinh học của cây trên cơ sở khoa học, góp phần hiện đại hóa và khoa học hóa nền Y học cổ truyền

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Mẫu thực vật

- Mẫu được thu tại Xóm Bái Rồng, Thường Tín, Kim Bôi, Hòa Bình

- Thời gian thu mẫu: tháng 6/2016

- Đã thu mẫu và gửi PGS.TS Nguyễn Xuân Phương, Viện sinh thái và

Tài nguyên sinh vật giám đinh tên loài của cây Xạ đen tại Hòa Bình Sau khi giám định tên loài thu được kết quả như sau: Cây Xạ đen tại Hòa Bình có tên

khoa học là Ehretia asperula Zoll & Mor (hình 2.1)

Hình 2.1 Mẫu Xạ đen thu được tại Hòa Bình

Hình 2.2 Mẫu tiêu bản Xạ đen đã được giám định

2.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất

2.2.1 Dụng cụ và thiết bị chiết tách mẫu

Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được

- Bình nuôi cấy tế bào

- Phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur

- Đầu týp cho micropipet

2.2.2 Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc

Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy BRUKER Avante 500 với chất chuẩn nội TMS (Tetrametyl Silan) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Máy LC-MS Agilent 1260 series Single Quadrupole để đo phổ khối lượng được thực hiện tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KHCNVN

 Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic

 Các loại chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipticine, Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO

Phát hiện vệt chất: đèn tử ngoại bước sóng 254 và 368 nm, thuốc thử H2SO4 10% hơ nóng từ từ đến khi vết chất hiện màu

2.2.4 Dòng tế bào (cell lines)

- Dòng tế bào Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan)

- Dòng tế bào LU-1 (Human lung adenocarcinoma – Ung thư phổi)

- Dòng tế bào MCF-7 (Human bredst adenocarcinoma – Ung thư vú)

- Dòng tế bào HeLa (HeLa cervical cancer cells – ung thư cổ tử cung HeLa)

2.3 Chiết phân đoạn

Sử dụng phương pháp ngâm dầm, trích kiệt bằng methanol để chiết các hợp chất ra khỏi lá xạ đen, qua trình cụ thể được thực hiện như sau:

Lá xạ đen đem phơi khô sau đó nghiền nhỏ thành bột (5,8kg), tiến hành ngâm bột xạ đen trong bình thủy tinh với dung dịch methanol trong vòng 3 ngày, sau đó lọc loại bỏ cặn, dịch chiết đem cất loại dung môi thu được cao tổng MeOH, quá trình này lập lại thêm 3 lần để lấy tối ưu lượng chất có trong lá xạ đen Từ cao tổng MeOH tiến hành chiết phân đoạn với

các hai loại dung môi là n-Hexane và ethyl acetate, quá trình được thực

hiện cụ thể như sau Hòa tan cao MeOH với hai lít nước chia đều vào 2

bình chiết có thể tích 2 lít sau đó bổ sung thêm vào mỗi bình chiết 1 lít

n-Hexane lắc đều trong 15-20 phút rồi để cho hai dung dịch tách thành 2 lớp, sau khi tách thành 2 lớp tiến hành chiết lấy phần n-Hexane cất loại dung

môi thu được cao n-Hexane, quá trình này được thực hiện liên tiếp 3 lần Sau khi chiết lấy phần n-Hexane thì phần hỗn hợp nước lại tiếp tục được bổ

sung thêm 2 lít EtOAc và cũng lắc đều trong 15-20 phút, quá trình chiết với

EtOAc có khả năng tạo nhũ cao hơn so với n-Hexane cho nên thời gian

tách lớp của chúng cũng lâu hơn Sau khi tách lớp đem chiết lấy phần dịch EtOAc, cất loại dung môi thu được cao EtOAc Cũng như với quá trình làm

với dung dịch n-Hexane thì quá trình này cũng thực hiện chiết liên tiếp 3

lần, tổng lượng cao thu được là 34,47g Dưới đây là sơ đồ chiết phân đoạn

lá xạ đen: