[Luận văn]nghiên cứu nuôi cấy in vitro và ảnh hưởng của ethylmethane sulphonate (EMS) đến cây cẩm chướng nuôi cấy mô

Luận văn, thạc sỹ, tiến sĩ, cao học, kinh tế, nông nghiệp

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

- & -

VŨ HOÀNG HIỆP

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA ETHYLMETHANE SULPHONATE (EMS) ĐẾN CÂY CẨM CHƯỚNG NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Kỹ thuật Trồng trọt

Mã số : 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI – 2008

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được

sử dụng và công bố trong các luận văn, luận án và các công trình khoa học nào trước đây

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn được sử dụng trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo đúng quy định

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này !

Tác giả

Vũ Hoàng Hiệp

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực của bản thân tôi đã nhận được sự giúp đỡ về mọi mặt của các thầy cô giáo, các tập thể và các cá nhân

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo, cán bộ bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Sinh học nông nghiệp - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Đặc biệt xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh, người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về mọi mặt trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Cao đẳng Cộng đồng Hải Phòng đã tạo điều kiện cho tôi có thể đảm bảo thời gian để thực hiện đề tài

Cũng qua đây cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới các, tập thể,

cá nhân, bạn bè đồng nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ, đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Tác giả

Vũ Hoàng Hiệp

EMS: Ethylmethane sulphonate

IAA: 3- Indoleacetic axit

LD50: Liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm

MS: Môi trường Murashige and Skoog

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số

nhân, sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng giống Quận

chúa 36

2 Ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số

nhân, sinh trưởng của chồi in vitro cấy cẩm chướng giống trắng

Đà Lạt 39

3 Ảnh hưởng của của tổ hợp cytokinin và auxin đến hệ số nhân,

sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng giống Quận chúa 43

4 Ảnh hưởng của của tổ hợp cytokinin và auxin đến hệ số nhân,

sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng giống trắng Đà

Lạt 46

5 Ảnh hưởng của α NAA và than hoạt tính trong môi trường MS

tới khả năng ra rễ của chồi in vitro cây cẩm chướng giống quận

chúa 49

6 Ảnh hưởng của α NAA và than hoạt tính trong môi trường MS

tới khả năng ra rễ của chồi in vitro cây cẩm chướng giống Trắng

Đà Lạt 50

7 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in

vitro ngoài vườn ươm của cây cẩm chướng giống Quận chúa 53

8 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in

vitro ngoài vườn ươm của cây cẩm chướng giống Trắng Đà Lạt 54

9 Ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống và phát sinh của chồi

in vitro với thời gian xử lý 1 giờ 61

10 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro

giống Quận chúa với thời gian xử lý 1giờ 64

11 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro

giống Trắng Đà Lạt với thời gian xử lý 1 giờ 65

v

12 Ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống và phát sinh của chồi

in vitro với thời gian xử lý 2 giờ 68

13 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro

giống Quận chúa với thời gian xử lý 2 giờ 71

14 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro

giống Trắng Đà lạt với thời gian xử lý 2 giờ 72

15 Ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống và phát sinh của chồi

in vitro với thời gian xử lý 3 giờ 76

16 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro

giống Quận chúa với thời gian xử lý 3 giờ 80

17 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro

giống Trắng Đà Lạt với thời gian xử lý 3 giờ 81

18 Sự sinh trưởng, phát triển, khả năng ra rễ của chồi giống Quận

chúa xử lý EMS 83

19 Sự sinh trưởng, phát triển, khả năng ra rễ của chồi giống Trắng

Đà Lạt xử lý EMS 84

20 Khả năng sinh trưởng và sự phục hồi của các dạng biến dị giống

Quận chúa cấy chuyển lần 2 87

21 Khả năng sinh trưởng và sự phục hồi của các dạng biến dị giống

Trắng Đà Lạt cấy chuyển lần 2 88 22: Sự sinh trưởng, phát triển của cây con giống Quận chúa xử lý

đột biến (Sau 2 tuần) 89 23: Sự sinh trưởng, phát triển của cây con giống Trắng Đà Lạt xử lý

đột biến (Sau 2 tuần) 90

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hoá 25

2 Mẫu giống hoa nghiên cứu 28

3 Chồi in vitro cây cẩm chướng giống Quận chúa được nuôi cấy trên môi trường bổ sung kinetin với nộng độ khác nhau 38

4 Chồi in vitro cây cẩm chướng giống Quận chúa được nuôi cấy trên môi trường bổ sung BA với nộng độ khác nhau 38

5 Chồi in vitro cây cẩm chướng giống Trắng Đà Lạt được nuôi cấy trên môi trường bổ sung kinetin với nộng độ khác nhau 40

6 Chồi in vitro cây cẩm chướng giống Trắng Đà Lạt được nuôi cấy trên môi trường bổ sung BA với nộng độ khác nhau 44

7 Chồi in vitro giống Quận chúa được nuôi cây trong các môi trường ra rễ khác nhau 51

8 Cây cẩm chướng giống Quận chúa giai đoạn ngoài vườn ươm 55

9 Các dạng chồi thu được sau xử lý EMS 58

10 Chồi dạng D và dạng C giống Quận chúa sau cấy chuyển lần 2 87

11 Cây cẩm chướng sau xử lý EMS trồng trên hệ thống thuỷ canh 90

vii

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Danh mục các từ viết tắt iii

Danh mục các bảng iv

Danh mục các hình vi

Mục lục vii

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 3

1.2.1 Mục đích 3

1.2.2 Yêu cầu của đề tài 3

1.3 Giới hạn của đề tài 4

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài 4

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng 5

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại 5

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng 5

2.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng 6

2.1.4 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước 8

2.1.5 Một số kết quả nghiên cứu về cây cẩm chướng 10

2.2 Nhân giống vô tính in vitro cây hoa cẩm chướng 16

2.2.1 Cơ sở khoa học của nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô 16

2.2.2 Các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây hoa cẩm chướng 20

2.3 Đột biến di truyền và phương pháp xử lý đột biến bằng Ethylmethane sulphonate (EMS) 21

2.3.1 Đột biến di truyền 21

2.3.2 EMS và ứng dụng EMS trong công tác chọn tạo giống cây trồng 24

3 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

viii

3.1 Đối tượng nghiên cứu 28

3.2 Vật liệu nuôi cấy 28

3.3 Nội dung nghiên cứu 28

3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro 28

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của αNAA và than hoạt tính trong môi trường MS tới khả năng ra rễ của chồi in vitro 29

3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm 30

3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của EMS tới khả năng sống, sự phát sinh và sinh trưởng và sự phát sinh hình thái của cây hoa cẩm chướng in vitro 30

3.3.5 Nghiên cứu khả năng tạo cây hoàn chỉnh của các dạng chồi thu được sau xử lý EMS 30

3.3.6 Nghiên cứu khả năng phục hồi của các dạng biến dị thu được sau xử lý EMS 31

33.7 Nghiên cứu khả năng sống và sự sinh trưởng phát triển của các dạng biến dị trong điều kiện vườn ươm 31

3.4 Phương pháp nghiên cứu 31

3.4.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 31

3.4.2 Phương pháp tạo đột biến in vitro 32

3.4.3 Phương pháp nông học trong đánh giá sinh trưởng, phát triển 32

3.4.4 Các chỉ tiêu theo dõi 32

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 34

3.6 Địa điểm nghiên cứu 34

3.7 Thời gian thực hiện 34

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây cẩm chướng 35

4.1.1 Nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro 35

4.1.2 Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh 47

4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm 51

4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của EMS tới sự phát sinh và sinh trưởng của cây hoa cẩm chướng in vitro 56

ix

4.2.1 Ảnh hưởng của EMS đến khả năng năng sống, phát sinh của

chồi in vitro cây cẩm chướng với thời gian xử lý 1 giờ 60

4.2.2 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái và khả năng sinh trưởng của các dạng chồi in vitro của cây cẩm chướng với thời gian xử lý 1 giờ 63

4.2.3 Ảnh hưởng của EMS đến khả năng phát sinh, sinh trưởng thân lá của chồi in vitro cây cẩm chướng với thời gian xử lý 2 giờ 68

4.2.4 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái và khả năng sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng với thời gian xử lý 2 giờ 70

4.2.5 Ảnh hưởng của EMS đến khả năng phát sinh, sinh trưởng thân lá của chồi in vitro cây cẩm chướng với thời gian xử lý 3 giờ 75

4.2.6 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái và khả năng sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng với thời gian xử lý 3 giờ 77

4.2.4 Nghiên cứu khả năng ra rễ của các dạng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý 82

4.2.5 Nghiên cứu sự phục hồi của các dạng chồi biến dị sau xử lý 85

4.2.6 Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện thuỷ canh 88

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 91

5.1 Kết luận 91

5.2 Đề nghị 92

Tài liệu tham khảo 93

Phụ lục 100

Trong những loài hoa cắt được trồng, cẩm chướng đang dần trở thành cây trồng phổ biến Với những ưu điểm: mầu sắc đẹp, đa dạng và phong phú (khoảng hơn 300 loài và rất nhiều giống lai khác nhau [26]), sản lượng cao, dễ vận chuyển và bảo quản (trong điều kiện kho lạnh hoa cẩm chướng có thể để được 16 - 24 tuần, trong khi đó một số loài hoa khác như hoa hồng, cúc, lay ơn, loa kèn chỉ có thể để được 2 đến 6 tuần [11]),… cây cẩm chướng ngày càng được người tiêu dùng biết đến, nó đã trở thành một trong bốn loài hoa cắt cành được trồng phổ biến trên thế giới (chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt [7])

Ở nước ta, trước đây hoa cẩm chướng được trồng làm cảnh trang trí, năm 1975 chúng ta đã bắt đầu sản xuất hoa cẩm chướng cắt cành với những giống được nhập nội từ nước ngoài Từ năm 1995 có nhiều giống hoa cẩm chướng mới được nhập nội có nguồn gốc từ Hà Lan, Trung Quốc với màu sắc

đa dạng phong phú [68] Cho đến nay, cẩm chướng đã trở thành một loài hoa được trồng phổ biến và góp phần không nhỏ vào sự phát triển của ngành rau hoa quả của nước ta Theo số liệu sơ bộ của Tổng cục Hải quan tháng 02 năm

2007 [68], kim ngạch xuất khẩu các loại hoa trong cả nước đạt 604 nghìn USD Trong đó, cẩm chướng có kim ngạch xuất khẩu tăng cao nhất (313 nghìn USD, chiếm 73%)

- 2 -

Hiện nay đa số các giống hoa cẩm chướng được trồng ở nước ta phải nhập từ nước ngoài, nên chi phí sản xuất cao, không chủ động trong sản xuất, năng suất, chất lượng sản phẩm chưa đáp ứng được yêu cầu, thị hiếu của người tiêu dùng Đặc biệt các giống này chưa thích ứng với điều kiện sinh thái của nước ta Vì vậy, việc phát triển cây hoa có giá trị này không chỉ là việc nhân nhanh các giống nhập nội hay tìm ra những biện pháp kỹ thuật nhằm nâng cao năng suất chất lượng mà còn phải tạo ra được những giống hoa cẩm chướng mới đáp ứng được nhu cầu thị trường và phù hợp với điều kiện sinh thái của Việt Nam

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ tế bào thực vật, công nghệ xử lý đột biến in vitro đã trở thành công cụ hữu hiệu trong chọn tạo giống cây trồng Kỹ thuật gây đột biến in vitro đã gây tạo và làm tăng tần số xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc cải tiến giống cây trồng Bằng phương pháp chọn lọc và lai tạo thông thường để tạo một giống cây trồng mới ổn định về năng suất, có chất lượng cao phải mất 6 - 10 thế hệ, nhưng nếu áp dụng phương pháp đột biến in vitro chỉ cần 3 - 6 thế hệ Phương pháp được đánh giá là một trong những thành tựu của thế kỷ 20

Ở nước ta hiện nay việc nghiên cứu gây đột biến in vitro vẫn còn hạn chế, đặc biệt trên đối tượng là cây hoa cẩm chướng thì cho đến nay vẫn chưa

có công trình nào được công bố

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên với sự giúp đỡ của PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và ảnh hưởng của Ethylmethane sulphonate (EMS) đến cây cẩm chướng nuôi cấy mô”

- 3 -

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục đích

- Nghiên cứu nuôi cây in vitro góp phần hoàn thiện quy trình nhân

giống in vitro cho cây hoa cẩm chướng (Diathus caryophyllus L.), làm cơ sở

cho việc tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh các mẫu xử lý đột biến in vitro bằng hoá chất EMS

- Nghiên cứu phương pháp và tác động của xử lý EMS in vitro đến cây cẩm chướng, nhằm tạo nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống cây hoa cẩm chướng

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

- Xác định được môi trường nuôi cấy có hệ số nhân chồi cao, chất lượng chồi tốt

- Xác định được môi trường ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh thích hợp

- Xác định được phương pháp ra cây thích hợp cho cây cẩm chướng in vitro giai đoạn ngoài vườn ươm

- Xác định được ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống, sự phát sinh chồi của mẫu cấy, sự sinh trưởng và sự phát sinh hình thái của chồi in vitro

- Xác định được liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm (LD50)

- Xây dựng mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ, thời gian xử lý EMS đến tỷ lệ chết, tỷ lệ biến dị của chồi in vitro cây cẩm chướng

- Xác định được ngưỡng xử lý hợp lý và hiệu quả cho cây hoa cẩm chướng in vitro

- Xác định khả năng phục hồi của các dạng chồi đã phân lập được sau

xử lý EMS

- Xác định được sự sinh trưởng và khả năng tạo cây hoàn chỉnh trong điều kiện in vitro của các dạng chồi

- 4 -

- Xác định khả năng sống, sinh trưởng của các dạng chồi sau xử lý EMS trong điều kiện vườn ươm

1.3 Giới hạn của đề tài

- Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận chúa

và giống Trắng Đà lạt qua 3 giai đoạn: giai đoạn nhân nhanh, giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh và giai đoạn thích ứng cây ngoài vườn ươm

- Nghiên cứu xử lý EMS ở nồng độ 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0% trong thời gian 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ

- Các thí nghiệm ngoài vườn ươm được tiến hành trong điều kiện khí hậu vùng Đồng bằng sông Hồng

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài

- Xác định được môi trường, điều kiện thích hợp cho việc nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in vitro và xác định giá thể phù hợp cho cây in vitro có tỷ lệ sống cao, sinh trưởng tốt, đạt chất lượng cây giống tốt ở vườn ươm Trên cơ sở đó góp phần hoàn thiện quy trình vi

nhân giống cây hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) nhằm cung cấp

cây giống có chất lượng cao cho người trồng hoa

- Trên cơ sở nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý EMS đến sự phát sinh hình thái, sinh trưởng phát triển của cây cẩm chướng trong điều kiện nuôi cấy in vitro, từ đó xác định được phương pháp xử lý EMS hiệu quả cho cây cẩm chướng, tạo tiền đề cho công tác chọn tạo giống cây cẩm chướng bằng phương pháp xử lý EMS

Các kết quả nghiên cứu của đề tài chính là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu tạo dòng đột biến tạo nguồn nguyên liệu cho việc chọn tạo giống cẩm chướng mới Đồng thời các kết quả cũng là tư liệu giảng dạy có giá trị cho lĩnh vực công nghệ sinh học và chọn tạo giống cây trồng

- 5 -

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại

Cẩm chướng hay còn gọi là hoa Phăng có tên tiếng Anh: Carnation, tên

khoa học: Dianthus caryophyllus L, thuộc chi: Dianthus, họ: Caryophyllaceae, bộ: Sentrospenmea [11]

Cẩm chướng có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải, bắt đầu được nuôi trồng để thưởng ngoạn từ thế kỷ XVI Lần đầu tiên vào năm 1750, các nhà làm vườn Pháp đã tạo ra giống cẩm chướng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều lần trong năm Năm 1846, họ đã trồng được rất nhiều giống cẩm chướng hoang dại và điều khiển cho chúng ra hoa quanh năm [7]

Năm 1852, cây cẩm chướng từ châu Âu được nhập vào Mỹ Tại đây hàng trăm giống hoa cẩm chướng mới với các hình dạng và mầu sắc khác nhau đã được tạo ra, trong đó các giống như North, Berwick, Maine và Wiliam Sim đã trở thành những giống hàng đầu Từ các giống hoa này, người

ta đã gây đột biến và lai tạo ra rất nhiều giống cẩm chướng khác nhau trong

đó có các giống thuộc dòng Sim nổi tiếng nhất và được trồng khắp nơi trên thế giới [7]

Ở Việt Nam hoa cẩm chướng được người Pháp đưa vào trồng từ đầu thế kỷ XIX, chủ yếu trồng ở những nơi có khí hậu mát mẻ như Đà Lạt, SaPa Những năm gần đây, cẩm chướng đã được trồng ở nhiều vùng trong cả nước [6]

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng

- Rễ : Cẩm chướng có bộ rễ chùm, có rất nhiều nhánh phát triển mạnh

để hút nước, dinh dưỡng Chiều dài của rễ 15 - 20 cm, phân bố tập trung ở tầng đất mặt 20 cm, một số ít có khả năng ăn sâu tới 40 - 45 cm Ở trạng thái

- 6 -

bình thường rễ và tán cây theo tỷ lệ tương đương Nếu đất quá nhiều phân, nhiều nước rễ sẽ sinh trưởng không tốt Nhiệt độ đất cao cũng ảnh hưởng đến

sự sinh trưởng, phát triển của rễ

- Thân : Thân thảo, thân thẳng đứng, phân nhánh nhiều, chiều cao cây khoảng 30 - 100 cm (tùy theo giống) và nửa hóa gỗ Thân rất dễ gẫy ở đốt Các đốt cẩm chướng thường gẫy khúc Thân thường có mầu xanh nhạt, bao phủ một lớp phấn trắng xung quanh Phấn có tác dụng chống thoát hơi nước

và bảo vệ cây khỏi sâu bệnh

- Lá: Lá kép mọc từ các đốt thân, lá mọc đối Phiến lá dày hình lưỡi mác, mép lá trơn Mặt lá nhẵn không có độ bóng Trên mặt lá có phủ một lớp phấn trắng, mỏng và mịn có tác dụng làm giảm sự thoát hơi nước Tốc độ sinh trưởng của lá phụ thuộc vào thời tiết: mùa xuân, mùa hè thường 4 - 5 ngày, mùa thu, mùa đông từ 7 - 10 ngày ra một đôi lá

- Hoa : Có hai dạng hoa chính: hoa chùm và hoa đơn Về cánh hoa có thể xếp làm hai loại: hoa đơn hoa kép Hoa đơn mọc từng chiếc một, hoa chùm có nhiều hoa trên một cành Hoa nằm trên đầu cành và có nhiều mầu sắc khác nhau Ngay cả trên một hoa cũng có thể có 2 - 3 mầu khác nhau Hoa đẹp, có mùi thơm thoang thoảng Nụ hoa có đường kính 2 - 2,5 cm Khi hoa

nở hoàn toàn có đường kính 6 – 7 cm Chiều cao bông hoa (tính từ đốt trên cùng của cành) khoảng 4 - 7,5 cm

- Hạt : Hạt cẩm chướng nhỏ, nằm trong quả Mỗi quả thường có từ 300

- 600 hạt

2.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng

- Ánh sáng : Cẩm chướng là cây ưa sáng và thích hợp với thời gian chiếu sáng ngày dài Thời gian chiếu sáng trong ngày càng dài, cây càng nhanh phân hóa hoa, hoa nở đều, chất lượng hoa tốt Lượng chất khô và tốc

- 7 -

độ sinh trưởng của cây tương quan thuận với cường độ ánh sáng Cường độ ánh sáng thích hợp là 1500 – 3000 lux, tối thích: 2000 – 2500 lux

Trong quá trình phát triển, nếu cường độ ánh sáng cao (> 3000 lux) cây

sẽ ra hoa sớm, nếu cường độ ánh sáng thấp (< 1000 lux) quá trình ra hoa sẽ muộn Ở thời kỳ ra hoa rộ vào mùa nóng, lúc giữa trưa, cường độ ánh sáng mạnh, cần che bớt ánh sáng cho cây vì ánh sáng quá mạnh sẽ làm cho cánh hoa dễ bị nhạt mầu và cháy, ảnh hưởng đến chất lượng hoa

- Nhiệt độ: Cẩm chướng là cây ôn đới nên thích hợp với khí hậu mát

mẻ Nhiệt độ thích hợp cho cây từ 15 - 200C, nhiệt độ tối ưu là 19 - 210C Trong khoảng nhiệt độ từ 10 - 150C cây vẫn sinh trưởng bình thường và cho chất lượng hoa tương đối tốt Nếu nhiệt độ vượt quá 300C hoặc dưới 100C thì cây sinh trưởng kém, thân lá, hoa nhỏ, sản lượng và chất lượng hoa giảm, tuổi thọ ngắn

Chênh lệch nhiệt độ ngày, đêm có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng hoa Nhìn chung chênh lệch nhiệt nhiệt độ ngày đêm khoảng 100C là tốt nhất, mức chênh lệch nhiệt độ ngày, đêm quá cao hoặc quá thấp sẽ làm chất lượng hoa kém, số hoa mù cao

- Nước: Hàm lượng nước trong lá cẩm chướng chiếm khoảng 70 - 80%, trong cành 68 - 70%, trong rễ 80% Nước có vai trò vô cùng quan trọng đối với cây trồng nói chung và cây hoa cẩm chướng nói riêng Ẩm độ thích hợp

60 - 70%, ẩm độ tối thích 70% Nếu độ ẩm ổn định sẽ tạo điều kiện cho cây hút chất ding dưỡng và muôi khoáng một cách thuận lợi, cây sinh trưởng tốt, năng suất và phẩm chất hoa cao [18]

- Không khí: Cẩm chướng ưa khí hậu mát mẻ và thông thoáng Trồng ở nơi có độ ẩm cao, kém gió sẽ bị bệnh nhiều

- Đất đai: Khoảng 70% số rễ của cẩm chướng tập trung ở tầng đất mặt (0 – 20 cm), yêu cầu đất có kết cấu tơi xốp Độ pH thích hợp với cây cẩm

- 8 -

chướng là từ 6,0 - 6,5 Đối với đất liên tục trồng cẩm chướng thì phải khử trùng, tiêu độc hoặc luân canh vì đất có nhiều vi sinh vật gây bệnh [7]

2.1.4 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước

2.1.4.1 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới

Trên thế giới, cẩm chướng là hoa cắt cành được trồng phổ biến tại châu

Âu, châu Á, châu Mỹ

Italia là nước có diện tích trồng hoa cẩm chướng nhiều nhất, năm 1995 sản lượng hoa cắt nước này đạt 2500 triệu cành Ở Hà Lan, tuy diện tích trồng hoa cẩm chướng không bằng diện tích trồng hoa tuylip nhưng sản lượng cũng đạt trên 1800 cành/năm, đứng thứ 2 trên thế giới và có xuất khẩu sang châu

Âu, Bắc Mỹ và Nhật Bản Ở Ba Lan, cẩm chướng chiếm 60% sản lượng hoa cắt, mỗi năm nước này sản xuất được khoảng 400 triệu cành, đứng thứ 3 trên thế giới [7]

Colombia là nước trồng cẩm chướng cho hoa tốt nhất trên thế giới và được coi là thiên đường của hoa cẩm chướng Cẩm chướng chiếm 40% tổng lượng hoa xuất khẩu của nước này Với điều kiện tự nhiên rất phù hợp, cây cẩm chướng đã phát triển trên 25 năm, năm 1986 đã có diện tích gần 1000 ha cẩm chướng được trồng trong nhà che plastic [47]

Cẩm chướng cũng là loại hoa phát triển mạnh ở Kenya Diện tích trồng hoa cẩm chướng của Kenya chủ yếu tập trung ở Ritf Valley Cây cẩm chướng cảnh được trồng ngoài đồng không bảo vệ ở độ cao khoảng 1800 m

và cẩm chướng thường được trồng trong nhà plastic ở độ cao 2700 m so với mực nước biển [24]

Ở Thổ Nhĩ Kỳ, hoa cẩm chướng được trồng rộng rãi từ năm 1925, hiện nay diện tích hoa cẩm chướng chiếm tỷ lệ 21%, đứng thứ 2 sau hoa hồng (24%) [18]

- 9 -

Ở châu Á, hoa cẩm chướng được trồng nhiều ở Trung Quốc, Malaysia, Srilanka,… Ở Trung Quốc, hoa cẩm chướng cùng hoa hồng là hai loại hoa phổ biến nhất Cẩm chướng chiếm khoảng 25% tổng lượng hoa trên thị trường tại Bắc Kinh và Côn Minh Trung tâm sản xuất hoa cẩm chướng tập trung ở Côn Minh và Thượng Hải Hầu hết các giống của Trung Quốc được nhập từ Israel, Hà Lan và Đức [57] Tỉnh Vân Nam của Trung Quốc có kim ngạch xuất khẩu hoa cắt cành ngày càng cao, theo thống kê tháng 11 năm

2006 đạt 10,4 triệu USD với sản lượng 4,3 nghìn tấn, trong đó cẩm chướng là một trong 3 loại hoa xuất khẩu chủ lực [68]

Tại Malaysia, sản lượng hoa cẩm chướng đứng thứ ba sau cây hoa hồng

và hoa cúc, chiếm 9,02% tổng sản lượng hoa Ở đây, hoa cẩm chướng được trồng bao gồm cả loại hoa chùm và hoa đơn [17]

Ở Philippin, cây cẩm chướng trồng được rất ít và phải nhập khẩu từ các nước khác Tỷ lệ nhập khẩu hoa cẩm chướng đứng thứ hai trong tổng giá trị nhập khẩu hoa với 22,05% chỉ đứng sau hoa cúc (36,98%) Năm 1996, lượng hoa cẩm chướng nhập khẩu của Philippin từ Hà Lan là 7691 kg (khoảng

620000 cành), từ Malaysia 5097 kg (khoảng 260000 cành), từ Australia 638kg (khoảng 32000 cành) và New Zealand 80 kg (khoảng 4000 cành) [53]

Tại Srilanka, hoa cẩm chướng là cây hoa ôn đới quan trọng nhất Hoa cẩm chướng được trồng chủ yếu để xuất khẩu, còn các loại hoa khác chỉ tiêu thụ được ở nội địa Hai giống cẩm chướng châu Mỹ và cẩm chướng Địa Trung Hải của Srilanka rất nổi tiếng trên thị trường thế giới Một phần diện tích cẩm chướng khá lớn được trồng trong môi trường bảo vệ hoàn toàn [29]

Ixraen có 150 ha hoa cẩm chướng chiếm 7,5% tổng diện tích trồng hoa, mỗi năm nước này xuất khẩu đạt 119 triệu USD [7]

- 10 -

2.1.4.2 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam

Ở Việt Nam, hoa cẩm chướng được trồng rộng rãi ở Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt, thành phố Hồ Chí Minh Các vùng chuyên hoa như An Hải (Hải Phòng), Tây Tựu - Từ Liêm, Phú Thượng - Tây Hồ (Hà Nội) trồng nhiều hoa cẩm chướng Trước đây, vào mùa hè, hoa cẩm chướng trên thị trường nước ta chủ yếu phải nhập từ Côn Minh (Trung Quốc) và Hà Lan, vài năm gần đây, để đáp ứng nhu cầu thị trường cẩm chướng đã được trồng ở Đà Lạt, Lào Cai, Sa Pa và đang dần chiếm lĩnh thị trường trong nước [18]

Theo số liệu thống kê của Tổng cục Hải quan [68], tháng 02/2007 kim ngạch xuất khẩu hoa cẩm chướng tăng mạnh đạt 313 nghìn USD, tăng 73% so với tháng 1/2007 và tăng 86% so với xuất khẩu năm 2006 Trong đó thị trường Trung Quốc là thị trường xuất khẩu lớn nhất đạt 202000 USD và chiếm 64% tổng kim ngạch xuất khẩu hoa cẩm chướng của cả nước Cuối tháng 6/2007, DaLat Hasfarrm là công ty dẫn đầu các doanh nghiệp xuất khẩu hoa cây cảnh cả nước, chiếm 99% tổng kim ngạch xuất khẩu Bốn loại hoa chủ lực của công ty là cúc, cẩm chướng, hồng và hoa ly xuất khẩu sang các thị trường khác nhau Trong đó sản lượng hoa cẩm chướng đứng thứ 2 sau hoa cúc, với đơn giá xuất khẩu trung bình 0,19 USD/cành Cùng với hoa cúc

và hoa hồng, cẩm chướng là một trong 3 chủng loại hoa xuất khẩu chính vào Nhật Bản - thị trường xuất khẩu hoa lớn nhất của nước ta đầu năm 2007

Như vậy có thể thấy cẩm chướng là một loại hoa có tiềm năng phát triển rất lớn, và có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc phát triển ngành sản xuất hoa của nước ta nói riêng và thế giới nói chung

2.1.5 Một số kết quả nghiên cứu về cây cẩm chướng

2.1.5.1 Kết quả nghiên cứu trên thế giới

Với những ưu điểm của mình hoa cẩm chướng đã trở thành một trong những loài hoa được trồng phổ biến trên thế giới và được nhiều người ưu

- 11 -

thích, cũng chính vì điều này đã thúc đẩy các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhằm chọn tạo ra những giống hoa chất lượng cao, có khả năng sinh trưởng phát triển tốt thích ứng với nhiều vùng sinh thái phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng

* Các kết quả nghiên cứu về chọn tạo giống:

Năm 1962, các tác giả người Mỹ đã sử dụng tia gamma để tạo đột biến trên giống UConn White Sim No.1 và đã thu được các dòng cẩm chướng đột biến về cấu trúc hoa

Năm 1972, các tác giả người Pháp đã sử dụng tia gamma để tạo đột biến trên giống Sim Feu Follet và đã thu được các dòng cẩm chướng đột biến

về màu sắc hoa

Năm 1972, các tác giả người Đức đã sử dụng EMS để tạo đột biến trên giống Enzett Barther Fruhl và đã thu được các dòng cẩm chướng đột biến về màu sắc hoa

Năm 1982, các tác giả người Pháp đã sử dụng tia gamma để tạo đột biến trên giống Maiella - lonchabi, Galatee - lonvego và đã thu được các dòng cẩm chướng của các giống Maiella - lonchabi, Galatee - lonvego đột biến có khả năng kháng lại nấm Fusarium

Năm 1983, các tác giả người Thái Lan đã sử dụng tia gamma để tạo được giống hoa cẩm chướng Chaichoompon có màu sắc khác lạ Cũng trong năm này, các tác giả người Nhật đã sử dụng tia gamma để tạo được giống hoa cẩm chướng Scarlet Bell đột biến về màu sắc

Butiati và các cộng sự (1985) [18], đã sử dụng tia X với liều lượng

2500 rad và 5000 rad chiếu vào đỉnh sinh trưởng và chồi rễ của cây, kết quả

đã gây ra biến dị mầu sắc ở cây hoa cẩm chướng Địa Trung Hải (giống Corrida)

- 12 -

Nakano và Mii (1993) [43], đã tiến hành nghiên cứu dung hợp tế bào trần trên cây hoa cẩm chướng Các tế bào trần được phân lớp từ tế bào thịt lá

của hai giống Dianthus chinensis và Dianthus barbatus đem dung hợp với

nhau nhờ tác động của polyethylene glycol (PEG) Sau khi dung hợp đem nuôi cấy tạo mô sẹo và chồi được tái sinh từ một trong những mô sẹo đó, sau

5 tháng nuôi cấy in vitro, cây ra rễ và sinh trưởng phát triển tốt và cho hoa Các số liệu về mầu sắc hoa, số nhiễm sắc thể, các chỉ tiêu về enzym và kỹ thuật phân tích ADN cho thấy các cây con này là các cây lai soma khác loài Công trình này cho thấy khả năng dùng kỹ thuật lai soma để cải tiến di truyền

đối với chi Dianthus

A.C.Cassells, C.Walsh và C.Periappuram (1993), đã nghiên cứu tạo đột biến trên cây cẩm chướng bằng cách sử dụng tia X Vật liệu xử lý là các đoạn thân có mang các mắt ngủ của giống cẩm chướng Mystère Kết quả đã thu được các cây cẩm chướng có sự đa dạng về màu sắc hoa, kiểu dáng lá Tỷ

lệ tạo cây biến dạng là 2% Phân tích về kiểu gen cho thấy có sự sai khác so với cây trước khi tạo đột biến

Burchi và các cộng sự (1995) [18], đã nghiên cứu sự biểu hiện của gen GUS ở chồi nách của các giống cẩm chướng, cúc được chuyển gen bằng xung điện với dòng điện 0,2 - 1, 0 mA trong 3 - 10 phút Kết quả là 50% chồi được

xử lý đã sống và 50% số này đã có biểu hiện mang gen NUS Tác giả đưa ra kết luận phương pháp chuyển gen bằng xung điện (in vitro electrotransfection) là phương pháp hiệu quả để đưa đoạn gen ngoại lai vào

mô sống đỉnh sinh trưởng của cây cẩm chướng

Năm 1996, các tác giả thuộc phòng thí nghiệm thực vật thuộc công ty Kirin Brewery, Nhật Bản khi sử dụng tia gamma làm tác nhân đột biến kết quả đã thu được giống cẩm chướng Mrs Elegant thay đổi về kích thước hoa

- 13 -

Năm 2002, các tác giả thuộc phòng thí nghiệm Akita Prefectural Agriculture, Nhật Bản sử dụng colchicine làm tác nhân gây đột biến, kết quả thu được giống cẩm chướng Boh-red và Kirikami-red thay đổi về mầu sắc hoa [66]

Năm 2004, nhờ xử lý tia X các tác giả Nhật bản thuộc Plant Laboratory Kirin Brewery Co Lt đã thu nhận đươc hai giống cẩm chướng có hình thái và màu sắc hoa mới

Rupali Mehta (2004) [63], Bằng cách sử dụng kỹ thuật chọn lọc in vitro, tác giả đã tạo được các giống cẩm chướng có khả năng sinh tổng hợp phenol ở mức độ cao, lượng đường và protein giảm

Năm 2005, các tác giả thuộc phòng thí nghiệm Akita Prefectural Agriculture, Nhật Bản đã thu được giống cẩm chướng Yua-red thay đổi về màu sắc hoa khi sử dụng colchicine làm tác nhân gây đột biến và các tác giả thuộc Plant Laboratory Kirin Brewery Co Lt tạo được 2 giống cẩm chướng

có màu sắc mới nhờ xử lý ion phóng xạ [63]

Bằng phương pháp chọn dòng tế bào biến dị soma Manisha Thakur (1999), đã tạo thành công giống hoa cẩm chướng có khả năng kháng lại vi

khuẩn Fusarium oxysporum f sp Dianthi Tác giả đã sử dụng các callus rắn có

màu xanh được tạo từ các đoạn thân được cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 D và 0,5 mg/1 NAA Callus được xử lý trên các nồng độ của CF

của Fusarium oxysporum f sp Dianthi Các callus sau chọn lọc được cấy trên

môi trường MS có bổ sung 2 mg/l kinetin và 0,5 mg/l NAA Ra rễ trên môi trường MS + 2 mg/l IBA Cây tái sinh từ các tế bào chọn lọc được có khả năng kháng lại ở mức cao các vi khuẩn dại trong điều kiện đồng ruộng [63]

* Các nghiên cứu về kỹ thuật trồng trọt:

Từ năm 1983 - 1986, Chesneaux và cộng sự đã nghiên cứu 163 loài cẩm chướng, tìm hiểu năng suất của chúng trong mùa đông (tháng 9 - tháng 3) Số cành thu là 1 cành/tuần Kết quả cho thấy năng suất của loài hoa đơn

Van Den Heuvel (1987) [55], nghiên cứu công nghệ trồng hoa cẩm chướng ở Hà Lan cho thấy các loại đất trồng và phương pháp tưới, bón phân

có thể làm giảm bệnh do nấm Fusarium, tưới nhỏ giọt có thể giữ cho cây khô

và tiết kiệm nước, sử dụng plastic trắng che có thể tận dụng được ánh sáng sẵn có của tự nhiên và giảm sự bay hơi nước trong mùa đông

Andersen và cộng sự (1989) [22], trồng cây cẩm chướng lai Fancy trong điều kiện nhân tạo ở các cường độ ánh sáng 10 - 60 W/m2 Kết quả cho thấy số cành và số hoa tăng rõ rệt theo cường độ ánh sáng

Sparnaaij và cộng sự (1990) [51], đã tiến hành nghiên cứu 27 hậu thế của các phép lai xa giữa các loài cẩm chướng và một số cây lai xa hỗn hợp đã phát triển dưới điều kiện chiếu sáng 8 giờ/ngày ở cường độ chiếu sáng 12 W/m2 và 22 W/m2 Kết quả là các hậu thế từ phép lai với loài D.Chinensis ra hoa sớm nhất Hầu hết các con lai từ cặp D.Superbus x D.Barbatus đã phân ly

thành cây ra hoa và cây không ra hoa

Sparnaaij và các cộng sự (1990) [52], cũng đã quan sát biến dị di truyền

ở cây cẩm chướng về ngày ra hoa và về phản ứng về ngày dài của một số kiểu

gen lai xa và của D.Caryophyllus Tỷ lệ cây có phản ứng với ngày dài thay đổi từ 28% (ở giống truyền thống) đến 54% ở các cây lai Diantini x

D allwoodii cv.Doris

- 15 -

Voogt (1991) [56], nghiên cứu ảnh hưởng của pH đất tới cây hoa cẩm chướng cho thấy pH đất có ảnh hưởng rất nhỏ tới cây cẩm chướng, nguyên nhân có thể do trong đất có nhiều nguyên tố trung tính và sự có mặt của calcium carbonate

Khanna và cộng sự [18], nghiên cứu trong 3 năm liền về ảnh hưởng của mật độ và ngắt ngọn đến sinh trưởng và sản lượng hoa cẩm chướng Thí nghiệm tiến hành với các mật độ 15 x 15 cm, 20 x 20 cm, 25 x 25 cm, 30 x 30

cm và ngăt ngọn 1 lần ở 60 ngày, 2 lần (lần 1: 45 ngày và lần 2; 70 ngày), 3 lần (lần 1: 40 ngày; lần 2: 60 ngày và lần 3: 80 ngày) sau khi trồng ra vườn Kết quả cho thấy mật độ dày cho ra hoa sớm hơn mật độ thưa Ngắt ngọn chậm và ngắt đau làm cây ra hoa muộn hơn Số hoa trên mỗi cây ở mật độ thưa cao hơn nhiều so với cây trồng ở mật độ dầy nhưng tổng số hoa/m2 ở thí nghiệm trồng dầy lại cao hơn trồng thưa Kích thước của hoa không có sự sai khác đáng kể

2.1.5.2 Kết quả nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần đây việc nghiên cứu nhằm phát triển cây hoa ở nước ta đã được nhiều tác giả quan tâm Tuy nhiên các nghiên cứu mới chỉ tập trung nhiều vào một số loại cây hoa chính như hoa hồng, cúc, đồng tiền, hoa lan, lay ơn,… Với cây hoa cẩm chướng việc nghiên cứu vẫn còn hạn chế

Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (1996) [15], đã tiến hành nghiên cứu xây dựng qui trình nhân giống một số cây trồng có giá trị kinh tế (chuối, dứa, cẩm chướng, loa kèn, khoai tây) Các tác giả đã đưa ra kết luận về cây cẩm chướng: “ Hoàn toàn có thể sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro để nhân nhanh cây cẩm chướng; Chất khử trùng mẫu thích hợp là HgCl2 0,1% thời gian 10 phút; Môi trường thích hợp cho quá trình nuôi cấy khởi động phát sinh chồi ban đầu là MS có bổ sung 1ppm BA + (0,02 - 0,05) ppm α NAA;

Tác giả Lê Sỹ Dũng và cộng sự (2001) [4], đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình in vivo và in vitro hoa cẩm chướng

Lê Đức Thảo (2003) [18], tiến hành nghiên cứu tuyển chọn giống hoa cẩm chướng và phương pháp nhân giống bằng giâm cành Tác giả đã nghiên cứu 15 giống cẩm chướng nhập nội từ Trung Quốc và Hà Lan và đã kết luận,

sử dụng IBA nồng độ 1000 ppm và trồng trên giá thể trấu hun là tốt nhất để giâm cành cây cẩm chướng

Nguyễn Thị Ngân (2007) [12], tiến hành nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật thuỷ canh và khí canh trong nhân giống hoa cẩm chướng Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi nhân giống bằng kỹ thuật thuỷ canh, sử dụng dung dịch Anthura với nồng độ bằng ¾ dung dịch chuẩn, kết hợp chế độ sục khí 4 lần/ngày cho kết quả tốt nhất; nhân giống bằng kỹ thuật khí canh thì sử dụng dung dịch Anthura nồng độ bằng ¾ nồng độ chuẩn, phun định kỳ 10 phút 1 lần trong 15 giây sẽ cho hiệu quả cao nhất

2.2 Nhân giống vô tính in vitro cây hoa cẩm chướng

2.2.1 Cơ sở khoa học của nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng

Cơ sở lý luận của phương pháp đó là dựa trên cơ sở tính toàn năng và đặc tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật

- 17 -

Theo Haberlandt (1902) [14], mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Đó chính là tính toàn năng của tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá) Sau đó

từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau Quá trình này gọi

là quá trình phân hoá tế bào

Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào Quá trình phân hoá và phản phân hoá được biểu diễn qua sơ đồ sau:

Phân hoá tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, phân hoá gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể,

có một số gen được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc của phân tử AND của mỗi tế bào

- 18 -

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng rẽ tế bào, thuận lợi thì các gen được hoạt hoá Quá trình phân hoá sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt đề xuất cũng như đặc tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể phục vụ nhiều mục đích khác nhau Trong lĩnh vực giống cây trồng nó được ứng dụng để làm phong phú vật liệu

di truyền cho công tác chọn tạo giống, nhân nhanh và duy trì những giống và các thể có ý nghĩa khoa học, làm sạch bệnh vi rút, phục tráng những giống thoái hoá Trong đó, ứng dụng trong nhân giống vô tính cây trồng là được quan tâm hơn cả [21]

Vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân giống bằng nuôi cấy mô là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

Khác với các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn, có thể tạo ra được một số lượng cây giống lớn đồng đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các phương pháp nhân giống khác không thể đáp ứng được Ngoài ra phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết nên có thể tiến hành quanh năm, do vậy nó được ứng dụng rộng rãi Phương pháp này đặc biệt tỏ ra ưu việt với các loại cây khó nhân giống bằng con đường nhân giống hữu tính, các giống quý hiếm có số lượng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh Phương pháp này có thể tạo ra một quần thể đồng nhất với số lượng lớn, cây giống khoẻ mạnh, sạch bệnh, có thể phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ bị diệt vong, có thể trao đổi

- 19 -

quốc tế nguồn gen và lưu giữ, bảo quản dưới dạng cây con in vitro Kỹ thuật này đã được ứng dụng rất có hiệu quả cho rất nhiều loại cây trồng như cây hoa, cây lương thực, cây ăn quả, cây công nghiệp và cây dược liệu,…

Theo Georger (1993) [14], quá trình nhân giống vô tính in vitro gồm các bước như sau:

Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ: Cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) cần phải được chọn lọc cẩn thận, đảm bảo sạch bệnh và đang ở giai đoạn sinh trưởng mạnh

Nuôi cấy khởi động: Đây là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy

in vitro Giai đoạn này cần phải đảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ

lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Để đảm bảo được yêu cầu này khi lấy mẫu chúng ta cần phải chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây

Nhân nhanh: Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái

và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính Đây là giai đoạn quan trọng quyết định đến

hệ số nhân của quá trình nhân giống Đối với mỗi loại cây trồng, loại mô đòi hỏi môi trường nuôi cấy và điều kiện ngoại cảnh khác nhau Vì vậy việc xác định được môi trường nuôi cấy và chế độ nuôi cấy cho từng loại đối tượng có

ý nghĩa rất lớn cho việc nuôi cấy in vitro

Tạo cây hoàn chỉnh: Đây là giai đoạn tạo rễ cho chồi Để chồi phát sinh rễ người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo

rễ Môi trường này thường được bổ sung auxin, than hoạt tính với liều lượng khác nhau tuỳ thuộc vào từng đối tượng

Thích ứng cây in vitrio ngoài điều kiện tự nhiên: Sau khi cây trong ống nghiệm đã đạt được những tiêu chuẩn hình thái nhất định thì chúng ta đưa

ra ngoài vườn ươm để cây thích ứng dần với điều kiện tự nhiên Trước khi

- 20 -

đưa ra ngoài vườn ươm cây được sống trong điều kiện hoàn toàn thuận lợi do vậy ở giai đoạn này cần phải có điều kiện chăm sóc thích hợp cho cây sinh trưởng phát triển tốt Giá thể tiếp nhận cây in vitro ở giai đoạn này có tính chất quyết định đến tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng của cây

2.2.2 Các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây hoa cẩm chướng

Gimelli và cộng sự (1984) [69], đã nghiên cứu ảnh hưởng của cytokinin tới hoạt động của sắc tố quang hợp của chồi nách cây cẩm chướng nuôi cấy

mô

Rupali Mehta (2004) [63], đã nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh tạo callus và tái sinh phôi phục vụ chọn giống cẩm chướng Để tái sinh tạo callus, mẫu cấy cẩm chướng được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l NAA và 2 mg/l kinetin, môi trường tái sinh tạo chồi từ callus là MS + 0,2 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA, môi trường tạo rễ là MS lỏng + 2 mg/l IBA

và 0,2% than hoạt tính

E.Casanova và cộng sự (2005) [69], nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ agar đến sự phát triển chồi nách của cây cẩm chướng nuôi cấy mô Tác giả đã đưa ra kết luận sử dụng nồng độ 8 g/dm3 sẽ thúc đẩy sự phát triển của chồi

Yang Yanzhou (2005) [62], đã nghiên cứu nuôi cấy mô cây cẩm chướng, tác giả đã khẳng định môi trường MS bổ xung 1,5 mg/l BA và 0,1mg/l α NAA cho hiệu quả cao với việc nhân nhanh chồi; môi trường MS

bổ xung 1,0 mg/l α NAA là môi trường ra rễ thích hợp cho cây cẩm chướng nuôi cấy mô

Năm 2005 các nhà khoa học thuộc trường đại học Shiraz (Iran) [35], đã nghiên cứu khảo sát sự phát triển của chồi và rễ cây cẩm chướng nuôi cấy mô Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường MS bổ sung 4,44 µm BA và 5,37 µm NAA cho hệ số nhân chồi tốt

- 21 -

Ở nước ta cũng đã có một số tác giả như Nguyễn Quang Thạch (1996), Lâm Hồng Hải (1996), Lê Sỹ Dũng (2001) [15], [9], [5] cũng đã nghiên cứu nuôi cấy mô cây hoa cẩm chướng Tuy nhiên việc trồng cây hoa cẩm chướng nuôi cấy mô mới chỉ áp dụng trong phạm vi thí nghiệm

2.3 Đột biến di truyền và phương pháp xử lý đột biến bằng Ethylmethane sulphonate (EMS)

2.3.1 Đột biến di truyền

2.3.1.1 Đột biến tự nhiên và đột biến nhân tạo

Đột biến (mutation) là những biến đổi di truyền hợp thành cơ sở di truyền của tính biến dị, nó là hiện tượng thường xuyên gắn liền với sự sống và tiến hoá của sinh vật Tác động của các đột biến rất đa dạng, nó có thể gây ra những biến đổi bất kỳ tính trạng nào với những mức độ khác nhau, từ những biến đổi rõ rệt, đến những sự sai lệch rất nhỏ khó nhận thấy Một số đột biến được biểu hiện ra kiểu hình có thể quan sát được, nhưng cũng có những đột biến chỉ ảnh hưởng đến sức sống Có những đột biến lặn, nhưng cũng có những đột biến trội Sự thay đổi kiểu hình do đột biến có thể biểu hiện ra ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau như phôi, hạt, cây con, cây trưởng thành

Căn cứ vào sự biến đổi cấu trúc di truyền người ta có thể phân ra làm các loại đột biến khác nhau như: đột biến gen: Biến đổi rất nhỏ trên một đoạn ADN, thường liên quan đến 1 hay 1 cặp nucleotide; đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể: tái sắp xếp, lặp đoạn, mất đoạn, Các đột biến này còn có thể gọi là sai hình nhiễm sắc thể [20]

Trong các dạng đột biến nêu trên dạng làm biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể thường dẫn đến những biến đổi có hại đối với cơ thể sinh vật Vì vậy, các nhà chọn giống chú trọng chủ yếu đến dạng đột biến gen, dạng này liên quan đến sự biến đổi cấu trúc của gen dẫn tới sự xuất hiện alen mới [10]

- 22 -

Sự phát sinh đột biến có thể do tự phát (đột biến tự nhiên): đột biến xuất hiện trong tự nhiên do tác động của tập hợp các yếu tố (vật lý, hoá học,…) có trong môi trường sống, và do những biến loạn về trao đổi chất trong tế bào Đột biến có thể do tác động của con người (đột biến nhân tạo): bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến như các tác nhân vật lý (tia X, tia gamma, bức xạ cực tím UV, bức xạ, neutron,…), các tác nhân hoá học (các chất đồng phân có tính base và những hợp chất có liên quan, chất kháng sinh, những tác nhân alkyl hoá, acridines, azides, hydroxylamine, nitrous acid, )

Trong điều kiện tự nhiên, tần số xuất hiện đột biến thay đổi tuỳ thuộc vào từng loại cây trồng và của từng gen riêng biệt, tuy nhiên tần số đột biến rất thấp (khoảng 10-6 [8]) và khó phát hiện, số đột biến có lợi cho sản xuất và đời sống lại càng thấp hơn Ngày nay các nhà chọn giống không thể chỉ trông chờ vào việc sử dụng các dạng đột biến tự phát Vì vậy, việc nghiên cứu đột biến nhân tạo được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, nhằm tăng tần xuất xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung và cây trồng nói riêng Mặc dù còn nhiều hạn chế nhưng đột biến thực nghiệm đã và đang đóng góp rất lớn cho việc cải tiến giống cây trồng trên thế giới

2.3.2.2 Vai trò của đột biến thực nghiệm trong công tác chọn tao giống cây trồng

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều phương pháp chọn tạo giống đã và đang được quan tâm phát triển Bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo hay chọn lọc, để tạo ra một giống cây trồng năng suất cao, ổn định cần ít nhất từ 6-10 thế hệ Trong khi đó chọn giống bằng phương pháp đột biến nhân tạo (đột biến thực nghiệm) chỉ cần 3-6 thế hệ [8] Đồng thời sử dụng phương pháp này có thể giải quyết những vấn

đề mà nhiều phương pháp khác không thể thực hiện được như khi biến dị tự

- 23 -

nhiên về một đặc tính mong muốn không có sẵn trong nguồn vật liệu di truyền; khi có sẵn một gen cần thiết song do mối liên kết chặt chẽ với các gen khác làm cho gen đó không sử dụng được; khi tạo đặc tính mong muốn không thể thực hiện được bằng phương pháp lai; khi muốn thay đổi một hoặc một số tính trạng riêng biệt nhằm khắc phục nhược điểm của giống mà không làm thay đổi những tính trạng khác của giống [13]

Với phương pháp đột biến thực nghiệm, sử dụng các tác nhân lý hoá gây đột biến đã làm tăng sự sai khác di truyền trong quần thể Việc xử lý đột biến thực nghiệm có thể tạo ra những đột biến mang tính nhảy vọt đáng kể

Do đó có thể tạo ra giống mới khác xa giống cũ [3]

Với các thành tựu mới về vật lý, hoá học, con người đã sử dụng các tia phóng xạ (tác nhân lý học) và các chất hoá học (tác nhân hoá học) như colchicine, EMS, trong công tác chọn giống cây trồng và đã thu được các thành tựu đáng kể Theo Ban Di truyền và Chọn giống thực vật của tổ chức Nông nghiệp Quốc tế và tổ chức Năng lượng nguyên tử Quốc tế (FAO, IAEA) đã cho biết tính đến năm 1996, số lượng các giống đột biến thu được

là 1737 giống từ hơn 50 nước trên thế giới Các giống đột biến này được tạo

ra từ 154 loài thực vật Trong đó cây trồng chiếm 1257 giống, 187 giống hoa cúc, 35 giống cây cảnh, 34 giống hoa phong lan, 30 giống xương rồng và rất nhiều loài khác [8] Từ những kết quả thu được chứng tỏ đây là một trong những phương pháp có hiệu quả nhất để tạo ra giống mới Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đánh giá: một trong những thành tựu xuất sắc của thế kỷ

20 là khám phá ra phương pháp tạo giống bằng cách gây đột biến thực nghiệm

Theo một số tài liệu thì tác nhân gây đột biến hoá học có hiệu quả hơn tác nhân vật lý Nếu dưới ảnh hưởng của chiếu tia ở các cây nông nghiệp xuất hiện 10 - 15% biến đổi di truyền có khả năng sống thì tác nhân hoá học cho

- 24 -

phép thu nhận từ 30 - 60% Hơn nữa tác nhân gây đột biến hoá học thường làm xuất hiện những biến dị đặc biệt hơn [20]

2.3.2 EMS và ứng dụng EMS trong công tác chọn tạo giống cây trồng

2.3.2.1 Chất gây đột biến EMS

EMS – Methylethane sulphonate, công thức hoá học: CH3SO2OC2H5

Theo một số tài liệu cho thấy EMS có thể gây đột biến ít nhất bằng 3 cách: thêm nhóm methyl (- CH3) hay ethyl (- C2H5) vào guanine tạo base đồng đẳng của adenine dẫn đến bắt cặp bổ sung sai; làm mất guanine do đã bị alkyl hoá (mất purine) tạo lỗ hổng trên ADN, khi sao chép có thể làm đứt mạch; liên kết chéo giữa các mạch của một hoặc các phân tử ADN khác nhau làm mất nucleotide

Trong các tác nhân gây đột biến bằng hoá học EMS là chất được sử dụng phổ biến và cho hiệu quả cao Dung dịch hoá chất gây đột biến này phải được chuẩn bị trước khi dùng và nó được tồn trữ như dung dịch gốc “stock” Tốc độ thuỷ phân của hợp chất này được đo bằng phương pháp bán thời gian

“hafl life” Qua các kết quả nghiên cứu người ta cho thấy tốc độ thuỷ phân của EMS phụ thuộc rất lớn vào nhiệt độ Trong nước cất (pH = 7) ở nhiệt độ

200C hafl life của EMS là 93 giờ, ở 300C là 26 giờ và ở 370C là 10 giờ [2] Vì vậy, để đảm bảo hoạt tính của chất gây đột biến chỉ nên chuẩn bị dung dịch trước khi xử lý không quá 30 phút và giữ trong bóng tối trong suốt thời gian

- 25 -

Hình 1 Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hoá [20]

Để gây đột biến cho cây trồng có thể xử lý hoá chất EMS trên các bộ phận như hạt, chồi, củ, phôi trong thời gian đang phát triển Tuy nhiên, đối với mỗi giống, bộ phận của cây trồng có sự cảm ứng khác nhau với hoá chất gây đột biến Các kết quả nghiên cứu cho thấy, khi tăng nồng độ của tác nhân đến mực độ nhất định thì khả năng sống của cây cũng tăng, sau đó nếu tiếp tục tăng thì khả năng sống của đối tượng lại giảm xuống Vì vậy, đối với từng giống, từng bộ phận cây trồng cần phải xác định nồng độ, thời gian tác động hợp lý mới có thể mong muốn đem lại hiệu quả di truyền cao

2.3.2.2 Các nghiên cứu về tạo giống cây trồng bằng xử lý EMS

Các tác giả Tulmann Neto và cộng sự (2004) [61], đã nghiên cứu ảnh

hưởng gây đột biến của EMS lên giống cúc Dendranthema grandiflora

Tzvelev Các tác giả tiến hành thí nghiệm trên cuống nhỏ non của giống cúc

cv Ingrid (màu hồng thẫm) được xử lý với dung dịch EMS nồng độ 0,77 % trong 1h và 45 phút, sau đó ngâm trong nước 15 phút và làm sạch bề mặt Tiếp theo đó, mẫu được cấy trên môi trường MS + 1 g/l hydrolyzed casein, 1

- 26 -

mg/l 6-benzylaminopurine (BAP) and 2 mg/l indole-3-acetic acid (IAA) Ước lượng có khoảng 910 mẫu thu được từ xử lý EMS cuống hoa cho kết quả ra hoa Thí nghiệm thu được khoảng 40 dạng đột biến (chiếm 5,2 %) cho màu sắc cánh hoa khác nhau (màu hồng cam, màu hồng nhạt, màu đồng, màu trắng, màu vàng và màu cam) Hầu hết chúng (89,6 % tổng số) là đồng dạng

về kiểu hình

Chen Wei và cộng sự (2004) [61], nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý

EMS lên các phôi tiểu bào tử in vitro họ cải bắp (Brassica napus) cho thấy: Khi xử lý các tiểu bào tử của B napusin vitro ở các nồng độ 0; 1,0; 1,5; 2,0;

2,5; và 3,0 mM/l và các khoảng thời gian 12, 24 và 36 giờ), kết quả chỉ ra rằng số lượng hầu hết các sản phẩm phôi tiểu bào tử đều giảm xuống, tăng dần ở các nồng độ xử lý và các khoảng thời gian xử lý Sản phẩm phôi giảm còn một nửa ở nồng độ 2,5 mM/l và khoảng thời gian 24 giờ Ở mức này, các tiểu bào tử bị đột biến có giá trị rất quan trọng trong xử lý đột biến EMS in

vitro B napus

Tác giả Luan và cộng sự (2007) [64], đã sử dụng EMS nhằm gây đột

biến tăng tính chịu mặn của các giống Khoai lang ( Ipomoea batatas L.) Mẫu

mô lá được sử dụng đem xử lý EMS ở nồng độ 0,5 % trong thời gian 0,0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 giờ; sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 4 lần Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS + 200 mM NaCl nhằm chọn lọc các dòng

tế bào đột biến và các dòng này sẽ được cấy chuyển 5 lần (20 ngày 1 lần) Sau

đó các dòng chọn được được cấy chuyển sang môi trường tạo phôi vô tính

MS + 4 mg/l ABA + 10 mg/l GA Sau 15 ngày cấy chuyển sang môi trường

MS + 0,05 mg/l ABA + 0,2 mg/l ZT Các giống như ML1, ML2 và ML3 được phục tráng từ các dạng phôi vô tính thích hợp với xử lý EMS nồng độ 0,5 % trong 2 và 2,5 giờ Các giống chọn tạo được có đặc tính chịu mặn hơn hẳn các giống gốc

- 27 -

Năm 1998, các tác giả thuộc Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long đã gây đột biến thành công giống lúa thơm Jasmine 85 bằng xử lý hóa chất EMS trong nuôi cấy mô Thí nghiệm được thực hiện từ vụ hè thu năm 1998 đến năm 2001 Đặc điểm: Lúa Jasmine 85 có nguồn gốc từ Hoa Kỳ là giống đặc sản xuất khẩu của Hoa Kỳ được thế giới ưa chuộng Khi trồng ở Việt Nam, lúa bị nhiễm sâu bệnh nên chi phí cao, không cạnh tranh lại với các nước khác, thị trường nội địa cũng khó tiêu thụ Sau khi xử lý, thế hệ M1, các cá thể được trồng ở ruộng vào thời điểm có dịch rầy, phần lớn đều bị cháy rầy

Từ 59 cá thể này, kỹ sư Phạm Thị Hường tiếp tục chọn lọc đến thế hệ M5, tuyển chọn một số dòng đã thuần đưa vào so sánh năng suất, trong đó có 4 dòng OM 3566 - 14, OM 3566 - 15, OM 3566 - 16, và OM 3566 - 70 có triển vọng [65]

Theo thời báo Nông nghiệp Việt Nam (2001), tại Malaysia bằng cách lấy đỉnh sinh trưởng nuôi cấy tạo mô sẹo rồi dùng các tác nhân gây đột biến

có thể là hóa chất như EMS 0,2% (Ethylmethane sulphonate), DMSO 2% (Dimethylsulfoxide) hoặc tia gama được điều chế từ Co60 đã chọn tạo thành công giống chuối FATON-1 Giống chuối FATON-1 có đặc điểm: từ khi trồng tới lúc thu hoạch khoảng 37 tuần (gần 9 tháng) sớm hơn giống gốc của

nó là giống chuối Cavedish gần 6 tháng Điều này đặc biệt có ý nghĩa do

chuối (Musa sp) là cây sinh sản vô tính, nên việc cải tiến giống chuối là rất

khó khăn, vì không có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái trong phôi Do

đó việc cải tiến giống chuối chủ yếu dựa vào đột biến kết hợp với nuôi cấy

mô

Tuy nhiên các nghiên cứu về xử lý EMS in vitro cho cây hoa cẩm chướng chưa tìm thấy ở các tài liệu công bố Chính vì vậy trong đề tài này chúng tôi bước đầu thử nghiệm những tác động của EMS lên cây hoa cẩm

chướng thơm Dianthus caryophyllus L

- 28 -

PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây hoa Cẩm chướng thơm (Dianthus caryophyllus L.), gồm 2 giống:

- Giống Quận chỳa

- Giống Trắng Đà Lạt

Giống Trắng Đà Lạt Giống Quận chúa

Hình 2 Mẫu giống hoa nghiên cứu 3.2 Vật liệu nuôi cấy

Đoạn thân mang mắt ngủ của chồi in vitro Đoạn thân được cắt thành từng đoạn nhỏ, dài khoảng 1,0 cm mang một mắt ngủ

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro

Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng như sau:

- ĐC: MS

- 30 -

- CT3: MS + 1,0 g/l than hoạt tính

- CT4: MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α NAA

- CT5: MS + 1,0 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α NAA

3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm

Thí nghiệm 4:

- CT1 : Phương pháp thuỷ canh (sử dụng dung dịch Anthura với nồng

độ bằng ¾ nồng độ dung dịch chuẩn kết hợp sục khí 4 lần/ngày)